Red iberoamericana deRed iberoamericana deinvestigación y desarrollo defármacos basados encompuestos metálicos.compuestos metálicos.
Programa CYTED red 209RT0380g
Coordinadora Dra. Dinorah Gambino
Desarrollo de fármacos de base Desarrollo de fármacos de base metálica: Técnicas biológicas demetálica: Técnicas biológicas demetálica: Técnicas biológicas de metálica: Técnicas biológicas de
evaluaciónevaluación
Susana B. Etcheverry
Facultad de Ciencias ExactasUniversidad Nacional de La Plata, Argentina
UNLP
Bioinorganic Chemistry: an interdisciplinary areaarea
Inorganic
Physicochemistry
Inorganic Chemistry Medicine
Organic Chemistry Pharmacology
Bioinorganic ChemistryChemistry
Biochemistry Environmental science
Biology PhysicsAgronomyV t i
science
Biology Physics Veterinary
Formación de complejos metálicosp jActivación/inhibición enzimática y obtención de efectos enzima-miméticosobtención de efectos enzima miméticosMejoramiento de la biodisponibilidadAumento de la estabilidad de la formaAumento de la estabilidad de la forma activa de una drogaDisminución de los efectos colateralesDisminución de los efectos colateralesDisminución de la resistencia hacia una drogadrogaCambio en los efectos farmacológicosObtención de compuestos activos por víaObtención de compuestos activos por vía oral
Usos de la Química Bioinorgánica en Medicina
1. Obtención de drogas para mejorar la homeostasis de los iones en el organismo.
2. Obtener drogas basadas en metales en las cuales elmetal es clave en el mecanismo de acción
Aplicaciones farmacocinéticas
Aplicaciones quimioterapeúticas
Aplicaciones al diagnóstico por imágenesAplicaciones al diagnóstico por imágenes
http://www.ugr.es/~bioinorg/index.html
http://www.ugr.es/~bioinorg/index.html
Selection and/or
Phase ISynthesis and characterizationS l ti t di t bilit
Experimental Scheme
-Selection and/orchemical modificationsof interesting biological
Solution studies: stability determinationsPhysicochemical characterization
ligands or substanceswith pharmacologicalactivity-
Phase IIBioactivityII1. In cell free systems
) ALPy-Bioactivity of free ions,free ligands and thecomplexes in cell
a) ALPb) SOD and catalasec) DNA cleavage-Nuclease activity.
.complexes in cellcultures.
Phase IIBioactivityy
II.2 Screening of bioactivity in cell cultures
Selection and/or chemical
PHASE IChemistry
modifications of interestingbiological ligands orsubstances withpharmacological activity
Phase II.1II.1 Bioactivity studies in Cell Free pharmacological activity-
-Bioactivity of free ions, freeligands and the complexesin cell cultures.
ySystems.
Phase IIBioactivity
II.2 Screening of bioactivity in cell cultures
Cellular proliferation
Selection and/or chemical Phase II
Phase I.ChemistryCOMPLETE EXPERIMENTAL DESIGN
-Selection and/or chemicalmodifications of interestingbiological ligands orsubstances withpharmacological activity-
Phase IIII.1 Bioactivity studies in Cell Free Systems
-Bioactivity of free ions, freeligands and the complexes incell cultures.
Phase II. BioactivityII.2 Screening of bioactivity in cell cultures
O t bl t lif +Cellular proliferation Tumoral cell prolif.-
Antimetastasic capacityOsteoblast prolif.+
Osteoblast differentiation+
Antimetastasic capacity -
Potential antitumoral compoundsCel prolif. +and glucose consumption +
Potential insulinmimetic compounds
ECM mineralization+
Bioactive compounds
Potential osteogenic
Phase III. Toxicity study
Phase IV.Mechanism of action study
Potential osteogenic compounds
In vivo studies
Selection and/or chemical
PHASE IChemistry
modifications of interestingbiological ligands orsubstances withpharmacological activity
Phase II.1II.1 Bioactivity studies in Cell Free pharmacological activity-
-Bioactivity of free ions, freeligands and the complexesin cell cultures.
ySystems.
Phase IIBioactivity
II.2 Screening of bioactivity in cell cultures
Cellular proliferation
CELLULAR PROLIFERTIONCELLULAR PROLIFERTION
Osteoblasts
) 110
120at
ion
(% b
asal
80
90
100MC3T3E1
Cel
l pro
lifer
a
50
60
70 UMR106
TreVO [M]0 20 40 60 80 100 120
40
Barrio DA, Williams PAM, Cortizo AM, Etcheverry SB. J Biol Inorg Chem. 8: 459-469, 2003.
MUERTE CELULARCELULAR
Importancia de la muerte celularImportancia de la muerte celular
La muerte celular juega un roli l l d ll dcrucial para el desarrollo de
plantas y animalesp y
En un humano adulto en buenEn un humano adulto en buenestado de salud, billones decéluulas mueren en médula ósea eintestino cada horaintestino cada hora.
Tipos de muerte celularp
La muerte celular puede ocurrir a t é d d dif ttravés de dos procesos diferentes:
Programados o accidentales
El í ú d lEl mías común de losmecanismos de muerteprogramada es la APOPTOSIS
y
el más común de los mecanismosaccidentales es la NECROSISaccidentales es la NECROSIS
NECROSIS
Necrosis (nuerte celularNecrosis (nuerte celular“accidental”) es un proceso
t ló i d lpatológico que ocurre cuando lascélulas son expuestas a seriospinsultos físicos o químicos
APOPTOSIS
Apoptosis: muerte celular “normalo programada”) es el procesoo programada ) es el procesofisiológico por el cual células nod d útildeseadas o que no son útiles soneliminadas durante el desarrollo yyotros procesos biológicosnormalesnormales
La apoptosis es una forma demuerte celular que estáregulada genéticamenteregulada genéticamente.La muerte celular programada es
t i t l d l d ll d lparte integral del desarrollo de los tejidos tanto de animales como de jplantas pluricelulares
Diferencias entre Necrosis y Apoptosis
Características morfológicas
Características bioquímicas
C í
Características bioquímicas
Características moleculares
Características morfológicasNecrosis
Pérdida de la integridad de la membrana celular
Comienza con hinchazón del
membrana celular
Comienza con hinchazón delcitoplasma y las mitocondriasFinaliza con lisis celular totalFinaliza con lisis celular totalDisintegración de organelasInvolucra células vecinas y macrófagosInvolucra células vecinas y macrófagos, generando una respuesta inflamatoria
Micrografía electrónica de una célula ótinecrótica
Muerte celular programadaMuerte celular programada
La muerte celular programada es parteLa muerte celular programada es parteintegral del desarrollo de los tejidostanto de plantas como de animalestanto de plantas como de animalespluricelulares
Nematode Caenorhabditis elegansg
Estudios genéticos queEstudios genéticos queidentificaron los primerosgenes de muerte celulargenes de muerte celularprogramada
Apoptosis“Burbujas” de la membrana celular“Burbujas” de la membrana celular,
pero sin pérdida de la integridad-Agregación de la cromatina en lamembrana nuclearmembrana nuclear-Finaliza con fragmentación celular enpequeños cuerpospequeños cuerpos-Formación de vesículas unidas amembrana (cuerpos apoptóticos)membrana (cuerpos apoptóticos)-Las mitocondrias se tornan permeablesdebido a la formación de porosdebido a la formación de porosinvolucrando a proteínas de la familia bcl-2
Células apoptóticas
Glóbulo blanco Glóbulo blanco en apoptosis
Nuclear
Membrane blebs
Nuclear
fragments
Apoptotic bodies
Etcheverry SB, Ferrer EG, Naso L, Rivadeneira J, Salinas V,Etcheverry SB, Ferrer EG, Naso L, Rivadeneira J, Salinas V, Williams PAM. J Biol Inorg Chem 13: 435-447, 2008
Células apoptóticas
Alteración del citoesqueleto
Rivadeneira J, Di Virgilio AL, Barrio DA, Muglia CI, Bruzzone L, Etcheverry SB. Med Chem 6: 9-23, 2010
Procesos apoptóticos
Desarrollo del i d tópie de ratón
Metamorfosis fibien anfibios
Desaeeollo de pie de ave
Cada día, en cualquiera denosotros, se produce el suicidiode alrededor de 10 mil millonesde alrededor de 10 mil millonesde células por apoptosis, siendo
t i l lesto necesario para el normaldesarrollo del organismog
Cuando una célula muere porapoptosis empaqueta suapoptosis, empaqueta sucontenido citoplasmático, loque evita que se produzca larespuesta inflamatoriarespuesta inflamatoriacaracterística de la muerte
id t l iaccidental o necrosis.
Cambios bioquímicos y moleculares de la apoptosis
Clivage del ADN cromosómico en grandes fragmentosen grandes fragmentos Cambios en la membrana
l á i ( li ió dplasmática (externalización de fosfatidilserina))Pérdida del potencial demembrana mitocondrialmembrana mitocondrial
APOPTOSIS y NECROSISAPOPTOSIS y NECROSIS
Molinuelo MS, Barrio DA, Cortizo AM, Etcheverry SB. Cancer Chemother Pharmacol 53: 163-172, 2004.
Potencial de membranamitocondrial
Permite que ciertas siondas fluorescentescon alta afinidad por las mitocondriascon alta afinidad por las mitocondriasmetabólicamente activas sean capaces deretener esos colorantes mostrando altaretener esos colorantes mostrando altaintensidad de fluorescencia. Lasmitocondrias de células apoptóticasmitocondrias de células apoptóticasretienen menos esas sondas y disminuyela intensidad de fluorescenciala intensidad de fluorescencia,
REGULACION DE LA APOPTOSIS
APOPTOSISAPOPTOSIS
Vía extrínseca
Vía intrínseca
La vía apoptótica extrínseca activa receptores de membranaactiva receptores de membrana tales como:FasFasTNFPorinas
La vía intrínseca está mediada por eventos mitocondriales
ELMORE 2007 Toxicologic Pathology
Para ambas vías laPara ambas vías laapoptosis depende de unacascada proteolíticaintracelular que es mediadaintracelular que es mediadapor caspasas
CASPASASCASPASAS
Las caspasas son una familia deproteasas q e tiene cisteína enproteasas que tiene cisteína ensu sitio activo y clivan proteínasy pespecíficas en sitiosdeterminados que poseen ácidodeterminados que poseen ácidoaspártico
ACTIVACION DE CASPASAS
PROCASPASAS
Las caspasas se sintetizan enLas caspasas se sintetizan entodas las células comoprec rsores inacti as oprecursores inactivas oprocaspasas, las que seactivan por clivajeproteolíticoproteolítico
Activación de Caspasaprocaspasa por clivaje activa
Subunid.grande Subunid.
Peq.
Sitios declivaje ClivajeClivaje
C
Procaspasai ti
Caspasaactiva
Prodominiosinactiva
Cascada de las Una moléculade las caspasas
de caspasa iniciadora activa
Muchas moléculas de caspasas ejecutoras
Clivaje de prot. del citoesqueleto Prot. nucleares
Targets de caspasas ejecutoras ti dactivadas
Di ersas proteínas o estr ct ras cel laresDiversas proteínas o estructuras celularestales como:
Proteínas nucleares
DNA-depending enzyme o endonucleasa, queal activarse cliva el DNA nuclear
Componentes del citoesqueleto y de lasproteínas de adhesión que vincula a cadaproteínas de adhesión que vincula a cadacélula con sus vecinas
Caspasas humanasInvolucradas en la inflamación
Caspasa 1 (ICE), 4, 5
Involucradas en apoptosisInvolucradas en apoptosis
Caspasas iniciadoras (2 8 9 10) Caspasas iniciadoras (2,8,9,10)
Caspasas ejecutoras (3, 6, 7)
Inicio de la apotosis
En todas las células, la maquinaria de las qcaspassas está siempre lista para actuar. Sólo se requiere un disparador del q pproceso.Cómo se activa la primera procaspasa?p p pLas caspasas iniciadoras presentan un gran prodominio que contiene un gdominio reclutador de caspasas (CARD)
Ese dominio CARD les permiteEse dominio CARD les permiteunirse a proteínas adaptadoras yforma un complejo activo cuandoforma un complejo activo cuandola célula recibe un estímulo
tótiapoptótico.Una vez en el complejo, lascaspasas iniciadoras están muypróximas unas de otras y lo quep y qes suficiente para activarlas. Ellasse clivan unas a otras y el procesose clivan unas a otras y el procesose torna irreversible
INHIBIDORES DE LA VÍA EXTRÍNSECAINHIBIDORES DE LA VÍA EXTRÍNSECA
Muchas células producen proteínasinhibitorias que pueden actuarq pintracelularmente o extracelularmenetepara restringir la vía extrínsecap g
Receptores decoydecoy de superficie: tienenun dominio de unión al ligando pero notienen un dominio de muerte
Los decoy pueden unir el ligandoLos decoy pueden unir el ligandopero no pueden activar la muertecelular Por eso son inhibidorescelular. Por eso son inhibidorescompetitivos de muerte celular
Vía intrínseca de apoptosisVía intrínseca de apoptosis
Depende de las mitocondrias
Vía intrínsecaVía intrínseca
Las células activan la apoptosisdesde adentro de las células.
Es respuesta a injuria, daño en elADN, falta de oxígeno, denutrientes o de señales denutrientes o de señales desupervivencia extracelulares
Vía intrínsecaVía intrínseca
Se activa por alteración de la membranaSe activa por alteración de la membranamitocondrial y liberación al citosol deproteínas u otros compuestosproteínas u otros compuestosmitocondriales, por ej el citocromo C, queactivan intrínsecamente la cascadaactivan intrínsecamente la cascadaproteolítica de caspasas
Vía intrínseca
Cuando el citocromo C se libera al citosolbi f ió l t tcambia su función completamente
Se une a una proteína adaptadora de unSe une a una proteína adaptadora de un activador de caspasas llamada Apaf1
Apaf1oligomeriza en un heptámero llamado apoptosomaapoptosoma
Los Apaf1 en el apoptosoma reclutan algunasLos Apaf1 en el apoptosoma reclutan algunasde las procaspasas iniciadoras (procaspasa9) que se activan por proximidad de unas con9), que se activan por proximidad de unas conotras en el apoptosoma
Vía intrínseca
Apaf 1
DominioCARD
Liberaciónde cit C
Activ de Apaf 1 por cit Chid óli i d dATP dADPe hidrólisis de dATP a dADP
Cit C en espeaciointermembrana
Mitocondria
Estímulosapoptóticos
Vía intrínsecaDominio CARD
Procaspasa 9
Ensamble de apoptosomas
catalizado por ADP
Reclutamientoy activ de
procaspasa 9
Apoptosoma
p p
Procaspasa 9 clivay activ caspasas ejecutorasy activ caspasas ejecutoras
Cascada de caspasa queCascada de caspasa quelleva a apoptosis
VIA INTRINSECA
VIA EXTRINSECA + VIA INTRINSECA
En algunas células, la víaEn algunas células, la víaextrínseca puede reclutar la víaintrínseca a fin de amplificar laintrínseca a fin de amplificar laseñal apoptótica para matar lasp p pcélulas.Esto se realiza mediante unEsto se realiza mediante unconjunto de proteínas de la familiaBcl2
Importancia de la regulación deImportancia de la regulación de la vía apoptótica intrínseca
La vía apoptótica intrínseca estáfinamente regulada a fin deasegurar que las células seasegurar que las células sematarán a sí mismas sólocuando sea absolutamentenecesarioecesa o
Proteínas Bcl2
Proteínas de la familia Bcl2regulan la vía intrínseca de laregulan la vía intrínseca de laapoptosis
REGULACION DE LA APOPTOSIS
Bcl-2 es el miembro fundador de lafamilia Bcl-2 de proteínas reguladorasfamilia Bcl-2 de proteínas reguladorasde la apoptosis.
Estas proteínas gobiernan el potencialde la membrana mitocondrial externa yde la membrana mitocondrial externa ysu permeabilidad (MOMP) y pueden serpro-apoptóticas (Bax BAD Bak y Bokpro-apoptóticas (Bax, BAD, Bak y Bokentre otras) o anti-apoptóticas(incluyendo Bcl-2 BCl-xL y Bcl-w entre(incluyendo Bcl-2, BCl-xL, y Bcl-w, entreun conjunto).
Algunas proteínas Bcl2 sonproapoptóticas y promueven laproapoptóticas y promueven lavía intrínseca induciendo laliberación de cit C al citosol,mientras otras Bcl2 sonmientras otras Bcl2 sonantiapoptóticas e inhiben esalib ióliberación
El balance entre estas dos clases deBcl2 determina si una célula vive oBcl2 determina si una célula vive omuere por la vía intrínseca de la
t iapoptosis
Bcl2 antiapoptótica
Familia de proteínas reguladoras Bcl2
Bcl2 antiapoptótica
Ej Bcl2, Bd-x
BH 123proapoptótica
Ej Bax, Bak
BH3-onlyproapotóticaproapotótica
Ej Badm Bim, Bid, Puma, Noxa
Cuando un estímulo apoptóticoCuando un estímulo apoptóticodispara la vía intrínseca, lasproteínas proapoptóticas BH123proteínas proapoptóticas BH123se activan y se agregan paraf li ó lformar oligómeros en lamembrana externa de lasmitocondrias y estimulan laliberación de cit C y otrasyproteínas mitocondriales.
Rol de BH123, proteína Bcl2 proapoptótica en relación a la activación de la vía intrínseca
P BH123 E tí lProt BH123inactiva
Estímulo apoptótico
Agregación de protBH123 activadas
Cit C
Otras prot del Espacio
intermembranaste e b a as
Vía intrínseca inactivaBcl2 activaBcl2 activa
BH123 inactiva
Cit C
Otras proteínasintermembrana
Activación de la vía intrínseca
Estímulo Bcl2 inactivaLiberación de prot intermebrana
apoptóticoBcl2 inactiva
Prot BH3-onlyAgregado de prot
BH123 activasyactivada
BH123 activas
Cit CCit C
Inhibidores de caspasas (IAPs)Inhibidores de caspasas (IAPs)
Descubiertos por primera vez encélulas de insectos infectadas porbaculovirus
La mayoría delas células delas células demamíferospuedenpuedensintetizar IAPS
Inhibidores de apoptosis (IAPs)E i d tí l tóti l IAP i hibEn ausencia de estímulos apoptóticos los IAPs inhiben la activación espontánea de las procaspasas
VÍA INTRÍNSICA INACTIVAPAnti IAP Cit C Procaspasas
ACTIVACIONESPONTANEAESPONTANEA
ProdominiosIAPs
Caspasabloqueada
Prot BH123 activas
ACTIV DE LA VIA INTRINSECA
ESTIMULOSAPOPTOTICOS
Apotosoma +caspasa 9 activada
Caspasaejecutora
APOPTOSIS
activada
Prot BH123 activadasAnti IAPs
IAP bloqueados
Rol de factores de supervivencia extracelulars en ajustar el número de células funcionales en el sistema nervioso
Célulasi
Neuronasapoptóticas
Cuerpo neuronal
nerviosas apoptóticas
neuronal
Muerte celular
Factores de Células blanco supervivencia
Apoptosis y p53Apoptosis y p53
El gen p53 o tp53, también llamado el"guardián del genoma" se encuentra en"guardián del genoma", se encuentra enel brazo corto del cromosoma 17(17p13) y codifica un factor de(17p13) y codifica un factor detranscripción nuclear
Resulta esencial para inducir la respuesta de la célula ante el daño alrespuesta de la célula ante el daño al ADN, deteniendo el ciclo celular en caso de mutación. El gen p53 es uncaso de mutación. El gen p53 es un gen supresor de tumor que desempeña un papel importante endesempeña un papel importante en apoptosis y control del ciclo celular.
Un p53 defectuoso podría permitirque las células anormales proliferenque las células anormales proliferendando por resultado cáncer(alrededor de un 50 % de todos los(alrededor de un 50 % de todos lostumores humanos contienenmutaciones en p53)mutaciones en p53).
La entrada en apoptosis es el últimomecanismo protector, si el daño en elADN es irreparable, para evitar laproliferación de las células quecontienen ADN anormal. p53 activa laexpresión de genes pro-apoptosis,como Bax o PUMA. Sin embargo, noestá claro cómo decide la célula si debereparar su ADN o entrar en apoptosis.
Aparentemente p53 presenta mayorafinidad por los promotores de los genesafinidad por los promotores de los genesde reparación del ADN que por lospromotores de los genes pro-apoptosis depromotores de los genes pro-apoptosis, demanera que primero se activa la reparacióndel ADN Pero si ésta no es efectiva y p53del ADN. Pero si ésta no es efectiva y p53continúa acumulándose, se activarían losgenes pro apoptosisgenes pro-apoptosis.
Nuestro agradecimiento a la Dra Dinorah Gambino por su gran esfuerzo en la coordinación de esta Red CYTED
y a la Dra Lena Ruiz Azuara y su grupo de trabajo por la organización de este curso de la Red CYTED en la UNAM
Gracias a todos por su atenciónGracias a todos por su atención