PRACTICA No 6
BALANCE DE FERMENTACIÓN. PARTE 1
1. OBJETIVO
Realizará el balance óxido-reducción durante el proceso de fermentación. Discutirá y
evaluará el significado de dicho balance para la célula microbiana.
2. INTRODUCCIÓN
La palabra fermentación proviene del latín que significa hervir. Éste proceso se remonta
desde la prehistoria, además de la producción de alcohol o bebidas alcohólicas, la
palabra fermentación se aplica a cualquier proceso en el cual los microorganismos
(bacterias, hongos, mohos, levaduras) actúan sobre una gran variedad de sustancias para
conservar la carne, quesos, mantequilla, yogur, etc. Se utiliza asimismo en la
producción de antibióticos, vitaminas y muchos materiales químicos importantes para la
industria. El primer investigador que estudió este proceso fue L. J. Thenard en 1803en
donde observó que la fermentación se debía a las levaduras. Más tarde en 1878, Wilhem
Kuhne dio nombre de enzimas a los fermentos que catalizaban la reacción.
Posteriormente en 1856 Louis Pasteur estudió la pasteurización de vinos y cervezas
como medio para evitar la descomposición y en 1897 Hans y Edward Buchner
estudiaron la fermentación de los carbohidratos en extractos libres de células. En
presencia de oxígeno, aumenta la respiración y disminuye la fermentación; sucediendo
lo contrario en procesos de anaerobiosis, a éste efecto se le llama Efecto Pasteur.
Cuando las levaduras actúan para convertir los carbohidratos en etanol, usan
básicamente las mismas reacciones de la glucólisis, la principal diferencia es el modo
como metabolizan el ácido pirúvico, al cual descarboxilan formando acetaldehído y
requiriendo Mg+2
y pirofosfato de tiamina en la célula. Posteriormente el acetaldehído
es reducido por una deshidrogenasa alcohólica que utiliza NADH + H+ como coenzima
formando etanol. Los balances estequiométricos en procesos de fermentación son
esenciales para su entendimiento y/o aplicación. El cálculo de flujos metabólicos resulta
fundamental en los estudios cuantitativos en fisiología celular
3. MATERIAL Y EQUIPO
Agitador mecánico
Balanza granataria
Baño maría
Bulbos y Pipetas Pasteur
Centrífuga clínica
Centrífuga refrigerada
Gradillas
Jeringas de 1 mililitro de aguja larga
Matraces para la fermentación
Matraces volumétricos de 10 y 100 mililitros
Mecheros tipo Fisher
Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros
Probetas de 25 y 100 mililitros
Parafilm
Tapones de hule
Tubos de ensayo de 16 por 150 mm
Material biológico: Levadura comercial (Saccharomyces cerevisiae)
4. REACTIVOS
Ácido tricloroacético al 10%
Agua destilada
Glucosa 2 M
Hidróxido de potasio al 10%
Cloruro de Bario al 5%
Regulador de fosfatos de 50 mM pH 6.8
Suspensión de levaduras al 30% v/v
5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
OBTENCIÓN DE LA SUSPENSIÓN CELULAR.
1. Resuspender tres gramos de levadura en 10 mililitros de medio YPG e incubar 30
minutos a 28°C.
2. Las células se lavan de 6 a 8 veces con agua destilada por centrifugación y se
recupera el paquete celular que se resuspende en el regulador de fosfatos hasta
obtener una concentración final del 30% v/v.
PROCESO DE FERMENTACIÓN.
1. En un matraz de 50 ml, se colocan 24 ml de suspensión celular y 12 ml de regulador
de fosfatos (véase la tabla indicada) y se realiza una conexión como se muestra en la
figura de abajo, los matraces deben estar conectados herméticamente durante 5
minutos a 32°C.
CONDICIÓN
48 ml de suspensión celular sin glucosa
48 ml de suspensión celular con Glucosa 2
M
48 ml de suspensión celular con Glucosa 2
M con 1 mililitro de solución de cloruro de
mercurio 100 mM
Suspensión de levadura
Solución de Cloruro de Bario
48 ml de suspensión celular con Glucosa 2
M con 1 mililitro de solución de fluoruro de
sodio 100 mM
2. Después de los cinco minutos de incubación, se inyecta 12 mililitros de solución de
glucosa 2 M y se incuban a la misma temperatura.
3. Después de 30 minutos el proceso de fermentación se detiene agregando a la mezcla
se mezcla 600 microlitros de ácido tricloroacético concentrado y se continúa la
incubación 15 minutos más.
4. Checar el pH de la solución y si es necesario neutralice con KOH al 10% y se lleva
a un volumen final de 100 mililitros con agua destilada.
USE MATRACES VOLUMÉTRICOS O AFORADOS
A partir de ésta mezcla de fermentación recuperada (muestra fermentada) se determina
ETANOL Y GLUCOSA RESIDUAL de la siguiente práctica.
6. INFORME
Mencione otros tipos de fermentación
Como realizaría Usted un proceso fermentativo a nivel industrial
Cuál es la enzima ausente en el ser humano que metaboliza el ácido pirúvico a acetaldehído
7. BIBLIOGRAFÍA
J. Hicks, J. Bioquímica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. México, D. F.
Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed.
Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214
Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism.
Academia Press London. pp. 72-74
PRACTICA No. 7
BALANCE DE FERMENTACIÓN. PARTE 2
1. OBJETIVO
Determinará la cuantificación de etanol y bióxido de carbono producidos en el proceso
cuantitativo de la fermentación con los productos obtenidos de la sesión anterior
1. INTRODUCCIÓN
Dos productos resultantes en el proceso de la fermentación son el alcohol etílico y el
bióxido de carbono. La medición del contenido de alcohol es de capital importancia en el
proceso de elaboración de vinos debido fundamentalmente a dos motivos. Normalizar el
producto en cuanto a sus características y sus componentes indicada en la etiqueta y el
origen fiscal, ya que el vino, como toda bebida alcohólica, está sujeto a pago de impuesto y
por tanto el fabricante debe ser cuidadoso en el manejo de este componente para evitar
sufrir penalizaciones. Sin embargo, debe tenerse en consideración que en elaboraciones
artesanales y principalmente en las caseras, la determinación de alcohol resulta de menor
importancia que en las elaboraciones industriales y sólo estará en función de la legislación
establecida en cada país.
Existe un buen número de metodologías diseñadas para la medición de alcohol (etanol) en
el vino tradicional y en el vino de frutas, pero la principal y más universalmente extendida
es la técnica densimétrica. Ésta se basa en la determinación de la densidad de una solución
hidroalcohólica obtenida previamente por destilación del vino. La densidad puede ser
medida a través de diversos instrumentos que el analista seleccionará según su
conveniencia. Entre ellos están el hidrómetro, alcoholímetro, picnómetro y el ebullómetro.
Hay otras metodologías para la determinación de alcohol como la cromatografía gas
líquido, la enzimática donde el etanol se puede oxidar a acetaldehído por el NAD en
presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) para producir NADH. El NADH
producido se determina espectrofotométricamente a 334, 340 o 360 nm dependiendo de la
concentración de etanol. Otra metodología es utilizando bicromato de potasio donde el
etanol lo reduce a acetaldehído y posteriormente a ácido acético reduciendo el cromo VI a
cromo III determinándolo espectrofotométricamente. El bióxido de carbono se puede
determinar volumétricamente y gravimétricamente usando reacciones de precipitación a
carbonatos insolubles.
3. MATERIAL Y EQUIPO
Agitador mecánico
Balanza analítica
Balanza granataria
Baño maría
Bulbos y pipetas Pasteur
Bomba de vacío
Cajas Conway y placas de vidrio
Centrífuga clínica
Centrífuga refrigerada
Desecador
Embudos Buchner
Estufa de 60°C
Espectrofotómetro y celdas para el mismo
Gradillas
Hielo picado
Matraces Erlenmeyer de 125 mililitros
Matraces kitasato de 500 mililitros
Matraces volumétricos de 10 y 100 mililitros
Mecheros tipo Fisher
Papel Whatman No. 1 Desecados
Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros
Probetas de 25 y 100 mililitros
Tubos de ensayo de 16 por 150 mm
Vaselina sólida neutra
4. REACTIVOS
Ácido tricloroacético al 10%
Agua destilada
Agua destilada libre de CO2
Antrona al 0.2% en H2SO4
Solución saturada de Carbonato de potasio
Dicromato de potasio 14 mM en H2SO4 de 46-49%
Etanol absoluto
Etanol a una concentración de 1500 microgramos por mililitro
Glucosa 100 miligramos/ mililitro
5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
DETERMINACIÓN DE ETANOL
El etanol producido se cuantifica por el método de Conway, como se indica a continuación:
En cajas Conway (ver esquema correspondiente), se coloca una cantidad de vaselina sólida
sobre el borde externo y 2 mililitros de solución de K2Cr2O7 en la cámara central.
En la cámara externa se colocan alícuotas de la muestra y se completa a un mililitro con
agua destilada. Se adicionan 2 mililitros de carbonato de potasio saturado y se sella
inmediatamente la tapa.
Se mezcla con ligeros movimientos de inclinación de la caja y se incuba a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
Al término de la incubación se recupera cuantitativamente el Dicromato de potasio y se
afora a 10 mililitros con agua destilada. Se lee absorbencia a 445 nm contra agua destilada.
Se realiza una curva de calibración de 0 a 1500 microgramos de etanol.
DETERMINACIÖN DE GLUCOSA RESIDUAL
Una vez que se retiran las alícuotas para la cuantificación de etanol, parte de la muestra se
centrífuga en tubos Eppendorf de 1.5 mililitros y se rescata el sobrenadante que debe ser
transparente. Después de haber llevado a cabo la dilución conveniente de cada
sobrenadante (según la concentración inicial de glucosa), se pasan diferentes alícuotas a
tubos de ensaye de 16 x 150 mm y se lleva a 1 mililitro con agua destilada. Los tubos se
sumergen en un baño de hielo hasta que adquieran la temperatura del baño y se les adiciona
2 mililitros del reactivo de Antrona fría despacio (¡Cuidado, puede proyectar la mezcla). Se
mantienen los tubos en hielo y para el desarrollo de la reacción colorida, los tubos se
mezclas vigorosamente (Mucha precaución) hasta obtener una solución homogénea y luego
se someten a calentamiento en un baño de agua a ebullición durante 10 minutos. Se dejan
enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 620 nm contra un blanco de
reactivos.
Siguiendo el protocolo anterior, se efectúa una curva de calibración de 0 a 100
microgramos de glucosa, usando una solución tipo de glucosa de 100 microgramos por
mililitro.
DETERMINACIÓN DE CO2 POR GRAVIMETRÍA
La solución de cloruro de bario se filtra al vacío. Se hacen dos lavados de dicho matraz con
agua destilada libre de CO2 y se le agregan a la muestra transferida. El precipitado se lava
con acetona al 50% y luego con acetona pura. El papel con la muestra se deseca en una
estufa a 60°C durante 20 a 24 horas y posteriormente se pesa.
6. RESULTADOS
CURVA TIPO ETANOL
Microgramos de Etanol Absorbancia a 445
nm
0 (1 ml de agua)
Cámara central
(K2Cr2O7)
Vaselina Cámara externa (Muestra, agua y
carbonato saturado)
CÁMARA
CONWAY
VISTA
LATERAL
VISTA
FRONTAL
150 (100 microlitros de
Etanol de 1500 +900
microlitros de agua)
300
600
900
1200
1500
DETERMINACIÓN DE ETANOL FORMADO EN LA FERMENTACIÓN
Muestras Absorbancia a 445 nm
0.1 mililitros de muestra fermentada
0.5 mililitros de muestra fermentada
1 mililitro de muestra fermentada
Estos valores se obtienen al efectuar la lectura de absorbencia contra agua destilada.
CURVA TIPO DE GLUCOSA
Microgramos de glucosa Absorbancia a 620 nm
0
10
20
30
40
50
60
90
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA RESIDUAL DE LA FERMENTACIÓN
Muestras Absorbancia a 620 nm
sobrenadante diluido 1:10
sobrenadante diluido 1:100
sobrenadante diluido 1:1000
sobrenadante diluido 1:10000
sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 1
sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 2
Los valores de absorbencia se obtienen al efectuar la lectura contra un blanco de reactivos.
DETERMINACIÓN DE CO2
Muestras Peso en gramos (g)
Papel filtro
Papel filtro + BaCl2
BaCl2 de fermentación
Papel filtro testigo
Papel filtro + BaCl2 testigo
BaCl2 testigo
Papel filtro + BaCl2 +
Inhibidor 1
BaCl2 Inhibidor 1
Papel filtro + BaCl2 + inhibidor
2
BaCl2 Inhibidor 2
7. CÁLCULOS
Calcule la cantidad de etanol formado en la fermentación (en mg /10 mililitros de muestra)
Calcule la cantidad de azúcar residual y de azúcar fermentado (en mg / 10 mililitros de
muestra)
Calcule la cantidad de CO2 formado a partir del peso de BaCO3 obtenido (en miligramos)
Convierta a unidades molares los miligramos de glucosa fermentada y los miligramos de
productos formados
Haga el balance de carbonos y el balance óxido-reducción
8. INFORME
Discuta y evalúe el significado del balance de fermentación que obtuvo en su equipo sobre
la base de los antecedentes
9. BIBLIOGRAFÍA
J. Hicks, J. Bioquímica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. México, D. F.
Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed.
Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214
Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism.
Academia Press London. pp. 72-74.
PRACTICA No. 8
MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA
(GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 1
1. OBJETIVO
Determinar aminoazúcares por el método de Elson-Morgan y proteínas por el método de
Bradford para el cálculo de la actividad específica de la enzima GlcN-6-P sintasa.
2. INTRODUCCIÓN
La Glucosamina-6-fosfato sintasa (L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa; EC
2.6.1.16; GlcN-6-P sintasa) cataliza el primer paso de la biosíntesis de hexosaminas,
convirtiendo la fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato usando glutamina como donador
de amonio. En eucariotas hay tres reacciones que convierten glucosamina-6-fosfato a
uridina-5-difosfo-N-acetil-D-glucosamina, un precursor de biomacromoléculas que
contienen aminoazúcares en hongos, bacterias y mamíferos tales como glicoproteínas y
quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa y la quitina sintasa catalizan el primer y último
paso de las reacciones para la síntesis de quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa es una
enzima que se ha propuesto como blanco en la quimioterapia antifúngica y como resultado
de éstas investigaciones, numerosos inhibidores de la glucosamina-6-fosfato sintasa han
sido descritos. La actividad de la ruta de las hexosaminas incrementada es importante en los
hongos durante los cambios morfológicos, en la síntesis de quitina y manoproteínas ambos
son esenciales como componentes en la pared celular del hongo y también involucra las
interacciones entre el hongo y su hospedero.
3. MATERIAL Y EQUIPO
Perlas de vidrio
Homogenizador MSK Braun
Centrífuga
Ultracentrífuga
Tubos para centrífuga
Baño metabólico
Pipetas Pasteur
Micropipetas
Tubos de ensayo
Gradillas.
4. REACTIVOS
Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5
Anhídrido acético al 5% (prepararse en el instante)
Solución saturada de bicarbonato de sodio
Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9
P-Dimetilaminobenzaldehído (PDMB)
HCl 0.1 M
Ácido acético glacial
Levadura de panificación
Reactivo de Bradford
Glucosamina 1 mg/ml
BSA 100 mg/ml (albúmina sérica bovina)
5. DESARROLLO
*Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es
la concentración final en el regulador de fosfato
*Reactivo de Ehrlich: por cada tubo necesario para la reacción lleva 25 microlitros de ácido
clorhídrico, 3 mililitros de ácido acético glacial y 0.03 gramos de PDMB.
PREPARACIÓN DE LA FRACCIÓN ENZIMÁTICA.
Se trabajará con tres cultivos de Saccharomyces cerevisiae con dos diferentes
concentraciones de rojo congo 0.001%, 0.01% y 0.1%, además de un control (sin rojo
congo) un día antes de la práctica.
Filtrar por medio del equipo Millipore los medios de cultivo donde se encuentra el hongo y
recuperar las pastillas de cada matraz.
Colocar cada pastilla del hongo en un tubo de vidrio y agregar dos volúmenes de perlas de
vidrio y un volumen determinado de regulador todo bajo condiciones de 4°C (en hielo)
Homogenice por 20 minutos, 2 minutos homogenizando por 30 segundos de descanso.
Recupere el homogenado celular aspirando con una pipeta Pasteur y centrifugarlo a 10,000
rpm durante 10 minutos a 4°C. Recupere el sobrenadante y manténgalo en hielo.
Medir la concentración de proteína y usar esta fracción como fuente de enzima.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD
Microlitros de
proteína Microlitros de agua
Reactivo de
Bradford 1
mililitro a todos los
tubos
Absorbencia a 595
nm
0 100
5 95
10 90
25 75
50 50
75 25
100 0
Problema 1:10
Problema 1:100
Problema 1:1000
CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL MÉTODO DE ELSON-MORGAN
Tomar 300 microlitros de agua y agregue 50 microlitros de anhídrido acético al 5% y 50
microlitros de solución saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar la
muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo.
Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y
hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo.
Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37°C. Leer la
absorbencia de las muestras a 585 nm.
Microgramos de
Glucosamina-6
fosfato
Absorbancia a 585 nm
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
6. RESULTADOS
Haga una gráfica para proteína y otra para la glucosamina de absorbencia contra
concentración para determinarla en la muestra problema.
7. INFORME
Mencione otros métodos para determinar proteína
Mencione algunos inhibidores de la enzima Glucosamina-6-fosfato sintasa y quitina
sintasa.
8. BIBLIOGRAFÍA
J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham.
Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato
amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996,
p 2320-2327
González-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagómez-Castro, Julio-César; Cano-Canchola,
C; López-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical
characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target.
Medical Mycology. 2009, p 1-12
PRACTICA No. 9
MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA
(GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 2
1. OBJETIVO
Determinar la actividad catalítica de una enzima esencial en el metabolismo de eucariotas y
procariotas.
2. MATERIAL Y EQUIPO
Perlas de vidrio
Homogenizador MSK Braun
Centrífuga
Ultracentrífuga
Tubos para centrífuga
Baño metabólico
Pipetas Pasteur
Micropipetas
Tubos de ensayo
Gradillas.
3. REACTIVOS
Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5
Fructosa-6-fosfato 15 mM
L-Glutamina 10 mM
EDTA 1 mM
DTT 1 mM
Anhídrido acético al 5% (prepararse en el instante)
Solución saturada de bicarbonato de sodio
Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9
P-Dimetilaminobenzaldehído
HCl 0.1 M
Ácido acético glacial
Levadura de panificación
Reactivo de Bradford
Glucosamina 1 mg/ml
BSA 100 mg/ml (albúmina sérica bovina)
4. DESARROLLO
Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es la
concentración final en el regulador de fosfato
Reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 1% en HCl 0.1 M en ácido acético
glacial).
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO
En un tubo coloque un mililitro de la mezcla de regulador de fosfato con las
concentraciones indicadas de fructosa-6-P, L-Glutamina, EDTA y DTT y la cantidad de
extracto que contenga una cantidad de proteína de 0.15 a 1.5 mg /ml.
Prepare una adicional que no contenga glutamina, en su lugar agregue regulador de fosfato.
Una vez que agregue el extracto celular incube a 30°C por 30 minutos y luego un minuto en
agua hirviendo para parar la reacción. Enfriar a temperatura ambiente. Medir la cantidad de
Glucosamina-6-fosfato por el método de Elson-Morgan.
MÉTODO DE ELSON-MORGAN
Tome 300 microlitros de la mezcla y agregue 50 microlitros de anhídrido acético al 5% y
50 microlitros de solución saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar
la muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo.
Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y
hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo.
Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37°C. Leer la
absorbancia de las muestras a 585 nm.
5. RESULTADOS
Consultar como se calcula la actividad específica de la enzima y calcúlela para las muestras
problema.
6. BIBLIOGRAFÍA
J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham.
Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato
amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996,
p 2320-2327
González-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagómez-Castro, Julio-César; Cano-Canchola,
C; López-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical
characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target.
Medical Mycology. 2009, p 1-12.
PRACTICA No. 10
ACTIVIDAD PARCIAL DE ORNITINA DESCARBOXILASA EN SEMILLAS
1. OBJETIVO Determinar la actividad de ornitina descarboxilasa de manera parcial en
semillas de frijol germinado.
2. INTRODUCCIÓN La Ornitina descarboxilasa (ODC, E.C. 4. 1. 1. 17) es una enzima
altamente regulada que cataliza el primer paso limitante para la producción de poliaminas, transformando la ornitina a putrescina y
posteriormente a espermidina y espermina. La ODC es una de las enzimas más reguladas en organismos eucariotas, es inducida por
diferentes activadores del crecimiento y suprimida por inhibidores específicos o por mutaciones que inhiben el crecimiento celular y la
transformación. También puede ser inducida por otros estímulos, tales como el tratamiento hipotónico o estímulos que inducen la diferenciación
celular. La ODC es una enzima de alto recambio cuya vida media
usualmente está en el orden de entre algunos minutos a una hora. Este recambio está sujeto a cambios marcados dependiendo de las
condiciones celulares, indicando que su degradación también es regulada. También está regulada la ODC bajo control negativo por las
poliaminas, ya que si son agregadas exógenamente no solo inhiben la síntesis de ODC sino que también provocan un rápido decaimiento en su
actividad. La degradación de la ODC es acelerada por las poliaminas lo cual es confirmado al seguir el decaimiento de la ODC marcada con
anticuerpos. Las poliaminas ejercen dos acciones de supresión en la ODC, una sobre la síntesis de la ODC y la otra sobre la inducción de una
proteína que posee un rápido recambio denominada antienzima, cuya síntesis es inducida por una exposición a un exceso de poliaminas y se
une a la ODC con gran afinidad inhibiendo su actividad. En forma resumida, los tres mecanismos que modulan negativamente a la ODC
por las poliaminas son:
a) Supresión traduccional de la síntesis, b) aceleración de su degradación y c) la inducción de la antienzima.
3. MATERIAL Y EQUIPO
Homogenizador Potter Hielo picado
Pipetas Pasteur Micropipetas
Matraces especiales Tapas para los matraces especiales
Jeringa con aguja
Cuadros de papel filtro Baño metabólico
4. REACTIVOS Regulador de Tris-HCl 100 mM pH 7.5 adicionado con EDTA 1 mM, DTT
2 mM y PLP 0.2 mM Semillas de frijol sin germinar y germinadas
Hidróxido de potasio 5 M Ácido clorhídrico 1 M
Agua destilada libre de CO2 Inhibidores 2 mM
Cloruro de bario al 5% en agua libre de CO2
5. DESARROLLO SE USARAN SEMILLAS GERMINADAS Y SIN GERMINAR
Muela las semillas de una por una en un mortero congelado en presencia de hielo y agregue un determinado volumen de regulador
compuesto de acuerdo a la cantidad de semillas que tenga.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ODC
La actividad de ODC de la muestra se determinó midiendo la liberación de CO2 gravimétricamente usando solución de cloruro de bario para su
cuantificación. Se coloca en matraces Erlenmeyer especiales en su compartimento exterior 200 microlitros de extracto de semilla y 100
microlitros de inhibidor (MGBG, Ornitina, Putrescina y DAB) a una concentración de 6 mM final (deje un matraz sin inhibidor como blanco)
y en el compartimiento interno se coloca un pedazo de papel filtro (1x1.5 cm) impregnado con 45 microlitros de KOH 5M. Se tapa
inmediatamente y se deja incubando a 37°C por 90 minutos. La reacción se detuvo inyectando a través del tapón de hule 100 microlitros de HCl
1 M en el compartimento exterior. PRECAUCIÓN NO TOQUE EL PAPEL FILTRO CON EL HCl. Se dejan incubando toda la noche para permitir que
el CO2 liberado reaccione con el KOH.
DETERMINACIÓN DE CO2 POR GRAVIMETRÍA
La muestra del vaso central que queda después de la fermentación se transfiere cuantitativamente sobre 20 mililitros de BaCl2 al 5%,
contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Se hacen dos lavados de dicho vaso central con agua destilada libre de CO2 y se le
agregan a la muestra transferida. El precipitado de carbonato de bario que se forma por filtración a través
de papel filtro Whatman No. 1 de peso conocido. El precipitado se lava con acetona al 50% y luego con acetona pura.
El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60°C durante 20 a 24
horas y posteriormente se pesa.
6. RESULTADOS
Determinación de CO2
Muestras Peso en
gramos (g)
Papel filtro
Papel filtro + BaCO3 blanco
Papel filtro + BaCO3 inhibidor 1
Papel filtro + BaCO3 inhibidor
2
Papel filtro + BaCO3 inhibidor
3
Papel filtro + BaCO3 inhibidor 4
7. INFORME
A que nivel afectan a la ODC los distintos inhibidores que usó en la práctica.
8. BIBLIOGRAFIA
Arteaga-Nieto, P; López-Romero, E; Terán-Figueroa, Y; Cano-Canchola, C; Luna-Arias, J. P.; Flores-Carreón, A. Entamoeba histolytica:
Purification and characterization of Ornithine decarboxylase. Experimental Parasitology 101 (2002), pp-215-222
Macias-Segoviano, J. I. Papel de las poliaminas en el desarrollo de
Sclerotium cepivorum. Tesis de maestría. 2004.