PRIMERA INVESTIGACIÓN ARGENTINA DE ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES:
Avance en la Identificación Grupal y Desarrollo Metodológico para la Individuación Patológica
BecariaLic. Silvina Edith Bender
DirectoraDra. Raquel Dodelson de Kremer
CEMECOCentro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas
ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP)ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO
Sindrome deZellweger
(SZ)
Adrenoleucodistrofia
Neonatal (ALDN)
Enfermedad de Refsum Infantil
(ERI)
Defectos de la Biogénesis Peroxisomal
Condrodisplasia Rizomélica
Puntata
(CDRP I)
Deficiencias Enzimáticas Aisladas
Pseudo Zellweger
(ALD-X)
AdrenoleucodistrofiaLigada al
Cromosoma X
Enfermedad de Refsum Clasica (ERC)
Pseudo Adrenoleucodistrofia
Hiperoxaluria
(HO)
Deficiencia de Proteína Bifuncional
Deficiencia de AcilCoA-Oxidasa
(DPBF)
(P-SZ)
Acidemia Pipecólica
Neonatal (ALDN)
ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP)
CONSECUENCIA METABÓLICA
-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, ácido pristánico, ácido trihidroxico-lestanoico y cadenas laterales del colesterol
Síntesis de ácidos biliares, plasmalógenos e isoprenoides
α- oxidación del ácido fitánico
Catabolismo de poliaminas, ácido L-pipecólico y H2O2
Metabolismo de glioxilato prostaglandinas, etanol y gluconeogenesis
FUNCIONES PEROXISOMALES
ácidos grasos de cadena muy larga
ácido trihidroxi-colestanoico
ácido pristánico
colesterol
plasmalógenos
ácido fitánico
ácido pipecólico
oxalato
MARCADORES
BIOQUÍMICOS
Integrar los objetivos hacia la “Investigación Trasnlacional”; colaboración entre investigadores clínicos, laboratorios y pacientes para propugnar que los descubrimientos sean translacionales a la práctica asistencial y promover enérgicamente la Investigación Clínica en Genética Médica como herramienta básica para el progreso en el cuidado de la Salud.
OBJETIVOS GENERALES DEL PROYECTO
Continuar con el desarrollo del temario seleccionado en el campo de la Genética Médica-Bioquímica, área de Enfermedades Genéticas Peroxisomales (EGP), graves patologías neurodegenerativas previamente no abordadas en nuestro país.
Contribuir a la difusión y utilización de un centro referencial en el país destinado a la contención del paciente, su familia y la sociedad, tendiente a disminuir el enorme impacto humano y económico que provoca la falta de diagnóstico en estas patologías.
OBJETIVOS ESPECIFICOS DEL PROYECTO
I. Desarrollar la metodología bioquímica diagnóstica, destinada a la definición nosológica exacta de cada una de las entidades del amplio grupo de las EGP (Algoritmo Bioquímico).
II. Estudiar biomarcadores secundarios a las EGP, perfil de ácidos orgánicos urinarios y análisis molecular de polimorfismos, involucrados en la extraordinaria variación fenotípica interfamiliar e intrafamiliar. (focalización: ALD-X)
III. Estandarizar los métodos para la medición de los metabolitos diagnósticos en muestras de sangre impregnadas en papel de filtro. (sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad).
ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTOALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO
EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA
AGCML PLASMÁTICOS
AUMENTADONORMAL
Excluye Defecto de -Oxidación y
DBP
Estudios Histométricos Peroxisomales, Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular
ANORMALNORMAL
Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa
Peroxisomal
PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS
DISMINUÍDO
ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO
Probable Defecto de -Oxidación/ Otras Conrodisplasias
DBP/CDRP
NORMALNORMALAUMENTADO
CDRP Tipo II y Tipo III
Probable Deficiencia de Acil
CoA-Oxidasa
RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO
NORMAL AUMENTADO
Probable DBP
NORMALNORMALAUMENTADO
INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA)
DBP DPBF Tipo BDeficiencia de
Acil CoA-Oxidasa
AUMENTADO
NORMAL
ALD-X
CDRP Tipo I
ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS
ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTOALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO
EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA
AGCML PLASMÁTICOS
AUMENTADONORMAL
Excluye Defecto de -Oxidación y
DBP
Estudios Histométricos Peroxisomales, Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular
ANORMALNORMAL
Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa
Peroxisomal
PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS
DISMINUÍDO
ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO
Probable Defecto de -Oxidación/ Otras Conrodisplasias
DBP/CDRP
NORMALNORMALAUMENTADO
CDRP Tipo II y Tipo III
Probable Deficiencia de Acil
CoA-Oxidasa
RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO
NORMAL AUMENTADO
Probable DBP
NORMALNORMALAUMENTADO
INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA)
DBP DPBF Tipo BDeficiencia de
Acil CoA-Oxidasa
AUMENTADO
NORMAL
ALD-X
CDRP Tipo I
ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS
METODOLOGÍA BIOQUIMICA
Ac. Orgánicos Urinarios (AOU)
Orina 5 ml
Cromatografía Gaseosa Capilar-Ionización a la llama
(CG-FID)
Ac. Grasos de Cadena muy Larga (AGCML)
Ac. Grasos Ramificados (AGR)
Plasma 250 µl
Metabolitos Primarios Biomarcadores Secundarios
METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS MOLECULAR
Polimorfimos del Metabolismo de la Metionina Parámetros no convencionales a las EGP
Sustitución 677C>T de la MTHFR
Inserción 844ins68 de la CBS
Digestión de producto de PCR con enzima de restricción HindI. Electroforesis en gel de poliacrilamida 6% (Frosst 1995)
Separación de productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa 3%. El alelo “wild type” produce un fragmento de 596 pb y la insersión uno de 664 pb. (Urreizti 2003)
5,10-Metilenetetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)
Cistationina Beta-Sintasa (CBS)
Mayor vulnerabilidad desmielinización
Efecto protector desmielinización
INTEGRACIÓN DEL ALGORITMO BIOQUÍMICO A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA
Evaluación Clínica Clasificación Fenotípica de ALD-X
FenotiposMoser HW 1997, 2001
Patrones de Lesión anatómica Loes 2003
Clasificación de RMN en 5 grupos
Severidad de Afectación Loes 1994
Escala de severidad de RMNespecífica
para ALD-X de 0 - 34 puntos
Cerebral Infantil
Cerebral Juvenil
Adrenomieloneuropatía
Cerebral Adulto
Addison Aislado
Asintomático
Portadoras Sintomáticas
Parieto-OccipitalFrontalCortico-EspinalCerebelarParieto-Occipital y Frontal
Definición o aproximación diagnóstica por determinación de AGCML
BN (9 a/M)BML (4 a/F)
BN (14 a/F)BE (11 a/M)
0,941,540,80
ND0,09
12,9115,4813,34
0,68 ND 10,43BI (4 a/M) 1,44 0,06 23,92BM (2 a/M) 1,61 0,05 21,79VG (madre) 1,25 0,02 26,90
0,78NDND0,740,920,51
ND
Valores deReferencia
ALD-X HemicigotaNormal
ALD-X Heterocigota
C24:0 (µg/ml)
0,84 ± 0,08
C24/C22
1,49 ± 0,45 1,09 ± 0,34
C26/C22
0,01 ± 0,01 0,07 ± 0,04 0,03 ± 0,02
13,34 ± 3,78 25,12 ± 4,83 25,43 ± 6,04
C26:0 (µg/ml)
0,22 ± 0,08 1,18 ± 0,53
0,70 ± 0,40
Pacientes
Heterocigota
ADL-X
Hemicigota -CI
Hemicigota- AsintomáticoNo Afectado
Heterocigota
ND
Hemicigota- Asintomático
No Afectado
CI
BMT
Asnt AA AA
Asnt
IB MBEB
Metabolitos Primarios: ALD-X
AGCML y AGCR en plasma
Pacientes sospechados de EGP
Heterocigotas ALD-X
n=3 n=3
AGCML normal
n=70
Hemicigotos ALD-X
Heterocigotas ALD-X
n=13 n=19
Sanos
n=11
Familiares directos de ALD-X
Hemicigotos ALD-X
n=46
EB IB MB
RMN Cerebral Normal RMN Cerebral Normal
EB
RMN Score: 0
RMN patrón : Normal
CI
TMO
Asnt AA AA
Asnt
677CT
677CT 677CT
Extensive involvement of periventricular white matter with temporal extension. Involvement of the splenium and body
Corpus callosum, internal capsule, peduncles and protuberance
parieto-occipital
RMN patrón: 1
RMN Score: 4
IB MBEB
11y 11y 10y 7y
INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA
Familia EB
Marked slimness of the spinal cord. Diffuse atrophy
RMN Cerebral : Normal
OR
OR
41
RMN patrón: 3
MRI Score: 3
10 19
CI
9
10
CIAMN
? Asnt
? ?
?
CI
CI CI Asnt
?
? ? ? ? ? ?
677 CC
OR
Sint SintSint
677 CT 677 CC
INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA
OR
Familia ORTracto corticospinal
Biomarcadores Moleculares Variación Fenotípica inter/intrafamiliar
CBS InsIns
CBS WIns
CBS WW
0
10
85 2 4 2 1
2
63
- - - - - -
- - - - -
Controlesn=95
X-ALD Hemicigotosn=9
CI AA AMN Asnt Sint Asnt
MTHFR 677TT
MTHFR 677CT
MTHFR 677CC
11
45
39
1 2 1
- - - -
1 2 1
-
1
- -
1 3
52
Polimorfismos Estudiados
X-ALD Heterocigotasn=11
Biomarcadores secundarios en EGP, específicamente en ALD-X
Caracterización del perfil de Ácidos Orgánicos Urinarios
≥ 300 metabolitos en corrida cromatográfica
1) lactato, 2) oxalato, 3) piruvato, 4) adipato, 5) p-OH-fenilacetato, 6) 2-cetoglutarato, 7) sebàcico, 8) p-OH-fenillactato, 9)estándar interno, 10) 3-OH sebàcico, 11) 3-6 epoxitetradecanedioico
PERFIL AOU NORMAL
10 20 30 40 50
4000
5000
6000
7000
8000
9000
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
Time (min.)
1
2
3
4
6
7
8
5
9
10
11
10 20 30 40 50
4000
5000
6000
7000
8000
9000
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
Time (min.)
1
2
3
4
6
7
8
5
9
10
11
17 19
6
8
14
13 16
3 5 -15 18 23 24 1 4 7 9 10 20 2- 11-
10 20 30 40 50
5000
5200
5400
5600
5800
6000
6200
Tiempo (min)
1) lactato, 2) oxalato, 3) cresol, 4) piruvato, 5) 3-OH-butirato, 6) gliceraldehído I, 7) 3-OH-isovalerato, 8) gliceraldehído II + urea, 9) fosfato + etilmalonato, 10) succinato, 11) adipato, 12) piroglutamato, 13) m-OH-fenilacetato, 14) p-OH-fenilacetato, 15) 2-cetoglutarato, 16) aconitato, 17) hipurato, 18)citrato, 19) estándar interno, 20) palmitato, 21) oleato, 22) estearato, 23 24) p-OH-hipurato
PERFIL AOU Adrenoleucodistrofia Neonatal
Hipotonía, dismorfias faciales, retraso psicomotor, convulsiones, cliteromegalia y disfunción hepática
Efectuar el diagnóstico o aproximación diagnóstica de EGP en nuestro medio.
Brindar una posta asistencial no disponible con anterioridad y evitar una larga deambulación diagnóstica de la afección en cuestión.
Definir en alta proporción el estado de portadora de ALD-X, entidad de aparente alta prevalencia en nuestra población.
Precisar el asesoramiento genético en las familias involucradas, acorde a los conocimientos científicos actuales.
Brindar el adecuado manejo del paciente, según su específica EGP.
Estimación preliminar de avance del proyecto
El estado de avance de la aplicación del Protocolo Clínico-Bioquímico posibilitó:
CEMECO
Metabolismo H2O2CatalasaAcatalasemia
Acido PipecólicoDegradación de Acido Pipecólico? No identificadaHiperpipecolico
Acidemia(variab)
Metabolismo Glutaril-CoA Glutaril-CoA OxidasaGlutarico Aciduria
III
Acido Oxállico, Glioxílico
Detoxificación Glioxilato
Alaninaglioxilato Aminotransferasa
Hiperoxaluria I
AGCR-Oxidación de Acidos GrasosFitanoil-CoA hidroxilasaER
Alkil-DHAP SintasaPlasmalógenosBiosíntesis de
EtherfosfolípidosDHAPAT
CDRP
RacemasaNeuropatía tardía
Tiolasa IP-SZ
D-Proteína BifuncionalP-SZ/ALDN
Acil-CoA OxidasaP-ALDN
AGCML- Oxidación de Acidos Grasos
PALD X-ALD
FenotipoBioquímico
Función Metabólica Alterada
Enzima/Proteína AfectadaFenotipo Clínico
Deficiencias de una Unica Proteína Peroxisomal (DUP)
A. Defectos de la Biogénesis Peroxisomal (DBP)
Sindrome de Zellweger (SZ)
B. Deficiencias Enzimáticas Aisladas
Condrodisplasia Rizomelica Punctata (RCDP) tipo I
Enfermedad de Refsum Infantil (ERI)
Adrenoleucodistrofia Neonatal (ALDN)
β-Oxidación de Ácidos GrasosAdrenoleucodistrofia Ligada al Cromosoma X (ALD-X)
Deficiencia de Acyl-CoA Oxidasa (ACOX1)
Deficiencia Proteina D-Bifunctional (PDB)Deficiencia Proteina Transportadora de Sterol-X (SCPx)
Deficienciencia 2-Methylacyl-CoA Racemasa (AMACR)Biosintesis Eterfosfolipidos
Deficiencia Dihidroxiacetona fosfato aciltransferasa (DHAPAT) (CDRP Tipo II)Deficiencia Alquil-DHAP sintasa (CDRP Tipo III)
α-Oxidacion de acidos grasosEnfermedad de Refsum (Deficiencia de Fitanoil-CoA hidroxilasa)
Metabolismo del Peróxido de HidrógenoAcatalasaemia (Deficiencia de Catalasa)
Detoxificación del GlioxilatoHyperoxaluria Tipo I (Deficiencia de Alanina Glioxilato Aminotransferasa)
C. Sindrome de Gen Contiguo
Sindrome de Deleción Contigua ABCD1 DXS1357E (CADDS)
PEX 7
Genes Involucrados
GNPAT AGPS
ABCD1
ACOX1
HSD17B4
AMACR
SCP2
PHYH/PAHX
AGXT
CAT
PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 16, PEX 1, PEX 2, PEX 13, PEX 19, PEX 5, PEX 12PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 3, PEX 13, PEX 5, PEX 12PEX 26,PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 5, PEX 12
Genes Involucrados