Permite la transferencia de proteínas desde ungel donde han sido separadas por por tamaño ocarga mediante electroforesis a una membranamanteniendo una configuración espacial.
Técnica empleada para el análisis individual de
proteínas en mezcla.
Para posteriormente ser detectadas mediante launión de un anticuerpo
Son transferidas a una membrana de nitrocelulosa para
su posterior marcaje con anticuerpos.
Las proteínas se separan mediante
electroforesis en gel
Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una
muestra determinada
• Una vez transferida a la membrana de nitrocelulosa se bloquean los sitios de acción inespecíficos para formar posteriormente un complejo con un anticuerpo específico primario.
• El anticuerpo primario no unido es eliminado y se adiciona un anticuerpo secundario marcado generalmente con HRP (peroxidasadel rábano) o fosfatasa alcalina.
Preparación de la muestra Electroforesis en gel
Transferencia electroforética a una
membrana
Hibridación del Anticuerpo
Detección de las Bandas
• Obtención de la proteína
Eliminar medio de cultivo y
lavar con PBS
Desprender células a un eppendorff
Llevar a sonicador y centrifugar
Obtiene sobrenadante y se deja en hielo
se añade anti proteasaSe añade,
Buffer y SDS
• La proteínas se desnaturaliza
con calor, SDS o
mercaptoetanol o ditiotreitol
que rompen los puentes S-S.
• SDS aporta carga negativas
• Las proteínas migran hacia el
cátodo (+) y se distribuyen
según su peso molecular.
Bloqueo de la membrana
(leche PBS-Tween)
Retira solución de bloqueo y lava 3
veces con PBS
Directo: Anticuerpo primario con
enzima
Indirecto: Anticuerpo secundario con
enzima
Incuba con sustrato en agitación
Se enjuaga con agua MQ
Lee Quimioluminiscencia,
Fluorescencia y Colorimetría
Indirecto: Anticuerpo
primario
Lavado 3 veces con PBS tras cada incubación
APLICACIONES Investigación: biología molecular.
*Detección de proteínas o
mutaciones puntualesDiagnóstico:
*Prenatal
* Enfermedades inflamatorias, perfil de
citoquinas en modelos experimentales,
Factores de crecimiento, Secreción de
proteínas
*Prueba de VIH: (estándar de oro) Ac´s
anti-VIH en suero. Membrana con
proteínas de células infectadas + suero
muestra; aparición de bandas indica =
seropositivo.
*Confirma la encefalopatía
espongiforme bovina, "enfermedad de
las vacas locas".
*Enfermedad de Lyme.
*Oncogenes
En veterinaria:
*FIV en gatos.
ventajas del uso de SDS – PAGE (electroforesis)
•La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.•Todos los complejos de SDS-proteína tiene carga negativa y migran en el mismo sentido.•Su densidad de carga es muy elevada, la velocidad de migración es mayor y las electroforesis son mas rápidas.•Los complejos de SDS- proteína se tiñen fácilmente.
*Costo elevado.
*Variabilidad reaccional en
las bandas según el ensayo ,
el tipo de muestras, las
condiciones técnicas, hacen
variar la subjetividad de
interpretaciones.
*Problema en las proteínas
de fácil degradación.
*Es tardado (inadecuada
transferencia) bandas
sesgadas, descolorido, o
incluso múltiple.
VENTAJAS
*Alta sensibilidad 0,1
nanogramos de proteína.
*Diagnóstico eficaz
temprano.
*Múltiples muestras y
tipos de estudio.
DESVENTAJAS