UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
Mtodos bsicos para el aislamiento e identificacin de entero-bacterias del agua.
Aura Ramrez VegaCarlos Martnez MartnezClaudia Larios AyalaIrving Quiroz MartnezJulia Mara Turcio Julia Mara
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
IntroduccinConsiderando que estudio de las enfermedades transmisibles ocasionadas por microorganismos patgenos.Constituye el objeto de transformacin del mdulo Procesos Celulares Fundamentales (PCE) del Tronco Comn Divisional de Ciencias Biolgicas y de la Salud (TCD de CBS).
Objetivo El Objetivo del presente texto es introducir a los alumnos de este mdulo en el manejo de los mtodos bsicos empleados en el laboratorio de microbiologa, tomando como modelo el aislamiento e identificacin de entero-bacterias a partir de muestras de agua.Objetivos Especficos. El alumno aprenda a preparar la muestra y a sembrarla por estra cruzada para obtener colonias aisladas. El alumno aprenda a preparar la muestra y a sembrarla estra cruzada pata Obtener colonias aisladas. El alumno aprenda a observar y determinar las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las colonias aisladas. As como, obtener cultivos puros. El alumno conozca los fundamentos de las pruebas bioqumicas y realice las que se requieren para identificar a las entero-bacterias.Principios tericosLas Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, distribuidas en la naturaleza en forma amplia. Se encuentran en el suelo, en el agua, sobre las plantas y como su nombre lo indica se encuentran dentro del tracio intestinal dc los seres humanos y de los animales. Se aslan con mucha frecuencia de clnicas,La familia Enterobacteriaceae est formada por aproximadamente 31 gnero y 139 especies y miles de serotipos. Algunos miembros de la familia siempre se asocian a enfermedades cuando se aslan en el hombre, por ejemplo: Shigella Salmonella, Yersinia pestis. Mientras que otros son miembros de la flora normal que producen infecciones oportunistas, por ejemplo: Escherichia coli, Klebsiella pneumomiae, Proteus mirabilis.Las entero-bacterias son causantes de un gran nmero de enfermedades infecciosas en el humano, entre las ms comunes se encuentran los sndromes diarreicos y disntricos, causados por cepas de Escherichia coli, Salmonella y Shigella. La fiebre tifoidea, causada por especies de Salmonella. Se tienen casos de neumona causados por Klebsiella pneumomiae. Especies de Proteus mirabilis, E. coli y varios miembros del grupo Klebsiella Enterobacteriaceae se aslan de heridas traumticas, contaminadas con tierra o material vegetal o de incisiones abdominales despus de una ciruga. El shock endotxico es una manifestacin potencialmente letal de la infeccin par entero-bacteria.
Metodologa y Resultados.La metodologa descrita consta de cuatro sesiones:1. Preparacin de las muestras y cultivo en un medio selectivo 2. Aislamiento y observacin de las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las enterobacterias3. Pruebas bioqumicas para enterobacterias4. Identificacin de las enterobactriasObtencin de la muestra:La tcnica empleada para obtener la muestra con la que se trabajara en el laboratorio, fue la misma que se emple en el resto de las unidades pertenecientes a la Universidad Autnoma Metropolitana (UAM).Es decir, se aplic la tcnica de medio chorro para la toma de muestra en un frasco estril de 100mL. Las muestras totales recolectadas fueron cuatro, pertenecientes a distintos medios donde se encuentra agua en diferentes condiciones (charco de agua sucia, cubeta con agua de lluvia, agua de la llave y agua estancada del rio Lerma), posteriormente las muestras recolectadas fueron rotuladas con la finalidad de mantener cierto orden con los frascos. Cabe mencionar que durante la toma de muestra, se trat de realizar de la manera ms estril posible, esto con la finalidad de no contaminar el agua y que alterara a los resultados; adems la toma de muestra se realiz el mismo da en el que se realizara la parte experimental de la investigacin.PRIMERA SESIN: Antes de comenzar a trabajar fue importante realizar la esterilizacin de rea de trabajo para evitar cualquier tipo de contaminacin.Para el cultivo de la muestra estas fueron tratadas de dos maneras:1. Dilucin de la muestra 1:10, que consiste en tomar 1ml de la muestra y diluirla en 9ml de Solucin Salina Isotnica estril (SSI) 2. Muestra directa, sin ningn tipo de dilucin En ambos casos el cultivo se realiz de la misma manera: Con ayuda de un el asa bacteriolgica estril se tom una pequea cantidad de la muestra de agua y se procede a estriar el inoculo en la caja de Petri sobre el agar siguiendo un patrn de cuatro cuadrantes y una estra abierta. Cada agar se sell con un pedazo de masking y se etiquet con los datos requeridos; especificando el nmero de muestra y si era diluida o no diluida. Las cajas de agar MacConkey se llevaron a incubar durante 24 horas.SEGUNDA SESION:Despus de que las muestra incubaron durante 24 horas se procedi a la seleccin de colonias desarrolladas de agar MacConkey. En el caso de las muestras obtenidas de: charco de agua sucia, cubeta con agua de lluvia, agua de la llave y agua estancada del rio Lerma se encontr un crecimiento o desarrollo de una colonia bacteriana observando mayor desarrollo en el cultivo no diluido a comparacin con el cultivo diluido. Se procedi a realizar la resiembra de las colonias desarrolladas en agar MacConkey para obtener cultivo puro de bacterias.Posteriormente se realiz la observacin microscpica de los cultivos seleccionados por Tincin de Gram. Siguiendo la metodologa de la prctica se prepar el frotis y la tincin para la observacin microscpica de las colonias cultivadas y as determinar si las enterobacterias presentes eran de carcter Gram+ o Gram-
Al observar las tinciones al microscopio se determin que las enterobacterias presentes en dicha muestra eran de carcter Gram+ debido a que presentaban una coloracin azul violeta. TERCERA SESION:Prueba Catalasa: Enzima que descompone el perxido de hidrogeno en oxgeno y agua oxigenada. Las bacterias que con Catalasa positiva liberan oxigeno que se manifiesta con la liberacin de pequeas burbujas.
Prueba Oxidasa: Todas las enterobacterias dan una reaccin negativa. Pseudomona y Neisseria son positivas. Las bacterias oxidasa positivas producen un color negro o azul intenso en 10seg. La reaccin se considera positiva si ocurre entre los 10 y 60 segundos posteriores. Si el desarrollo de color se da despus de 60 segundos la prueba se considera Negativa.
Prueba Muestra 1Muestra 2Muestra 3Muestra 4
Catalasa++++
Oxidasa++++
Siembra en medios para pruebas bioqumicas:1. Prueba Voges Proskauer / Rojo de metiloCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro de bacterias y suspenderlo en un tubo con caldo VP-RM
2. Citrato de SimmonsCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro y simbralo en forma de una estra abierta sobre el rea inclinada del medio.3. IndolCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo en el medio SIM a 3mm del fondo del tubo.
4. Caldo UreaCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo en el caldo urea.
5. Agar Hierro Triple Azcar (TSI)Con el asa bacteriolgica se toma un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo por picadura en el fondo y en forma de una estra en la superficie
Se realizaron los mismos pasos en cuatro ocasiones, una con cada muestra diferente. Todos los tubos se dejaron incubar durante 24 horas
CUARTA SESIN:
Interpretacin de las pruebas de identificacin bioqumica
1) Voges-Proskauer / Rojo de metilo Prueba positiva: Color rojo en el medio (presenciad e acetona) Prueba negativa: Color amarillo cobrizo en el medio *El tubo control debe dar una reaccin negativa2) Rojo de Metilo Prueba positiva: Color rojo en el medio Prueba retardada: Color anaranjado Prueba negativa: Color amarillo en el medio*El tubo control debe dar una reaccin negativa3) Citrato de Simmons Prueba positiva: Crecimiento con color azul intenso en la zona inclinada del pico de flauta Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color *El tubo control debe dar una reaccin negativa4) Indol Prueba positiva: Color negro en la picadura o en todo el tubo Prueba negativa: Ausencia de color negro en todo el tubo*El tubo control debe dar una reaccin negativa5) cido Sulfhdrico (H2S) Prueba positiva: Aparicion de un color rojo 1 o 3 minutos despus de adicionar el reactivo Prueba negativa: Color amarillo *El tubo control debe dar una reaccin negativa6) Movilidad: Obsevar medio SIM Prueba positiva: El medio SIM debe encontrarse turbio Prueba negativa: solo debe existir crecimiento a lo largo de la picadura *El tubo control debe dar una reaccin negativa7) Ureasa Prueba positiva: Color rosa fuerte en el caldo urea Prueba negativa: Color amarillo o sin cambio en el caldo urea*El tubo control debe dar una reaccin negativa8) Agar Hierro Triple Azcar (TSI) Pico de flauta rojo/Profundidad amarillo: Medio Alcalino/cido (Alc/A). Glucosa fermentada; lactosa o sacarosa no fermentada. Pico de flauta amarillo/Profundidad amarillo: Medio cido/cido (A/A). Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada. Resultados:PruebaMuestra 1Muestra 2Muestra 3Muestra 4
Voges ProskaeurNegativaNegativaNegativaPositiva
Rojo de MetiloNegativaPositivaNegativaNegativa
Citrato de SimmonsPositivaPresenta crecimiento con ligero cambio de coloracin hacia un tono azul verdosoPositivaPresenta ligero crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intensoNegativaPresenta ligero crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intensoPositivaPresenta ligero crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intenso
IndolNegativaNegativaNegativaPositiva
cido Sulfhdrico (H2S)PositivaNegativaNegativaPositiva
MovilidadPositivaNegativaNegativaNegativa
UreasaPositivaNegativaNegativaPositiva
TSI (hierro triple azcar)NegativaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).NegativaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
Anlisis de las muestras recolectas de Rectora
Por:Alicia Maribel Curiel RojoDelfina Garca BetanzoLucero Edith Gonzlez CruzGrisel Loeza CoatzozonMelina Trejo Lara
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
Recoleccin de la muestra
El propsito de esta investigacin es evidenciar la presencia de Enterobacterias en el agua de los bebederos de las distintas unidades de la UAM (Universidad Autnoma Metropolitana)Cabe resaltar que en la Rectora de la UAM no hay bebederos como en la UAM X sin embargo cuentan con dosificadores de agua, de los cuales fueron seleccionados 5 al azar para la toma de muestra.En cada uno de los dosificadores seleccionados se aplic la tcnica de medio chorro para la toma de muestra en un frasco estril marcado para identificar el dosificador seleccionado y dicho frasco se mantuvo en un medio refrigerante hasta el momento que se us en el laboratorio, lapso que no fue mayor a 1 hora.Dispensadores seleccionados:1) Dosificador de Coordinacin general de administracin y relaciones laborales (2do piso)
2) Dosificador de Tesorera adjunta de control patrimonial (3er piso)
3) Dosificador de Direccin de recurso humanos (2do piso)
4) Dosificador de Direccin de Tecnologas de la informacin (1er piso)
5) Dosificador de la caseta de vigilancia en la entrada principal (planta baja)
Trabajo en laboratorio
PRIMERA SESIN: Sembrado en Agar MacConkey
Antes de comenzar a trabajar fue importante realizar la esterilizacin de rea de trabajo para evitar cualquier tipo de contaminacin.
Para el cultivo de la muestra estas fueron tratadas de dos maneras:
1) Dilucin de la muestra 1:10, que consiste en tomar 1ml de la muestra y diluirla en 9ml de Solucin Salina Isotnica estril (SSI) 2) Muestra directa, sin ningn tipo de dilucin
En ambos casos el cultivo se realiz de la misma manera: Con ayuda de un el asa bacteriolgica estril se tom una pequea cantidad de la muestra de agua y se procede a estriar el inocuo en la caja de Petri sobre el agar siguiendo un patrn de cuatro cuadrantes y una estra abierta.
Cada agar se sell con un pedazo de masking y se etiquet con los datos solicitados; especificando el nmero de muestra y si era diluida o pura.
Las cajas de agar MacConkey se llevaron a la estufa para dejarlas incubar a 37 C durante 24 horas. SEGUNDA SESIN: Aislamiento y observacin de las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las Enterobacterias.
Despus de que las muestra incubaron durante 24 horas se procedi a la seleccin de colonias desarrolladas de agar MacConkey. En el caso de las muestras de Rectora de los 10 cultivos totales solo 2 presentaron desarrollo de colonias bacterianas, ambas correspondieron a la muestra nmero 5 (Dosificador de la caseta de vigilancia en la entrada principal) observando mayor desarrollo en el cultivo puro a comparacin con el cultivo diluido.
Las colonias observadas presentaron las siguientes caractersticas:COLONIA 1Muestra PuraCOLONIA 2Muestra 1:10
MORFOLOGIA COLONIAL
FormaCircularCircular
ColorAmarillo / DoradoAmarillo / dorado
ElevacinUmbilicada con rugosidadUmbilicada con rugosidad
BordeIndefinidoIndefinido
ConsistenciaViscosaViscosa
TamaoGrande y puntiformeGrande y puntiforme
OpacidadAusenteAusente
SuperficieIrregularIrregular
De las dos muestras sealadas se procedi a realizar la resiembra de las colonias desarrolladas en agar MacConkey para obtener cultivo puro de bacterias.
Observacin microscpica de los cultivos seleccionados por Tincin de Gram.
Siguiendo la metodologa de la prctica se prepar el frotis y la tincin para la observacin microscpica de las colonias cultivadas y as determinar si las enterobacterias presentes eran de carcter Gram+ o Gram-
Al observar las tinciones al microscopio se determin que las enterobacterias presentes en dicha muestra eran de carcter Gram+ debido a que presentaban una coloracin azul violeta. Tambin se observ la presencia de un hongo en segundo plano
TERCERA SESIN: Pruebas bioqumicas para Enterobacterias.
Pruebas de identificacin bioqumica de los cultivos puros seleccionados Prueba Catalasa: Enzima que descompone el perxido de hidrogeno en oxgeno y agua oxigenada. Las bacterias que con Catalasa positiva liberan oxigeno que se manifiesta con la liberacin de pequeas burbujas.Prueba Oxidasa: Todas las enterobacterias dan una reaccin negativa. Pseudomona y Neisseria son positivas. Las bacterias oxidasa positivas producen un color negro o azul intenso en 10seg. La reaccin se considera negativa si ocurre entre los 10 y 60 segundos posteriores. Si el desarrollo de color se da despues de 60 segundos la prueba se considera Negativa.
Resultados obtenidos en las muestras de rectora: COLONIA 1Muestra PuraCOLONIA 2Muestra 1:10
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASA + +
OXIDASA
Prueba Catalasa en muestra pura
Prueba Catalasa en muestra diluida 1:10
-
Prueba Oxidasa en muestra puraPrueba Oxidasa en muestra diluida 1:10
Siembra en medios para pruebas bioqumicas:1) Prueba Voges Proskauer / Rojo de metiloCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro de bacterias y suspenderlo en un tubo con caldo VP-RM
2) Citrato de SimmonsCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro y simbralo en forma de una estra abierta sobre el rea inclinada del medio.
3) IndolCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo en el medio SIM a 3mm del fondo del tubo.
4) Caldo UreaCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo en el caldo urea.
5) Agar Hierro Triple Azcar (TSI)Con el asa bacteriolgica se toma un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo por picadura en el fondo y en forma de una estra en la superficie
Se realizaron los mismos pasos en tres ocasiones, la primera sin bacterias para los tubo de control, la segunda para los tubos con la muestra pura y la tercera para los tubos con las muestra diluida 1:10 Todos los tubos se dejaron incubar a 37 C durante 24 horas
CUARTA SESIN: Lectura de pruebas bioqumicas
Interpretacin de las pruebas de identificacin bioqumica
9) Voges-Proskauer / Rojo de metilo Prueba positiva: Color rojo en el medio (presenciad e acetona) Prueba negativa: Color amarillo cobrizo en el medio *El tubo control debe dar una reaccin negativa
10) Rojo de Metilo Prueba positiva: Color rojo en el medio Prueba retardada: Color anaranjado Prueba negativa: Color amarillo en el medio*El tubo control debe dar una reaccin negativa
11) Citrato de Simmons Prueba positiva: Crecimiento con color azul intenso en la zona inclinada del pico de flauta Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color *El tubo control debe dar una reaccin negativa
12) Indol Prueba positiva: Color negro en la picadura o en todo el tubo Prueba negativa: Ausencia de color negro en todo el tubo*El tubo control debe dar una reaccin negativa
13) cido Sulfhdrico (H2S) Prueba positiva: Aparicion de un color rojo 1 o 3 minutos despus de adicionar el reactivo Prueba negativa: Color amarillo *El tubo control debe dar una reaccin negativa
14) Movilidad: Obsevar medio SIM Prueba positiva: El medio SIM debe encontrarse turbio Prueba negativa: solo debe existir crecimiento a lo largo de la picadura *El tubo control debe dar una reaccin negativa
15) Ureasa Prueba positiva: Color rosa fuerte en el caldo urea Prueba negativa: Color amarillo o sin cambio en el caldo urea*El tubo control debe dar una reaccin negativa
16) Agar Hierro Triple Azcar (TSI) Pico de flauta rojo/Profundidad amarillo: Medio Alcalino/cido (Alc/A). Glucosa fermentada; lactosa o sacarosa no fermentada. Pico de flauta amarillo/Profundidad amarillo: Medio cido/cido (A/A). Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada. Pico de flauta rojo/Profundidad rojo: Medio Alcalino/Alcalino (Alc/Alc). Reaccin negativa, no hay fermentacin de ninguno de los carbohidratos.
COLONIA 1Muestra PuraCOLONIA 2Muestra 1:10
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Voges ProskaeurNegativaNegativa
Rojo de MetiloNegativaNegativa
Citrato de SimmonsPositivaPresenta crecimiento con ligero cambio de coloracin hacia un tono azul verdosoPositivaPresenta ligero crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intenso
IndolNegativaNegativa
cido Sulfhdrico (H2S)NegativaNegativa
MovilidadPositivaPositiva
UreasaPositivaPositiva
TSI (hierro triple azcar)PositivaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).
TSIGASH2SRMVPINDCITUREMOV
TRIBUTO I: Escherichiae
GNERO : Escherichia
E.coli
GNERO: Shigella
Grupos: A,B,CAlc/A---- / +
S.SonneiAlc/A----
TRIBU II: Edwarsiellae
GNERO: Edwarsiella
E.TardaAlc/A-+
TRIBU III: Salmonelleae
GENERO: SalmonelleaeAlc/A--++
TRIBU IV: Citrobactereae
GENERO: Citrobacter
C.freundii
C.koseriAlc/A--++ / -+
TRIBU V: Klebsielleae
GENERO: Klebsiella
K.pneumoniae
k.axytoca
GENERO: Enterobacter
E.aerogenes
E.cloacae
GENERO: Hafnia
H. AlvesAlc/A-- / +-+
GENERO: Pantoea
P.agglomeransAlc/A- / +-- / +- / ++ / -+
GENERO: Serratia
S. marcescensAlc/A-- / +- ++
TRIBU VI: Proteeae
GENERO: Proteus
P. vulgarisAlc/A-+++
P.mirabilisAlc/A-+ / -+++
GENERO: Morganella
M.morganiiAlc/A--+++
GENERO: Providencia
P.rettgeriAlc/A---++++
P.stuartiiAlc/A---++ / -
P.alcalifaciensAlc/A--++
TRIBU VII: Yersinieae
GENERO: Yersinieae
Y. enterocoliticaAlc/A---+ / -
Las reas sombreadas indican las Reacciones clave + / - del 50% al 90% de las cepas Positivas - / + del 50% al 90% de las cepas NegativasAnlisis de resultados
Clasificacin de EnterobacteriasNumero de Reacciones PositivasReacciones Positivas
TRIBUTO I:
GNERO: Shigella
Grupos: A,B,C5* TSI Alc/A* GAS* H2S* VP* IND
S.Sonnei5* TSI Alc/A* GAS* H2S* VP* IND
TRIBU II: Edwarsiellae
GNERO: Edwarsiella
E.Tarda3* TSI Alc/A* VP* MOV
TRIBU III: Salmonelleae
GENERO: Salmonelleae5* TSI Alc/A* VP* IND* CIT* URE* MOV
TRIBU IV: Citrobactereae
GENERO: Citrobacter
C.koseri6* TSI Alc/A* H2S* VP* CIT* URE* MOV
TRIBU V: Klebsielleae
GENERO: Hafnia
H. Alves5* TSI Alc/A* H2S* RM* IND* MOV
GENERO: Pantoea
P.agglomerans7* TSI Alc/A* GAS* H2S* RM* IND* CIT* MOV
GENERO: Serratia
S. marcescens6* TSI Alc/A* H2S* RM* IND* CIT* MOV
TRIBU VI: Proteeae
GENERO: Proteus
P. vulgaris4* TSI Alc/A* VP* URE
* MOV
P.mirabilis5* TSI Alc/A* IND* CIT* URE* MOV
GENERO: Morganella
M.morganii5* TSI Alc/A* H2S* VP* URE* MOV
GENERO: Providencia
P.rettgeri7* TSI Alc/A* GAS* H2S* VP* CIT* URE* MOV
P.stuartii6* TSI Alc/A* GAS* H2S * VP* CIT* MOV
P.alcalifaciens5* TSI Alc/A* H2S* VP* CIT* MOV
TRIBU VII: Yersinieae
GENERO: Yersinieae
Y. enterocolitica5* TSI Alc/A* GAS* H2S * VP* URE
TSI Alc/A: Agar hierro triple azcar, Alcalino/cido H2S: Sulfuro de Hidrogeno RM: Rojo de Metilo VP: Voges Proskauer IND: Indol CIT: Citrato de Simmons URE: Ureasa (Caldo urea) MOV: Movilidad N (negritas y subrayado): Reacciones Clave
Despus de realizar las pruebas necesarias se pudo determinar la presencia de Enterobacterias en las muestras del agua recolectadas en uno de los dispensadores de la Rectora de la UAM que est localizado en la caseta de vigilancia de la entrada principal y en base a la identificacin bioqumica las posibles bacterias presentes en dicha muestra podran ser: Shigella, Grupos A, B, C Shigella, S. Sonnei Edwarsiella, E. Tarda Salmonelleae Citrobacter, C. Koseri Hafnia, H. Alves Pantoea, P. Agglomerans Serratia, S. Marcescens Proteus, P. Vulgaris Proteus, P. Miriabilis Morganello, M. Morganii Providencia, P. Rettgeri Providencia, P. Stuartii Providencia, P. AlcalifaciensEs importante resaltar que le objetivo de esta investigacin es solo evidenciar la presencia de las Enterobacterias, ya que si se desea especificar cul es el organismo presente en dichas muestras se tendra que proceder a realizar las pruebas especficas correspondientes.
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
PRACTICA DE LABORATORIO.
lvarez Romn Thania SarahiAroz Vsquez AlbertoCorrales Andrade Tania GabrielaNavarrete Gonzlez Diana AlejandraValerio Ordua Sofa Lizeth
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
Resultados Para estas sesiones se trabaj nicamente con las muestras de agua de los bebederos de la UAM-Xochimilco, ya que los bebederos de la UAM-Iztapalapa se encontraban sin servicio.Primera SesinPreparacin de las muestras y cultivo en un medio selectivoI. Preparacin de la zona estril para trabajo microbiolgico II. Cultivo de la muestra de agua en el medio MacConkey III. Manejo de material contaminado
En la primera sesin se realiz los cultivos de las muestras de agua de los bebederos de la UAM-X, y se realiz la dilucin 1:10 en agua en los tubos de ensayo. Se hizo la siembra y diluciones en medio MacConkey por estra cruzada, las muestras se sembraron por duplicado y se dej incubar a 37 durante 24 horas.
Segunda SesinAislamiento y observacin de las caractersticas macroscpicas y microscpicas de enterobacterias I. Solucin de las colonias desarrolladas en el agar MacConkey II. Resiembra de las colonias desarrolladas de agar en MacConkey para obtener cultivo puro de bacterias III. Observacin microscpica de los cultivos seleccionados
En esta sesin no hubo desarrollo de colonias en 24 horas, de los medio de cultivo MacConkey de las muestras de agua de los bebederos de la UAM-X.Realizamos la identificacin de colonias en medios de cultivo del agua de los bebederos de Rectora.Se realiz la observacin macroscpica de la morfologa de las colonias seleccionadas del agar MacConkey
Se realiz de igual modo la resiembra de las colonias seleccionadas desarrolladoras del agar MacConkey y se hizo la observacin microscpica con la Tincin de Gram.
En este cuadro se muestra que estructura tie cada uno de los colorantes utilizados. ColoranteEstructura que tie
LugolAlmidn, glicgeno, cilios, flagelos.
Verde rpidoCitoplasma, ncleo.
GiemsaGrnulos citoplasmticos, ncleo.
AcetocarmnCromosomas en clulas mitticas
Azul alcianoTeido de estructuras con proporcin de carbohidratos.
Amarillo de MetaniloMicelios y levaduras.
Tabla 1. ResultadosCaractersticas de las bacterias observadasCOLONIA 1RectoraCOLONIA 2Rectora diluido
Morfologa Colonial
FORMAIrregularIrregular
COLORMarrnRoja
ELEVACINPlanaPlana
BORDEErosionadoContinuo
CONSISTENCIAMucosaMucosa
TAMAOMedianaMediana
OPACIDADOpacoOpaco
SUPERFICIELisaLisa
Morfologa Microscpica
Tincin de GramNegativasNegativas
Pruebas Bioqumicas
CATALASAPositivoPositiva
OXIDASAPositivoNegativa
UREANegativaNegativa
GLUCOSANegativaNegativa
LACTOSANegativaNegativa
SACAROSANegativaNegativa
MOVILIDADNegativaNegativa
Ac. SULFHIDRICONegativaNegativa
INDOLNegativaNegativa
ROJO DE METILONegativaNegativa
VOGES PROSKAUERNegativaNegativa
CITRATO DE SIMMONSPositivaNegativa
Tercera SesinPruebas bioqumicas para enterobacterias.I. Pruebas de identificacin bioqumica de los cultivos puros seleccionados.II. Observacin microscpica de los cultivos puros seleccionados.
En la tercera sesin se realizaron las pruebas para la identificacin de las enterobacterias de los cultivos en los tubos de ensayo.Realizamos 7 diferentes pruebas con distintas tcnicas para poder observar posteriormente los resultados, las cuales fueron:
a) Prueba de catalasa:Colocamos sobre el portaobjeto con el asa bacteriolgica una pequea porcin del cultivo puro de las bacterias del medio Mac- Conkey y despus agregamos una gotita de agua oxigenada sobre la muestra, las muestras resultaron positivas, liberaron oxgeno.
b) Prueba de oxidasa:Con el asa bacteriolgica colocamos una porcin del cultivo puro y lo extendimos sobre el papel filtro. Le agregamos 2 gotas de reactivo. Las bacterias resultaron positivas para la muestra de rectora y se hizo lo mismo con las muestras de rectora diluida (1:10) y sus resultados fueron negativos.
c) Prueba Voges-Proskauer / Rojo de metilo:Con el asa bacteriolgica tomamos un inoculo denso del cultivo y lo suspendimos en el tubo de caldo. Las dos muestras resultaron negativas.
d) Citrato de Simmons:Con el asa bacteriolgica tomamos un inoculo ligero del cultivo y lo sembramos en forma de estra abierta. Se sembraron dos muestras una de rectora diluida (1:10) y la otra fue de rectora no diluida. La muestra de rectora diluida resulto negativa y La muestra de rectora no diluida resulto positiva.
e) IndolCon el asa bacteriolgica colectamos un inoculo denso del cultivo y lo sembramos por picaduras en el medio SIM a 3 mm del fondo del tubo. Las dos muestras resultaros negativas.
f) Caldo ureaCon el asa bacteriolgica colocamos un inoculo poco denso del cultivo y los sembramos den el caldo urea. Las dos muestras resultaron negativas.
g) Agar hierro triple azcar
inoculo poco denso del cultivo y lo sembramos por picadura en el fondo y en forma de estra por la superficie. Las dos muestras resultaron negativas.
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
REPORTE DE LABORATORIO
Por: Cruz Hernndez BrendaDimas Guzmn CristianHernndez Acosta Juan CarlosJernimo Hernndez EduardoVentura Maqueda Diana
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
INTRODUCCINLa microbiologa se ocupa generalmente de organismos tan pequeos que no pueden ser vistos a simple vista por el ojo humano. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el microscopio tiene una importancia crucial; la mayor parte de los conocimientos sobre los microorganismos se han descubierto con microscopio.[footnoteRef:1]. [1: Lansing M. Prescott, John P. Harley, Donald A. Klein, Microbiologa, quinta edicin, editorial Mc Graw Hill, 2014, pgina 19.]
La mayora de microorganismos patgenos presentan caractersticas fsico-qumicas, estas caractersticas son importantes para la deteccin de estos microorganismos. Los mtodos empleados en el laboratorio son los siguientes 1. preparacin de las muestras y cultivo en un medio selectivo, 2. Aislamiento y observacin de las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las enterobacterias, 3. Pruebas bioqumicas para enterobacterias, 4. Identificacin de las enterobacterias.Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae son los aislamientos bacterianos recuperados con ms frecuencia de muestra clnicas;[footnoteRef:2] como alumnos del rea de ciencias biolgicas y de la salud, es imprescindible que estemos familiarizados con la teora y prctica que implica el proceso de aislamiento e identificacin de enterobacterias. [2: Koneman et al., 1999, p. 172]
OBJETIVO GENERAL-Identificar enterobacterias a partir de su morfologa y pruebas bioqumicas especficas.OBJETIVOS PARTICULARES.-Aprender a sembrar por tcnica de estra cruzada para obtener colonias aisladas.-Identificar caractersticas morfolgicas, macroscpicas y microscpicas de las colonias aisladas.-Obtener cultivos puros mediante el resembrado de colonias aisladas.-Conocer los fundamentos tericos de las pruebas bioqumicas con la finalidad de realizar una lectura apropiada de stas, as como contar con la tcnica adecuada para realizar las pruebas seleccionadas de identificacin de enterobacterias.
MARCO TERICO.Preparacin y tincin de las muestrasAunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio ptico, a menudo hay que fijarlos y teirlos para aumentar la resolucin y acentuar las caractersticas morfolgicas para su estudio en el futuro.FijacinLas clulas teidas que se observan en el microscopio deben parecerse lo ms posible a las clulas vivas. La fijacin es un proceso por el cual se conservan y fijan en su posicin las estructuras internas y externas de las clulas de los microorganismos.Colorantes y tincin simple:Los numerosos tipos de colorantes empleados para teir microorganismos poseen dos caractersticas en comn: 1. Todos poseen grupos cromfobos (grupos con dobles enlaces conjugados que dan el color al colorante), 2. Pueden unirse a las clulas mediante enlaces inicos, covalentes o hidrfobos. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a estructuras cargadas negativamente de la clula. Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases generales tomando como base la naturaleza de su grupo cargado. Colorante bsico: Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta, safranina, verde malaquita. Colorante cido: Eosina, rosa de bengala y fucsina cida. Tincin diferencial.Los mtodos de tincin diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes segn sus propiedades de tincin. La tincin de Gram, desarrollada por el mdico Dans Christian Gram, en 1884, es el mtodo de tincin ms ampliamente utilizado en bacteriologa. Se trata de un mtodo de tincin diferencial porque divide a las bacterias en dos clases. Gram negativas Gram positivas
Agar MacConkeyExisten numerosos medios de cultivo con cualidades y usos distintos, en esta prctica, por las razones expuestas a continuacin, se usar el Agar MacConkey, el cual es un medio de cultivo selectivo para el aislamiento, recuperacin y diferenciacin de Enterobacteriaceae. Por su contenido de sales biliares y cristal violeta resulta inhibitoria de bacterias Gram-positivo y de algunas bacterias Gram-negativas exigentes; pues tales sales son secretadas al intestino para la digestin de lpidos, siendo as un medio propicio para enterobacterias. Contiene, adems, lactosa como nica fuente de carbono; fermentadores fuertes de lactosa, como Escherichia, Kleibsiella y Enterobacter, producen colonias rojas; fermentadores lentos, como Citrobacter, Providencia, Serratia y Hafnia, pueden aparecer sin color despus de 24h o rosa plido en 24-48h; Proteus, Edwarsiella, Salmonela y Shigella, producen colonias transparentes, al no fermentar lactosa.[footnoteRef:3] [3: Koneman et al., 1999]
Pruebas bioqumicas para identificacin de EnterobacteriaceaeEn base a las caractersticas macroscpicas observadas en medios de cultivo y a la tincin de Gram, se puede hacer una identificacin primaria de las caractersticas morfolgicas de las colonias sembradas. Sin embargo, una identificacin concluyente se basar en la presencia o ausencia de diferentes enzimas, las cuales dirigen el metabolismo de las bacterias a lo largo de uno o ms caminos que pueden ser detectados por medios especiales usados en las tcnicas de cultivo in vitro[footnoteRef:4] Tales medios son las pruebas bioqumicas, sustratos con indicadores sobre los cuales reaccionan estas enzimas, dependiendo de la enzima a detectar ser la prueba aplicada; gracias a esto se puede determinar un perfil bioqumico que permitir hacer una clasificacin de la especie bacteriana. Las pruebas Utilizadas en la presente prctica son.[footnoteRef:5] [4: Koneman et al. 1999, p 173] [5: Bustos at al. 2007.]
Prueba catalasa: Detecta la enzima catalasa con el uso de HO que se descompone en oxgeno y agua; por lo que hay desprendimiento de burbujas. Prueba oxidasa: Detecta la enzima citocromo oxidasa, que se encuentra en organismos anaerobios y anaerobios facultativos. Voges-Proskauer/Rojo de Metilo: Mide la conversin de acetona en diactilo; identifica la produccin de cidos fuertes a partir de glucosa. Citrato de Simmons: Detecta microorganismos que utilizan citrato de sodio como nica fuente de carbono. SIM: Sirve para detectar la presencia de la enzima triptofanasa a partir de la produccin de indol; detecta movimiento bacteriano; identifica la liberacin de azufre en forma de HS. Caldo urea: Detecta la enzima ureasa a partir de la liberacin de amoniaco. Kliger (TSI): Determina el tipo de azcares que fermenta la bacteria.
METODOLOGAPara llevar a cabo la prctica es necesario tener contemplados varios aspectos como lo son:-Materiales y mesa de trabajo en perfecto orden y limpieza.-Utilizacin de bata, guantes y cubrebocas.-Entender perfectamente la metodologa de la prctica para obtener resultados y conclusiones adecuadas y verdicas (una forma para evitar el olvido de algn rubro es mediante la realizacin de una bitcora, en la que por cada sesin se escribir el nombre de la prctica a realizar; precauciones; materiales; metodologa y as, tambin, alguna recomendacin).
PRIMERA SESIN: Sembrado en Agar MacConkey1. Esterilizacin: esterilizacin de rea de trabajo2. Cultivo de la muestra de agua de los bebederos de la UAM Cuajimalpa y UAM Lerma En la primera sesin se procede a cultivar muestras de agua en el agar MacConkey; la muestra HO 1 la obtuvimos de los bebederos de la UAM Cuajimalpa, la muestra HO 2 se obtuvo de los garrafones de la UAM Lerma.
Se procedi a cultivar las muestras de agua, de las cuales se hicieron 2 cultivos de cada uno de los bebederos (uno diluido y otro sin diluir), en total se hicieron 10 cultivos de cada una de las unidades de la UAM.La manera de cultivar las muestras fue la siguiente: 1) Se esteriliz el asa bacteriolgica al rojo vivo en la flama del mechero y para enfriar se sumergi en el agar (sto se realiz cada vez que se iba a hacer un cultivo). 2) Se toma la muestra de agua con el asa y se procede a estriar la misma en el agar. 3) Cada agar se sell con un pedazo de masking y se etiquet con los datos solicitados. 4) Las muestras se llevaron a la estufa para dejarlas incubar.
SEGUNDA SESIN: Tincin de Gram y Resembrado.1. Seleccin de colonias desarrolladas de agar MacConkey2. Resiembra de las colonias desarrolladas en agar MacConkey para obtener cultivo puro de bacterias.3. Observacin microscpica de los cultivos seleccionados por Tincin de Gram.
24 horas despus de la siembra de las muestras de agua de los bebederos de las unidades Lerma y Cuajimalpa de la UAM en el agar MacConkey, no se present desarrollo de las bacterias.Debido a sto, para realizar la resiembra de las colonias, se tuvo que pedir muestras en las cuales s hubo desarrollo de las colonias de bacterias (agua del ro Lerma).Se resembraron las colonias que tenan las siguientes caractersticas: 1) Colonias rojas; 2) Colonias rosadas y 3) Colonias blancas. Se dividi un nuevo agar MacConkey en 3 secciones y en cada uno se resembr cada una de las colonias.Para resembrar la colonia se esteriliz el asa bacteriolgica al rojo vivo y para enfriarla se sumergi en el agar, seguido de sto se colecto la colonia y se deposit en la seccin que le corresponda en el nuevo agar (esto se realiz para cada una de las resiembras). Al finalizar la resiembra se sellaron los agar con masking y se llevaron a la estufa para la incubacin.
Para preparar el frotis se lavaron (con agua y jabn) y desengrasaron (con gotas de alcohol-acetona) los portaobjetos, para que no resulte difcil la observacin de las bacterias.Se coloc una gotita de SSI en el portaobjetos seguido de una pequea porcin del cultivo que fue resembrado y se mezclaron hasta quedar una mezcla homognea, se extendi la muestra hasta quedar una fina capa y se fij pasando el portaobjetos por la flama del mechero (a una altura hasta donde fuera soportable el calor al dorso de la mano).Para realizar la tincin de Gram, se cubri el frotis con cristal violeta durante 1 minuto, pasado el minuto se lav con lugol y posteriormente se elimin el exceso de lugol con agua, seguido, se dej resbalar alcohol-acetona hasta que no se desprendiera el color y se lav inmediatamente con agua, finalmente se coloc una gota de safranina a la preparacin (durante un minuto) y se lav, se dej secar perfectamente y se observ el resultado en el microscopio.
TERCERA SESIN: Pruebas bioqumicas para enterobacteriasPruebas de identificacin bioqumica de los cultivos puros seleccionados Prueba Catalasa: Procedimiento.1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur2. Suspender la bacteria3. Detectar la formacin de burbujasPrueba Oxidasa: Procedimiento.1. Poner un trozo de papel de filtro sobre un portaobjetos.2. Depositar una porcin del cultivo y extenderlo sobre el papel filtro 3. Aadir 2 gota del reactivo de oxidasa.
Siembra en medios para pruebas bioqumicas:1. Siembra en TSI (medio inclinado color anaranjado) Con el asa bacteriolgica se toma un inoculo ligero del cultivo puro y se siembra en forma de una estra abierta sobre el rea inclinada del medio y se deja incubar.2. Siembra en caldo urea (caldo de color rosa): Con el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro , se suspende en el caldo y se agita el asa dentro de este. Dejar incubar el tubo.3. Siembra en Citrato de Simmons (Medio inclinado color verde): Con el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro y simbralo en forma de una estra abierta sobre el rea inclinada del medio y dejar incubar.4. Siembra en caldo semislido de SIM (color ambar): Con el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero de cultivo puro y sembrarlo por picadura en el caldo semislido y dejar incubar el tubo.5. Siembra en caldo Voges Proskauer/Rojo de metilo (Color ambar): Con el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro, suspenderlo en el caldo y agitar el asa dentro de este. Dejar incubar el tubo En la tercer sesin pudimos observar el re-aislamiento satisfactorio de las colonias de las muestras del ro Lerma, se procedi a realizar las pruebas bioqumicas ya enlistadas para as conocer caractersticas enzimticas de las colonias aisladas.En relacin a las muestras de las unidades Cuajimalpa y Lerma de la UAM, nuevamente no hubo desarrollo de bacterias 48 horas despus del cultivo.CUARTA SESIN: Lectura de pruebas bioqumicas1. Interpretacin de las pruebas de identificacin bioqumica: determinar los resultados de las pruebas bioqumicas para saber el metabolismo de la bacteria identificada y as saber su familia y especie2. Manejo de material contaminado
COLONIA 1COLONIA 2
MORFOLOGIA COLONIAL
FORMALOBULADOONDULADO
COLORBLANCAROJO
ELEVACIONPLANAPLANA
BORDEINDEFINIDOBLANCO DELGADO
CONSISTENCIAVISCOSAVISCOSA
TAMAOGRANDEGRANDE
OPACIDADOPACO-------------
SUPERFICIEIRREGULARIRREGULAR
MORFOLOGA MICROSCPICA
TINCIN GRAMNEGATIVANEGATIVA
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASAPositivaPositiva
OXIDASA Positiva Negativa
UREAPositivaPositiva
TSI (hierro triple azcar)PositivaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).
MOVILIDADPositivaPositiva
Ac. SULFHIDRICONegativaNegativa
INDOLPositivaPositiva
ROJO DE METILONegativaNegativa
VOGES PROSKAEURNegativaNegativa
CITRATO DE SIMMONSPositivaPresenta crecimiento con ligero cambio de coloracin hacia un tono azul verdosoPositivaPresenta ligero crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intenso
COLONIA 3
MORFOLOGIA COLONIAL
FORMA LOBULADO
COLORROSA
ELEVACIONCONVEXA
BORDEIRREGULAR
CONSISTENCIAVISCOSA
TAMAOMEDIANA
OPACIDADSI
SUPERFICIEIRREGULAR
MORFOLOGA MICROSCPICA
TINCIN GRAMNEGATIVA
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASAPOSITIVA
OXIDASAPOSITIVA
UREANEGATIVA
GLUCOSAPOSITIVO
LACTOSAPOSITIVO
SACAROSAPOSITIVO
MOVILIDADPOSITIVO
Ac. SULFHIDRICONEGATIVO
INDOLNEGATIVO
ROJO DE METILOPOSITIVO
VOGES PROSKAEURNEGATIVO
CITRATO DE SIMMONSPOSITIVO
TSIGASH2SRMVPINDCITUREMOV
TRIBUTO I:
GNERO :
E.coliAlc/A---- / +
GNERO:ShigellaAlc/A----
Grupos: A,B,C
S.Sonnei
TRIBU 2: EdwarsiellaeAlc/A-
GNERO: Edwarsiella
E.TardaAlc/A--+
TRIBU 3: Salmonelleae
GENERO: Salmonelleae
TRIBU 4: Citrobactereae
GENERO: CitrobacterAlc/A--++ / -
C.freundii
C.koseri
TRIBU 5: Klebsielleae
GENERO: Klebsiella
K.pneumoniae
k.axytoca
GENERO: Enterobacter
E.aerogenes
E.cloacaeAlc/A-- / +-
GENERO: Hafnia
H.alvesAlc/A- / +-- / +- / ++ / -
GENERO: Pantoea
P.agglomeransAlc/A-- / +- +
GENERO: Serratia
S. marcescens
TRIBU 6: ProteeaeAlc/A-++
GENERO: ProteusAlc/A-+ / -++
P. vulgaris+
P.mirabilisAlc/A--++
GENERO: Morganella+
M.morganiiAlc/A---+++
GENERO: ProvidenciaAlc/A---+
P.rettgeriAlc/A--+
P.stuartii+
P.alcalifaciens+
TRIBU 7: YersinieaeAlc/A---+ / -
GENERO: Yersinieae
Y. enterocoliticaAlc/A---+/-
RESULTADOS:
CITRATO DE SIMMONS CRECIMIENTO DE LA BACTERIA OBSERVACIN DE BACILOS A 40xOBSERVACION DE COCOS A 40X CALDO UREAHIERRO TRIPLE AZCAR VP-RM (CRECIMIENTO DE LA BACTERIA)
CALDO SEMISOLIDO SIM RESIEMBRA DEL CULTIVO BACTERIANO