REQUISITOS PARA UN LABORATORIO
DE MICOLOGÍA• 1. Sala adecuada.• 2. Poseer los
instrumentos • 3. técnicas de
búsqueda de anticuerpos
• 4. laboratorio de biología molecular
• 5. bioseguridad.
TÉCNICAS Y MÉTODOS
• 1. Poner de manifiesto el parásito
• 2. Permitir el aislamiento del hongo
• 3. Identificación del hongo.
• 4. Investigación de las reacciones inmunitarias
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS• Pinzas de depilar y
tijeras, Aguja de disección. Cajas de Petri o portaobjetos, Asa de aluminio o platino, Matraces Erlenmeyer, Tubos de ensayo, espátulas, torundas, Cepillos, Solución salina, formol , Medios de cultivo.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
RECHAZO DE MUESTRAS
• 1. esputo mas no la saliva.
• 2. Las muestras de las zonas enfermas pero no ser tomadas al azar.
• 3 Muestras insuficientes.
• 4. no se usen muestras con mucho tiempo de almacenamiento
BIOPSIA DE TEJIDOS U ÓRGANOS
• valorar el tipo de reacción en los tejidos, que puede ser: congestiva con vasodilatación, edema, exudados y depósitos de fibrina; purulenta, con cúmulos de polimorfonucleares, o más a menudo granulomatosa con histiocitos, células gigantes de tipo cuerpo extraño o de Langhans, rodeadas por linfocitos y plasmocitos.
• Los hongos se presentan en forma de filamentos, levaduras y esporangios
• fenómeno de Splendore-Hoeppli
ANÁLISIS DIRECTO • Sencillo, rápido y
barato.• Se efectúa a partir de
escamas, pelos y exudados. (Dificiles de observar sin sustancias aclarantes)
• Se encuentran abundantes hongos oportunistas.
• Se utiliza solución de lugol.
ANÁLISIS DIRECTO CON FLUORESCENCIA
• Se utiliza blanco de calcoflúor bajo el microscopio fluorescencia.
• Se observan hifas, seudohifas y levaduras.
• Imposible ver endosporas de C. immitis.
CULTIVO• Las muestras se
recolectan con un hisopo estéril.
• Especímenes en el centro del cultivo, a temperatura ambiente (en caso de micosis profundas de 30 a 37 C°)
• Las levaduras se siembran en zigzag y se desarrollan en 24 a 48 horas.
• Los hongos patógenos se desarrollan en una a dos semanas.
Técnica de resiembra: Recolección de la colonia en tubo pasa la conservación de la cepa.
Cultivo en lámina o microcultivo: Se coloca un fragmento del cultivo en un porta objetos con laminilla.
Esta técnica tiene dos variedades: • Lamina desecada• Cuadrado de gelosa
Cultivo sobre pelo o método del anzuelo: Se depositan en tierra húmeda pelos o cabellos para aislar dermatofitos del suelo.
Ataque del pelo in vitro: En agua estéril se depositan cabellos rubios o de niño junto con el extracto de levadura, permite la observación de dermatofitos.
AUXONOGRAMA Y ZIMOGRAMAImportante para definir especies de levaduras.
Auxonograma: Asimilación de alimentos con carbono o nitrógeno.
Medio de lodder modificado:• Asimilación de azucares.• Asimilación de nitrógeno.
Zimograma: Fermentación de azucares, cultivo de levadura en medio liquido con glucido.
Medio de Marcelou-Kinti: Agar en 900ml de agua por 24 horas.
Se añade peptona y se calienta a 110°C durante 10 minutos.
Si hay fermentación, el medio se decolora.
ESTUDIO DE LAS NECESIDADES VITAMINÍCAS
En tubos se incuba un fragmento de cultivo o suspensión de esporas o levaduras. No se observa crecimiento en el tubo donde falta una vitamina indispensable.
SINTESIS DE UREASASe utiliza medio urea-
indol a 37°C. Rojo fenol, de color amarillo, vira a rojo-violeta en tres a seis horas. (cryptococcus)
En tubos solidificados en posición inclinada se siembra un pequeño inoculo de la colonia y se incuba a 25 grados centígrados.
INOCULACIÓN EXPERIMENTAL
Se emplea en la investigación, pero también tiene utilidad diagnostica.
Se usan conejos, ratas, ratones, cobayos y hámsteres.
Los hongos pueden ser inoculados por vía subcutanea, intravenosa, intraperitoneal, intratesticular e intracraneal.
REACCIONES INMUNOLÓGICASPRUEBAS DE
SENSIBILIDAD CUTÁNEA
• intradermorreacciones
SERODIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
• doble difusión en agar• técnica de Ouchterlony• técnicas de electrodifusión
pueden ser inmunoelectroforesis y electrosinéresis
• anticuerpos fijadores de complemento
• inmunofluorescencia indirecta • técnicas inmunoenzimáticas• anticuerpos monoclonales
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A FARMACOS Se utilizan métodos como: tubos germinativos,
consumo de metabolitos, citometría de flujo, métodos basados en agar y dilución de caldos de cultivo.
Las técnicas de agar son fáciles y de bajo costo. Los métodos de dilución son ampliamente usados pero reservados para Candida y Cryptococcus.
Prueba Colorimétrica
Se usa azul de alamar para producir cambio de azul a rojo, cuando se reduce en presencia de un crecimiento microbiano. Las sales de tetrazoilo pueden cambiar de color cuando se reducen, y para detectarlo se usa el espectrofotómetro.
AISLAMIENTO DEL HONGO • se pueden agregar dos
gotas de una mezcla de penicilina estreptomicina o emplear medios que contengan cloranfenicol
Técnicas de aislamiento para líquidos, sólidos y ambiente• técnica de dilución y
vaciado en placa
IDENTIFICACIÓNDE LOS HONGOSmedio de cultivo, la naturaleza de los azúcares, la pureza de la peptona, el pH, el grado de humedad y la temperatura
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA
1. Forma y tamaño.2. Color en la superficie o en el reverso.3. Difusión del pigmento.4. Coloración5. Textura6. Superficie7. Aspecto8. Consistencia9. Rapidez de crecimiento
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
1. Análisis a través del tubo. 2. Análisis de un fragmento del cultivo. 3. Método de la cinta adhesiva transparente 4. Cultivo en lámina
PRESERVACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CULTIVOS
Preservar su viabilidad, sin degeneración, variación ni mutación. mantener en agarmétodo de agua
destilada Congelado en
nitrógeno líquido
BIOLOGIA MOLECULAR EN MICOLOGIA MEDICAPermite estudiar cualidades estables e
inmodificables por el ambiente.
• Hibridación.• Reacción en cadena polimerasa.• Polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción.
• Análisis de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción de regiones amplificadas por PCR.
• Análisis del polimorfismo en la conformación de las cadenas sencillas de ADN de regiones amplificadas por reacción de PCR.
• Análisis del polimorfismo del ADN amplificado con cebadores arbitrarios.
RIESGO BIOLÓGICOLas vías más frecuentes de exposición son:• accidentes con objetos
punzocortantes• picaduras• mordeduras de
animales • la inhalación de
aerosoles• ingestión accidental • contacto de
membranas mucosas