PCR Fundamentos, variantes y aplicaciones
MSc. Edgar Neyra Valdez
Unidad de Genomica
Universidad Peruana Cayetano Heredia
Sntesis de cidos nucleicos: generalidades
La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en direccin 5 3
Las DNA polimerasas pueden iniciar la sntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde
Las DNA polimerasas adems de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensin)
Se requieren adicionalmente los dNTP y el cofactor Mg
Reaccin en cadena de la polimerasa -
PCR
PCR es bsicamente una tcnica de
amplificacin del DNA.
PCR
amplificacin
DNA
(molecula sencilla)
Muchas
moleculas
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
5 3
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T A 5 3
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T A C
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
5 3
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T A C G
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
5 3
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T A C G T
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
5 3
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T A C G T A
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
5 3
Despues del primer periodo de sintesis de
DNA, tenemos copiada una cadena de
DNA
Primer 1 Extensin de la cadena
Cadena original de DNA
Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?
Reaccin en cadena de la polimerasa -
PCR
Primero, la separacin de las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (94C)
Reaccin en cadena de la polimerasa -
PCR
Primero, la separacin de las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (94C)
Reaccin en cadena de la polimerasa -
PCR
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
Al mismo tiempo, la cadena original se copia
nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1
2
1
Ahora tenemos dos copias de la molcula original
Reaccin en cadena de la polimerasa -
PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Reaccin en cadena de la polimerasa -
PCR
Fusin
94C
Hibridizacin
50-60C
Extensin de
La cadena
72C
Primer Ciclo
2do Ciclo
94C
50 - 60C
72C
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el
nmero de copias
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
PCR Melting
94 oC
Tem
per
atu
ra
100
0
50
Tiempo
5 3
3 5 DNA de
cadena doble
PCR Melting
94 oC
Tem
per
atu
ra
100
0
50
Tiempo
3 5
5 3
Calor
DNA de
cadena simple
PCR Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ura
100
0
50
Tiempo
3 5
5 3 5
5
Melting
94 oC
Hibridacin
de primers
PCR Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ura
100
0
50
Tiempo
30 ciclos
3 5
5 3
Calor
Calor
5
5
5
PCR Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3 5
5 3 5
5
5
5
5
5
PCR Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3 5
5 3 5
5 5
5
5
5
Calor
Calor
PCR Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3 5
5 3 5
5 5
5
5
5
5
5
5
5
Fragmentos de
tamao definido
PCR Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3 5
5 3 5
5 5
5
5
5
5
5
5
5
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
0
# ciclos
Numero de copias
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
Termociclador
Electroforesis en agarosa
Electroforesis en agarosa
VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado especfico o productos amplificados previamente)
TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR
PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea
PCR Nested: amplificacin de una secuencia dentro de otra previamente amplificada
RT-PCR : deteccin de mRNA
IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR
Real Time PCR : cuantificacin de copias iniciales en tiempo real
PCR-Diagnstico Molecular
Un aproximacin ha sido encontrar secuencias genmicas especficas de gnero o especie: protenas de choque trmico 90 (Hsp 90), lanosterol demetilasa, proteinasa aspartica, quitina sintasa, y actina son algunos ejemplos.
Estas secuencias se encuentran casi exclusivamente en copias simples en el genma, hacindolas altamente especficas.
PCR-Diagnstico Molecular
Otra aproximacin es la de amplificar secuencias genmicas altamente conservadas que se encuentran en copias mltiples (generalmente unidades transcripcionales de 50-100 copias) presentes en las especies fngicas: tenemos el gen 18S rRNA, 5S, 28S rRNA mitocondrial, regiones ITS.
PCR Multiplex
- Varias secuencias target en forma simultnea.
- La eficiencia de amplificacin de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets
(%GC)
- Temperatura de hibridacin de los diferentes
primers
- Tamao de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dmeros entre diferentes primers.
PCR-Diagnstico Molecular
Diagnstico Molecular
Diagnstico Molecular
PCR-Diagnstico Molecular
NESTED PCR o PCR anidado
Se realiza una segunda reaccin de PCR a partir del amplicn , usando primers internos a la primera amplificacin
Aumenta la sensibilidad , ya que se realizan dos reacciones de PCR
consecutivas Aumenta la especificidad, ya que se utilizan otros primers internos
especificos
Nuclear rDNA 18S 5.8S Nuclear rDNA 26S ITS I ITS II
Its-1 Its-4 PCR
Sequencing
Base de Datos ITS, ID y GeneBank
Its-1
Its-4
Levaduras
Diagnstico Molecular
PCR-Diagnstico Molecular
Base de
Datos
mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR
RT-PCR
Consiste en dos pasos:
Transcripcin reversa
PCR
OBJETIVO:
Deteccin de la expresin de
un gen por presencia de mRNA
Transcripcin Reversa
1. Purificacin de RNA mensajero
2. Transcripcin reversa a cDNA (DNA copia)
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RNAc DNA
Prueba cuantitativa para determinar la carga viral del VIH
Carga Viral = Viremia, virus en sangre
HIV es un retrovirus, se obtiene RNA y se realiza el RT-PCR
Seguimiento de la terapia del paciente infectado
Limite de deteccin de 40 Copias virales/mL (ultrasensible)
Inmuno PCR-Diagnstico Molecular
Se emplean dos tecnologas, la deteccin basada en
anticuerpos y PCR, La deteccin del antgeno por el
anticuerpo se ve enormemente potenciada por la
conjugacin del sistema de deteccin del anticuerpo con
un fragmento de ADN que posteriormente es amplificado
mediante PCR.
Esta tcnica recuerda a ELISA (anlisis inmuno
absorbente ligado a enzima) y permite detectar incluso 10
femtogramos de protena.
Immuno-PCR vs ELISA
protein
E
S P
ELISA
antibody with
linked enzyme
St B
protein
Immuno-PCR
antibody with
linked DNA
B
El Producto de PCR puede ser detectado por
electroforesis o por ELISA
REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL
Cuantificacin del nmero de copias de DNA presentes en la muestra (diagnstico, monitoreo de
carga viral, comparacin entre nmero de copias en
diferentes subespecies, etc.)
Cuantificacin del mRNA por RT-PCR en tiempo real (anlisis de la expresin de genes en diferentes
tejidos o en diferentes condiciones normales vs
patolgicas, efecto de drogas, etc)
Anlisis de la cintica de la reaccin
PCR en tiempo real
Deteccin y cuantificacin de reporteros fluorescentes.
La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto formado en cada ciclo de PCR.
Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green
PCR en tiempo Real sondas de hidrolisis
Sonda especfica
PCR en Tiempo Real: deteccin mediante sondas de hidrlisis.
Se lleva a cabo mediante la hibridacin con una sonda
complementaria a una regin interna de la secuencia blanco,
previamente a la amplificacin. Tm sonda debe ser 10C > que el de los
cebadores, de modo que hibride antes que los mismos.
PCR en Tiempo Real: deteccin mediante sondas de hidrlisis.
SYBR Green
Agente que se intercala
en DNA de doble
cadena.
Desventaja: se une a
CUALQUIER DNA de
doble cadena (dmeros
de primers y productos
inespecficos).
CYCLE NUMBER DNA copy number
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1,024
11 2,048
12 4,096
13 8,192
14 16,384
15 32,768
16 65,536
17 131,072
18 262,144
19 524,288
20 1,048,576
21 2,097,152
22 4,194,304
23 8,388,608
24 16,777,216
25 33,554,432
26 67,108,864
27 134,217,728
28 268,435,456
29 536,870,912
30 1,073,741,824
31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
34 1,580,000,000
PCR reagent is the limiting factor!!
Copies of DNA=2N
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
6.0E+08
8.0E+08
1.0E+09
1.2E+09
1.4E+09
1.6E+09
1.8E+09
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DN
A c
op
y n
um
ber
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DN
A c
op
y n
um
ber
(lo
g)
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS
Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relacin como lnea recta
al utilizar logaritmos, porque la amplificacin por PCR es una reaccin
logartmica.
Real Time PCR
2a. excitation
filters
2b. emission
filters
1. halogen
tungsten lamp
4. sample plate
3. intensifier 5. ccd
detector
350,000
pixels
Log phase Level off/ plateau
Amplification Plot of real-time PCR D
NA
co
py n
um
ber
(log)
PCR cycle (Ct)
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
Dmeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeos
PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
DISEO EN PLACA
Ventajas del PCR en tiempo real
Simple y rpida (semi-automatizada).
No hay manipulacin post-PCR.
Eliminacin de contaminacin por amplicones.
Cuantificacin del DNA o RNA molde inicial.
Muy sensible.
Deteccin de productos inespecficos con la opcin curva de desnaturalizacin (Melt-Curve).
Deteccin de ms de un producto especfico en una misma reaccin.
Extraordinariamente especfico.
Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002
Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003
Polymerase chain reaction (PCR)
DNA polimerasas para PCR :Termoestables
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
APLICACIONES DE PCR
MUTAGENESIS
RT-PCR
PRODUCCION DE SONDAS
DETECCIN DE INFECCIONES BACTERIANAS Y VIRALES
DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS
ESTUDIOS DE EVOLUCIN MOLECULAR
ESTUDIOS DE MEDICINA FORENSE
ESTUDIOS DE FILIACIN