Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico
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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA - FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA VETERINARIA - CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: PRODUCTOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO.
INTRODUCCIÓN
La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación. Los pasos a seguir para una perfecta identificación bacteriana son:
1.- Obtener un cultivo puro
2.- Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.
3.- Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.
4.- Realización de pruebas primarias (Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.
5.- Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.).
Además de los nutrientes básicos y específicos, que le son proporcionados a las especies de interés, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel de laboratorio, en la fórmula de algunos medios de cultivo empleados al efecto, se incluyen determinados compuestos con el objetivo de favorecer su desarrollo en detrimento de otras especies contaminantes o no, o para distinguir y diferenciar las colonias producidas.
Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se emplean indistintamente productos químicos, principalmente carbohidratos, para conocer su capacidad metabólica frente a esos sustratos o se enfrentan a otros tipos de compuestos para determinar su resistencia, así como a diversos productos biológicos para evidenciar sus reacciones.
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1.- OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
a. Entender, comprender y aplicar las técnicas adecuadas para la realización de
pruebas bioquímicas empleadas rutinariamente en los procedimientos de
identificación bacteriana.
b. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta realización de las pruebas
bioquímicas convencionales en el proceso de identificación bacteriana.
c. Reconocer la necesidad de emplear cultivos puros como sustrato para la realización
de pruebas bioquímicas requeridas en el proceso de identificación bacteriana.
d. Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra, aislamiento y
proceso de identificación de bacterias realizando las diferentes pruebas bioquímicas
de uso rutinario en el laboratorio de diagnóstico bacteriológico.
2.- ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR:
a. Explicación sobre las pruebas bioquímicas de uso rutinario en el diagnóstico
bacteriológico, los métodos de siembra y sus aplicaciones en el proceso de
identificación bacteriana.
b. Demostración de las técnicas de siembra y los pasos a seguir para la correcta
realización de las pruebas bioquímicas empleadas en diagnóstico bacteriológico
3.- ACTIVIDADES DE LOS ALUMNOS:
a- Aplicando técnicas asépticas, siembre los diferentes medios de cultivo diferenciales
líquidos a partir del tubo con el medio de cultivo líquido que se le suministra. Emplee
el esquema de diseminación del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en
estufa a 37ºC.
b- Aplicando técnicas asépticas, siembre el medio de cultivo sólido en tubo (medio con
bisel) que se le suministra. Emplee el esquema de diseminación del inoculo indicado.
Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37ºC.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: ASPECTOS GENERALES
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados (las llamadas pruebas bioquímicas convencionales), generalmente determinan la actividad de una vía metabólica de la bacteria (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Obviamente, en la identificación bacteriana hay que partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, sub-cultivado de una colonia bien aislada. Es aconsejable realizar una comprobación efectuando una siembra en placa en la que crezcan únicamente colonias del mismo tipo. La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al
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crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos.
Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la
fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es
exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas
(manuales de identificación, comerciales, etc.).
HIDRATOS DE CARBONO
Los carbohidratos comúnmente empleados son diversos. Los más utilizados son los
monosacáridos como: glucosa, manosa, galactosa y fructuosas, entre otros y los
disacáridos como: lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. También algunos
trisacáridos, entre los que se encuentra la rafinosa y polisacáridos como la celulosa y el
almidón.
Uno o varios de estos carbohidratos suelen formar parte, como fuente de carbono, de
la composición de diversos medios, para el cultivo primario o las resiembras, así como,
de los medios bioquímicos destinados para el diagnóstico de las especies.
El objetivo de su empleo, es determinar, si el microorganismo en estudio, fermenta "in
vitro" el carbohidrato con formación de sustancias ácidas, como por ejemplo: el ácido
láctico, lo cual será detectado por la acción del indicador presente en el medio de
cultivo al variar el pH.
INDICADORES
Los indicadores son compuestos químicos elaborados con ácidos o bases débiles, que
se caracterizan por dar lugar al cambio de color de la disolución o sustancia donde se
encuentran al variar el pH, debido a su capacidad de ionización mediante la cual, a
determinado nivel de la escala de pH, transforman los iónes o moléculas y viceversa.
Los indicadores son de dos colores pudiendo ser uno de ellos incoloro. Cuando el
indicador está cambiado de color, la mitad se encuentra en estado iónico y la otra mitad
en estado molecular, por lo que el color en esta fase no será definido, sino más bien un
color intermedio entre ambos.
Los indicadores que forman parte de la fórmula del medio de cultivo, deben estar en
concentraciones muy bajas, para que la determinación del pH se deba exclusivamente
a los cambios que tiene lugar en la solución.
En el siguiente cuadro se citan ejemplos de indicadores de pH:
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Cuadro. Colores a los que dan lugar los indicadores en su rango de pH
I N D I C A D O R C O L O R
RANGO DE pH ACIDO BASE
ROJO FENOL Amarillo Rojo 6.4 - 8.2
AZUL BROMOTIMOL Amarillo Azul 6.0 - 8.0
ROJO DE METILO Rojo Amarillo 4.0 - 6.0
ROJO NEUTRO Rojo Amarillo 7.0 - 8.0 FENOLFTALEINA Incoloro Rojo 8.0 - 10.0 ROJO CRESOL Amarillo Rojo púrpura 7.2 - 8.3 PÚRPURA DE BROMOCRESOL Amarillo Rojo 5.2 - 6.8
Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color del medio o de las
colonias, en correspondencia con las variaciones del pH.
SANGRE Y HEMODERIVADOS
La sangre se emplea en la elaboración de algunos medios de cultivo, no teniendo como
única finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desarrollo de determinadas
especies, sino además, el permitir evidenciar y diferenciar la actividad hemolítica de
algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollan en el medio "Agar sangre",
colonias correspondientes a especies productoras de hemolisinas, éstas actúan sobre
la sangre que se encuentra en sus inmediaciones, hemolizando a los hematíes total o
parcialmente.
Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciará por la
formación de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis total se
clasifica como "betha".
En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hematíes, pero actúa sobre la
hemoglobina que porta, reduciéndola a biliverdina, el efecto se evidenciará por la
presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis se
clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre humana, como los obtenidos de
diversas especies de animales, como por ejemplo: carneros, conejos, cabras, etc., son
utilizadas en diferentes pruebas de hemaglutinación o para detectar diversas
reacciones hemolíticas.
El suero sanguíneo se emplea comúnmente para serodiagnósticos y el plasma (sin
preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capacidad enzimática
de especies productoras de coagulosa, una enzima que utiliza como sustrato el plasma
sanguíneo, provocando la formación de coágulos.
COLORANTES
La edición de determinados colorantes a la fórmula del medio de cultivo, tiene como
objetivo, inhibir el desarrollo de las especies más sensibles, que interfieren el estudio,
favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras más resistentes de interés en la
investigación, como por ejemplo: el "Verde brillante" que forma parte de la composición
del medio de cultivo del mismo nombre, utilizado para aislar algunas especies del
género Salmonella, al interferir total o parcialmente el desarrollo de otras especies
presentes en la muestra. Las colonias de Salmonella se observan además en este
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medio con un color, rosado o casi blancas, dependiendo de las condiciones de cultivo y
el tiempo de incubación.
Otro ejemplo lo constituye la siembra en el medio "Eosina-Azul de Metileno Agar".
Estos colorantes inhiben el desarrollo de los gérmenes gramnegativos y al mismo
tiempo permiten diferenciar a las especies de Enterobacterias fermentadoras de
lactosa, la sacarosa o ambos azúcares, de los que no las fermentan. Por ejemplo, las
colonias de E. coli, Citrobacter y P. vulgaris, adquieren un color azul oscuro, con
aspecto metálico (que se evidencia con luz indirecta), en tanto que las Salmonella spp.
y las Shigella spp., se mantienen incoloras o ligeramente teñidas, mientras que las del
resto de los coliformes se tiñen con un tono parduzco.
PRODUCTOS QUÍMICOS
Teniendo en cuenta, la información genética de que dispone cada especie bacteriana,
que la capacita para actuar metabólicamente sobre determinados sustratos, es parcial
o totalmente diferente entre sí, se emplean para su diagnóstico diversos sustratos, la
mayoría de naturaleza química, cuyas reacciones específicas, nos aportan información
acerca de su identidad.
Entre los productos químicos, empleados con mayor frecuencia se encuentran los
siguientes: Urea, citrato, malonato, nitrato, KCN, así como diversos tipos de
aminoácidos, entre otros.
El producto químico que se vaya a emplear, formará parte de la fórmula de un medio
de cultivo, que contiene además los nutrientes necesarios para el desarrollo de la
especie en estudio. Al actuar la bacteria sobre el producto químico en cuestión,
generalmente lo degradan por acción enzimática a productos más simples,
caracterizados por tener un ph diferente al del producto reaccionante, lo cual se pondrá
en evidencia por la acción del indicador que forma parte del medio de cultivo, que
proporcionará el cambio de color del medio, haciendo factible la lectura de esa prueba.
AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos: lisina, ornitina y arginina son utilizados corrientemente en el
laboratorio, como parte de las pruebas que se realizan a una cepa en estudio, para
determinar la identidad de la especie. De manera similar a la empleada con los
productos químicos para igual propósito, cada uno de estos aminoácidos es adicionado
por separado, en una proporción del 1 % a un caldo base que contiene los nutrientes
necesarios para el desarrollo del germen y un indicador.
El principio de estas pruebas radica en la capacidad de algunos microorganismos para
decarboxilar uno o varios de estos aminoácidos formando una amina con la
consiguiente alcalinidad, lo que será puesto de manifiesto por la acción del indicador, al
producirse el cambio de pH.
ANTIBIÓTICOS
Para medir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en estudio a los
antibióticos, se realiza una técnica denominada antibiograma con el empleo de discos
de papel de filtro estériles de unos 5 ó 6 mm de diámetro, impregnados por separado
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con una carga en g o unidades de un antibiótico determinado, equivalente a la
concentración sérica media, obtenida en el pico de una terapéutica a dosis habituales.
Estos discos (desecados) se colocan con todas las precauciones de asepsia sobre la
superficie del cultivo, tan pronto
se realiza la siembra, siendo incubada de inmediato. Transcurridas 24 horas, un halo
de inhibición alrededor de cada disco, en dependencia del tamaño del diámetro, será
indicativo de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en estudio a cada uno de
los antibióticos empleados.
Basado en el mismo principio y por un procedimiento similar, se realizan pruebas
específicas con el empleo de un solo disco, impregnado en este caso con bacitracina u
optoquina. La bacitracina inhibe el crecimiento de más del 95 % de los Estreptococos
del grupo A, en tanto que la optoquina inhibe el desarrollo del S. pneumoniae
(Neumococos), por lo que, la lectura de estas pruebas aportaran un importante dato
para sus respectivos diagnósticos.
Otras pruebas de resistencia, se realizan con el empleo de productos químicos como:
el cianuro de potasio o el desoxicolato de sodio, así como mediante la exposición del
microorganismo a sustancias de secreción orgánica como la bilis. La interpretación de
los resultados se sustentará en el hecho de que los microorganismos sean o no
capaces de desarrollarse en presencia de estos compuestos.
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1ra SESIÓN PRÁCTICA
METABOLISMO PROTEICO
Licuefacción de gelatina (lenta y rápida)
Fenilalanina desaminasa
Indol
Ureasa
Lisina descarboxilasa
PRUEBAS DE TOLERANCIA
BHI con cloruro de sodio al 6,5%
BHI con pH 9,6
Bilis esculina
2da SESIÓN PRÁCTICA
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Oxidación Fermentación de carbohidratos - glucosa
Hidrólisis de carbohidratos: Medio CTA, Caldo Base Rojo de fenol y/o
Bromocresol purpura con tubos durhan
Manitol Movilidad
Rojo de Metilo
Voges-Proskauer: Acetoina
3ra SESIÓN PRÁCTICA
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Kliger
Hidrólisis de almidón
ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES
Catalasa
Oxidasa
Reducción de Nitratos
COMPUESTOS COMO FUENTE ÚNICA DE CARBONO
Utilización de Citrato
OTRAS PRUEBAS
Prueba de cloroformo
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METABOLISMO PROTEICO
LICUEFACCIÓN DE GELATINA (LENTA)
Detectar la producción de una enzima proteolítica extracelular por parte de las bacterias que es la “GELATINASA”. Permite diferenciar géneros productores de Gelatinasa, que hidrolizan la Gelatina tales como: Staphylococcus: (+ muy rápida) Bacillus (+) Micrococcus: (+ lenta) Clostridium (+ lenta) Streptococcus - (negativos) Listeria - (negativos) FUNDAMENTO: Gelatinasa(Proteasa) Gelatinasa (Peptidasa)
Gelatina + Agua Peptonada Polipeptidos aa (Proteina + agua) + bacteria PROCEDIMIENTO:
1) Siembra del m.o. en medio rico en Gelatina por punción profunda Ej. Agua Peptonada + 12% gelatina Caldo nutritivo + 12% gelatina (esterilizados previamente) 2) Incubar por varios días (20 días) a 20-22ºC 3) Colocar en nevera 30’ antes de la interpretación RESULTADOS Medio se derrite (líquido) Gelatinasa + (bacteria hidrolizó gelatina) Medio está sólido Gelatinasa - (bacteria no hidrolizó gelatina)
PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE GELATINA (LENTA)
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FENILALANINA DESAMINASA
FUNDAMENTO:
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias
PROCEDIMIENTO
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del bisel con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento.
RESULTADO
La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.
PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA
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PRODUCCIÓN DE INDOL Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir indol a partir del triptófano.
MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO
Caldo triptonado + Triptona 10,0 g + Cloruro de sodio 5,0 g + agua destilada 1000,0 ml
pH 7,1 Disuelva los ingredientes, reparta en tubos y esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C (15 libras de presión). Reactivo de Kovac Para-dimetil-aminobenzaldehído 10,0 g Alcohol amílico o isoamílico 150,0 mL Acido clorhídrico concentrado 50,0 mL Se prepara disolviendo el aldehído en el alcohol y añadiéndole el ácido lentamente. Se reparte en pequeñas cantidades y se almacena en el refrigerador cuando no esté en uso. PROCEDIMIENTO
Se inocula un tubo del medio con el asa de platino, transfiriendo una porción del cultivo puro y se incuba a 37°C por 40 a 48 horas. Luego se añaden 0,5 mL del reactivo de Kovac y se agita suavemente. RESULTADOS Una reacción positiva es indicada por la aparición de un anillo rojo en la superficie del medio (capa alcohólica).
PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE INDOL
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UREASA Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la úrea, formando dos moléculas de amoníaco por la acción de la enzima ureasa.
MEDIO DE CULTIVO
Caldo úrea
Extracto de levadura 0,1 g
Fosfato monopotásico 9,1 g
Fosfato disódico 9,5 g
Úrea 20,0 g
Rojo fenol 0,01 g
Agua destilada 1000,00 mL
pH 6,7-6,9 Disuelva y esterilice por filtración. PROCEDIMIENTO
Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro proveniente de un medio sólido. Incube a 37°C por 24 horas. RESULTADOS
Una reacción positiva (hidrólisis de la urea) es indicada por un cambio de color del amarillo (pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o más alcalino).
PRUEBA DE UREASA
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DESCARBOXILACIÓN DE LA LISINA
MEDIO DE CULTIVO
Caldo Lisina
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
Lisina 5,0 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agua destilada 1000,00 mL
pH 6,8
Disuelva y caliente a ebullición por 2 ó 3 minutos, reparta en tubos y esterilice en el autoclave por 10 minutos a 121°C (15 libras de presión). PROCEDIMIENTO Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro al caldo lisina. Incube a 37°C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de parafina estéril. RESULTADO
Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su color original violeta.
A tubo sin inocular B resultado positivo C resultado negativo
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PRUEBAS DE TOLERANCIA
BHI CON CLORURO DE SODIO AL 6,5% Se estudia sembrando el microorganismo en un medio capaz de soportar su desarrollo, al cual se le ha agregado NaCl en la concentración referida. El medio puede usarse solo, en cuyo caso se lee simplemente por observación de crecimiento o no, o puede adicionarse con glucosa al 1% y un indicador de pH, como el rojo fenol, para facilitar la lectura. En este último caso, los microorganismos capaces de fermentar la glucosa, y tolerar la concentración salina del medio, desarrollan y acidifican, con el consiguiente viraje de color en el medio
RESULTADOS
Crecimiento: Tolera la concentración de sal No crecimiento: no tolera la condición
BHI CON pH 9,6
Puede usarse el caldo nutritivo como base, ajustando el pH a 9,6 antes de su esterilización. Puede adicionarse glucosa y un Indicador de pH, como se indicó en el caso anterior, para facilitar la lectura de resultados
RESULTADOS Crecimiento: Tolera el nivel de pH a 9,6 No crecimiento: no tolera la condición
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BILIS ESCULINA Medio utilizado para el aislamiento e identificación presuntiva de estreptococos del
grupo D.
FUNDAMENTO
Los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e
hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de
color verde oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de
la flora acompañante.
MEDIO DE CULTIVO
Fórmula (en gramos por litro)
Extracto de carne 3 g Peptona de carne 5 g Bilis de buey 40 g
Esculina 1 g Citrato férrico 0.5 g Agar 15 g
pH final: 6.6 ± 0.2
Suspender 64,5 g en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar
a ebullición hasta su completa disolución. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar
15 minutos a 121°C.
PROCEDIMIENTO
Sembrar el material en estudio, en tubo o placa según la preferencia. Incubación
Hasta 3 días a 35-37 °C, en aerobiosis.
RESULTADOS
Microorganismos Enterococcus
faecalis
ATCC 29212
Proteus
mirabilis
ATCC 43071
Streptococcus
pyogenes
ATCC 19615
Crecimiento Bueno Bueno Inhibido
Hidrólisis de la
Esculina
+ - Inhibido
Oscurecimiento + - Inhibido
CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO:
Medio preparado: ámbar u oscuro ligeramente opalescente. El medio con
esculina tiene un leve tinte azulado.
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METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
OXIDACIÓN FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS – (GLUCOSA)
FUNDAMENTO:
Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su
falta de utilización. Se usa el medio OF de Hugh y Leifson que contiene peptonas e
hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas,
hay menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a
elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los
microorganismos no fermentadores. El medio posee azul de bromotimol como
indicador de pH. El test es útil en la diferenciación de los Géneros incluidos en la
Familia Micrococcaceae como para diferenciar miembros de la Familia
Enterobacteriaceae de las Pseudomonas.
PROCEDIMIENTO:
Se utilizan 2 tubos con el medio O-F glucosa o lactosa o cualquier otro carbohidrato
por cada agente a estudiar. Se hace la siembra profunda con aguja de platino. Uno de
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con parafina estéril (1,5 a 2 cm de
alto) para crear condiciones anaerobias. Se incuba a 37°C por 24 horas y hasta 14
días dependiendo del microorganismo.
Los organismos oxidativos y fermentativos utilizan el carbohidratos tanto el tubo
aeróbico (sin parafina) como en el anaeróbico, acidifican el medio y provocan el viraje
del color del indicador de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos sólo
podrán utilizar el carbohidrato en el tubo aeróbico. Como la producción de ácido en
algunas especies puede ser lenta, se recomienda incubar el medio por 7-14 días, a
menos que se observe cambio con anterioridad.
INTERPRETACIÓN:
Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo expuesto al O2
atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su
color original a amarillo.
Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos
tubos viran del verde al amarillo.
Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino
después de la incubación, conservando su color original.
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POSITIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO
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HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS
La mayoría de las bacterias utiliza un cierto número de carbohidratos como fuente de
energía, ya sea por vía oxidativa, fermentativa o ambas, provocando acidificación del
medio que se pone de manifiesto por el viraje de un indicados de pH incorporado al
mismo. Algunas bacterias, producen también gas como producto de la fermentación del
carbohidrato, lo que es también una característica de interés para su identificación.
La investigación de la hidrólisis de distintos carbohidratos se realiza utilizando un medio
basal como por ejemplo el Cysteina Trypticase Agar (medio o agar CTA), que es un
medio semisólido, el Caldo Base Rojo de Fenol (rojo en medio neutro o alcalino;
amarillo en medio ácido), el caldo base Púrpura Bromo Cresol (Violeta en medio neutro
o alcalino y amarillo en medio ácido), etc. A los medios basales, conteniendo un
indicador de pH, se añade el azúcar a una concentración final del 1%.
a.- Medios líquidos: Cuando el medio basal es líquido, se reparte en tubos 12x120
mm o mayores, dentro de los cuales se introduce un tubo de pequeño diámetro o
tubo de Durham, en posición invertida. Este tubo se llena completamente durante
la esterilización, pues por efecto de la temperatura y la presión, se desplaza el
aire contenido dentro de él.
Procedimiento: El medio se siembra con el microorganismo en prueba, se incuba
por 24-48 horas y se procede a la lectura, observando viraje del indicador y
presencia o no de gas en el tubo Durham.
b.- Medios semisólidos y sólidos: se procede igual, excepto que no requiere
introducir tubos Durham, pues el gas que se pueda generar queda atrapado en el
agar y se observa desplazamiento del mismo.
HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (BROMOCRESOL PURPURA CON DURHAN)
HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (CYSTEINA TRYPTICASE AGAR - CTA)
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MANITOL MOVILIDAD
Se incluyen en este apartado 2 pruebas debido a que pueden realizarse cultivando el microorganismo en un único medio (el Manitol Movilidad), que se prepara en tubo con agar en taco y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en medios separados.
Prueba del Manitol: Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar
el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciarStaphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
Prueba de la Movilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil.
Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.
El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.
Entre las Enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen poseer movilidad (+). Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).
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ROJO DE METILO
FUNDAMENTO:
La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno presente cuando una bacteria cataboliza la glucosa.
Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido mixta sobre los azúcares, ésta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del tipo fórmico, acético, láctico y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad de los ácidos orgánicos).
PROCEDIMIENTO:
Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), cuya composición es la siguiente:
Peptona 7 g Glucosa 5 g K2HPO4 5 g Agua destilada 1000 ml
Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v). Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados.
RESULTADOS:
Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá rojo el indicador.
Medio ácido indicador rojo RM (+) (Escherichia coli) Medio neutro indicador amarillo naranja. RM (-) (Klebsiella)
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico
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VOGES-PROSKAUER: ACETOINA
FUNDAMENTO:
La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de le fermentación butanodiólica de la glucosa. Las bases bioquímicas de la prueba consideran que a partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir vías metabólicas diferentes para la obtención de energía, según la composición de sus sistemas enzimáticos. Una de estas vías es la fermentación butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es su precursor. La prueba de VP se basa en la detección de este último metabolito.
La acetoína que se produce en la fermentación cuando reacciona con el hidróxido de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanidínicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloración rojiza.
PROCEDIMIENTO
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo. Se siembra el microorganismo problema y se incuba a 37ºC durante 48 horas. La lectura se realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solución de KOH al 40% y luego 1 ml de solución alcohólica del alfa naftol al 5% (p/v). Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la estufa, el cultivo con los reactivos agregados.
RESULTADOS (NTERPRETACIÓN)
La formación de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la prueba es positiva.
Escherichia coli es VP -
Klebsiella sp es VP +