UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA
La Universidad Católica de Loja
ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMÉDICA
TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO
Estudio para la eliminación de Enterococos
presentes en aguas de la industria piscícola mediante
procesos de oxidación avanzada.
TRABAJO DE TITULACIÓN
Autora: Díaz Pardo, Thalía Monserrath
Director: Aguilar Ramírez, Silvio David Mgtr.
LOJA – ECUADOR
2018
Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NY-SA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es
2018
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es
ii
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN
Magister.
Silvio David Aguilar Ramírez.
DOCENTE DE LA TITULACIÓN
De mi consideración:
El presente trabajo de titulación: Estudio para la eliminación de Enterococos
presentes en aguas de la industria piscícola mediante procesos de oxidación
avanzada realizado por Thalía Monserrath Díaz Pardo, ha sido considerado y
revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del
mismo.
Loja, febrero de 2018
f)…………………..………….
iii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
“Yo Thalía Monserrath Díaz Pardo, declaro ser autora del presente
trabajo de titulación: Estudio para la eliminación de Enterococos
presentes en aguas de la industria piscícola mediante procesos de
oxidación avanzada, de la Titulación de Ingeniero Químico, siendo
Silvio David Aguilar Ramírez director del presente trabajo; y eximo
expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus
representantes legales de posibles reclamos o acciones legales.
Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y
resultados vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi
exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del
Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en
su parte pertinente textualmente dice: “Forman parte del patrimonio de
la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos
científicos o técnicos y tesis de grado o trabajos de titulación que se
realicen con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo)
de la Universidad”
f)……………………………………
Autor: Thalía Monserrath Díaz Pardo
Cédula: 1104070634
iv
DEDICATORIA
Dedico este trabajo principalmente a Dios, por haberme dado la vida y permitirme
el haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.
A mi madre Bertha, por ser la persona que me ha acompañado durante todo mi
trayecto estudiantil, y que ha sabido formarme con buenos valores que me ha
ayudado a salir adelante en los momentos más difíciles.
A mi abuelita Luz, quien a pesar de haberla perdido, cuando aún era muy pequeña,
ha estado siempre cuidándome y guiándome desde el cielo.
A Karla, quien se ha convertido en mi familia y ha estado a mi lado durante la
realización de todo este trabajo brindándome todo su amor y apoyo incondicional.
v
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por protegerme durante todo mi camino y darme fuerzas para
para culminar esta etapa de mi vida.
A mi madre Bertha, quien a lo largo de mi vida me ha demostrado su amor,
corrigiendo mis faltas y celebrando mis triunfos; y me ha enseñado a no rendirme
ante nada.
Al Mgtr. Silvio Aguilar, director de tesis y Dr. Daniel Rosado, por su tiempo y
valiosas guías y asesoramientos en la realización de este trabajo.
A mis compañeros y amigos, Andrés Espinoza., Rebeca Curipoma, Daniela
Valarezo, Andrés Coronel, Alejandro Ordóñez y Alexander Chamba por la
motivación y ayuda brindada durante toda la carrera estudiantil, demostrándome
que siempre podré contar con ellos.
vi
INDICE DE CONTENIDOS
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN ......................................................... II
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS ................................................................. III
DEDICATORIA ............................................................................................................................ IV
AGRADECIMIENTO ..................................................................................................................... V
INDICE DE CONTENIDOS ............................................................................................................ VI
INDICE DE TABLAS ................................................................................................................... VIII
INDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................IX
NOMENCLATURA ........................................................................................................................X
RESUMEN .................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ................................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 3
OBJETIVOS .................................................................................................................................. 6
OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................................... 6
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 6
CAPITULO I .................................................................................................................................. 7
MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................ 7
1.1 ACUICULTURA EN ECUADOR ..................................................................................................... 8
1.2 CALIDAD DEL AGUA DE MAR ..................................................................................................... 8
1.3 AGUA DE LASTRE .................................................................................................................... 9
1.4 ENTEROCOCCUS SPP. ............................................................................................................ 10
1.4.1 Microorganismos indicadores ....................................................................................... 10
1.4.2 E. faecalis como indicadores de contaminación fecal ................................................... 11
1.4.3 Nivel aceptable de E. faecalis en muestras de agua de mar ......................................... 11
1.5 EFECTOS SOBRE LA SALUD ...................................................................................................... 11
1.6 PROCESOS DE OXIDACIÓN AVANZADA (POA) ............................................................................. 12
1.6.1 Desinfección por UV (Fotólisis) ...................................................................................... 12
1.6.2 Proceso fotólisis (UV/H2O2) ............................................................................................ 12
1.6.3 Proceso Foto-Fenton (UV/H2O2/Fe) ............................................................................... 13
1.7 VENTAJA DE LOS POA ........................................................................................................... 13
CAPITULO II ............................................................................................................................... 15
MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................................... 15
vii
2.1 UBICACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO ............................................................................................ 16
2.1.1 Muestreo ....................................................................................................................... 17
2.2 ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS .......................................................................... 17
2.3 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ......................................................................................... 19
2.4 MICROORGANISMO DE ESTUDIO .............................................................................................. 21
2.5 PROPAGACIÓN DE LA CEPA ..................................................................................................... 21
2.6 CONSERVACIÓN DE LA CEPA .................................................................................................... 21
2.7 CULTIVO DE LA CEPA EN AGAR INCLINADO ................................................................................. 22
2.7.1 Preparación de Agar inclinado ...................................................................................... 22
2.7.2 Inoculación de la cepa en Agar inclinado ...................................................................... 22
2.8 CRECIMIENTO DEL INÓCULO EN CALDO NUTRIENTE ....................................................................... 23
2.8.1 Preparación de caldo nutriente ..................................................................................... 23
2.8.2 Siembra del inóculo en caldo nutriente ......................................................................... 24
2.9 DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS PARA EL MEDIO DE CULTIVO ................................................. 24
2.9.1 Peptonas Bacto .............................................................................................................. 24
2.10 REACTORES UV ................................................................................................................. 25
2.11 ENSAYOS.......................................................................................................................... 26
2.11.1 Preparación del agua de mar sintética ........................................................................ 26
2.12.2 Procedimientos de oxidación avanzada ...................................................................... 27
2.12.2.1 Tratamiento UV ........................................................................................................ 28
2.12.2.2 Tratamientos UV/H2O2 y UV/H2O2/Fe3+ .................................................................... 28
2.13 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO ............................................................................................. 28
2.13.1 Preparación de Agar KF Estreptococos y Cloruro de Tetrazolio para siembra en cajas
petri …………………………………………………………………………………………………………………………………..28
2.13.2 Análisis de E. faecalis en muestras de agua. .............................................................. 29
2.13.3 Recuento bacteriano ................................................................................................... 29
2.14 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................................................ 30
CAPITULO III .............................................................................................................................. 32
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 32
3.1 CARACTERIZACIÓN DEL AGUA .................................................................................................. 33
3.1.1 Comparación de resultados de análisis del agua Vs normativa. ................................... 33
3.2 EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN BACTERIANA ........................................................................ 36
3.3 CINÉTICA DE ELIMINACIÓN DE E. FAECALIS .................................................................................. 37
3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO SPSS ................................................................................................... 39
CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 43
RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 44
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 45
ANEXOS .................................................................................................................................... 32
viii
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Calidad bacteriológica de agua de mar para uso recreativo con contacto
primario considerando las bacterias E. faecalis como indicador bacteriológico . 11
Tabla 2. Análisis fisicoquímicos realizados ........................................................ 18
Tabla 3. Equipos usados en el laboratorio. ........................................................ 19
Tabla 4. Materiales usados ............................................................................... 20
Tabla 5. Reactivos usados ................................................................................ 20
Tabla 6. Metodología experimental aplicada ..................................................... 27
Tabla 7. Parámetros de calidad del agua de mar. Puerto Hualtaco y piscina
camaronera ....................................................................................................... 33
Tabla 8. Criterios de calidad de las aguas para sus distintos usos .................... 34
Tabla 9. Resultados de Análisis de varianza (ANOVA) de un factor ................. 39
Tabla 10. Resultados del Análisis Post hoc de Tukey ....................................... 39
Tabla 11. Resultados de grupos que presentan valores de las medias ............. 40
Tabla 12. Condiciones de trabajo para la lámpara reactor UV-C ....................... 33
ix
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Células de Enterococcos ssp ............................................................. 10
Figura 2. Provincia de El Oro, Cantón Huaquillas. Puerto Hualtaco .................. 16
Figura 3. Etiqueta de muestreo ......................................................................... 17
Figura 4. Preparación y conservación de la cepa E. Faecalis ........................... 21
Figura 5. Preparación de Agar inclinado ........................................................... 22
Figura 6. Inoculación de E. faecalis en agar inclinado ....................................... 23
Figura 7. Preparación de Agar inclinado y Crecimiento de bacteria .................. 24
Figura 8. Esquema general del reactor de flujo continuo .................................. 25
Figura 9. Agua de mar sintética, inoculada con E. faecalis. Concentración: 6X106
UFC/ml .............................................................................................................. 27
Figura 10. Siembra, incubación y conteo de colonias de Enterococcos faecalis 29
Figura 11. Diluciones decimales de E. faecalis 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 sembradas
en placas ........................................................................................................... 30
Figura 12. Curvas eliminación de E. faecalis, evolución en el tiempo hasta 66
segundos ........................................................................................................... 36
Figura 13. Cinética de eliminación de E. faecalis .............................................. 38
x
NOMENCLATURA
ATT American Type Culture Collection
EPA Agencia de Protección Ambiental
Log10 Logaritmo decimal
ml Mililitro
L Litro
NMP Número más probable
OMI Organización Marítima Internacional
Ph Potencial de hidrógeno
POA Procedimientos de oxidación avanzada
S Segundos
µm Micrómetro
µl Microlitro
°C Grados Celsius
•OH Radical hidroxilo
UV Radiación ultra violeta
1
RESUMEN
En el presente trabajo se realizó el estudio de inactivación de Enterococcos
faecalis en agua de mar sintética a escala de laboratorio, utilizando un reactor de
flujo continuo de luz UV-C, a diferentes tiempos de exposición, se determinó la
cinética de eliminación; mediante procesos de oxidación avanzada (UV, UV/H2O2,
y UV/H2O2/Fe3+) a diferentes concentraciones. Los resultados sugieren una buena
eficiencia en cuanto a la desinfección microbiana; pero a nivel estadístico la
mayoría de los tratamientos no muestran diferencia significativa en la media
cinética, ya que la adición del reactivo catalizador en rangos pequeños, no
aumenta la cinética de eliminación. Sin embargo, realizando varios ensayos, la
reducción óptima se consigue con el tratamiento UV/H2O2/Fe3+ con
concentraciones de 30 ppm de H2O2 y 6 ppm de Fe3+, que logra reducir el 99,999%
de concentración bacteriana en un tiempo de 36 segundos y que presenta un
aumento significativo en la cinética de eliminación 0,41 s-1. Por ello este
tratamiento se considera idóneo para futuras evaluaciones de diferentes matrices
de agua.
PALABRAS CLAVE: Acuicultura, Enterococcos faecalis, oxidación avanzada y
desinfección microbiológica.
2
ABSTRACT
In the present work the study of inactivation of Enterococcos faecalis in synthetic
seawater at laboratory scale was carried out, using a continuous flow reactor of
UV-C light, at different exposure times, the kinetics of elimination was determined;
through advanced oxidation processes (UV, UV/H2O2, and UV/H2O2/Fe3+) at
different concentrations. The results suggest good efficiency in terms of microbial
disinfection; but at the statistical level most of the treatments did not show a
significant difference in the kinetic mean, since the addition of the reagent in small
ones does not increase the kinetics of elimination. However, performing several
tests, the optimal reduction is achieved with the UV/H2O2/Fe3+ treatment with
concentrations of 30 ppm of H2O2 and 6 ppm of Fe3+, which manages to reduce
99.999% bacterial concentration in a time of 36 seconds and that presents a
significant increase in elimination kinetics 0.41 s-1. Therefore, this treatment is
considered suitable for future evaluations of different water matrices.
KEY WORDS: Aquaculture, Enterococcos faecalis, advanced oxidation and
microbiological disinfection.
3
INTRODUCCIÓN
La acuicultura en Ecuador ha sido una de las principales actividades económicas
de mayor crecimiento productivo y económico durante los últimos años (Monteros
& Salvador, 2015) especialmente en la provincia de El Oro, donde la siembra y
cosecha de camarón es una de las principales actividades productivas; en esta
provincia se cosecha un 40% de todo el crustáceo que exporta el Ecuador
(Durazno, Jiménez, & Moral, 2007).
Por ello en la acuicultura la calidad del agua de mar es un factor muy importante
en el proceso de producción y expansión de sus sistemas, la salud de la población
y conservación del ecosistema (Jorquera et al., 2002; Ministerio del Ambiente,
2014). Sin embargo existen varios estudios que reportan altas concentraciones de
Enterococos Faecalis, Escherichia Coli, y algunos géneros de Vibrio. (Soler et al.,
2010; Larrea et al., 2013). Estos microrganismos patógenos se han ido
incrementado con la magnitud de siembra del camarón; y a pesar de ello, esta
actividad no ha sido ampliamente investigada en cuanto al tratamiento del recurso
hídrico (Saldias, 2001; Veuthey & Gerber, 2012) ocasionando impactos
ambientales.
Por tanto, es necesario aplicar metodologías orientadas a la desinfección de
cargas contaminantes en los suministros de agua, o que eviten el desarrollo de
microorganismos potencialmente patógenos (Pozo & Velasteguí, 2012).
Los tratamientos destinados al agua de mar se encuentran poco desarrollados en
la actualidad (Penru et al,. 2012). Por ello, muchos tratamientos tradicionales no
pueden ser utilizados en el tratamiento de aguas contaminadas, ya que algunos
de estos métodos no son capaces de eliminarlos completamente, o causan
efectos contrarios sobre lo que se quiere llegar, considerándose ineficientes (Liu,
Qiu, & Huang, 2011); como el uso de la cloración que presenta numerosos
inconvenientes, como la producción de tóxicos, subproductos cancerígenos y
junto con altos costes de mantenimiento. (Ortega., et al 2013). Por esta razón, se
han buscado nuevas tecnologías aplicadas que sean económicas y efectivas, en
4
términos de disminución de microrganismos patógenos de manera permanente y
eficiente (Garcia, 2014).
Una alternativa viable para tratar este tipo de microrganismos son los procesos de
oxidación avanzada (POA), que se basan en la oxidación química del
contaminante mediante un proceso en donde se forman radicales (•OH), que
atacan las moléculas orgánicas de forma rápida, además poseen una alta
reactividad e inmediatamente desaparecen después de reaccionar
(Muruganandham et al., 2014). Estos métodos se pueden desarrollar a escala de
laboratorio en reactores de tipo continuo, obteniendo agua libre de contaminantes
orgánicos, sin representar un mayor costo o riesgo para la salud; utilizando
organismos indicadores de calidad (González-Bahamón et al., 2011).
Los organismos indicadores de calidad de aguas son organismos cuyas
densidades o concentraciones en el agua, pueden ser relacionadas con el riesgo
a la salud que implica el uso de esta (Rodríguez., et al 2012); por ello, E. faecalis
es un indicador de contaminación fecal para aguas costeras (Vergaray et al,. 2007)
y de gran importancia por su por su resistencias a condiciones salinas y a varios
tratamientos de desinfección (Larrea-Murrell., et al 2013)
El uso de estas tecnologías (POA) para el tratamiento de aguas marinas implican
un monitoreo y control constante de las variables físico-químicas y sanitarias del
agua, degradación eficaz de componentes recalcitrantes sin generar un flujo de
residuos secundario, con la propósito de reutilizar el agua, para nuevas
producciones de camarón o uso recreativo (Galli, & Sal, 2007; Dewil et al., 2017).
Dentro de las nuevas tecnologías que cumplan con los criterios mencionados, se
ha planteado el uso de tratamientos UV (Fotólisis) radiación ultravioleta, Fotólisis
(UV/H2O2) y Foto-Fenton (UV/H2O2/Fe3+), que utilizan reactivos como peróxido de
hidrógeno (H2O2) para que actúe como promotor de los procesos (Moreno-andrés
et al., 2015) y cloruro de hierro hexahidratado que funciona como catalizador para
la formación de radicales (•HO) y radiación UV para una mejor eficiencia en la
reducción de contaminantes orgánicos (González-Bahamón et al., 2011).
5
Por ello, la finalidad de esta investigación radica en el estudio del efecto de una
matriz de agua sobre el proceso de inactivación de E. faecalis mediante procesos
de oxidación avanzada con el objetivo de determinar la cinética de eliminación.
6
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar la inactivación de Enterococos faecalis mediante los procesos UV,
UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+, en agua de mar proveniente de la industria acuícola.
Objetivos específicos
Ubicar el área de estudio donde se va a llevar a cabo la investigación.
Caracterizar el agua de mar destinada a la industria acuícola.
Analizar las alternativas (UV, UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+), para la
eliminación de la bacteria Enterococos faecalis en agua de mar sintética.
Establecer el mejor proceso para el tratamiento de agua de mar
Determinar la cinética de eliminación de Enterococcos
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO
8
1.1 Acuicultura en Ecuador
De acuerdo a los datos proporcionados por la Cámara Nacional de Acuacultura,
Ecuador produce cerca del 60% del camarón de América, donde se registran 187
empresas destinadas a la producción y exportación de camarón, que ocupan en
la actualidad, alrededor de 210.000 hectáreas, donde solo en el primer semestre
del año 2016 se produjo 154.885 toneladas de camarón, equivalentes a US $
1.116,314 millones en valor FOB (Libre a bordo), generando plazas de empleo y
contribuyendo con la economía nacional (Bernabé, 2016; Muñoz et al., 2017).
Sin embargo, el cultivo intensivo del camarón excede la capacidad de cargas de
los estanques, o piscinas camaroneras, ocasionando el deterioro de piscinas,
sistemas de cultivo y brote de enfermedades tanto al camarón como al ser humano
(Veuthey & Gerber, 2012); puesto que el agua contiene, nutrientes empleados
para acelerar y aumentar el crecimiento del camarón, drogas y antibióticos que
generan mayor resistencia en el camarón, dando lugar a que formen
microrganismos patógenos (García, 2003), que sin la revisión necesaria de las
normas de protección del medio ambiente, constituyen un potencial
contaminación, considerado como el mayor problema ambiental en el cultivo de
camarón (Boyd, 2001; Moreno, 2010).
1.2 Calidad del agua de mar
La calidad del agua de mar depende de muchas variables, como elementos
químicos contenidos, organismos biológicos, materias en suspensión, y las
características físicas y estéticas, como el color, sabor y olor (Ramírez, et al.,
2017); de ahí su aprovechamiento, utilización y mantenimiento constituye
elementos esenciales en cualquier estrategia en el desarrollo. De manera que la
importancia de establecer la calidad de agua se constituye en mantener las
características físicas, químicas y microbiológicas; y que no se vea afectada por
contaminaciones químicos, residuos industriales u otros. (Guzman & Narvaez,
2010).
A diferencia de los derrames y otras contaminaciones causadas por el tráfico
marítimo; las especies y organismos biológicos, no pueden ser desinfectados
9
mediante medios físicos artificiales, ni absorbidos o eliminados de forma natural
por los océanos. Una vez asentados son casi imposibles de erradicar, pudiendo
causar daños muy graves en el hábitat natural. (P. González & Salamanca, 2013).
1.3 Agua de lastre
El agua de lastre se bombea en los buques con el fin de proporcionar estabilidad
y maniobrabilidad cuando estos se transportan sin el peso suficiente de la carga
(Jung, 2013).
Los buques pesqueros utilizan una red lastrada que barre el fondo del mar
capturando todo lo que encuentra a su paso (MAE, 2013); donde además de agua,
hay partículas de sedimentos y organismos, que se liberaran cuando se descarga
el agua de lastre, a través de sistemas de bombeo y tuberías (Moreno-Andrés et
al., 2016); y que además, se encuentran en constante aumento debido a que el
comercio internacional se realiza a través del transporte marítimo (Martiínez et al.,
2015)
Algunos de los organismos que se liberan provienen de los efluentes de las
piscinas de camaroneras, que como ya se mencionó, contienen residuos de
alimentos, fertilizantes, microrganismos etc. (Moreno, 2013). Estos organismos
transportados con agua de lastre han encontrado una forma para desarrollarse y
propagarse en el nuevo hábitat, convirtiéndose en especies invasoras (Moreno-
Andrés et al., 2016), que pueden generar cambios en los ecosistemas marinos y
costeros por desplazamiento de las especies nativas, así como daños en la salud
del hombre y las actividades económicas (Velalcázar, 2015).
Por ello, la OMI (Organización Marítima Internacional) ha implementado un
Convenio Internacional para el manejo de las aguas de lastre y sedimento de los
buques, adoptado en el 2004 y que entra en vigencia a partir del 2017, en donde
se establece que los buques deben implementar un sistema progresivo de gestión
de aguas de lastre, con el objetivo de prevenir, reducir los riesgos para el medio
ambiente y la salud de los seres humanos; por lo tanto, los organismos indicares
de contaminación E. faecalis, forman parte de los organismos que deben ser
10
controlados a la hora de descargar las aguas de lastre, y que deben cumplir con
límites máximos permisibles (OMI, 2004; Moreno, 2013).
1.4 Enterococcus spp.
Los Enterococcus spp son células esféricas u ovoides, de tamaño 0,6 – 2 × 0,6 –
2,5 µm (Díaz et al., 2010). Son cocos gram positivos ubicuos, que se encuentran
aislados, de a pares, o formando cadenas cortas tal como se muestra en la Figura
1, (Rodríguez, 2001; Acosta-Gnass, 2005 y Ortega, 2010). Diferenciados en 1899
de otros cocos que se disponían en cadenas por su bajo poder patógeno,
pertenecían al grupo D de la clasificación de Lancefield; sin embargo, a mediados
de la década de 1980 fueron clasificados en su propio género. (Lopardo, 2004).
Figura 1. Células de Enterococcos spp Fuente: Revista chilena de Infectología. Retrato microbiológico (2007) Elaboración: Revista chilena de Infectología. Retrato microbiológico (2007)
1.4.1 Microorganismos indicadores
Para determinar la calidad bacteriológica del agua se utilizan organismos como
indicadores bacteriológicos, que evalúan la presencia y abundancia de bacterias
(Kacar & Omuzbuken, 2017). La evaluación del potencial de riesgo para la salud
se basa en datos de concentración del indicador bacterias, que indica
indirectamente la presencia de microorganismos patógenos (Lušić et al., 2017).
11
1.4.2 E. faecalis como indicadores de contaminación fecal
En 2003, la Secretaría de Salud introdujo a los Enterococos como indicador
bacteriológico de contaminación fecal para aguas marinas de uso recreativo con
contacto primario (Silva et al., 2007), por su habilidad para crecer a 6.5% NaCl,
pH 9.6, temperaturas que oscilan entre 10 – 45 ºC; y la relación directamente con
enfermedades gastrointestinales, respiratorias y dermatológicas (Rodríguez,
2012). Por ello son considerados como el indicador más eficiente para evaluar la
calidad de agua de mar. (Secretaría de Salud, 2004)
1.4.3 Nivel aceptable de E. faecalis en muestras de agua de mar
Los criterios de calidad microbiológica de aguas costeras para uso
recreativo según, (Secretaría de Salud, 2004) establece, Tabla 1.
Tabla 1. Calidad bacteriológica de agua de mar para uso recreativo con contacto primario considerando las bacterias E. faecalis como indicador bacteriológico.
Según (NMX-AA-120-SCFI-2016, 2016), la calidad bacteriológica del agua
de mar deberá ubicarse dentro del límite de 100 Enterococcos NMP/100
ml.
1.5 Efectos sobre la salud
La presencia de Enterococcos fecales en agua insinúa la contaminación fecal y
una posible presencia de patógenos entéricos como consecuencia (Martzy et al.,
2017). Se relacionan directamente con gastroenteritis, conjuntivitis, dermatitis,
Fuente: Secretaria de Salud, 2004 Elaboración: Secretaria de Salud, 2004
12
entre otras; ocasionadas por ingestión, contacto e inhalación de estos
microorganismos a través del agua. (Vergaray et al., 2007; Díaz et al., 2010)
1.6 Procesos de oxidación avanzada (POA)
Los procesos de oxidación avanzada (POA), son métodos de oxidación en fase
acuosa recomendadas en el tratamiento de agua residual (Dewil et al., 2017). Su
acción se basa en la producción del radical hidroxilo extremadamente oxidante
(•OH), que se obtiene mediante reacciones fotoquímicas homogéneas de H2O2
irradiada con UV (Sauer et al., 2006); estos atacan la estructura química de
algunos compuestos orgánicos y la pared celular de los microorganismos
presentes en aguas (Giannakis et al., 2015), es decir son capaces de destruir los
contaminantes orgánicos y los gérmenes patógenos (Rodríguez-Chueca etal.,
2015).
1.6.1 Desinfección por UV (Fotólisis)
La radiación UV es un tratamiento físico sin dosis químicas, que transfiere energía
electromagnética desde una lámpara de vapor de mercurio al material genético
del organismo (Zhang, Hu, & Shan, 2014). Cuando la radiación UV penetra en las
paredes de la célula de un organismo y alcanza su núcleo, ésta destruye la
capacidad de reproducción de la célula al distorsionar parte de su ADN. La eficacia
del sistema de desinfección con luz ultravioleta depende de las características del
agua, la intensidad de la radiación, el tiempo de exposición de los
microorganismos a la radiación y la configuración del reactor (EPA, 1999; Nebot
et al., 2007).
1.6.2 Proceso fotólisis (UV/H2O2)
Las radiaciones ultravioletas tienen un fuerte potencial de desinfección y algunas
propiedades oxidativas que en combinación con hidrógeno peróxido (UV/H2O2)
conducen a un avanzado proceso de oxidación mejorado debido a la formación
de hidroxilos radicales (Penru et al., 2012) de acuerdo con la (reacción 1).
H2O + hv 2 °OH (reacción 1)
13
1.6.3 Proceso Foto-Fenton (UV/H2O2/Fe)
En el caso de la fotocatálisis homogénea, el proceso foto–Fenton ha sido uno de
los más profundamente ensayados y es el más efectivo en la eliminación de
contaminantes orgánicos en soluciones acuosas (González, 2015). En este
proceso el reactivo de Fe(II) se oxida a Fe(III) descomponiendo el peróxido de
hidrógeno para formar radicales hidroxilo (reacción 2), el empleo de la radiación
UV incrementa el poder de oxidación principalmente por la foto-reducción de
Fe(III) a Fe(II) la cual produce más radicales hidroxilo (reacción 3) y de esta forma
se establece un ciclo en el reactivo de Fenton y se producen los radicales hidroxilo
para la oxidación de compuestos orgánicos (reacción 4) (Hincapié-Mejía et al.,
2011); además la velocidad de disminución de contaminantes orgánicos con la
reacción Fenton, se aumenta cuando el sistema es irradiado con luz UV visible
(Oquendo, 2011)
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH° + OH- (reacción 2)
Fe3+ + H2O + hv → Fe2+ + OH° + H+ (reacción 3)
RH + OH° → fotoproductos + H2O (reacción 4)
El uso de esta tecnología tiene como ventaja que el hierro es abundante y no
tóxico, el peróxido de hidrógeno es fácil de manejar y ambientalmente benigno, no
se forman compuestos clorados y no existen limitaciones de transferencia de
masa por tratarse de un sistema homogéneo. (Domènech & Jardim, 2000; Litter,
2005)
1.7 Ventaja de los POA
Degradación efectiva de componentes insistentes sin originar una corriente
secundaria de residuos (Pablos et al., 2013).
El uso de catalizadores tales como óxidos de metales aceleran las
reacciones de oxidación parcial, llevando una mineralización más completa
del efluente; además alteran la distribución de subproductos y favorecen
la formación de compuestos menos tóxicos (Quintanilla et al., 2006).
CAPITULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
16
En este apartado se describe la ubicación del área de estudio, materiales y
metodología utilizados en la inactivación de E. faecalis. Los ensayos se realizaron
a escala de laboratorio con agua de mar sintética contaminada con cepa pura de
la bacteria, a la cual se somete a los procesos de oxidación avanzada descritos y
se evalúa el grado de inactivación de la misma, para ello se utilizó los materiales
y reactivos descritos en las Tablas 3,4 y 5.
2.1 Ubicación del área de estudio
El área de estudió se situó en una camaronera ubicada en Puerto Hualtaco, del
Cantón Huaquillas (Lat. 3º 28’ 52.97” S y Long. 80º 14’ 36” O), provincia de El Oro,
al sur del país. Véase Figura 2.
Figura 2. Provincia de El Oro, Cantón Huaquillas. Puerto Hualtaco Fuente: Google Mapas, 2017 Elaboración: Google Mapas, 2017
17
2.1.1 Muestreo
Mediante convenios se tuvo acceso a una camaronera ubicada en el Puerto
Hualtaco, en donde se identificó los puntos de muestreo mediante coordenadas
geográficas, se realizó la colección dentro y fuera de las piscinas camaroneras
siguiendo la Norma: INEN 2169:98 AGUA. CALIDAD DEL AGUA. MUESTREO.
MANEJO Y CONSERVACION DE MUESTRAS.
Las muestras fueron recolectadas en galones de 20 L para análisis fisicoquímicos
y frascos de 250 ml estériles para microbiológicos, todos etiquetados de forma
detallada, con número de muestra, sitio de muestra, fecha y hora, tal como se
muestra en Figura 3.
Figura 3. Etiqueta de muestreo Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.2 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos
Los análisis se llevaron a cabo en el laboratorio acreditado de aguas de la sección
Ingeniería Ambiental de la UTPL, todos los parámetros fueron basados en la
metodología “Standard Methods of Water 22nd edition” de acuerdo a las técnicas
estandarizadas.
Algunos parámetros fueron medidos in situ como: pH, oxígeno disuelto,
temperatura y conductividad mediante un multiparámetro HQ40D marca HACH.
Las muestras fueron llevadas al laboratorio donde se culmina su análisis con los
parámetros que se muestran en la Tabla 2.
MUESTRA #1
Piscina Camaronera: Entrada
12/09/2016
09:00 AM
18
Tabla 2. Análisis fisicoquímicos realizados
Parámetro Unidades
Sólidos totales Mg/L
Nitritos mg/L
Nitratos mg/L
Coliformes totales UFC/100 ml
Enterococcos faecalis UFC/ml
Cloruro mg/L Fuente: Autora Elaboración: Autora
La cantidad de Nitritos se determina por espectrofotometría, usando el método
diazotización. En celdas de 25 ml se añade la muestra de agua (blanco), y en otra
celda, la muestra de agua y el reactivo NITRIVER3. Se agita para homogenizar y
finalmente medir. Así mismo la cantidad de nitratos por el método de reducción de
Cadmio; en una celda de 25 ml se añade agua desionizada (blanco), y en otra
celda, la muestra de agua; el reactivo NITRIVER5 se añade a los dos celdas; se
agita y se mide la concentración.
El cloruro total se mide por volumetría, que consiste en añadir 50 ml de la muestra
en un vaso de precipitación de 250 ml y agregar 5 gotas de cromato de potasio
(K2CrO4) al 10%, para titular con nitrato de plata (AgNO3) 0,0141N, hasta observar
un viraje de amarillo claro a ligeramente rojizo; y calcular la concentración.
La presencia de coliformes totales se determinó mediante la técnica normativa de
Filtración por membrana, que consiste en la filtración de un volumen medido de
muestra (100 ml) a través de una membrana de nitrato de celulosa y su incubación
en un medio de cultivo selectivos a 44.5 ºC (APHA/AWWA/WEF, 2012).
19
2.3 Equipos, materiales y reactivos
Tabla 3. Equipos usados en el laboratorio.
Equipos
Modelo
Función
Lámpara UV (254nm)
OPP-625, 1.0GPM
eliminación bacteriana
Bomba peristáltica
Masterflex® L/S®
(600RPM)115/230 VAC 0,
07523-80
Control del caudal
Estufa de cultivo Serie CL
STD – Control estándar digital
Mantener a una
temperatura controlada
Autoclave vertical
automática de 50 litros
CVQ-B50L
Esterilización de
material
Contador de colonias
manual
Quebec®
Facilitar el conteo de colonias bacterianas
Cámara de flujo laminar
vertical – CHC LAB
CHC-CLB-201-04
Proporcionar un ambiente estéril para el
cultivo de microrganismos
Mechero de alcohol
Asegura condiciones de esterilidad
Freezer LabTech
Congeladores Haier -86° ULTDW-86L959
Preservación de microorganismos
Fuente: Autora Elaboración: Autora
20
Tabla 4. Materiales usados
Materiales Función
Frascos boeco de tapa rosca Guardar y mezcla de muestras
Tubos de ensayo con tapa rosca Toma de muestras y diluciones
Balones de aforo de 1000 ml Preparación de muestras
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml Toma de muestras
Probetas de 100 y 200 ml Distribución homogénea de agua
Manguera Conductor del medio líquido
Pinzas universales Sujetar la lámpara UV
Pinzas doble nuez Sujetador de pinza universal
Soporte universal Soporte al reactor
Fuente: Autora Elaboración: Autora
Tabla 5. Reactivos usados
Fuente: Autora Elaboración: Autora
Reactivos
Marca Función
KF Streptococcus Agar, 500 Gr
DIFCOTM
Medio de crecimiento de bacteria E. faecalis
Caldo Nutriente Agar Nutriente
DIFCOTM
Medio de conservación y enriquecimiento bacteriano
Peptonas DIFCOTM
Medio de cultivo bacteriano
Cepa de referencia E. faecalis
ATCC® 19433™ Medio para inocular las muestras
Cloruro de Sodio NaCl
MERCK Compuesto del agua de mar sintética
Solución de peróxido de
hidrógeno al 30%
HX0640 EMD MILLIPORE
Medio para generar radicales hidroxilo para los procesos oxidación avanzada
Hierro (III) Cloruro hexahidratado
EMSURE® ACS Catalizador para los procesos oxidación
avanzada
Agua destilada Medio para preparar
21
2.4 Microorganismo de estudio
Se utilizó la cepa comercial E. faecalis ATCC® 19433™ de ATCC Company
(E.E.U.U), organización global de recursos y estándares de materiales biológicos
destinado a fines de investigación de laboratorio.
2.5 Propagación de la cepa
Se agregó 5 ml de agua destilada estéril al vial que contiene la cepa replicada y
seguidamente incubar por 24 horas a 37°C. Para una mayor propagación se
realizó una siembra en cajas petri con Agar BHI (Infusión cerebro corazón), de
igual manera por 24 horas a 37°C.
2.6 Conservación de la cepa
La preservación de la cepa de E. faecalis, se realizó por congelación a -76°C para
reducir su metabolismo hasta prácticamente anularlo. Para ello se preparó DMSO
(dimetilsulfóxido) al 10%, que según (Waites et al., 2001) neutraliza los efectos de
las sales. Posteriormente se preparó en microtubos roscados de 0,5 ml, 900 µl de
cepa E. faecalis con 100µl de DMSO; se llevó a congelación en el Deep freezer,
hasta el momento de realizar la inoculación. Este proceso de conservación
mantiene la bacteria aproximadamente 2 años, Figura 4.
Figura 4. Preparación y conservación de la cepa E. faecalis Fuente: Autora Elaboración: Autora
22
2.7 Cultivo de la cepa en Agar inclinado
2.7.1 Preparación de Agar inclinado
Se pesó 2,3 gramos de agar nutriente y se mezcla hasta disolver en 100 ml de
agua destilada en un frasco de tapa rosca de 250 ml. Una vez disuelto, se calienta
a ebullición y se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 120°C. Se distribuyen 5
ml del medio de cultivo líquido en tubos de ensayo de 16 x 100 mm, en un total de
20 tubos, se verifica que se realice una distribución homogénea evitando pérdidas
del medio y colocando los tubos en una posición inclinada sobre una superficie
recta, tal como se muestra en la Figura 3, dejar enfriar hasta solidificación del
medio, quedando listos para la siembra. Se preparan varios tubos conforme al
número de experimentos, Figura 5.
Figura 5. Preparación de Agar inclinado Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.7.2 Inoculación de la cepa en Agar inclinado
Acondicionar la cepa que se encuentra en estado de congelación, hasta
temperatura ambiente; con un asa estéril a temperatura ambiente, se realiza la
inoculación en cada uno de los tubos. La forma de realizar la siembra consiste en
introducir el asa en el fondo del tubo y trazar en toda la superficie, procurando no
desgarrar el agar. El procedimiento se repite para los 20 tubos de ensayo y se
23
procede a incubar durante 24 – 48 horas a 37 °C, para finalmente llevar a
refrigeración entre 1 – 3°C; en estas condiciones su tiempo de vida útil es de
aproximadamente 15 días desde su refrigeración. De igual manera se preparan
varios tubos conforme al número de experimentos y sus réplicas, Figura 6.
Figura 6. Inoculación de E. faecalis en agar inclinado Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.8 Crecimiento del inóculo en Caldo nutriente
2.8.1 Preparación de caldo nutriente
Se pesó 1,2 gramos de Caldo nutriente y se disuelven en 150 ml de agua destilada
en un frasco de tapa rosca de 250 ml, se calienta hasta ebullición para disolver
completamente el caldo y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 120°C. Se
Distribuye el caldo en tubos de ensayos de 16 x 150 mm, 15 ml por cada tubo en
un total de 10 tubos de ensayo; a manera que la distribución sea homogénea y no
exista pérdidas. Se preparan varios tubos acorde al número de experimentos, y
se mantienen en refrigeración a 3°C para la conservación del medio.
24
2.8.2 Siembra del inóculo en caldo nutriente
Se toman 10 ml caldo nutriente en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm, y mediante
un asa bacteriológica estéril y un mechero de alcohol, repitiendo el mismo proceso
de esterilización; se introduce el asa en el agar inclinado que contiene la cepa
bacteriana en refrigeración, se toma una asada para depositarla en el tubo que
contiene el caldo nutriente. Este proceso se repite hasta obtener una turbidez de
4 según la escala de Mc Farland; obteniendo una concentración nominal
bacteriana inicial de 1.2x109 UFC/ml (OMS 2004) de E. faecalis. Se deja incubar
a 37°C durante aproximadamente 8 horas para un mejor crecimiento, Figura 7.
Figura 7. Preparación de Agar inclinado y Crecimiento de bacteria Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.9 Digestión enzimática de proteínas para el medio de cultivo
2.9.1 Peptonas Bacto
Se pesó 1 gr de peptona bacto y se diluye en 1 litro de agua destilada, para
distribuir a tubos de ensayos de 16 x 100 mm, 9 ml de la mezcla a cada uno de
los tubos en un total de 50 o cuantos sean necesarios, esterilizar en autoclave por
15 minutos a 120°C. Se disponen de varios tubos conforme a las réplicas de los
experimentos, y se mantienen en refrigeración a 3°C.
25
2.10 Reactores UV
Los ensayos se realizaron en un reactor tubular o de flujo continuo a escala de
laboratorio; este consiste en una bomba peristáltica con un caudal regulable de
máximo de 36 ml/s y un reactor lámpara de fuente de luz UV-C (254 nm), con
capacidad de volumen irradiado de 143 ml a 0,177 W/m2. El diseño está
conformado por un sistema de entrada que contiene la muestra a tratar, la cual es
aspirada por la bomba peristáltica que se calibra a diferente flujo en función del
ensayo, luego pasa al reactor donde se aplica diferentes tratamientos (UV,
UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+), y finalmente una salida del sistema donde se colectan
las muestras para evaluar la eficiencia en la inactivación del microorganismo,
Figura 8.
Figura 8. Esquema general del reactor de flujo continuo Fuente: Autora Elaboración: Autora
26
2.11 Ensayos
El procedimiento experimental consistió en aplicar tratamientos UV, UV/H2O2, y
UV/H2O2/Fe3+, a diferentes dosis de UV-C utilizando un reactor lámpara de flujo
continuo, a una matriz de agua inoculada con cultivo puro de E. faecalis a escala
de laboratorio; añadiendo diferentes concentraciones de H2O2, catalizador Fe3+
(FeCl3 6H2O), con el objetivo de optimizar los tratamientos.
Durante los ensayos, la irradiación del reactor lámpara se mantiene constante,
siendo flujo y tiempo de incidencia las únicas variables; es decir, después de
recolectar el primer volumen de muestra, el flujo se reduce y el tiempo aumenta;
repitiendo el mismo procedimiento para cada muestra.
De los volúmenes colectados se realiza las diluciones decimales necesarias, para
la siembra y análisis microbiológico, por duplicado; y conteo de colonias
sobrevivientes.
La eficiencia de desinfección se determinó por reducción logarítmica Log (N/N0),
donde N es la concentración de la bacteria a un tiempo (t) del tratamiento y N0 la
concentración inicial de la bacteria antes del tratamiento; donde el límite de
detección fue en 6 unidades logarítmicas de reducción, ya que la concentración
inicial se encontraba en 106 CFU/mL, en todos los ensayos.
Los resultados experimentales obtenidos se ajustaron con una herramienta de
Microsoft Excel, GInaFiT aplicando el modelo “log-linear + tail”, para determinar la
cinética de eliminación; y finalmente se aplicó un análisis multifactorial de varianza
(ANOVA) para determinar si existe diferencia significativa entre los tratamientos
aplicados.
2.11.1 Preparación del agua de mar sintética
En un litro de agua destilada se agregó 35 gr de cloruro de sodio (NaCl), se agita
durante 1 minuto y esteriliza en autoclave. Se procede a inocular con E. faecalis,
agregando los 10 ml del inóculo que se encuentra en el caldo nutriente y se agita
durante 30 segundos y se mide pH, medir la concentración inicial de
27
microorganismos, donde en base a la experimentación, la concentración inicial
real promedio de todos los experimentos fue aproximadamente de 6,13x106
UFC/ml, Figura 9.
Figura 9. Agua de mar sintética, inoculada con E. faecalis. Concentración: 6X106 UFC/ml Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.12.2 Procedimientos de oxidación avanzada
Consiste en la exposición de luz UV-C a las muestras inoculadas de agua de mar
sintética, aplicando los tratamientos establecidos en diferentes dosis y tiempo,
según Tabla 6. El flujo según el tiempo de exposición se establece en el Anexo 1.
Tabla 6. Metodología experimental aplicada
Fuente: Autora Elaboración: Autora
Microorganismo
de estudio
pH
Tratamientos
UV-C
Concentración (ppm)
Tiempo de exposición
(seg) H2O2 FeCl3 6H2O
Enterococcos faecalis
6x106 (UFC/ml)
7
UV
Si
0
0
0,
26, 36,
46, 56,
66
UV/H2O2
Si 10 0
Si 20 0
Si 30 0
UV/H2O2/Fe3+
(5:1)
Si 10 2
Si 20 4
Si 30 6
28
2.12.2.1 Tratamiento UV
En la muestra inoculada (1L) se determina la concentración real bacteriana y se
hace pasar por el reactor UV, teniendo en cuenta que se cumpla con los tiempos
de residencia según Tabla 5, por cada tiempo se colecta un volumen 10 ml en
frascos pyrex, (en total 6 frascos). Finalmente realizar la siembra de estas
muestras y el análisis microbiológico.
2.12.2.2 Tratamientos UV/H2O2 y UV/H2O2/Fe3+
Para la muestra de agua inoculada (1L) se determina la concentración real
bacteriana y se divide en volúmenes iguales de 200 ml, para cada frasco, se
calcula las concentraciones a añadir de H2O2 y FeCl36H2O respectivamente según
el tratamiento, tal como se muestra en la Tabla 5; y Anexo 2.
Para estos tratamientos tener en cuenta que antes de aplicar radiación UV-C, se
agrega el volumen calculado de H2O2 a cada muestra para el tratamiento UV/H2O2
y para UV/H2O2/Fe3+, añadir primero H2O2 y después la solución de FeCl36H2O
para mejorar la acción del catalizador. Todas las muestras se homogenizan
durante 15 segundos y se hacen pasar por el reactor UV. De igual forma que en
el ensayo UV-C se colectan muestras de 10 ml en frascos pyrex, para concluir
con el análisis microbiológico de las muestras en cada tratamiento.
2.13 Análisis microbiológico
2.13.1 Preparación de Agar KF Estreptococos y Cloruro de
Tetrazolio para siembra en cajas petri
Pesar 15,28 gr de Agar Estreptococos diluir en 200 ml de agua destilada
y colocar en frascos con tapa rosca de 250 ml, preparar un total de 4
frascos, calentarlos a ebullición. Nota para evitar que el caldo se solidifique
se mantiene en baño maría a 45°C, hasta que se realice la siembra con
las muestras de agua.
Cloruro de Tetrazolio, pesar 1 gr, diluir con agua destilada y aforar a 100
ml d homogenizar durante 15 segundos y mantenerlo hasta realizar la
siembra
29
2.13.2 Análisis de E. faecalis en muestras de agua.
A partir de los volúmenes colectados a la salida del reactor, se toma 1 ml por cada
frasco y se realizan las diluciones decimales necesarias de la muestra, utilizando
la peptona Bacto preparada anteriormente, las muestras se deben realizar, por
duplicado para cada ensayo. Seguidamente se siembran en las cajas petri,
utilizando pipetas estériles, se agregan entre 18 a 20 ml del medio de cultivo Agar
KF Estreptococos con 1 ml de Cloruro de Tetrazolio. Una vez que se realiza la
mezcla, se homogeniza mediante movimientos de derecha a izquierda y de arriba
hacia abajo, sobre una superficie lisa y horizontal. Las placas se solidifican y se
incuban de forma invertida a 37°C por 24 horas. Transcurrido el tiempo de
incubación se cuenta las colonias que crecen en la membrana de la placa
mediante un contador de colonias, Figura 10.
Figura 10. Siembra, incubación y conteo de colonias de Enterococcos faecalis Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.13.3 Recuento bacteriano
Después del periodo de incubación se determina el número de colonias de E.
faecalis, utilizando la técnica de recuento bacteriano por placas, que se basa en
contar las unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un mililitro de
muestra (UFC/ml), mediante un contador de colonias. Cuando la cantidad de
bacterias es demasiado alta, se realizan las diluciones decimales, de manera que
permita el conteo confiable, tal como se muestra en la Figura 11.
30
Figura 11. Diluciones decimales de E. faecalis 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 sembradas en placas Fuente: Autora Elaboración: Autora
2.14 Análisis de datos
El análisis de resultados se realiza en hojas de cálculo en el Software Microsoft
Excel, donde se determina la desviación típica, coeficiente de variación y promedio
de las corridas. Estos datos estadísticos nos permiten expresar la cantidad de
bacterias en unidades logarítmicas (Log10).
Seguidamente utilizamos la herramienta GInaFiT, que es una extensión freeware
para Microsoft Excel, donde se ajusta los datos a un modelo logaritmo lineal + cola
y se calcula la cinética de la población bacteriana en base al tratamiento y tiempo
de exposición. El comportamiento de la bacteria se describe mediante curvas de
inactivación en función de la ecuación 1, donde se hace presente el fenómeno de
Incontable Moderadamente contable
Contable Contable
31
cola después de un descenso logarítmico lineal, por ende la ecuación 1 se
renombra en base a logaritmo tal como se muestra en la ecuación 2; además se
muestran las medidas estadísticas de cinética expresada como Kmax, coeficiente
de regresión lineal (R2) y tiempo de eliminación.
N= (N0- Nres) * e (-kmax * t) + Nres (ec.1)
LOG10(N)= LOG10 (10LOG10 (N0) – 10LOG10 (Nres)) * e (-kmax*t) + 10LOG10 (Nres) (ec.2) Se realiza un análisis en SPSS, que es un software de análisis estadístico de
datos; que incluye la prueba de análisis de varianza ANOVA de un factor, que
compara varios grupos de variables para saber si existe diferencia significativa
entre ellos, considerando que el nivel de significancia o el P valor debe ser menor
a 0,05. Para este caso se ha aplicado dos variables tipo numéricas, la cinética que
es la variable dependiente o la que se quiere comparar y el tratamiento que es el
factor o variable de agrupamiento con la que se forman los grupos de cinética.
Una vez que se ha determinado que existen diferencias significativas entre sus
tratamientos se aplica la prueba de Post hoc Tukey, que permite determinar qué
grupos específicamente se diferencian entre sí, con respecto a la variable
dependiente (cinética); para finalmente identificar subconjuntos homogéneos de
los tratamientos que no se diferencian entre sí, y grupos que si tienen diferencia
significativa; para ordenarlos de menor a mayor eficiencia.
CAPITULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
33
En este apartado se presenta el análisis de resultados obtenidos en este estudio.
3.1 Caracterización del agua
En la tabla 7, se presentan los datos obtenidos del análisis físico, químico y
microbiológico del agua de estudio Puerto Hualtaco y camaronera estudiada.
Tabla 7. Parámetros de calidad del agua de mar. Puerto Hualtaco y piscina camaronera
Fuente: Autora Elaboración: Autora
3.1.1 Comparación de resultados de análisis del agua Vs
normativa.
Los parámetros de calidad según el Reglamento de Prevención y Control de la
Contaminación Ambiental en lo relativo al recurso agua (Ministerio del Ambiente
Ecuador, 2015) para Criterios de calidad admisible para la vida acuática y silvestre
en agua dulce, marina y estuarios; y Límite de descarga a un cuerpo de agua
marina establecen lo siguiente, Tabla 8.
Parámetros
Unidades
Piscina camaronera
Puerto
Hualtaco Entrada
Dentro
Salida
Temperatura ºC 28,40 29,60 28,50 27,70
pH adimensional 7,50 8,75 8,55 7,67
Sólidos totales
mg/L 1656,00 35438,00 35696,00 1050,00
Oxígeno Disuelto
mg/L 6,15 11,29 6,27 6,53
%Saturación 79,20 148,70 80,70 85,00
Nitrito mg/L 0,15 0,33 0,28 0,15
Nitrato mg/L 11,00 1,00 2,00 15,00
Cloruro mg/L 818,01 19254,67 19758,06 812,97
Conductividad eléctrica
uS/cm 2431,64 44236,50 44503,50 1339,73
Coliformes Totales
NMP/100 ml 2258,99 1715,11 2258,99 5522,32
E. Faecalis NMP/100 ml 778,24 3816,56
34
Tabla 8. Criterios de calidad de las aguas para sus distintos usos
Fuente: Autora Elaboración: Autora
Los resultados obtenidos según el análisis fisicoquímico muestran un pH medio
dentro del límite (6,5 – 9,5) de 8,1, una temperatura media de 28,55 °C que se
encuentra dentro del rango (< 35°C) y la concentración de Nitritos de 0,22 mg/L y
Nitratos de 7,25 mg/L se encuentran dentro del límite permisible (200 mg/L).
La concentración de oxígeno disuelto, tanto en el puerto como en la camaronera,
se encuentra en un nivel aceptable según la normativa >60% de saturación y >5
mg/L, presentando valores promedio de 98% de saturación y 7,56 mg/L de
oxígeno disuelto.
La cantidad de cloruro en agua de mar según (Grau & Muñoz, 2013), es de 19440
mg/L; y la cantidad promedio de cloruros de las muestras en estudio es de
10160,92 mg/L, lo cual se debe a que en este sector hay la influencia del río
Zarumilla de agua dulce que se mezcla con las aguas marinas y provoca
disminución en la concentración de cloruros.
Parámetros
Criterios de calidad
admisible para la vida acuática y silvestre en agua
dulce, marina y estuarios
Límite de descarga a un cuerpo de agua marina
Unidades Criterio de calidad
Unidades Criterio de calidad
pH - 6,5 - 9,5 - 6 – 9
Oxígeno disuelto
% saturación > 60
mg/L > 0,05
Nitritos y Nitratos
mg/L 200
Coliformes totales
NMP/100 ml
10000
Sólidos suspendidos
totales
mg/L
250
Temperatura °C < 35
35
La concentración de Coliformes totales se encuentran dentro del rango
establecido (10000 NMP/100), siendo un valor medio de 2938,85 NMP/100; sin
embargo con respecto a E. faecalis, se determinaron concentraciones muy
considerables tanto en la camaronera con 778,24 NMP/100, como en el Puerto
Hualtaco con 3816,56 NMP/100; valores que sobrepasan por mucho el límite
permisible, como se puede apreciar en Tabla 1, según (Secretaría de Salud,
2004), que establece los criterios para clasificar las playas, en la cual se establece
que una concentración >500 NMP/100, no es apta para el uso recreativo y requiere
registro sanitario; además, según Norma Mexicana (NMX-AA-120-SCFI-2016,
2016), que fijan los requisitos y especificaciones de sustentabilidad de calidad de
playas, considera que la calidad bacteriológica del agua de mar deberá ubicarse
dentro del límite de 100 NMP/100ml.
36
3.2 Evolución de la concentración bacteriana
A continuación se presenta los resultados de la eliminación de E. faecalis, con luz
UV-C 254 nm e irradiación de 0,177 W/m2, a una concentración inicial 6,13X106
UFC/ml expresados mediante el logaritmo del cociente entre la concentración de
bacterias en un tiempo (t) y la concentración inicial, Log (N/N0), en función del
tiempo de exposición, Figura 12.
Figura 12. Curvas eliminación de E. faecalis, evolución en el tiempo hasta 66 segundos Fuente: Autora Elaboración: Autora
Se fijan los ejes de la gráfica, donde “x”, corresponde al tiempo de exposición de
la bacteria en segundos y “y” la concentración de la bacteria resultante expresada
en logaritmo; es decir la eliminación de la bacteria, que indica que si la curva tiene
un mayor descenso, se ha eliminado mayor cantidad de bacterias.
Los puntos que se observan en la gráfica son los datos experimentales que se
obtuvieron según el tratamiento y tiempo de exposición; y las curvas, representan
el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático de regresión
“logaritmo lineal + cola” de GInaFiT, que como su nombre lo indica, consta de dos
partes, la primera es la eliminación de la bacteria (curva lineal inclinada) y la
segunda es la concentración residual de la bacteria (curva horizontal).
37
El modelo adoptado fue el que mejor ajuste tuvo con respecto al coeficiente de
regresión lineal (R2) con valores entre 0,9919 – 0,9932.
De acuerdo a la gráfica se puede apreciar que el tratamiento más eficiente es
UV/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm), debido a que su pendiente (celeste) presenta mayor
inclinación y descenso, inactivando aproximadamente a los 36 segundos 6
unidades logarítmicas (99,9999%), en donde posterior a este tiempo llega a un
estado constante donde la inactivación es casi nula. Comparando este tratamiento
con el de UV-C se puede observar que la curva de eliminación (verde), tiene menor
pendiente lo implica una reducción bacteriana mucho más lenta, por lo que tarda
más tiempo en obtener la concentración residual de la bacteria aproximadamente
55 segundos hasta volverse constante. De la gráfica podríamos concluir que la
adición de peróxido y hierro ayudan a mejorar la cinética de inactivación ya que
aumentan la pendiente y disminuyen los tiempos de exposición, pero se debe
tener en cuenta que para cada tratamiento hay un óptimo que permite llegar a
reducir el máximo de microorganismo E. faecalis.
3.3 Cinética de eliminación de E. faecalis
En la siguiente gráfica se observa las medias cinética de eliminación (s-1), entre
tratamientos, en función de la variación de UV y concentraciones de peróxido y
hierro aplicados, para E. faecalis, Figura 13.
38
Figura 13. Cinética de eliminación de E. faecalis Letras mayúsculas indican los grupos formados en base a las diferencias significativas obtenidas en el análisis ANOVA. Fuente: Autora
Las medias entre cinéticas de eliminación de cada tratamiento en la mayoría no
muestran diferencias significativas, ya que se encuentran muy próximas unas de
otras y las desviaciones típicas (líneas sobre las barras) en algunos tratamientos
son muy grandes, sim embargo hay un tratamiento que presenta mayor cinética y
deferencia significativa entre los demás.
La media de la cinética en el tratamiento UV, es la menor de todos los tratamientos
aplicados. En el tratamiento UV/H2O2 al añadir H2O2 y aumentar las
concentraciones entre 10, 20 y 30 ppm, si bien es cierto se logra un pequeño
aumento entre la media de la cinética pero sin embargo no presenta diferencia
significativa ni entre tratamientos ni en concentraciones. En el tratamiento
UV/H2O2/Fe3+ se logra determinar diferencia significativa al aplicar una
concentración de H2O2 30 ppm y Fe3+ 6 ppm. En los análisis realizados se puede
notar que las dispersiones entre las desviaciones típicas son considerables, esto
se debe al hecho que al trabajar con microorganismos estos tienen
comportamientos distintos y poca repetitividad entre tratamientos frente a un
39
análisis químico, por lo cual la variabilidad es mayor cuando se realiza este tipo
de estudios.
3.4 Análisis estadístico SPSS
El análisis ANOVA realizado para las medias cinéticas de los tratamientos
determina que existe diferencia significativa ya que el valor P o Sig obtenido es de
0,000, siendo menor que el valor del nivel crítico de 0,05, tal como se muestra en
la tabla 9.
Tabla 9. Resultados de Análisis de varianza (ANOVA) de un factor
A continuación los resultados del Análisis específico, Post hoc de Tukey,
Tabla 10, en el cual se realiza la comparación entre las medias cinéticas de
los tratamientos.
Tabla 10. Resultados del Análisis Post hoc de Tukey
El análisis de las diferencias de medias mediante la prueba de Tukey señala que
el tratamiento cuyas medias cumplen con el nivel de significación establecido
(
40
Seguidamente la clasificación en subconjuntos homogéneos realizado por el
método de Tukey, Tabla 11.
Tabla 11. Resultados de grupos que presentan valores de las medias
Se forman dos grupos en base a la media de cinética de los tratamientos. En el
primer subconjunto homogéneo se puede apreciar que los tratamientos UV,
UV/H2O2 de 10, 20 y 30 ppm, UV/H2O2(10ppm)/Fe3+(2ppm) y UV/H2O2(20ppm)/Fe3+(4ppm)
ppm tienen una media de cinética similar, que demuestra que a pesar de que se
aumente las concentraciones de H2O2 y Fe3+ en los rangos establecidos, no
existen diferencias significativa entre los tratamientos. El segundo subconjunto
muestra a UV/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm) con un aumento en la media cinética,
concluyendo que se debería trabajar con concentraciones de Fe3+ más altas, para
mejorar la media cinética de los tratamientos y que exista diferencias significativas.
Comparando nuestros estudios con los realizados por (Ortega-Gómez et al., 2012)
sobre el efecto de la temperatura para la inactivación bacteriana de E. faecalis
mediante foto-Fenton, donde todos los experimentos se trabajaron una
concentración bacteriana inicial (106 CFU/ml) en solución salina estéril (NaCl, 9
gr/L) con 20 mg (Carbono orgánico disuelto) DOC/L de resorcinol, cámara de
lámpara solar con un detector UV-A rango de 320-400 nm e irradiación de luz UV-
Fuente y elaboración: Software estadístico SPSS
41
A 32 W/m2 a 120 min por cada tratamiento. Se usaron diferentes concentraciones
de peróxido de hidrógeno 30% en peso (20, 70 y 120 ppm) y 10 ppm de
heptahidrato de sulfato de hierro (II) (FeSO4 7H2O) como reactivo catalizador. Las
temperaturas a evaluar fueron de 10, 20, 30 y 40 °C.
Los resultados obtenidos determinaron la concentración óptima de inactivación
aplicando foto-Fenton con UV-A/Fe2+(10 ppm)/H2O2(120 ppm); además la constante
cinética, kmax, aumenta con la temperatura (0,11 – 0,27 min-1), siguiendo una
ecuación de tipo Arrhenius que permite predecir la tasa de desinfección en el
rango de temperaturas estudiadas; donde solo se necesitaron de 40 min a 40 °C
para eliminar las 6 unidades logarítmicas . Esto se debe a que a temperaturas
cercanas a 37 °C (temperatura óptima de crecimiento), la bacteria entra a su
actividad metabólica completa, y por lo tanto es más vulnerable al ataque de
radicales hidroxilo.
Paralelamente a los resultados obtenidos en esta investigación, como se observa
en la figura 11, donde foto-Fenton UV/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm) logra una disminución
de 6 unidades logarítmicas en 36 segundos, con una cinética de eliminación, kmax
de 0,41 s-1, usando luz UV-C 254 nm e irradiación de 0,177 W/m2, concentraciones
e irradiación menores por mucho, en comparación al estudio evaluado. Por tanto,
el uso de luz UV-C como fuente de luz implica mayor efectividad en el proceso, en
contraste con UV-A; además las condiciones del aumento de temperatura, se
prestan para la aplicación en experimentos usando luz UV-C, donde el tiempo y
las concentraciones de trabajo pueden mejorarse obteniendo un tratamiento
óptimo para E. faecalis.
Otro estudio similar (Lanao, Ormad, Mosteo, & Ovelleiro, 2012), de Inactivación
de Enterococcus sp por fotólisis y fotocatálisis de TiO2 con H2O2 en agua natural,
donde todos los experimentos se trabajaron una concentración aproximada de
108CFU/100 ml, cámara solar con una lámpara de xenón y un filtro adicional para
aplicar longitudes de onda de luz UV-B (290 – 800 nm) y UV-A (320 – 800 nm)
con un rango de irradiación de 500 W/m2; la concentración de TiO2 fue de 1 g/L y
42
de H2O2 0.04 mM (1,36 ppm) y los tiempos máximos de irradiación fueron de 30
minutos con un recuento microbiológico cada 5 min para todos los experimentos.
Los resultados obtenidos aplicando luz UV-A, muestran que el tratamiento al
UV/H2O2(1,36 ppm), reduce una cantidad mínima de concentración bacteriana,
inactivando 0.4 unidades logarítmicas, UV/TiO2(1g/L) reduce 2,3 unidades log y por
último UV/TiO2(1 g/L)/H2O2(1,36 ppm) logra reducir 1.9 unidades logarítmicas.
Usando luz UV-B, los tratamientos UV/TiO2(1g/L) y UV/TiO2(1 g/L)//H2O2(1,36 ppm)
obtienen reducciones de 5.5 y 5.9 unidades log respectivamente; UV-B logra
reducir 7.6 unidades logarítmicas y UV/H2O2(1,36 ppm) alcanza 8.2 log; por ende la
irradiación de luz UV-B resulta mucho más efectivo en Enterococcus sp; sin
embargo el uso de TiO2 no logra obtener buenos resultados esperados, a pesar
de cambiar el tipo de luz.
Comparando con los resultados obtenidos de esta investigación, como ya se
mencionó el uso de luz UV-A no obtiene resultados satisfactorios y en este caso
para UV/TiO2 y UV/TiO2/H2O2, no es la excepción, donde la reducción logarítmica
es casi mínima (1,9 – 2,3) en 30 minutos; en comparación con tan solo el primer
tratamiento empleado en este estudio, UV-C reducción logarítmica de 6 unidades
logarítmicas en 55 segundos, como se observa en la figura 11. Sin embargo el
cambio de luz a luz UV-B, muestra resultados significativos, donde los
tratamientos UV/TiO2 y UV/TiO2/H2O2, reducen mayor cantidad de concentración
bacteriana, pero no son los resultados esperados, por tanto el uso de TiO2 como
reactivo catalizador no es apto para reducir la concentración bacteriana de
Enterococcus sp; pero cuando se aplica los tratamientos UV y UV/H2O2 reducen
(7-6 – 8,2) unidades log en 30 minutos, respectivamente. Estos resultados
favorables con luz UV-B, se pueden considerar para aplicar a foto-Fenton, usando
las concentraciones óptimas de esta investigación.
43
CONCLUSIONES
La caracterización de las aguas del Puerto Hualtaco y camaronera
permitieron determinar la presencia de microrganismos patógenos como
E. faecalis con 778,24 NMP/100 dentro de la camaronera y 3816,56
NMP/100 en el puerto; y Coliformes totales con 3816,56 NMP/100 en la
camaronera y 5522,32 NMP/100 en el puerto.
La inactivación de E. faecalis aplicando procesos oxidación avanzada UV,
UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+ demostraron un alto grado de eficiencia en torno
a las condiciones de trabajo, donde todos los experimentos condujeron a
la inactivación de 4,9 – 6 unidades logarítmicas, respectivamente.
Los tratamientos UV-C, fotólisis UV-C/H2O2 (10, 20, 30) ppm y foto-Fenton
UV/H2O2(10ppm)/Fe3+(2ppm) y UV/H2O2(20ppm)/Fe3+(4ppm) probaron que la cinética
de eliminación a nivel estadístico, no tiene diferencia significativa, por
tanto, agregar cantidades de reactivo en rangos pequeños, no muestran
resultados característicos.
El tratamiento óptimo en nuestro estudio para este tipo de bacterias es UV-
C/H2O2/Fe3+ con una concentración de 30 ppm de H2O2 y 6 ppm Fe3+,
siendo el tratamiento que consigue inactivar 6 unidades logarítmicas
(99,999%) en 36 segundos.
La cinética de eliminación UV-C/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm) es 0,413 s-1, cantidad
superior en cuanto a todos los demás tratamientos realizados en nuestro
estudio. En consecuencia, el tratamiento foto-Fenton es una opción
atractiva para realizar pruebas en una matriz de agua de mar real.
44
RECOMENDACIONES
En función de los resultados obtenidos se recomienda continuar la
investigación en este tema agregando concentraciones mayores tanto de
Peróxido (H2O2) y Hierro III (Fe3+) ya que en nuestro estudio no se pudo
realizar experimentación a estos niveles.
Probar con otra cepa bacteriana con características similares a E. faecalis
y evaluar la eficiencia de inactivación, a las condiciones trabajadas por este
estudio.
Probar la eficiencia de inactivación de E. faecalis en una matriz de agua
de mar real.
Para cada ensayo trabajar con todo el material esterilizado y equipos
calibrados.
Debido a que se realiza varios ensayos, se debe administrar correctamente
los extractos Agares.
Evitar el riesgo de contaminación exterior, cuando se realice las siembras
microbiológicas.
Eliminar los desechos microbiológicos, después de autoclave.
45
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