INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Efecto del resveratrol sobre la toxicidad
espermática inducida por cadmio en
ratones
PROYECTO DE INVESTIGACION (CURRICULAR)
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
PRESENTA
AGLAE PAOLA CAÑAS PÉREZ
ASESOR: M. en C. GERARDO N. ESCALONA
CARDOSO
COASESORA: Dra. NORMA PANIAGUA CASTRO
México, D.F. 2014
El presente proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Farmacología
del Desarrollo del Departamento de Fisiología de la ENCB, Campus
Zacatenco.
Bajo la dirección de
M. en C. Gerardo Norberto Escalona Cardoso y
Coasesoría de
Dra. Norma Paniagua Castro.
Índice General
Pág.
i. Abreviaturas i
ii. Índice de Tablas y Figura iii
I. INTRODUCCIÓN 1
1. Espermatogénesis 1
1.1 Fases de la espermatogénesis 2
1.1.1 Espermacitogénesis 2
1.1.2 Espermiogénesis 4
1.2 Factores que afectan la espermatogénesis 6
1.3 Anormalidades de los espermatozoides en humano 7
1.4 Espermatogénesis en el ratón 8
2. Cadmio 10
2.1 Efectos adversos 11
2.2 Efectos del cadmio en el sistema reproductor masculino 11
2.3 Mecanismos tóxicos del cadmio 12
2.4 Especies reactivas del oxigeno 12
2.5 Estrés oxidativo
2.6 Lipoperoxidación
2.7 Antioxidantes
2.7.1 Enzimas antioxidantes
2.7.2 Antioxidantes no enzimaticos
13
13
15
15
15
3. Resveratrol 15
II. JUSTIFICACIÓN 18
III. HIPÓTESIS 18
IV. OBJETIVOS
General 18
Específicos 18
V. MATERIAL 19
VI. METODOLOGÍA 20
VII. RESULTADOS 23
VIII. DISCUSIÓN
IX. CONCLUSIONES
32
36
X. BIBLIOGRAFÍA
XI. ANEXO
37
41
Página i
I. Abreviaturas
Ad
Ap
ANOVA
Cd
CdCl2
CMC
CdS
DNA
EG
ERO
FSH
g
HDL
H2O2
kg
L
LDL
LPO
min
mg
Espermatogonias oscuras
Espermatogonias pálidas
Análisis de varianza
Cadmio
Cloruro de cadmio
Carboximetíl celulosa
Sulfuro de cadmio
Ácido desoxirribonucleico
Células germinales embrionarias
Especies reactivas de oxigeno
Hormona folículo estimulante
Gramos
Colesterol de alta densidad
Peróxido de hidrógeno
Kilogramos
Litro
Colesterol de baja densidad
Lipoperoxidación
Minutos
Miligramo
Página ii
nm
·OH
O2·
1O2
PGC
pH
rpm
RSV
SSI
VIH
°C
µg
µL
Nanómetro
Radical hidroxilo
Superóxido
Singulete de oxigeno
Células germinales primordiales
Potencial de hidrogeno
Revoluciones por minuto
Resveratrol
Solución salina isotónica
Virus de inmunodeficiencia humana
Grados Celsius
Microgramo
Microlitro
Página iii
ii. Índice de Tablas y Figuras
Pág.
Figura 1 Diagrama esquemático de los componentes del aparato genital
masculino.
1
Figura 2 Comparación entre la mitosis y la meiosis en células germinales. 4
Figura 3 Diagrama esquemático de la espermatogénesis humana. 5
Figura 4 Malformaciones de los espermatozoides. 8
Figura 5 Espermatogénesis en el ratón. 9
Tabla 1 Efectos adversos de la exposición al cadmio. 11
Figura 6 Reacciones de la iniciación y propagación de la lipoperoxidación. 14
Figura 7 Estructura química del resveratrol. 16
Figura 8. Registro de peso promedio ganado de ratones que fueron
sometidos a distintos tratamientos.
Figura 9. Comparación del peso relativo promedio de testículo izquierdo de
ratones sometidos a diferentes tratamientos.
23
24
Figura 10. Comparación del peso relativo promedio de testículo derecho de
ratones sometidos a diferentes tratamientos.
24
Figura 11. Comparación del peso relativo promedio de la vesícula seminal
de ratones sometidos a diferentes tratamientos.
25
Figura 12. Porcentaje de espermatozoides de ratones sometidos a
diferentes tratamientos que presentan movimiento continuo (A), in situ (B)
e inmóviles (C).
26
Figura 13. Promedio de espermatozoides expresado en millones de
espermatozoides por mililitro de ratones sometidos a diferentes
tratamientos.
27
Figura 14. Viabilidad espermática de ratones sometidos a diferentes
tratamientos.
28
Figura 15. Morfología espermática de ratones sometidos a diferentes
tratamientos.
Figura 16. Niveles de lipoperoxidación en espermatozoides de ratones
29
30
Página iv
sometidos a diferentes tratamientos.
Figura 17. Niveles de lipoperoxidación en testículo de ratones sometidos a
diferentes tratamientos.
Figura 18. Niveles de testosterona en suero de ratones sometidos a
diferentes tratamientos
30
31
Página 1
I. INTRODUCCIÓN.
La fertilidad en los humanos, así como en animales de experimentación, es
susceptible a los efectos tóxicos del medioambiente, productos químicos
industriales y fármacos. Entre los agentes más tóxicos se encuentran las
hormonas esteroidales, agentes quimioterapéuticos, metales, pesticidas, aditivos
de comida y alimentos contaminados.
Metales como cobalto, cadmio, mercurio, molibdeno y plata, pueden afectar la
espermatogénesis y la función de órganos accesorios (Thomas y Thomas J.,
2001).
1. ESPERMATOGÉNESIS.
Las dos funciones primarias del testículo (Figura 1) son la producción de gametos
masculinos o espermatozoides (espermatogénesis) y la síntesis de hormonas
sexuales masculinas o andrógenos (esteroidogénesis).
Figura 1. Diagrama esquemático de los componentes del aparato genital masculino.
Página 2
En la pubertad la secreción de testosterona inicia la producción de
espermatozoides, la secreción de las glándulas sexuales anexas y el
desarrollo de las características sexuales secundarias.
En el adulto la secreción de testosterona es indispensable para el
mantenimiento de la espermatogénesis y de las características sexuales
secundarias, el buen funcionamiento de las vías espermáticas y de las
glándulas sexuales anexas.
Por lo tanto la espermatogénesis es el proceso por el cual se producen los
gametos sexuales masculinos. Comienza poco antes de la pubertad con la
influencia de las gonadotrofinas hipofisiarias y continúa durante toda la vida
reproductiva.
1.1 Fases de la espermatogénesis.
La espermatogénesis se inicia con la división de las células madre
(espermatogonias tipo Ad) y finaliza con la formación de espermatozoides
maduros.
1.1.1 Espermatocitogénesis (reducción cromosómica).
Fase proliferativa.
Durante esta fase se produce la continua repoblación de células madre que
finalmente se diferenciarán en espermatozoides maduros.
Las espermatogonias son células diploides situadas en la base del epitelio
seminífero. En el hombre, se han descrito tres tipos de espermatogonias: las
espermatogonias oscuras (Ad), que se consideran las células madre de la
espermatogénesis; no presentan actividad proliferativa en condiciones normales,
pero entran en mitosis cuando se reduce drásticamente la población total de
espermatogonias; como por ejemplo tras la radioterapia; las espermatogonias
Página 3
pálidas (Ap), que dan lugar, al dividirse a dos espermatogonias de tipo B (Gill
Salmon y col., 2004).
Durante estas divisiones mitóticas, las células conservan un complemento diploide
de cromosomas. Después de una división por mitosis, las espermatogonias B
producen espermatocitos primarios; los cuales están destinados a entrar a la fase
meiótica de la espermatogénesis, cuya duración en el ser humano es alrededor de
24 días ( Drucker, 2005).
Fase meiótica.
En esta fase, los espermatocitos primarios sintetizan de manera activa DNA,
siendo las últimas células germinales en llevar este proceso. Después de duplicar
su contenido de DNA, los espermatocitos inician la profase de la división meiótica,
durante la cual las células experimentan diversos cambios en su cromatina.
Después de esta fase, las células entran con rapidez a los estados subsecuentes
de la meiosis, para originar los espermatocitos secundarios (con un número
haploide de cromosomas). La segunda división meiótica es precedida por un
periodo de interfase breve, esta fase es similar a la mitosis, con excepción de que
las células mantienen un número haploide de cromosomas; está división da origen
a las espermátides (Figura 2).
Página 4
1.1.2 Espermiogénesis (diferenciación de espermátidas).
Fase de Golgi: condensación Nuclear, gránulos pro-acrosómicos,
formación del axonema por el centríólo maduro.
Figura 2. Comparación entre la mitosis y la meiosis en células germinales. Los dos
pares de cromosomas (2n) de origen materno y paterno están ilustrados en rojo y azul,
respectivamente. La división mitótica produce células hijas que son genéticamente
idénticas a la célula progenitora (2n). la división meiótica, que tiene dos componentes
(división reduccional y ecuacional), producen células que poseen solo la mitad de la
cantidad de cromosomas (n). Además, durante el apareamiento de los cromosomas en la
profase I de la meiosis se intercambian segmentos cromosómicos (recombinación o
crossing-over) para crear la diversidad genética. En los seres humanos el primer cuerpo
polar no se divide, pero si lo hace en otras especies. (Martini, 1998).
Página 5
Fase de Casquete: formación de la vesícula acrosómica sobre el núcleo,
desaparición de poros nucleares.
Fase de Acrosoma: Orientación en células de Sertoli hacia lámina basal,
desplazamiento de citoplasma, formación del manguito de microtúbulos, el
centriolo inmaduro forma el cuello o piezas de conexión (9 fibras densas).
Las mitocondrias se desplazan a la región del cuello y forman la vaina
helicoidal en el cuello.
Fase de Maduración: Cuerpos Residuales con puentes citoplásmicos,
liberación de las células de Sertoli a la luz del túbulo seminífero Figura 3).
Figura 3. Diagrama esquemático de la espermiogénesis humana. Se ilustran las
modificaciones básicas en la estructura de los orgánulos fundamentales de la
espermátide. (Modificada de Dym M., 1988).
Página 6
1.2 Factores que afectan a la espermatogénesis.
Las células espermatogénicas son muy sensibles a agentes nocivos, se detectan
algunas alteraciones degenerativas como la apoptosis, exfoliación prematura o la
formación de células gigantes multinucleadas. Entre los factores que afectan
negativamente la espermatogénesis pueden mencionarse las deficiencias
alimentarias, debido a que las vitaminas, coenzimas y los oligoelementos (vitamina
A, B12, C y E, ß-caroteno, zinc y selenio) son una fuente importante en la
formación de espermatozoides. También destacan los factores ambientales/estilo
de vida, en un estudio realizado en Dinamarca se observó que el recuento de
espermatozoides de varones de zonas rurales es más alto que los de zonas
urbanas debido a las constantes situaciones de estrés provocadas por el tráfico,
trabajo o simplemente la vida acelerada de la ciudad provocan la muerte de los
espermatozoides. Los trastornos del desarrollo embrionario, cabe mencionar que
la criptorquidia, el hipospadías y el bajo peso al nacer son factores de riesgo
importantes de cáncer testicular asociados con la disminución de la calidad del
semen y la reducción de la fertilidad. Las enfermedades sistémicas o infecciones
locales, las infecciones que afectan a los testículos son conocidas como orquitis.
Las enfermedades sistémicas que pueden alteran la espermatogénesis
comprenden la fiebre, nefropatías, infección por VIH y otras infecciones virales. La
temperatura testicular elevada, la temperatura es uno de los factores clave en la
producción de espermatozoides. Hay que tener en cuenta que los testículos están
separados del resto del cuerpo para mantener una temperatura ligeramente
inferior, entre uno y dos grados menos. Todo lo que suponga que esos testículos
estén unidos al cuerpo y suba la temperatura puede ser perjudicial para la
producción de espermatozoides. Las hormonas esteroides y fármacos
relacionados, la exposición a estrógenos sintéticos (dietilestilbestrol) y a otros
esteroides sexuales puede ejercer un retrocontrol negativo sobre la secreción de
FSH, con la consiguiente reducción de la espermatogénesis. La radiación
ionizante y agentes alquilantes, se ha comprobado que el gas mostaza
nitrogenado y la procarbazina ejercen efectos tóxicos sobre los espermatogonios.
Las radiaciones electromagnéticas y las microondas también afectan la cantidad y
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la movilidad de los espermatozoides. Finalmente los agentes tóxicos, los agentes
mutagénicos, antimetabolitos, pesticidas, productos de la combustión, etc. pueden
afectar drásticamente la producción de espermatozoides normales, por lo tanto se
ve afectada la fertilidad. (Health.com).
1.3 Anormalidades de los espermatozoides en humano.
Los espermatozoides que presentan anomalías morfológicas carecen de movilidad
normal y es probable por ello que no lleguen a fecundar a los ovocitos. Las
anomalías pueden ser de la cabeza o de la cola; los hay gigantes y pequeños, en
ocasiones están unidos.
Hay datos que sugieren que un 10% de los espermatozoides pueden ser
anormales sin que ello represente una disminución de la fertilidad. Sin embargo,
cuando existen anomalías en un 25 % o más, la fecundidad suele estar disminuida
(Sadler, 1988).
Las anormalidades que se presentan en los espermatozoides del ser humano,
pueden presentarse de igual forma en los espermatozoides de ratón (Figura 4).
Página 8
1.4 Espermatogénesis en el ratón.
En el ratón el proceso de la producción de gametos se inicia en la fase
embrionaria alrededor de los 11 días y medio después de la fecundación, cuando
las células germinales primordiales (PGC), localizadas en el saco vitelino adosado
al alantoides, colonizan la cresta genital. Las PGC proliferan, algunas sufren
apoptosis, y el resto llega a la fase de células germinales embrionarias (EG). Éstas
se mantienen quiescentes como T-proespermatogonias hasta después del
nacimiento, cuando son reactivadas e inician la espermatogénesis (McLaren &
Southee, 1997). La primera ola de espermatogénesis empieza cuando las
T-proespermatogonias se diferencian en espermatogonias Ais (isolated), entre el
nacimiento y el día 3 en el ratón (Vergouwen y col., 1993).
A: Espermatozoide normal.
B: Espermatozoide con dos cabezas.
C: Espermatozoide con dos colas.
D: Espermatozoide con atrofia de la cabeza.
E: Espermatozoide con la cola rizada.
F: Espermatozoide con atrofia de la cola.
G: Espermatozoide con malformación de la
cabeza.
H: Espermatozoide con cola flexionada.
I: Espermatozoide con hipertrofia de la
cabeza.
Figura 4. Malformaciones de los espermatozoides.
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El resto se diferencian en espermatogonias A1, las cuales sufren cinco divisiones
mitóticas generando secuencialmente espermatogonias A2-A4, intermedias, y tipo
B. Después de la última división de las espermatogonias de tipo B, empieza la
meiosis dando lugar a los espermatocitos en preleptoteno (día 10), que se
diferencian sucesivamente en espermatocitos en leptoteno, zigoteno, paquiteno y
diploteno, completándose así la profase.
Las células en diploteno se dividen para formar los espermatocitos secundarios
(primera división meiótica) que rápidamente dan lugar a las espermátidas de tipo I
(segunda división meiótica). Éstas marcan el inicio de la espermiogénesis (Figura
5). En el ratón, las primeras espermátidas haploides aparecen alrededor del día 20
y hacia el día 35 ya se pueden detectar los primeros espermatozoides en el lumen
de los túbulos seminíferos (Vergouwen y col., 1993). En función de la morfología
de las espermátidas, la espermatogénesis se puede subdividir en diferentes
asociaciones celulares denominadas estadios. En el ratón casero se han descrito
16 tipos de espermátidas y 12 estadios.
El ciclo espermatogénico en el ratón tiene una duración de 36 días y en el hombre
es de 74 días (Roberts, 1990).
Figura 5. Espermatogénesis en el ratón (Whittingham, 1990).
Página 10
2. CADMIO.
Es un elemento metálico, de color blanco brillante, dúctil, maleable y persistente a
la corrosión. Es un metal pesado que produce efectos tóxicos en los organismos
vivos, aún en concentraciones muy pequeñas, se encuentra ampliamente
distribuido en la corteza terrestre en una concentración promedio de 0.1 mg/kg
(Vallejo, 2001).
La exposición al cadmio en los humanos se produce generalmente a través de dos
fuentes principales: la primera es la vía oral (por agua e ingestión de alimentos
contaminados) y la segunda vía es por inhalación (Chang, 1996).
Por vía oral se absorbe del 5 al 10% del total de cadmio en el organismo. Aunque,
con excepción del sulfuro de cadmio (CdS), los compuestos de cadmio iónico son
altamente solubles en agua, los humanos sólo ingieren una pequeña cantidad
directamente del agua potable o del aire. La exposición humana proviene
principalmente de los alimentos, mariscos y vísceras, particularmente riñón.
La segunda vía es por inhalación; en este caso la absorción depende del tamaño
de las partículas y su composición química. La cantidad de cadmio inhalado
depende de la concentración del metal en el aire, la retención y tamaño de las
partículas en los pulmones, del compuesto químico inhalado, las condiciones
fisiológicas del sistema respiratorio y en el caso de los fumadores, de la intensidad
del hábito, pues por esta vía se absorbe del 15 al 20% del cadmio que pasa a la
sangre.
La población fumadora es la más expuesta al cadmio; ya que el cigarro es una
fuente importante del metal. Como muchas plantas, el tabaco contiene cadmio,
algo del cual es inhalado en el humo. Muchos fumadores tienen alrededor del
doble de cadmio en sus órganos que los no fumadores (Al-Bader y col., 1999).
Página 11
2.1 Efectos adversos.
Aunque las exposiciones prolongadas son extremadamente raras actualmente, la
ingestión de altas dosis es causa de severas irritaciones del estómago, vómito y
diarrea y su inhalación causa graves irritaciones en los pulmones.
Algunos efectos adversos de la exposición crónica a Cadmio se presentan en la
Tabla 1 (Saldivar y col., 1997):
2.2 Efectos del Cadmio en el sistema reproductor masculino.
En los años 50´s se reportó por primera vez el efecto adverso del cadmio sobre la
reproducción. Cuando la concentración de cadmio en sangre es superior a 1.5
mg/L, hay reducción significativa en la densidad de los espermatozoides,
sugiriendo un posible efecto del cadmio en la espermatogénesis (Parizek y Zahor,
1956).
La inyección de cadmio en los testículos de ratas, causa atrofia testicular y
producción de anticuerpos antiespermatozoide por ser inductor de cambios
vasculares que llevan a la isquemia.
Tabla 1. Efectos adversos de la exposición al cadmio.
Página 12
El cadmio contenido en el humo del cigarro daña la función de los
espermatozoides a través de sus efectos citotóxicos.
2.3 Mecanismos tóxicos del Cadmio.
Produce modificaciones oxidativas del DNA, tal como la formación de 8-
hydroxiguanosina, e inmoviliza e interrumpe cambios bioquímicos en diferentes 18
tipos de células; por ejemplo en las células del hígado y riñón (Fernández y col.,
2003).
Los daños oxidativos sobre el DNA se han asociado con un incremento de
producción de especies reactivas de oxigeno (ERO) e interacciones entre este
metal y enzimas que participan en la reparación de las cadenas de DNA. A nivel
celular, el cadmio también induce diferentes cambios bioquímicos, los cuales se
asocian con el proceso de apoptosis (Fernández y col., 2003).
2.4 Especies Reactivas de Oxígeno.
Los radicales libres son cualquier especie química que contenga uno o más
electrones no apareados. Prácticamente todas los radicales libres que se
producen en el organismo derivan del oxígeno y del nitrógeno por la ganancia o
pérdida de un electrón (González, 2010).
Las especies reactivas del oxígeno (ERO) como el radical hidroxilo (·OH),
superóxido (O2·), singlete (1O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), son iones de
oxígeno, radicales libres y peróxidos, son moléculas muy pequeñas altamente
reactivas, debido a la presencia de una capa de electrones de valencia no
apareada que se forman de manera natural como subproductos del metabolismo
normal del oxígeno. Su presencia puede inducir estrés oxidativo (Halliwell y col.,
1989).
Página 13
Se sabe que las ERO y el estrés oxidativo son dos de las mayores causas en la
infertilidad masculina y defectos de la función espermática. Se ha observado la
formación de radicales libres en espermatozoides humanos y el daño oxidativo en
el DNA del esperma, lo que provoca alteraciones funcionales y estructurales,
además de que existe una gran relación entre la lipoperoxidación y la infertilidad
masculina (Shen y col., 2000).
2.5 Estrés oxidativo.
De manera natural, a concentraciones moderadas los radicales libres son
benéficos para determinados procesos celulares, pero a concentraciones elevadas
pueden desencadenar daños irreparables en la celula, a esta alteración se le
conoce como “estrés oxidativo”.
El estrés oxidativo es una situación en la que existe tanto un aumento en la
velocidad de generación de ERO como una disminución de los sistemas de
defensa, lo que resulta en una mayor concentración de estas (Shen y col., 2000).
2.6 Lipoperoxidación.
La lipoperoxidación (LPO) es el deterioro oxidativo de lípidos polinsaturados
(Tappel et al., 1989), es una reacción autocatalítica donde las ERO o radicales
libres sustraen átomos de hidrógeno a las moléculas de los lípidos polinsaturados
y por lo tanto se deterioran. La lipoperoxidación puede dañar lípidos y proteínas de
las membranas biológicas (Ibrahim y col., 2008).
La LPO se inicia cuando una especie reactiva reacciona con alguna parte de la
membrana formada por ácidos grasos polinsaturados y extrae un protón de un
metileno de la cadena, dejando un electrón sin aparear en este grupo, lo que
conllevará a un rearreglo molecular formando un dieno conjugado, el cual bajo
condiciones aeróbicas se unirá a oxígeno en el interior de la célula dando como
Página 14
producto un radical peroxilo. El radical extraerá otro protón de otro ácido graso
entrando a una fase de propagación, formando otro dieno conjugado que
reaccionará con O2 y formará más radicales peroxilo. Los radicales peroxilo
también pueden reaccionar con los protones extraídos y formar un lípido
hidroperoxidado (Halliwell y col., 1989).
Figura 6. Reacciones de la iniciación y propagación de la lipoperoxidación. Se
observa la extración de protones y la inducción de una reacción en cadena (Halliwell y
col.,1989).
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2.7 Antioxidantes.
Existen moléculas llamadas antioxidantes que se encargan de mantener el
equilibrio de radicales libres y por lo tanto el potencial oxido reducción. Estas
sustancias evitan el daño de las células al ceder electrones a los radicales libres
(Silverthorn, 2009).
2.7.1 Enzimas antioxidantes.
Superóxido-dismutasa y catalasa: La primera cataliza la dismutación del
superóxido a H2O2, el cual es neutralizado posteriormente por la catalasa.
Estas reacciones tienden a ser mayores en tejidos con elevada utilización
de O2 elevada como el hígado y los eritrocitos.
Glutatión-peroxidasa y glutatión-reductasa: Las primeras reducen
hidroperóxidos lipídicos y H2O2 al oxidar el glutatión, el glutatión oxidado se
reduce de nuevo por la glutatión reductasa (González, 2010).
2.7.2 Antioxidantes no enzimáticos.
Pueden ser de origen endógeno como el urato, la bilirrubina o proteínas como la
albumina. Otros pueden ser adquiridos en la dieta, como flavonoides o vitamina A,
C y E (González, 2010).
3. RESVERATROL.
El consumo de antioxidantes, parece prevenir o al menos disminuir el deterioro
funcional originado por un exceso de estrés oxidativo. Existe una gran diversidad
de antioxidantes los cuales tienen diferentes mecanismos de acción, entre ellos se
encuentra el resveratrol.
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Figura 7. Estructura química del resveratrol.
El resveratrol se encontró por primera vez en la raíz de la planta Veratrum
grandiflorum. Años más tarde se descubrió que la uva, vino tinto y arándanos,
entre otros alimentos lo contenían.
El resveratrol (3,5,4-trihidroxiestilbeno) es un polifenol natural, pertenece a la
misma familia de los flavonoides y taninos, y se le han atribuido características
medicinales, debido principalmente a sus propiedades antioxidantes que reducen,
de manera importante, la probabilidad de padecer enfermedades cardiovasculares
y pueden ayudar a tratar otros problemas de salud.
Algunos efectos benéficos atribuidos al resveratrol son:
Reduce la inflamación causada por el exceso de grasa acumulada en las
paredes internas de las arterias. Esto impide que se formen placas de
grasas en dichas paredes.
Evita la adhesión de plaquetas en las paredes arteriales, evitando la mala
circulación o falta de irrigación sanguínea.
Disminuye la formación de radicales libres que pueden producir
enfermedades como el cáncer.
Mejora la respiración celular, aumentando el gasto energético a base de
tejido graso.
Reduce el colesterol LDL o malo y triglicéridos.
Aumenta el colesterol HDL o bueno.
http://www.abajarcolesterol.com/%C2%BFque-es-el-resveratrol/http://www.abajarcolesterol.com/que-alimentos-contienen-resveratrol-para-bajar-el-colesterol/http://www.plantasparacurar.com/flavonoides/
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Mejora la utilización de glucosa, reduciendo la resistencia a la insulina.
Debido a su estructura química, el resveratrol es capaz de capturar radicales libres
y estabilizarlos por medio de resonancia de sus electrones y así poder ejercer su
efecto antioxidante (Quin y col., 2010).
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II. JUSTIFICACIÓN.
La intoxicación con Cd se manifiesta por una variedad de patologías que incluyen
disfunción sexual y problemas de fertilidad. Al parecer la toxicidad del metal está
mediada por la producción de radicales libres que incrementan los procesos
oxidativos.
Por otro lado, el resveratrol ha mostrado actividad antioxidante en algunos
estudios experimentales, lo cual le proporciona un potencial farmacológico en la
prevención de los efectos tóxicos del cadmio.
III. HIPÓTESIS.
Si el CdCl2 provoca daño espermático por la inducción de radicales libres, al pre-
tratar a los ratones con un compuesto que ha mostrado tener una actividad
antioxidante como el resveratrol, entonces se podrá evitar la espermatotoxicidad
causada por el CdCl2.
IV. OBJETIVOS.
General.
Determinar la actividad protectora del resveratrol sobre la toxicidad aguda
del CdCl2 durante la espermatogénesis en ratón.
Específicos.
• Determinar si el resveratrol previene las alteraciones morfológicas de los
espermatozoides causadas por CdCl2 en ratones.
• Evaluar la toxicidad aguda del CdCl2 durante la espermatogénesis en ratón.
• Determinar si el resveratrol tiene efecto sobre los niveles de
lipoperoxidación, en los testículos de los ratones expuestos a CdCl2.
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V. MATERIAL.
Material Biológico:
48 Ratones ICR macho.
Material y equipo:
Material de laboratorio Papel filtro
Pipetas Pasteur Porta y cubreobjetos
Micropipetas Cámara de Neubauer
Termómetro Microscopio compuesto
Equipo de disección Centrifuga
Viales Espectrofotómetro
Parrilla Sonicador
Goteros Balanza analítica
Balanza granataria Jaulas para ratón
Bebederos
Kit Testosterona EIA; Diagnostic Systems Laboratories. Inc.
Reactivos:
Preparación de la dilución espermática.
Formol al 10%.
Solución salina fisiológica.
Tinciones para evaluar la vitalidad y morfología de los espermatozoides.
Colorante Eosina-Nigrosina
Eosina 1% (Disolver en amortiguador de fosfatos).
Nigrosina 4% (Disolver en amortiguador de fosfatos).
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Amortiguador de fosfatos pH 7.4 (13.4 g de Na2HPO4. 7H2O; 3.4 g
NaH2PO4. H2O / litro).
Determinación de niveles de lipoperoxidación (TBAR´S).
Ácido Tricloroacético 15%.
Ácido Tiobarbitúrico 0.375%.
Ácido clorhídrico 0.25N.
Reactivo de Bradford.
VI. METODOLOGÍA.
Se emplearon cinco lotes de seis ratones macho cada uno, de la cepa ICR con un
peso entre 20 a 30 g, y se mantuvieron bajo condiciones controladas de
temperatura (21+/- 2 °C) y humedad relativa del 50 %, ciclos de luz-oscuridad de
12 horas cada uno ( luz de 9:00am a 21:00pm) y alimentación ad libitum.
Los animales recibieron los siguientes tratamientos de acuerdo al lote
correspondiente:
A) SSI
B) CdCl2 0.6 mg/Kg
C) Resveratrol
D) CdCl2 0.6 mg/Kg + Resveratrol
E) Carboximetil celulosa 0.3% (Vehículo)
Se administró por vía intragástrica los diferentes tratamientos diariamente durante
30 días, durante este tiempo se pesaron los ratones cada 5 días para poder
calcular la dosis requerida conforme al peso; las interacciones con cadmio (lote D)
se realizaron administrando primero el antioxidante y una hora después el cloruro
de cadmio.
Página 21
Al día 30 del tratamiento se eutanizaron los animales y se les extrajo las vesículas
seminales, el epidídimo y los testículos.
A un testículo se le determinaron los niveles de lipoperoxidación por medio de la
técnica de TBAR’s.
Se obtuvo un segmento de conducto de la cola del epidídimo y se introdujo en un
tubo con 1 mL de SSI a 37°C, se expulsó el líquido seminal formando una
suspensión espermática para su análisis posterior de viabilidad y morfología por la
tinción de Eosina-Nigrosina en donde los espermatozoides vivos no presentan
color y los muertos se tiñen de color fiusha; movilidad al microscopio y cuenta
espermática.
Análisis de movilidad.
Se colocó una gota de solución espermática sobre un portaobjetos atemperado y
se observó inmediatamente al microscopio, se determinó el porcentaje de células
espermáticas que presentaron movimiento progresivo y en línea recta, los que se
movían sin desplazarse y los que no presentaron movimiento.
Cuenta espermática.
Se realizó una dilución de 20 µL de la suspensión espermática con 200 µL de
formol. Se colocó una gota de esa dilución en cada compartimiento de la cámara
de Neubauer y se hizo el conteo de células. Para el cálculo final se promediaron
las cuentas de ambos compartimientos y se realizaron los cálculos para obtener
los millones de espermatozoides de acuerdo a las diluciones realizadas.
A = Cuenta * 5
Dónde:
Cuenta x = cuenta promedio de ambos compartimientos de la cámara de
Neubauer.
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Determinación de los niveles de lipoperoxidación (Técnica TBAR´s).
Una vez extraído el testículo se homogeneizo con agua destilada. Se adiciono 1
mL del reactivo de TBAR´s y se sometieron a baño maría en ebullición por 30
minutos, se preparó un blanco de reactivos. Transcurrido el tiempo, se dejaron
enfriar las muestras y se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos. Se
determinó la absorbancia del sobrenadante en un espectrofotómetro a una
longitud de onda de 535 nm. Se calculó la cantidad de MDA utilizando un
coeficiente de extinción de 1.56 x 105 M-1 cm-1. Los resultados se reportaron como
mM de MDA/g de tejido. (Buege y Austin, 1998).
Determinación de proteínas (Técnica de Bradford).
Se determinaron las proteínas totales por la técnica de Bradford utilizando una
curva de albumina sérica bovina (Anexo 1).
Las concentraciones obtenidas se encontraban en µg, por lo que se convirtieron a
mg, después se obtuvieron las proteínas por muestra al multiplicar los mg por un
factor. Este resultado se dividió entre la absorbancia obtenida para determinar los
mg de proteína.
Se midieron los niveles de testosterona en suero mediante el uso del Kit
Testosterona EIA; Diagnostic System Laboratories.Inc.
Análisis estadístico.
Los datos se expresan como media +/- EEM o mediana. El análisis estadístico se
llevó acabo usando el programa Sigma Plot 12.5. el valor de P
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Figura 8. Registro de peso promedio ganado de ratones que fueron
sometidos a distintos tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente
significativa (P = 0,128).
SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
Pes
o c
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ora
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)
0
10
20
30
40
VII. RESULTADOS.
En la figura 8, se muestra la ganancia de peso corporal de ratones sometidos a
diferentes tratamientos, en donde se puede observar que esta variable no se
modificó con ninguno de los tratamientos.
Registro de pesos.
Peso Relativo.
Testículos.
En la figura 9, 10 y 11 se muestran el peso relativo de los testículos izquierdo y
derecho y de la vesícula seminal respectivamente de ratones sometidos a
diferentes tratamientos, en las cuales no se observa diferencia significativa en
ninguna de estas variables.
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
Pes
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0.5
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Figura 9. Peso relativo de testículo izquierdo de ratones sometidos a
diferentes tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa
(P=0.722). Se representa la media ± error estándar.
Figura 10. Peso relativo de testículo derecho de ratones sometidos a
diferentes tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa
(P=0.107). Se representa la media ± error estándar.
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
Pe
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0.8
1.0
1.2
1.4
Vesícula Seminal
Figura 11. Peso relativo de la vesícula seminal de ratones sometidos a
diferentes tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa
(P=0.481). Se representa la media ± error estándar.
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
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20
30
40
50
60
70
Movilidad espermática.
En la figura 12, se muestra el porcentaje de movilidad espermática; en la movilidad
continua (A), se encontró que hay una disminución de esta en los ratones tratados
con cloruro de cadmio, así como un aumento en los lotes que fueron tratados
previamente con resveratrol. No hubo diferencia con los espermatozoides con
movimiento in situ (B), mientras que los inmóviles aumentaron con el cloruro de
cadmio y el co-tratamiento con resveratrol previno este incremento (C).
Figura 12. Porcentaje de espermatozoides de ratones sometidos a diferentes
tratamientos que presentan movimiento continuo (A), in situ (B) e inmóviles
(C) a: Diferencia significativa con respecto a CdCl2, b: Diferencia significativa con
respecto a CMC 0.3% y c: Diferencia significativa con respecto a SSI). (P =
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
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Cuenta espermática.
La figura 13, muestra los valores de cuenta espermática de los ratones sometidos
a los diferentes tratamientos, se observa una disminución de este parámetro en
los ratones tratados con cloruro de cadmio y una ligera mejora en los lotes pre
tratados con resveratrol aunque no de manera significativa.
Viabilidad espermática.
La figura 14, representa el porcentaje de espermatozoides vivos de ratones
sometidos a diferentes tratamientos. Se observa una disminución de los
espermatozoides vivos en los ratones tratados con cloruro de cadmio y un efecto
protector en el valor de esta variable en el lote previamente tratado con resveratrol
aunque no de manera significativa.
Figura 13. Concentración de espermatozoides expresado en millones de
espermatozoides por mililitro de ratones sometidos a diferentes
tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 0,111).
Se representa la media ± error estándar.
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
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Morfología espermática.
En la figura 15 se presenta el porcentaje de espermatozoides con anormalidades
morfológicas observándose un aumento en esta variable en los ratones tratados
con cloruro de cadmio y un efecto protector en el lote tratado previamente con
resveratrol.
Figura 14. Viabilidad espermática de ratones sometidos a diferentes
tratamientos. a: Diferencia significativa con respecto a SSI, b: Diferencia
significativa con respecto a CdCl2; P = 0,015; Se representa la media ± error
estándar.
a
b
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
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Lipoperoxidación.
En la figura 16 y 17, se muestra el contenido de malonaldehído en la
determinación de lipoperoxidación en espermatozoides y testículo
respectivamente, en los ratones sometidos a diferentes tratamientos.
Figura 15. Morfología espermática de ratones sometidos a diferentes
tratamientos. a:Diferencia significativa con respecto al lote de SSI, P =
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
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Figura 16. Niveles de lipoperoxidación en espermatozoides de ratones
sometidos a diferentes tratamientos. a: Diferencia significativa con respecto a
CdCl2., P = 0,015. Se representa la media ± error estándar.
Figura 17. Niveles de lipoperoxidación en testículo de ratones sometidos a
diferentes tratamientos. a: Diferencia significativa con respecto a CMC., P =
0,021). Representando mediana y percentiles a 25% y 75%. Mann-Whitney.
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SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC
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Testosterona.
La concentración de testosterona en suero de ratones sometidos a los diferentes
tratamientos se muestra en la figura 18, no se observa diferencia significativa con
los diferentes tratamientos.
Figura 18. Niveles de testosterona en suero de ratones sometidos a
diferentes tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa
(P = 0,337). Representando media ± error estándar.
Página 32
VIII. DISCUSIÓN.
Estudios previos indican que el cadmio induce daño testicular así como
alteraciones en los valores del análisis espermático en algunas especies de
animales incluyendo ratones, hamsters, marmotas, conejos, cuyos, perros y
ardillas (Xu, 1996), entre los que destacan disminución del tamaño de los
testículos y alteraciones en la calidad espermática, debido a la acumulación de
este metal sobre los tejidos, (Yang y col., 2003). También se ha observado el
aumento de estrés oxidativo que se manifiesta por el incremento en la generación
de radicales libres como son el anión superóxido (O2), hidroxilo (-OH) y el peróxido
de hidrogeno (H2O2), los cuales debido a su alta reactividad química pueden
aumentar la lipoperoxidación en la membrana de algunos tejidos como la del
testículo o de las células germinales y de este modo provocar daños significativos
en la función reproductiva que se traduce a problemas de fertilidad masculina
(Acharya y col.,2008).
En el presente estudio, se sometió a ratones macho a una exposición a cloruro de
cadmio por vía oral durante 30 días que es casi lo que dura un ciclo espermático
en ratón, durante todo el periodo de exposición se registraron los pesos de los
animales para determinar si el tratamiento altera la ganancia de peso en los
animales. En estudios realizados en pacientes que presentan intoxicación por
cadmio, se ha observado la disminución de peso corporal debido a los distintos
síntomas que se presentan como falta de apetito, nauseas, vómito y diarrea
principalmente (Marx JA, et al. 2009). De acuerdo a lo anterior en este estudio se
esperaría que hubiese una disminución del peso corporal en los animales que
fueron sometidos a cloruro de cadmio, sin embargo, se observa que el tratamiento
no afectó esta variable; esto se pudo deber a que el periodo de intoxicación al que
se sometieron los ratones fue insuficiente que no permitió observar los efectos
tóxicos en ellos, por lo que se sugiere una exposición prolongada.
Se hizo la determinación de los pesos relativos tanto de los testículos como de las
vesículas seminales y por los antecedentes se esperaba una disminución
significativa en los órganos de los ratones tratados con cloruro de cadmio, sin
Página 33
embargo, no se presentó una diferencia significativa entre los ratones tratados. La
diferencia puede deberse al tiempo de tratamiento, si se realiza una administración
crónica de cloruro de cadmio probablemente se observe el cambio de tamaño de
dichos órganos.
En humanos, tras la exposición continua al cadmio se ha asociado un efecto sobre
los espermatozoides causando un daño en la fertilidad (Al-Bader y col., 1999);
este daño es consecuente de anormalidades morfológicas de los
espermatozoides, disminución de la cuenta y movilidad espermática comparado
con los resultados de hombres fértiles y sanos (Roste y col., 2003; Siam et al.,
2005). Los resultados en el presente estudio coinciden con lo reportado, en donde
el porcentaje de espermatozoides que presentan movilidad continua y que cruzan
el campo disminuyó significativamente en el lote tratado con cloruro de cadmio; así
mismo el porcentaje de espermatozoides inmóviles tuvo un incremento
significativo en comparación con los ratones testigo.
También se ha reportado que la exposición al cloruro de cadmio provoca
interacciones en el sistema endócrino que llevan a la disminución en la producción
o secreción de hormono luteinizante, folículo estimulante, hormona liberadora de
gonadotropinas y testosterona que están involucradas en la espermatogénesis y
por lo tanto provoca la disminución de la cuenta, movilidad y viabilidad
espermática (Shen y col., 2000). En este estudio se observó que tanto en la
cuenta como la viabilidad espermática hubo una disminución en el porcentaje de
estas variables en los ratones tratados con cloruro de cadmio. Sin embargo se
observó un incremento de movilidad espermática en los lotes donde se realizó el
pretratamiento con resveratrol. Este efecto protector se puede atribuir a las
propiedades antioxidantes que presenta el resveratrol, ya que, se ve
incrementada la concentración y la viabilidad de los espermatozoides de ratones;
además de que el vehículo utilizado no presento alguna alteración.
Con respecto a la morfología espermática, se encontró que existe un aumento en
el número de espermatozoides con algún tipo de anormalidad cuando se trataron
los ratones con cloruro de cadmio, por otra parte se mostró disminución con la
Página 34
administración de resveratrol. Algunos autores an demostrado que las ERO
generadas en la catálisis metálica pueden incrementar errores meióticos y
deformación del esperma, se sabe también que la morfología del esperma es
controlada por el complejo autosomal y los genes específicos contenidos en el
cromosoma y por otro lado, mecanismos dependientes de oxigeno son claramente
importantes para inducir anormalidades espermáticas. (Acharya y col., 2008).
Por lo tanto, el aumento de espermatozoides morfológicamente anormales en
ratones tratados con cloruro de cadmio supone que las ERO generadas afectaron
alguna de las etapas de la división meiótica durante la espermatogénesis, y el
tratamiento con un antioxidante como el resveratrol tiene la capacidad de disminuir
este daño.
En otro estudio realizado donde se empleó CdCl2 como agente toxico, los
resultados demostraron que el CdCl2 incremento los niveles de oxidación testicular
(Oviedo, 2011). Los radicales libres pueden iniciar degradación peroxidativa de los
lípidos por abstracción de hidrógeno de los ácidos grasos (Zoltán, 2001),
destruyen a la membrana lipídica propiciando la formación de compuestos como el
malonaldehído los cuales pueden provocar mutagenesis o daño en el DNA.
Los peróxidos lipídicos derivados de acidos grasos poliinsaturados son inestables
y se descomponen para formar una serie de compuestos complejos. Entre estos
se incluyen compuestos carbonílicos, de los cuales el más abundante es el
malonaldehído, por esta razón el MDA es ampliamente usado como indicador de
peroxidación lipídica (Mallok y cols. 2011).
El resveratrol destaca por ser un polifenol que le atribuye su gran poder
antioxidante (Quin y col., 2010), lo que explica los resultados obtenidos, donde se
observó diferencia significativa en los niveles de MDA, entre los diferentes lotes de
ratones tratados.
En cuanto a los niveles de testosterona no se observó una diferencia significativa,
esto se pudo deber a que no fue el tiempo necesario del tratamiento para observar
Página 35
alguna alteración que pudiera modificar la concentración de dicha hormona; pero
eso no descarta la variación de testosterona a otros niveles.
Página 36
IX. CONCLUSIONES.
El CdCl2 disminuyó la cuenta, viabilidad y movilidad espermática.
El CdCl2 incrementó el número de espermatozoides anormales.
El CdCl2 produjo cambios en los niveles de lipoperoxidación de los
testículos.
El pre y co-tratamiento con el resveratrol en los ratones tratados con
cloruro de cadmio previno el daño espermático.
El efecto protector que mostro el resveratrol contra el CdCl2 en este
estudio se estima que es debido a su actividad antioxidante.
No se encontraron cambios en los niveles de testosterona.
Página 37
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Página 41
XI. ANEXO.
Proteínas Totales. Técnica de Bradford.
Se basa en el acoplamiento de un colorante con la proteína, donde existe una
relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas.
Se utilizo una curva con albumina sérica bovina con concentraciones de o, 10,
20, 40 y 80 µg/mL.
Se empleó el colorante de Bradford para proteínas, 10 µL de muestra y 1 mL
del reactivo.
La absorbancia de las muestras se determinó a una longitud de onda de 595nm
y se interpolaron en la curva para obtener la concentración de proteínas.