Profesor Patrocinante Dra. Maite Castro Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias Profesor Copatrocinante Dra. Ilona Concha Instituto de Bioquímica y
Microbiología Facultad de Ciencias
REGULACIÓN DE LA LOCALIZACIÓN Y FUNCIÓN DE LOS
TRANSPORTADORES DE GLUCOSA DE ALTA AFINIDAD
Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico.
ANÍBAL IGNACIO ACUÑA SAN MARTÍN
VALDIVIA – CHILE
2012
i
A mi abuelo Alfonso, que sin
saberlo sembró las primeras
semillas que me llevarían a buscar
y seguir una vida en la ciencia.
ii
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a la Dra. Maite Castro por recibirme en su
laboratorio para la realización de esta tesis. Su apoyo fue fundamental en mi formación
durante estos años. Gracias por todas las largas conversaciones, brain-storming,
planificación de experimentos y por darle un espacio a mi lado creativo. También debo
agradecer a mis compañeros de laboratorio con quienes compartí los altos y bajos de
estos años de tesis: Felipe Beltrán, Adriana Covarrubias, Magdalena Esparza, Carlos
Kramm, María Paz Miró, Pablo Moll, Alejandra Parra, Andrea Riveros, Macarena Solís y
Paulina Troncoso. Gracias por su compañía tanto dentro como fuera del laboratorio.
Agradezco también a la Dra. Ilona Concha y todos los integrantes de su laboratorio con
quienes he compartido día a día.
Quisiera agradecer a mis grandes amigos de la vida Claudio Enzo, Daniella
Elisa, Magdalena, María Paz y María Javiera. Gracias por todo, su amistad, las risas,
las penas, las conversaciones y mucho más.
Finalmente quisiera agradecer a mi familia por todo el cariño y apoyo durante
todos estos años: A mis padres, si no fuera por ellos nada de esto sería posible. A mis
hermanos, Emilio, Joaquín, Martín y Matilde. A mis abuelos paternos que siempre me
han guardado un espacio en su hogar y su corazón. No puedo dejar de mencionar a mi
segunda familia en Valdivia, muchas gracias a Ximena Spooner por abrirme las puertas
de su hogar.
Agradecimientos a las fuentes de financiamiento: los proyectos DID-UACh S-
200745, FONDECYT 11070065, 1060135, 1110571 y al Centro virtual DID-UACh
CISNe (Centro de Investigación Sur-Austral en Enfermedades del Sistema Nervioso).
iii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... i
ÍNDICE DE CONTENIDOS ............................................................................................. iii
ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... vi
ÍNDICE DE ABREVIATURAS ....................................................................................... viii
1. RESUMEN .................................................................................................................. 1
1.1 SUMMARY ............................................................................................................. 2
2. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 3
2.1 GENERALIDADES DE LA GLUCOSA .................................................................. 3
2.2 SISTEMAS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA .............................................. 5
2.3 HEXOQUINASA, LA PUERTA DE ENTRADA A LA VÍA GLICOLÍTICA. ............. 9
2.4 REGULACIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA .................................................................................................................. 11
2.5. HIPÓTESIS .......................................................................................................... 15
2.5.1. OBJETIVOS .................................................................................................. 15
3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 16
3.1 MATERIALES ....................................................................................................... 16
3.2 MÉTODOS ............................................................................................................ 19
iv
4. RESULTADOS ........................................................................................................... 30
4.1 ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN EN TIEMPO REAL DE
GLUT1 Y GLUT3. ....................................................................................................... 30
4.1.1 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES DE GLUCOSA
EN CÉLULAS NG108. ............................................................................................. 30
4.1.2 EXPRESIÓN DE GLUT3-EGFP y GLUT1-mCherry EN CÉLULAS NG108. . 32
4.1.3 ESTUDIO DE LA REDISTRIBUCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA GLUT3 MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA. ............................... 34
4.1.4 ESTUDIO DE LA REDISTRIBUCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA GLUT1 Y GLUT3 EN LA SUPERFICIE CELULAR MEDIANTE
MICROSCOPÍA DE REFLEXIÓN TOTAL INTERNA. ............................................. 36
4.1.5 ANÁLISIS DE RECUPERACIÓN DE LA FLUORESCENCIA DESPUÉS DEL
FOTOBLANQUEO DE SVCT2-EGFP. .................................................................... 39
4.1.6 ANÁLISIS DE FRAP PARA GLUT1 Y GLUT3 FRENTE A DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA EN CÉLULAS NG108 EN CULTIVO. ........ 42
4.2 ANÁLISIS DE INCORPORACIÓN DE ANÁLOGOS DE GLUCOSA
FLUORESCENTE EN CÉLULAS HEK293T. ............................................................. 44
4.3 EFECTO DE LA ALTERACIÓN DEL CONTENIDO DE COLESTEROL EN
MEMBRANAS SOBRE LA DISTRIBUCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA GLUT1 Y GLUT3 EN LA SUPERFICIE CELULAR MEDIANTE TIRM. ... 47
v
4.4 EXPLORANDO UNA POSIBLE INTERACCIÓN ENTRE GLUT3 y
HEXOQUINASA ......................................................................................................... 49
4.4.1 ANÁLISIS DE COLOCALIZACIÓN DE GLUT3 Y HEXOQUINASA TIPO I, II Y
III. ............................................................................................................................. 49
4.4.2 ANÁLISIS DE COINMUNOPRECIPITACIÓN DE HEXOQUINASA TIPO I Y
TRANSPORTADORES DE GLUCOSA GLUT1 Y GLUT3. ..................................... 51
4.4.3 ANÁLISIS CINÉTICO DEL TRANSPORTE DE GLUCOSA .......................... 53
4.4.4 SECUENCIACIÓN DE VECTORES pcDNA3-HKI/HKII/HKIII. ....................... 57
4.4.5 DIGESTIÓN VECTORES HEXOQUINASA I, II Y III ....................................... 58
5. DISCUSIÓN ............................................................................................................... 63
6. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... 72
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Caracterización de la expresión de los transportadores de glucosa, GLUT1 y
GLUT3 en células NG108………………………………………………………………..….31
Figura 2: Expresión de las proteínas de fusión GLUT1-mCherry y GLUT3-EGFP en
cultivos de células NG108 y HEK293T………………………………………………….…33
Figura 3: Ensayos de inmunofluorescencia de GLUT3 frente a variaciones en la
concentración de glucosa extracelular………………………………………………….…35
Figura 4: Ensayos de microscopía de reflexión total interna para GLUT1-mCherry y
GLUT3-EGFP en células NG108 frente a incrementos de la concentración de glucosa
extracelular……………………………………………………………………………………38
Figura 5: Análisis de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo
(FRAP) en presencia de ácido ascórbico en células HEK293T transfectadas con
SVCT2-EGFP…………………………………………………………………………………41
Figura 6: Análisis de FRAP en presencia de distintas concentraciones de glucosa
extracelular células NG108 transfectadas con GLUT1-mCherry y GLUT3-EGFP..…43
Figura 7: Análisis de la incorporación de NBDG en células HEK293T……………..…45
Figura 8: Análisis del efecto del colesterol sobre la distribución de GLUT1 y GLUT3
en la membrana plasmática. ……………………………………………………………….48
vii
Figura 9: Ensayo de colocalización de GLUT3 y hexoquinasa I, II y III mediante
inmunofluorescencia………………………………………………………………………..50
Figura 10: Ensayo de coinmunoprecipitación de hexoquinasa tipo I, GLUT1 y
GLUT3……………………………………………………………………………………… .52
Figura 11: Análisis del transporte de glucosa en cultivo primario de neuronas
corticales……………………………………………………………………………………..54
Figura 12: Secuenciación de los vectores pcDNA3-HKs………………………………59
Figura 13. Digestión de los vectores pcDNA3-HKs con las enzimas de restricción
EcoRI y XbaI………………………………………………………………………………...62
viii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
DOG: 2-desoxiglucosa.
EDTA: Ácido etilendiaminotetracético.
FRAP: Recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo.
FRET: Transferencia de Energía Resonante Fluorescente o de Förster.
GFP: Proteína verde fluorescente.
GLUT: Transportador facilitativo de hexosas.
HK: Hexoquinasa.
IgG: Inmunoglobulina G.
Km: Constante de Michaelis-Menten.
MβCD: metil-beta-ciclodextrina.
2NBDG: 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-2-desoxiglucosa.
6NBDG: 6-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-6-desoxiglucosa.
OMG: 3-0-metilglucosa.
PBS: Tampón fosfato salino.
SDS-PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes.
SVCT: Transportador de vitamina C y sodio.
TIRM: Microscopía de reflexión total interna.
Vmax: Velocidad máxima.
1
1. RESUMEN
Los transportadores facilitativos de glucosa (GLUTs) se expresan en todas las
células de mamíferos. GLUT1 se expresa de forma ubicua, mientras que GLUT3 está
presente en órganos que tienen altos requerimientos energéticos. Se ha descrito la
presencia de GLUT1 y GLUT3 en dominios de membrana, esta compartimentalización
podría significar cambios funcionales en estas proteínas. Sin embargo, no hay mayores
estudios de la dinámica de GLUT1 y GLUT3 en la membrana plasmática en células
vivas. Para analizar el comportamiento de GLUT1 y GLUT3 a través de técnicas de
microscopía en célula viva, se utilizó microscopía de reflexión total interna, recuperación
después del fotoblanqueo y ensayos de incorporación de análogos de glucosa
fluorescente (NBDG) en tiempo real mediante microscopía confocal. Estos
experimentos se complementaron con ensayos de inmunofluorescencia,
inmunoprecipitación y ensayos de transporte utilizando análogos de glucosa
radioactivos. Cambios en la concentración de glucosa extracelular no provocaron
mayores alteraciones en la disponibilidad en membrana plasmática y en la fracción
móvil de GLUT1 y GLUT3. Ensayos cinéticos utilizando análogos de glucosa
radioactiva, inmunoprecipitación utilizando anticuerpos contra GLUT1, GLUT3 y
hexoquinasa sugieren una relación directa o indirecta entre los transportadores y la
enzima. Esto fue apoyado por ensayos de incorporación de NBDG en presencia y
ausencia de colesterol, lo que sugiere la presencia de un complejo GLUT-hexoquinasa
en dominios ricos en colesterol. Por consiguiente, alteraciones en la
compartimentalización podrían gatillar cambios en el transporte y utilización de glucosa.
2
1.1 SUMMARY
Facilitative glucose transporters (GLUTs) are expressed in all mammalian cells.
GLUT1 is ubiquitously expressed, while GLUT3 is present in organs with high energetic
requirements. The presence of GLUT1 and GLUT3 has been described in membrane
domains. This compartmentalization could be related to functional changes in these
proteins. However there are no extensive studies on GLUT1 and GLUT3 dynamics at
plasma membrane in live cells. To analyze GLUT1 and GLUT3 behavior through live cell
microscopy techniques, we performed total internal reflection microscopy, fluorescence
recovery after photobleaching and confocal microcopy real-time uptake assays using
fluorescent glucose analogs (NBDG). These experiments were complemented by
immunofluorescence, immunoprecipitation assays and uptake assays using radiolabeled
glucose analogues. Changes in extracellular glucose concentration did not cause major
changes at plasma membrane availability and mobile fraction of GLUT1 and GLUT3.
Kinetic assays using radiolabeled glucose analogues, immunoprecipitation using
antibodies against GLUT1, GLUT3 and hexokinase suggest a direct or indirect
interaction between the transporters and the enzyme. This was supported by NBDG
uptake assays in presence and absence of cholesterol, which suggests the presence of
the putative GLUT-hexokinase complex in cholesterol rich domains. Therefore,
alterations in compartmentalization could drive changes in glucose uptake and
utilization.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1 GENERALIDADES DE LA GLUCOSA
La glucosa es la principal fuente energética de todas las células de nuestro
organismo (Thorens & Mueckler, 2010). Esta molécula es adquirida por la dieta donde
primero debe atravesar el epitelio intestinal. Luego es destinada a los distintos órganos
a través del torrente sanguíneo (Takata, 1995; Ferraris, 2001). La glucosa es una
excelente fuente de energía ya que permite la generación de ATP a través de la
glicólisis y posteriormente una mayor generación de ATP mediante el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos o ciclo de Krebs.
Además, la glucosa aporta con un esqueleto carbonado que ayuda en la
mantención de los niveles de varios intermediarios metabólicos, tanto en las vías
catabólicas ya mencionadas como en vías anabólicas. Por ejemplo, la generación de
ribosa 5-fosfato para la síntesis de nucleótidos y lípidos. La vía de las pentosas fosfato
está encargada también, de restituir y mantener el ambiente reductor intracelular
mediante la generación de NADPH a partir de glucosa 6-fosfato. Por lo que la glucosa
también es un sustrato que favorece la generación de especies reductoras (Ho et al.,
2007).
La glucosa puede ser almacenada intracelularmente en forma de glucógeno. Su
síntesis es mediada por la enzima glucógeno sintasa (EC 2.4.1.21), la cual adiciona
unidades de glucosa 1-fosfato a una cadena de glucosa sintetizada inicialmente sobre
un residuo de tirosina de la enzima glicogenina (EC 2.4.1.186). El glucógeno,
dependiendo del tipo celular es una fuente de glucosa para las necesidades energéticas
4
locales o sistémicas. Se puede encontrar, por ejemplo, en tejidos como el músculo
esquelético y el hígado (Roach et al., 2012). En el primero frente a estados de elevada
actividad física la degradación de glucógeno es favorecida mediante la unión de
adrenalina a su receptor presente en la membrana plasmática de dichas células
musculares. Debido a que este receptor está acoplado a proteína Gs, la unión
desencadena una cascada de señales que se inicia por la activación de la adenilato
ciclasa y finaliza con la estimulación de la glucógeno fosforilasa (EC 2.4.1.1), enzima
encargada de la degradación del glucógeno. Este proceso llamado glicogenólisis, se
utiliza en músculo esquelético para compensar la disminución de ATP y glucosa en las
células musculares para sostener la contracción muscular (Hargreaves, 2004; Jensen &
Lai, 2009; Lodish et al., 2004). En el caso de las células hepáticas, la glicogenólisis es
estimulada por la hormona glucagón, la cual es liberada por el páncreas frente a una
disminución de la concentración de glucosa sanguínea o hipoglicemia. La unión del
glucagón a su receptor acoplado a proteína Gs estimula la producción de AMPc lo cual
favorece la glicogenólisis produciendo glucosa 1-fosfato que mediante la enzima
fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2) es convertida a glucosa 6-fosfato (Mayo et al., 2003,
Lodish et al., 2004). En células hepáticas la glucosa 6-fosfato pierde su grupo fosfato
gracias a la enzima glucosa 6-fosfatasa (EC 3.1.3.9), produciendo glucosa que es
entonces liberada al torrente sanguíneo para restablecer los niveles plasmáticos y
regresar a concentraciones normales o normoglicemia (Klover & Mooney, 2004). Las
células musculares carecen de glucosa-6-fosfatasa, por lo tanto, utilizan el glucógeno
como fuente de glucosa para sí mismas.
5
Por consiguiente, la glucosa es una molécula importante en diversos procesos
celulares. Participando en producción de energía, y también proporcionando poder
reductor e intermediarios metabólicos para la síntesis de moléculas complejas.
2.2 SISTEMAS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA
La glucosa no es capaz de difundir por sí sola a través de la membrana
plasmática, por lo que requiere de un sistema de transporte eficaz que permita su paso
hacia el interior de la célula. Se han descrito dos familias de proteínas como las
principales encargadas del transporte de glucosa a través de membranas: los
cotransportadores de sodio y glucosa (familia génica SLC5A), y los transportadores
facilitativos de hexosas (familia génica SLC2A).
Los cotransportadores de sodio y glucosa o SGLTs por sus siglas en inglés, son
una familia de proteínas co-transportadoras de glucosa y sodio. Los SGLTs transportan
glucosa de forma activa en contra de su gradiente de concentración y a favor de la
gradiente de sodio. Hasta el momento se han descrito seis isoformas funcionales
(SGLT1-6) y además seis secuencias relacionadas. No obstante, la mayor parte de los
estudios se ha enfocado en SGLT1 y SGLT2. SGLT1 presenta una alta afinidad para
glucosa. Se encuentra principalmente en la membrana apical de los enterocitos del
intestino delgado, en los túbulos rectos proximales y en la barrera hemato-encefálica
(Lee et al., 1994; Elfeber et al., 2004). SGLT2 es un transportador de baja afinidad/alta
capacidad y se expresa principalmente en la cara apical del túbulo contorneado
proximal. Se le considera el responsable del transporte de la mayor parte de la glucosa
6
plasmática proveniente del filtrado glomerular, evitando su pérdida en la orina (Hediger
et al., 1995; Wright, 2001; Wood & Trayhurn, 2003). SGLT3 es una isoforma que fue
descubierta en cerdo y se ha detectado en musculo esquelético e intestino delgado.
Debido a que experimentos en oocitos expresando SGLT3 humano no lograron detectar
una función como transportador de glucosa, se ha sugerido su participación en un
mecanismo sensor de glucosa debido a que en presencia de glucosa extracelular,
hSGLT3 induce una depolarización celular. En rata y ratón dos genes codifican para
dos SGLT3 diferentes, SGLT3a y SGLT3b. Por un lado SGLT3b es un transportador de
glucosa funcional, mientras que SGLT3a al igual que SGLT3 de humano no transporta
glucosa, sin embargo, genera corrientes activadas por una diminución del pH
extracelular. SGLT3 de ratón se expresa en el sistema gastrointestinal mientras que
hSGLT3 se expresa en neuronas colinérgicas de los plexos submucoso y mesentérico.
Estudios de hibridación in situ revelaron que en ratón se expresa SGLT3 en células
colinérgicas y no en células epiteliales (Balon 2012). La distribución de SGLT4 humano
se ha descrito principalmente en intestino delgado y riñón, donde realizaría una función
en la reabsorción de manosa y fructosa además de glucosa (Tazawa et al., 2005). Se
han encontrado dos miembros más de la familia (SGLT5 y SGLT6) pero hasta el
momento los estudios permanecen a nivel de ARN mensajero, con una expresión renal
de SGLT5 y SGLT6 en cerebro (Chen et al., 2010).
Los transportadores facilitativos de hexosas o GLUTs son una familia de
proteínas que tal como su nombre lo indica transportan hexosas de forma facilitativa, es
decir, a favor del gradiente de concentración. No obstante, esta familia de proteínas que
también es llamada de transportadores facilitativos de glucosa, también incluyen
7
transportadores de fructosa, mioinositol y urato. Los GLUTs son proteínas integrales de
membrana que poseen doce segmentos transmembrana y sus extremos amino y
carboxilo teminal están expuestos hacia el lado intracelular (Uldry et al., 2001). A esta
familia pertenecen 14 proteínas que han sido clasificadas según identidad en cuatro
clases (Joost & Thorens, 2001; Doege et al., 2001; Ibberson et al., 2000; Lisinski et al.,
2001; Joost et al., 2002; Rogers et al., 2002; Thorens & Mueckler, 2010).
Los GLUTs son capaces de transportar a través de la membrana plasmática sólo
los D-enantiómeros de glucosa a favor de un gradiente químico no dependiente de
energía (Muekler, 1994; Joost & Thorens, 2001) y se caracterizan por poseer 12
dominios de transmembrana con los extremos amino y carboxilo ubicados en la zona
citoplasmática de la membrana celular (Uldry et al., 2001). GLUT1 se encuentra
ampliamente distribuido, siendo responsable del suplemento basal de glucosa para la
mayoría de las células. Está encargado en particular del suplemento de glucosa para el
sistema nervioso central a través de la barrera hemato-encéfálica (Thorens et al., 1988).
GLUT2 tiene una elevada Km, superando los 15 mM y se expresa principalmente en las
células β-pancreáticas y en las membranas basolaterales de las células epiteliales del
riñón e intestino, además de los hepatocitos (Thorens, 1992). En estas células debido a
que el transporte se verá favorecido incluso en casos de hiperglicemia, la regulación del
consumo de glucosa está dada por la fosforilación. Sin embargo, el transportador es
importante y necesario, por ejemplo, en la liberación de insulina por las células β-
pancreáticas en respuesta a alzas de glucosa plasmática, ya que su carencia previene
este mecanismo de secreción (Guillam et al., 2000; Jensen et al., 2008). GLUT3 es el
principal transportador neuronal, pero es expresado además por otros tipos celulares,
8
como células germinales masculinas y espermatozoides, linfocitos y plaquetas. Este
transportador posee una alta afinidad por glucosa (Km: ~1.5 mM) (Simpson et al.,
2008). El knockout de GLUT3 es inviable, alcanzando los embriones solamente los 6
días de vida (Ganguly et al., 2007). GLUT4 es expresado principalmente por adipocitos
y músculo esquelético. GLUT4 ha sido uno de los GLUTs más estudiados, porque su
disponibilidad en la superficie celular es regulada por insulina, mecanismo que se ve
alterado en ciertos casos de obesidad y diabetes (Leto & Saltiel, 2012). GLUT5 es un
transportador con una alta afinidad por fructosa. Se expresa principalmente en la
membrana apical de las células epiteliales del intestino, pero también se expresa en
menor nivel en testículo, cerebro y riñones entre otros (Barone et al., 2009; Takata,
1996; Douard et al., 2008). GLUT6 se ha detectado en leucocitos (Doege et al., 2000).
GLUT7 posee una similitud de secuencia de 74.3% con GLUT5. Se expresa en la
membrana apical del intestino delgado y grueso, sin embargo, no se ha descrito su
principal sustrato fisiológico (Cheeseman, 2008). Se ha descrito la expresión de GLUT8
en sistema nervioso central, testículo, tejido adiposo, intestino e hígado. Tendría una
Km para glucosa de 2,4 mM, transportando también fructosa. (Doege et al., 2000,
Carayannopoulos et al., 2000; Schmidt et al., 2009; Romero et al., 2009). GLUT9 no
sería un transportador de glucosa, sino de urato. Se ha descrito su expresión en
hígado, riñón, intestino y condrocitos, siendo de importancia en la reabsorción renal de
urato y su degradación en el hígado (Matsuo et al., 2008; Preitner et al., 2009). Se ha
observado que mutaciones en GLUT10 alteran la angiogénesis y estarían involucradas
en problemas arteriales. Se ha descrito como un transportador de ácido
deshidroascórbico mitocondrial y que una falla en este rol contra el estrés oxidativo
9
sería el causal de las alteraciones arteriales (Coucke et al., 2006; Lee et al., 2010;
Segade, 2010). El transportador GLUT11 se ha descrito que transporta glucosa y
fructosa. Se ha detectado su expresión en corazón y músculo esquelético (Scheepers
et al., 2005). GLUT12 se ha descrito en músculo, riñón, y que sería sensible a insulina
(Macheda et al., 2002; Stuart et al., 2006; Stuart et al., 2009; Purcell et al., 2011).
GLUT13, también llamado HMIT, es un transportador de mioinositol y protones. Se
expresa principalmente en cerebro y sería el único GLUT que funciona como un
simporter (Uldry et al., 2001). Finalmente, se ha descrito que GLUT14 se expresa en
testículo. Sería un duplicón del gen de GLUT3, sin embargo se desconoce su rol en el
transporte de glucosa (Wu & Freeze, 2002).
2.3 HEXOQUINASA, LA PUERTA DE ENTRADA A LA VÍA GLICOLÍTICA.
Una vez que la glucosa ingresa a la célula y alcanza el citosol, esta es
rápidamente fosforilada en el carbono 6, originando como producto glucosa 6-fosfato
(Glc-6-P). Esta reacción es catalizada por la enzima hexoquinasa (EC 2.7.1.1). Se han
descrito 4 isoenzimas de hexoquinasa: I, II, III (de aproximadamente 100kDa) y IV
(50kDa). La hexoquinasa tipo I (HKI) es ubicua y se expresa en grandes cantidades en
tejidos altamente dependientes de glucosa tales como el cerebro (Kao-Jen & Wilson,
1980). HKI tiene un Km para glucosa de 0,03mM (Wilson, 2003). Ya que la
concentración de glucosa plasmática y extracelular en diversos órganos es
aproximadamente 3-5 mM (Pfeuffer et al., 2000), es posible predecir que HKI fosoforila
prácticamente toda la glucosa que es translocada a través de la membrana plasmática
10
en células que expresan el sistema de transporte facilitado comprendido por los GLUTs.
Hexoquinasa tipo II (HKII) se expresa en tejidos sensibles a insulina, como adipocitos y
músculo esquelético (Wilson, 2003). También se encuentra expresada en un mayor
grado en varios tumores (Shinohara et al., 1994), probablemente para compensar las
elevadas necesidades energéticas de células con una alta tasa proliferativa. Tanto HKI
como HKII poseen un dominio N-terminal que les permite unirse al canal VDAC (Voltage
dependent anion channel o Porina) de la mitocondria, unión que se cree permite que la
hexoquinasa tenga acceso a un pool de ATP intramitocondrial, aumentando su
actividad con respecto a HK libre (citoplasmática). HKI y HKII son inhibidas
alostéricamente por su producto, glucosa 6-fosfato, pero al unirse a la mitocondria
disminuye su sensibilidad a esta inhibición. Por otro lado Pi es capaz de revertir esta
inhibición en HKI pero no en HKII. (Arora & Pedersen, 1988; de Cerqueira Cesar &
Wilson, 1995; de Cerqueira Cesar & Wilson, 2002; Fang et al., 1998; Wilson, 2003). Se
ha descrito que HKII sería translocada de la mitocondria al citoplasma para abastecer
vías anabólicas. Sin embargo HKI permanecería unida a la mitocondria favoreciendo las
necesidades glicolíticas basales. Esto apoyaría los comentarios de Wilson (2003), que
la compartimentalización de las distintas isoformas de hexoquinasa destina la glucosa
en vías catabólicas o anabólicas (John et al., 2011). La tercera isoforma, HKIII se
expresa en diversos tejidos incluidos riñón, hígado y bazo, pero su localización
intracelular discrepa de lo descrito para las isoformas HKI y HKII, localizándose
principalmente en la periferia nuclear (Preller & Wilson, 1992). La baja Km para glucosa
de HKII (0,3mM) y de HKIII (0,003 mM) implica que, al igual que HKI, son enzimas que
se encuentran permanentemente favoreciendo la utilización de esta hexosa (Wilson,
11
2003). La isoforma HK-IV (también llamada glucoquinasa, EC 2.7.1.2) se encuentra
expresada principalmente en hígado y páncreas. Esta isoenzima posee una Km de 7,5
mM (Postic et al., 2001) y participa principalmente en la regulación de la homeostasis
de glucosa. Su elevada Km la hace menos sensible a pequeñas variaciones de la
concentración de glucosa local, ya que reacciona a concentraciones por sobre los
niveles sanguíneos normales.
Como fue mencionado anteriormente, las hexoquinasas poseen una alta afinidad
por glucosa por lo que prácticamente toda la glucosa que es translocada al interior de la
célula es rápidamente fosforilada. Entonces, debido a que la concentración de glucosa
intracelular depende del transporte y consumo de ésta, la disponibilidad de
transportadores de glucosa en la membrana plasmática puede ser un elemento clave
para estudiar posibles mecanismos de regulación local de la incorporación y utilización
de la glucosa.
2.4 REGULACIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA
Se ha descrito el mecanismo de regulación de la disponibilidad de
transportadores de glucosa en respuesta a una variedad de hormonas, factores de
crecimiento y otros agentes. En adipocitos, células de músculo esquelético y cardíaco,
la translocación de GLUT4 a la superficie celular es mediada por la activación de
cascadas de señales río abajo de receptores de insulina que rápidamente estimulan la
incorporación de glucosa gatillada por insulina (Rea & James, 1997; Rice et al., 1996;
12
Welsh et al., 2005). En células hematopoyéticas, de la médula ósea y en células
HEK293, citoquinas como IL-3 y GM-CSF son capaces de controlar tanto la
redistribución de GLUT1 a la superficie celular como un incremento en la incorporación
de glucosa (Bentley et al., 2003; Berridge & Tan, 1995; Vera et al., 1998; Wieman et al.,
2007; Zambrano et al., 2010). Se ha descrito la localización de GLUT1 y GLUT3 en
dominios de membranas resistentes a detergentes, colocalizando con caveolina-1 y
hexoquinasa en células germinales masculinas, perdiendo dicha localización al depletar
de colesterol las membranas con metil-β-ciclodextrina (MβCD) (Rauch, et al., 2006).
Además, algunos estudios en corazón de rata describen que la presencia de lactato
extracelular causaría un incremento en la localización de GLUT1 y GLUT4 en la
superficie celular independiente de la vía PI3K/Akt. Sin embargo, este efecto se vería
acompañado con una disminución de la acumulación de glucosa-6-fosfato (Medina et
al., 2002; Southworth et al., 2002).
Un estudio evaluó mediante el uso de una sonda de glucosa basada en la
técnica de Transferencia de Energía Resonante Fluorescente o de Förster (FRET), el
flujo de glucosa intracelular de células (GLUT1/GLUT3 +/+) incubadas a diferentes
concentraciones de glucosa extracelular. En dicho estudio se observó que las células
preincubadas a altas concentraciones de glucosa (25 mM) presentaban una alta tasa
metabólica pero una lenta incorporación de glucosa, encontrando concentraciones
intracelulares iguales o menores a 0,07 mM (cercano al Km de hexoquinasa I). Por el
contrario, cuando la concentración extracelular era disminuida a 10 mM o menor, se
observaba una rápida incorporación alcanzando niveles intracelulares de 1 mM.
Finalmente, al ser las células expuestas a concentraciones menores que 5 mM, los
13
niveles basales de glucosa intracelular aumentan, alcanzando potencialmente la
concentración extracelular (al ser inhibida la glicólisis) (John et al., 2008). Por lo tanto,
existiría una regulación de la homeostasis de glucosa a nivel celular, modificando la
incorporación y el metabolismo de glucosa dependiendo de la disponibilidad
extracelular de glucosa al menos en células que expresan GLUT1 y GLUT3 (o GLUT4).
Además de los mecanismos de regulación de la disponibilidad de
transportadores de glucosa, como los descritos anteriormente (por ejemplo insulina),
podría ser necesaria la existencia de mecanismos que sean capaces de realizar un
sensing de cambios en las concentraciones extracelulares de glucosa que no requieran
de la unión de ligandos a sus receptores y posterior activación de cascadas de
transducción de señales. En efecto, como fue mencionado anteriormente, en células
expuestas a cambios en la concentración extracelular de glucosa se observan
variaciones en el transporte y el flujo metabólico. Un mecanismo capaz de responder de
forma rápida a cambios locales sería de vital importancia, por ejemplo, en el sistema
nervioso central (SNC), dónde los requerimientos energéticos son altos y después de
cada episodio de actividad sináptica se realiza un elevado gasto de las reservas
energéticas para restablecer el potencial de membrana (Ames, 2000; Attwell &
Laughlin, 2001). Entonces podría existir una respuesta temporal rápida y eficiente que
sea capaz de aumentar la disponibilidad de transportadores de glucosa o incrementar
su función dependiendo de las necesidades locales de manera de asegurar una
constante llegada de sustratos energéticos. En consideración a lo expuesto
anteriormente, y a que GLUT1 es el transportador de glucosa más abundante en
células animales y que GLUT3 es un transportador ubicado en tejidos de alta demanda
14
energética como el cerebro, decidimos estudiar si la localización subcelular de los
transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 es sensible a cambios de la
concentración de glucosa extracelular. Puesto que uno de los factores determinantes
en el consumo de glucosa es la fosforilación de glucosa en posición 6 por la enzima
hexoquinasa (lo que permite mantener una gradiente de glucosa favorable para el
transporte), adicionalmente se propone en esta tesis estudiar los posibles cambios de
localización de las isoenzimas de hexoquinasa I, II y III frente a variaciones de glucosa
extracelular.
15
2.5. HIPÓTESIS
La localización subcelular de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 es
sensible a cambios en la concentración de glucosa extracelular.
2.5.1. OBJETIVOS
2.5.1.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar si cambios en la concentración de glucosa extracelular son capaces de
modificar la localización subcelular de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3,
y si esto ocurre, analizar si se correlaciona con cambios de localización de HKI, HKII y
HKIII.
2.5.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Estudiar la localización subcelular de GLUT1 y GLUT3 en células tratadas con
distintas concentraciones de glucosa extracelular.
2. Estudiar el efecto del colesterol sobre el transporte y localización a nivel de
superficie celular de los transportadores GLUT1 y GLUT3.
3. Estudiar la función de transportadores de glucosa mediante el uso de análogos
de glucosa fosforilables y no fosforilables. Determinación de parámetros cinéticos
y estudiar la posible interacción entre GLUT1, GLUT3 y hexoquinasas.
16
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
De Sigma Chemical Co. (USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: azul de
Coomassie G-250, poli-L-lisina (peso molecular >350kDa), D-(+)-glucosa, sacarosa,
NP40, cloruro de colina, Histochoice (fijador de tejido), 2-desoxiglucosa (DOG), o-
metilglucosa (OMG), Tritón X-100, rojo fenol, metil β-ciclodextrina (C4555-5G), y
colesterol Synthechol® (S5442).
De Merck & Co, Inc. (Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: cloruro
de mercurio II, ácido clorhídrico, cloruro de potasio, alcohol metílico, alcohol etílico,
fosfato diácido de sodio, fosfato dihidrógeno de potasio, acrilamida, bisacrilamida,
alcohol isopropílico, etanol absoluto, cloroformo, hidróxido de sodio. De Calbiochem,
EMD Chemicals Inc (USA), se adquirió Tween 20 y β-mercaptoetanol.
De Winkler Ltda. (Chile), se adquirió albúmina de suero de bovino (BSA),
glicina, Tris, carbonato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), persulfato de amonio,
cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, reactivo de Bradford, agua ultra
pura libre de nucleasas y tampón de carga de proteínas 2X.
De Gibco-BRL Laboratorios Life Technologies, Inc. (USA) se adquirió:
tripsina-EDTA, L-glutamina, penicilina/estreptomicina/fungizona, OPTIMEM-I.
De Hyclone (USA), se obtuvo medio de cultivo Dulbelco´s Eagle modificado
enriquecido con F-12 (DMEM-F12) y suero fetal bovino (FBS).
17
De INVITROGEN Corporation (USA) se obtuvo hipoxantina, aminopterina y
timidina (HAT), 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-2-deoxiglucosa (2-
NBDG), 6-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-6-deoxiglucosa (6-NBDG),
Lipofectamine™ 2000, TO-PRO-3, Hoechst 33342, anticuerpo anti-IgG de cabra y
conejo conjugados a Alexa Fluor 488, anti-IgG de cabra, conejo y ratón conjugado a
Alexa Fluor 568. De DAKO (USA) se adquirió medio de montaje para fluorescencia.
De Santa Cruz Biotechnology (USA), se adquirió anti GLUT3 (sc-7582), anti
GLUT1 (sc-7903), anti β-actina (sc-81178).
De Abcam (USA), se obtuvo anti GLUT3 (Ab15311) y de Chemicon/Millipore
Internacional, Inc. (USA), se obtuvo anti Hexoquinasa-I (MAB1532), anti Hexoquinasa-
II (AB3279) y anti Hexoquinasa-III (MAB1535).
De Pierce Biotechnology, Inc. (USA) (Thermo Scientific), se adquirieron los
anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa, anti-IgG de ratón, anti-IgG de cabra
y anti-IgG de conejo, reactivo ECL para quimioluminescencia y cocktail de inhibidores
de proteasas 100X.
De Promega Co. (USA), se adquirió estándar de DNA 1kb. De Lonza Group
Ltda., (Switzerland), se obtuvo Agarosa Seakem. De MO Bio Lab, Inc, se obtuvo medio
LB.
De New England Biolabs (USA), se obtuvieron las enzimas de restricción
EcoRI (R0101S) y XbaI (R0145S).
18
De MBI Fermentas (USA), fue obtenido el estándar de peso molecular preteñido
para geles de poliacrilamida-SDS.
De bioWORLD (USA), se adquirió TEMED.
Los análogos radioactivos [1,2-3H]-desoxi-D-glucosa (3H-DOG) y D-3-O-[metil-
3H]-glucosa (3H-OMG) fueron adquiridos en Americans Radiolabeled Chemicals, Inc.
(USA).
Finalmente los equipos utilizados fueron los siguientes: pH metro WTW Inolab
pH720, Balanza precisa AND GR-200, cámara de Neubauer VWR, Gabinete de cultivo
NuaireTM class II UN-425-600-E, Incubador NuaireTM DH Autoflow, Baño
termorregulado Memmert, Centrífuga SIGMA 2-16PK, Centrífuga SIGMA 1-14,
Contador de Centelleo Perkin Elmer Tri-Carb 2910 TR, Microscopio confocal OLYMPUS
FLUOVIEW FV100, Microscopio invertido OLYMPUS CKX41, Microscopio OLYMPUS
IX70 , Fuente de poder Bio-Rad Power PacTM basic, agitador magnético IKA RH basic
2, Sonicador Ultrasonic Homogenizer 4710 Cole Parmer instruments Co,
Espectrofotómetro Thermo Scientific Evolution 60, Sistema de electroforesis Mini
proteanR Tri-Carb 1600 TR, Freezer -80°C Foma Scientific Bio- freezer 8425, Freezer -
20°C Consul, Refrigeradores Fensa y Whirlpool, NANODROP.
19
3.2 MÉTODOS
CULTIVOS CELULARES
En todos los casos las células se cultivaron en estufa a 37ºC y en un ambiente
de CO2 al 5%.
CULTIVOS DE LAS LÍNEAS CELULARES. Las líneas celulares HEK293T
(ATCC® CRL-11268™) y NG108 (ATCC® HB-12317™) fueron cultivadas en medio
DMEM-F12 suplementado con FBS 10%, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml,
fungizona 50 ng/ml y L-glutamina 2 mM. Además las células NG108 fueron
suplementadas con HAT (concentración final: 0,1 mM Hipoxantina, 400 nM
Aminopterina, 0,016 mM Timidina). Para su uso las células mantenidas a un 80% de
confluencia fueron lavadas con tampón fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4, 320 mOsm) y
tratadas con tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) para posteriormente ser sembradas a una
densidad de 3-4 x 104 células/cm2 para los respectivos experimentos.
TRATAMIENTO DE PLACAS DE CULTIVO CON POLI-L-LISINA. Las
respectivas placas de cultivo celular y cubreobjetos redondos de 12 mm para
imnunofluorescencia o 25 mm para microscopía de fluorescencia en células vivas
fueron tratadas con una solución 0,01% poli-L-lisina (peso molecular > 350 kDa) por 30
minutos en estufa de cultivo a 37ºC y posteriormente lavadas 3 veces por 10 minutos
con agua estéril.
INMUNOFLUORESCENCIA. Las células fueron cultivadas sobre cubreobjetos de
vidrio previamente esterilizados y tratados con poli-L-lisina. Las placas fueron incubadas
por 1 h en tampón de incubación (Hepes 15 mM, NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,8
20
mM, MgCl2 0,8 mM, pH 7,4) con una concentración de glucosa de 0, 5 ó 25mM
glucosa. Las células fueron posteriormente lavadas con PBS 0,1 M (pH 7,4, 320 mOsm)
y fijadas con una mezcla 4:1 de Histochoice y etanol absoluto, posteriormente se
permeabilizaron membranas celulares con Tritón X-100 al 0,3% en PBS 0,1 M para
facilitar la entrada de los anticuerpos. Se bloquearon las preparaciones con solución de
bloqueo (BSA 1% en PBS 0,1M) por una hora a temperatura ambiente. Posteriormente
se incubaron con los diferentes anticuerpos con sus respectivas diluciones en la misma
solución de bloqueo por toda la noche en cámara húmeda a 4ºC. Como anticuerpos
secundarios de ocuparon anti-IgG de cabra, ratón o conejo conjugado con Alexa Fluor
488, 568, 633 en una dilución de 1:300 en solución de bloqueo por 2 horas a
temperatura ambiente. En los casos en que se realizaron tinciones nucleares se usaron
Hoechst 33342 o TOPRO-3 a una dilución de 1:3000 y 1:5000 respectivamente junto
con los anticuerpos secundarios. Las muestras fueron montadas sobre portaobjetos de
vidrio nuevos usando medio de montaje para fluorescencia DAKO y visualizadas en
microscopio confocal invertido FluoView FV1000.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES. Las células en cultivo fueron lavadas
con PBS 0,1M (pH 7,4, 320 mOsm) y tratadas con tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) a 37ºC
para despegar las células de la placa de cultivo. Las células se transfirieron a un tubo
de centrifuga estéril de 15 ml y se centrifugaron, posteriormente se lavaron con PBS 0,1
M y se centrifugaron nuevamente, las células se resuspendieron en tampón A
(sacarosa 300 mM, DTT 3 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4), conteniendo cocktail de
inhibidores de proteasas a una concentración final 1x (AEBSF 1 mM, aprotinina 800 nM,
bestatina 50 µM, E64 15 µM, leupeptina 20 µM, pepstatina A 10µM, EDTA 5 mM), y se
21
sonicaron 3 a 5 veces por 10 segundos a 4ºC hasta disgregar completamente. Los
homogeneizados fueron centrifugados a 14000 x g por 15 minutos a 4ºC, el
sobrenadante fue rescatado y se cuantificaron las proteínas presentes mediante el
método de Bradford. Estos extractos proteicos fueron utilizados para realizar
inmunoprecipitaciones o ensayos de Western blot.
SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS. Las muestras de
proteínas fueron separadas electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10%. El
gel separador y el espaciador se prepararon a partir de una solución de
acrilamida:bisacrilamida 30:0,8%. El gel separador se preparó con una concentración
final de poliacrilamida de 10% conteniendo Tris (pH 8,8) 375 mM; SDS 0,1%, persulfato
de amonio 0,04% y TEMED 0,03%. Mientras que el gel espaciador se preparó con una
concentración final de poliacrilamida de 3,8% incluyendo Tris 125 mM (pH 6,8), 0,1%
SDS, 0,01% persulfato de amonio y 0,04% TEMED. Se tomaron muestras de proteínas
de 50 µg a 80 µg y se les agregó tampón carga 2X Winkler (Tris 100 mM, 2-
mercaptoetanol 2%, SDS 4%, glicerol 20%, azul bromofenol 0,2%, pH 6,8) a cada una y
se calentaron a 95ºC por 5 minutos. Las muestras fueron cargadas en el gel
realizándose la electroforesis a 30 mA por 1 hora en tampón de corrida (Tris 25 mM,
glicina 190 mM, SDS 0,1%, pH 8,3). Las proteínas separadas fueron transferidas a
membranas de PVDF.
TRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A MEMBRANAS DE PVDF. Finalizada la
electroforesis, las muestras se electrotransfirieron a membranas de PVDF (difluoruro de
polivinildeno; 0,45 micrones de poro, 100-145 µm de espesor). Sobre una esponja
22
embebida en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0,1%, metanol
20%, pH 8,3) se depositó secuencialmente: un trozo de papel de filtro (Whatman n° 1),
la membrana de PVDF (previa activación de la membrana en metanol por 15
segundos), el gel a transferir, otro papel de filtro y luego otra esponja embebida en el
mismo tampón. Esto se colocó en una cámara de electrotransferencia conteniendo el
tampón mencionado y se aplicó una intensidad de corriente de 250 mA por 2 horas.
Una vez cumplido el tiempo la membrana se dejó secar a temperatura ambiente. Para
verificar el buen resultado de la transferencia, el gel fue teñido con solución de azul de
Coomassie (30% metanol y 10% ácido acético) durante tres horas, y luego desteñido en
una solución que contenía 30% de metanol y 10% de ácido acético.
ANÁLISIS DE WESTERN BLOT. Las membranas de PVDF estando secas
fueron activadas en metanol por 15 segundos e incubadas en 10 ml de solución de
bloqueo (BSA 5%, Tween-20 0,3% en PBS 0,1 M, pH 7,4) durante 1 hora a temperatura
ambiente. Luego se incubaron las membranas con los respectivos anticuerpos primarios
diluidos 1:1000 – 1:2000 en tampón anticuerpo (BSA 1%, Tween-20 0,3% en PBS 0,1
M pH 7,4) por 10 horas en agitación constante a temperatura ambiente. Posteriormente
las membranas se lavaron 3 veces con PBS-Tween (PBS 0,1 M, 0,3% Tween-20, pH
7,4) por 20 minutos cada lavado y se incubaron con el respetivo anticuerpo secundario
(anti-IgG de conejo, cabra o ratón) conjugado a peroxidasa (dilución 1:5000, en tampón
anticuerpo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, las membranas se
lavaron 3 veces con PBS-Tween (PBS 0,1 M, 0,3% Tween-20, pH 7,4) por 20 minutos
cada lavado más un lavado final con PBS 0,1 M. El revelado del conjugado se realizó
utilizando un método de quimioluminiscencia ocupando una solución de peróxido de
23
hidrógeno y luminol. En el caso de revelado clásico, luego de 1 minuto se expuso un
film fotográfico sobre la membrana y se reveló con reactivo D72 y fijada con reactivo
U3. En el caso de captura digital del revelado se utilizó el equipo Omega ULTRALUM.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Y PURIFICACIÓN PLASMIDIAL. Las
células competentes DH5-α o JM109 fueron transformadas utilizando el plasmidio
correspondiente. Las bacterias fueron almacenadas en un volumen de 50 μL a -80ºC y
se descongelaron en hielo durante 5 minutos, luego se mezclaron con 1 μL del
plasmidio durante 30 minutos. Después se aplicó un “shock” térmico a 42ºC durante 90
segundos y posteriormente se incubó por 2 minutos en hielo. Luego se agregaron 450
μL de medio LB sin antibiótico y se agitó la mezcla a 225 rpm por 1h a 37ºC.
Posteriormente se sembraron 200 μL de esta mezcla en una placa de medio LB-agar, a
la cual se le agregó kanamicina (concentración final de 50 µg/ml) o ampicilina (a una
concentración final de 100 µg/ml), y se dejó incubando a 37ºC por 16-24 h
aproximadamente. Una vez obtenidas las colonias se procedió con el protocolo descrito
por el fabricante para el kit AxyPrep Plasmid Midiprep o MiniPrep EZNA, para
purificación de DNA plasmidial.
TRANSFECCIÓN DE LÍNEAS CELULARES. Las transfecciones se realizaron
con Lipofectamina 2000. Las células fueron sembradas en placas de cultivo de 40 mm a
una densidad de 2 x 105 células por placa y mantenidas en medio sin antibióticos por 12
horas antes de la transfección. Para la transfección de células HEK293T se preincuban:
en un tubo, 250 µl de OPTIMEM-I y 1 µg del plasmidio correspondiente, en otro tubo,
100 µl de OPTIMEM-I y 7 µl de Lipofectamina 2000 (en el caso de NG108, los
24
volúmenes de OPTIMEM-I se redujeron a 100 µl y 80 µl respectivamente), ambas
mezclas se dejaron reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la mezcla que contiene el DNA plasmidial es depositada lentamente en
el tubo que contiene la mezcla con Lipofectamina 2000 y se dejan reposar mediante 15
minutos a temperatura ambiente, una vez transcurrido este tiempo la mezcla es
depositada sobre las células en cultivo. Después de 12 horas en cultivo se procede a
cambiar medio en ausencia de antibióticos.
ENSAYOS DE MICROSCOPÍA DE REFLEXIÓN TOTAL INTERNA (TIRFM)
Las células expresando GLUT3-EGFP, GLUT1-mCherry se visualizaron en un
microscopio de TIRF basado en objetivo. Se utilizó un láser de diodo en estado sólido
que está enfocado en una fibra óptica de modo único y es transmitida por la entrada de
iluminación trasera de un microscopio Olympus IX70. La luz emitida por el láser se
refleja en un espejo dicroico doble (Z488/532RPC; Chroma Tech) y pasa a través de un
objetivo de gran apertura numérica (60x, N.A. 1,45, aceite; Olympus) y es reflejado
internamente por completo por la interfase vidrio-agua. Bajo estas condiciones
experimentales, los objetos fluorescentes se encontrarán dentro de 150 nm desde la
interfase vidrio-agua (Brauchi 2008). Luego de 1h de incubación en tampón de
incubación con una concentración de glucosa de 0, 5 ó 25 mM glucosa se registraron
series de 100 cuadros de 100 ms de exposición por cuadro. Luego se aumentó la
concentración de glucosa y se tomaron registros de la misma forma a los 1, 3, 5 y 10
minutos desde el cambio de concentración. Los análisis se realizaron a partir imágenes
obtenidas de la sumatoria de los 100 cuadros registrados durante cada condición.
25
RECUPERACIÓN DE LA FLUORESCENCIA DESPUÉS DEL
FOTOBLANQUEO (FRAP) Las células previamente transfectadas y expresando
GLUT1-mCherry o GLUT3-EGFP se visualizaron en un microscopio confocal
OLYMPUS Fluoview 1000. Luego de las incubaciones correspondientes fueron
fotoblanqueadas utilizando áreas específicas de un tamaño alrededor de 0,18±0,06
µm2. El fotoblanqueo se llevó a cabo utilizando las líneas de laser de 488, 515 y 633
nm al 100% durante aproximadamente 7 s. Los datos experimentales fueron tratados
para corregir el fotoblanqueo natural normalizándolos a una intensidad de fluorescencia
pre-blanqueo Fi=1, y ajustados a la siguiente ecuación:
F(t) = 100*[F0 + F∞(t/t1/2)/(1+t/t1/2)] (Ec. 1)
Donde F0 corresponde la intensidad de fluorescencia inmediatamente después
del fotoblanqueo y F∞ es la intensidad en la asíntota de la recuperación de la
fluorescencia (Kenworthy, 2007).
La fracción móvil (Mf), se calculó a partir de los datos obtenidos de la
normalización (Ec. 1) según la ecuación,
Mf = (F∞-F0)/(Fi-F0) (Ec.2) (Kenworthy, 2007)
INCORPORACIÓN DE ANÁLOGOS DE GLUCOSA FLUORESCENTE.
Se realizaron ensayos de incorporación en el tiempo en 400 µl de tampón de
incubación con una concentración de 0,5 mM 2-NBDG (2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-
diazol-4-il)amino]-2-deoxiglucosa ó de 0,5 mM 6-NBDG (6-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-
26
diazol-4-il)amino]-6-deoxiglucosa), análogos fluorescentes de glucosa. Se evaluó la
incorporación de la fluorescencia con un microscopio confocal Olympus Fluoview 1000.
Los ensayos se realizaron a temperatura ambiente.
Los tratamientos con Metil-β-ciclodextrina (MβCD) se realizaron para secuestrar
el colesterol de las células mediante incubaciones de 15 minutos a 10 mM MβCD previo
a la incorporación de NBDG.
CULTIVOS PRIMARIOS DE NEURONAS CORTICALES. Los cultivos de
neuronas de rata se obtuvieron a partir de ratas Sprague-Dawley, según lo descrito por
Castro et al 2001. Se obtuvieron los hemisferios cerebrales de embriones de rata de 17
días de gestación. En ambos casos, se disecaron las cortezas o hipocampos, según
fuera el caso, en una solución salina balanceada Hank (HBSS, Hepes 10 mM, NaCl 80
mM, KCl 2,7 mM, glucosa 2,8 mM, KH2PO4 0,2 mM, Rojo Fenol 0,02 mM, pH 7,4 , 320
mOsm). El tejido fue digerido durante 10 minutos a 37ºC en tripsina 0,25% (p/v) en
tampón fosfato 0,1M (PBS, pH 7,4, 320 mOsm), y posteriormente disgregado en forma
mecánica utilizando una pipeta Pasteur. La solución celular obtenida fue sembrada en
medio MEM-10 (medio mínimo esencial, MEM, suplementado con 10% suero bovino
fetal, FBS, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml, fungizona 50 ng/ml y L-
glutamina 2 mM), a una densidad de 2-3x105 cels/cm2, en placas de cultivo celular pre-
tratadas con poli-L-lisina (0,2 mg/ml, Yavin y Yavin, 1974). Luego de 20 minutos de
incubación a 37ºC, se removió el medio junto con las células no adheridas y se
reemplazó por medio Neurobasal suplementado con B27 2%, penicilina 50 U/ml,
estreptomicina 50 mg/ml, fungizona 50 ng/ml y L-glutamina 2 mM.
27
INMUNOPRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS. Para las inmunoprecipitaciones las
proteínas fueron extraídas mediante el método descrito anteriormente a partir de
cultivos celulares. Para inmunoprecipitar se utilizó Proteína A-agarosa o Proteína G-
Agarosa según corresponda. Se tomaron 200 µg de proteínas totales o lo
correspondiente a una placa de 60mm y se realizó un preaclaramiento con 10 µl de
Proteína A-agarosa por 1h a 4ºC en agitación, posteriormente se centrifugó a 1000 x g
mediante 5 minutos a 4ºC rescatando el sobrenadante. Al sobrenadante obtenido se le
agregó 2 µg de anticuerpo primario correspondiente y se incubó por 1 hr a 4ºC en
agitación, posteriormente se agregó 20 µl de Proteína A-agarosa y se incubó por toda la
noche a 4ºC en agitación. Al día siguiente se centrifugó a 1000 x g mediante 5 minutos
a 4ºC y se rescató el pellet, éste se lavó 4 veces con 800 µl de tampón RIPA (Tris 50
mM, NaCl 150 mM, NP40 1%, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) y se resuspendió en
30µl de tampón de carga 3X Winkler (Formamida 95%, azul de bromofenol 0,05%,
xilén-cianol FF 0,05%, EDTA disódico 20 mM) en ausencia de 2-mercaptoetanol y DTT.
Finalmente se calentaron las muestras a 95ºC mediante 5 minutos y se procedió a
separar electroforéticamante para realizar ensayos de Western blot para la proteína
respectiva, según métodos descritos anteriormente.
ENSAYOS DE TRANSPORTE UTILIZANDO RADIOISÓTOPOS. Para los
experimentos de transporte las respectivas células se sembraron en placas de cultivo
de 12 pocillos previamente tratadas con poli-L-lisina a una densidad de 0,1–0,2 x 106
células por pocillo. Previo a cada ensayo se seleccionaron bajo microscopio sólo
aquellos pocillos con densidad celular uniforme. Adicionalmente, se determinó el
número de células promedio por pocillo usando una cámara de Neubauer. Las células
28
fueron lavadas con tampón de incubación o IB (Hepes 15 mM, NaCl 135 mM, KCl 5
mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8 mM, pH 7,4) e incubadas en la misma solución durante
30 minutos de manera de permitir el equilibrio entre los espacios intra y extracelular.
Los ensayos de captación se realizaron en 0,5 ml de solución de incubación
conteniendo 1-1,2 µCi de 2-[1,2-3H]-desoxi-D-glucosa (3H-DOG), ó 1-1,2 µCi de D-3-O-
[metil-3H]-glucosa (3H-OMG). La reacción fue detenida con solución de incubación fría
(4ºC) conteniendo HgCl2 0,2 mM, seguido de 3 lavados con la misma solución. Luego,
las células fueron tratadas con 200 µl de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, SDS
0,2%), el lisado celular fue cargado en un vial conteniendo 2ml de líquido de centelleo
biodegradable Ecoscint y la radioactividad incorporada fue cuantificada mediante un
contador de centelleo líquido. Todos los ensayos utilizando radioisótopos fueron
realizados de acuerdo a las medidas de bioseguridad del “Manual de Normas de
Bioseguridad” de CONICYT de 2008. Los residuos contaminados fueron almacenados
en bodegas especiales destinadas para ello en las instalaciones de la Unidad de
Gestión Ambiental (UGA, ex-PAAC), de acuerdo al Manual de Procedimiento para el
Manejo de Residuos de la UACh.
ANÁLISIS DE DIGESTIÓN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN. Los
análisis con endonucleasas de restricción, se hicieron usando 6 µg de DNA plasmidial a
los cuales se le agregó 1,5 µl de cada enzima (26000-100.000 U/ml) y tampón (en que
la actividad de ambas enzimas fuera óptima) suficiente para un volumen final de 20 µl.
Luego, esta solución se incubó a 37 ºC por 2 h. Las muestras se separaron en geles de
agarosa 1% en TAE 1X y los fragmentos de interés se aislaron mediante un kit de
extracción de DNA desde geles (E.Z.N.A. Gel Extraction Kit).
29
ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Los datos de todas las gráficas fueron presentados
como promedio ± desviación estándar. La significancia estadística fue evaluada usando
la prueba t-student o por análisis de varianza (ANOVA seguido del test de Bonferroni),
utilizando el programa GraphPad Prism 4.0. Para los análisis de regresión hiperbólica,
ajustes a curvas exponenciales y regresión lineal se utilizó el programa Sigma Plot 11.0.
30
4. RESULTADOS
4.1 ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN EN TIEMPO REAL DE
GLUT1 Y GLUT3.
4.1.1 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES DE GLUCOSA EN
CÉLULAS NG108.
Se realizaron cultivos de la línea celular NG108 (ATCC HB.12317) la cual es un
híbrido entre un neuroblastoma de ratón y glioma de rata. Esta línea celular ha sido
utilizada como modelo neuronal en diversos trabajos (Kawaguchi et al., 2007; Schmitt &
Meves, 1995; Tsukane et al., 2007; entre otros). Se ha descrito que estas células
expresan principalmente GLUT3 murino y GLUT1 de rata (Maher et al., 1991; Maher et
al., 1992). En esta tesis se confirmó la expresión de los transportadores GLUT1 y
GLUT3 en células NG108 mediante ensayos de Western blot e inmunofluorescencia
indirecta.
Los análisis de Western blot confirmaron la presencia de ambas proteínas,
GLUT1 con un tamaño estimado de 60 kDa y GLUT3 con un tamaño estimado de 57
kDa (Figura 1B). Asimismo mediante microscopía confocal se adquirieron imágenes de
inmunofluorescencia indirecta que se realizaron utilizando anticuerpos contra GLUT1 y
GLUT3 (Figura 1A). La distribución de GLUT1 en células NG108 se presenta de
manera homogénea en la célula lo que concuerda con hallazgos que describen a
31
Figura 1. Caracterización de la expresión de los transportadores de glucosa,
GLUT1 y GLUT3 en células NG108. (A) Inmunofluorescencia indirecta para GLUT1 y
GLUT3. La barra de magnificación corresponde a 10 µm. Los núcleos fueron teñidos
con Hoechst (izquierda) o TOPRO-3 (derecha). (B) Western blot de GLUT1 y GLUT3
a partir de extractos de proteínas totales de células NG108.
32
GLUT1 localizado tanto a nivel de membrana plasmática como intracelularmente en
vesículas (Kandror & Pilch 1996; Harris et al., 1992). Por otro lado, observamos GLUT3
tanto intracelularmente como con una marcada presencia en la vecindad de la
membrana plasmática. Se ha descrito la localización de GLUT3 en compartimentos
intracelulares y en la superficie celular, además de una expresión apical en células
polarizadas (Bilan et al., 1992; Harris et al., 1992; Thoidis et al., 1999; Inukai et al.,
2004).
4.1.2 EXPRESIÓN DE GLUT3-EGFP y GLUT1-mCherry EN CÉLULAS NG108.
A partir de células NG108 en cultivo se realizaron transfecciones agudas de los
transportadores GLUT1 y GLUT3 fusionados a proteínas fluorescentes. De esta forma
fuimos capaces de observar el comportamiento de estos transportadores en células
vivas. Mediante el uso de lípidos catiónicos (Lipofectamine™ 2000) se transfectó
GLUT1-mCherry o GLUT3-EGFP. Posteriormente se evaluó la expresión en un
microscopio de epifluorescencia cada 24 horas observándose un peak de expresión a
las 48 horas post transfección. Todos los análisis de microscopía confocal posteriores
se realizaron a las 48 horas observándose un patrón que sugiere una localización en la
membrana plasmática (Figura 2).
Además se realizaron transfecciones de GLUT1-mCherry y GLUT3-EGFP en
cultivos de células HEK293T debido a su alta eficiencia de transfección. Es así como a
las 24 horas ya alcanzó un nivel de expresión lo suficientemente alto para realizar los
posteriores análisis en el microscopio confocal (Figura 2). El patrón de expresión al
33
Figura 2. Expresión de las proteínas de fusión GLUT1-mCherry y GLUT3-EGFP en
cultivos de células NG108 y HEK293T. Análisis de microscopía confocal en células
NG108 (48 horas post transfección) y células HEK293T (24 horas post transfección)
expresando GLUT1-mCherry o GLUT3-EGFP. Las barras de magnificación corresponden
a 10 µm.
34
igual que en cultivos de NG108, sugiere una localización en la membrana plasmática.
La expresión de GLUT1 y GLUT3 ya ha sido descrita en HEK293 y se observan tanto
intracelularmente como en una distribución que sugiere su localización en membrana
plasmática (Castro et al., 2008).
4.1.3 ESTUDIO DE LA REDISTRIBUCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA GLUT3 MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA.
Para analizar el efecto de la variación de la glucosa extracelular sobre la
localización del transportador de glucosa GLUT3, realizamos ensayos de
inmunofluorescencia indirecta. Las células NG108 fueron incubadas en concentraciones
crecientes de glucosa y luego fueron fijadas. La inmunofluorescencia no reveló cambios
de la distribución del transportador de glucosa GLUT3 frente a variaciones de la
concentración de glucosa (Figura 3). En todas las condiciones se mantiene la
localización ya descrita en la figura 1, presentando inmunorreacción en regiones
intracelulares y una aparente localización en membrana plasmática. Interesantemente,
en las prolongaciones se observa una gran presencia del transportador, lo que se
puede observar también en las transfecciones con ambas proteínas de fusión (Figura
2). Sin embargo, la microscopía confocal tiene una resolución espacial en XY cercana a
los 200 nm. Además, debido a que la marca que observamos es tanto intracelular como
en la membrana plasmática, no es posible observar pequeñas variaciones a nivel de
superficie celular. Por lo tanto decidimos complementar estos ensayos con un método
que nos permite reducir el área de la célula a evaluar, enfocándose en la superficie
celular.
35
Figura 3. Ensayos de inmunofluorescencia de GLUT3 frente a variaciones en la
concentración de glucosa extracelular. Cultivos de células NG108 fueron incubados
durante 60 minutos en buffer de incubación conteniendo diferentes concentraciones de
glucosa (0 mM, 5mM y 25 mM). Los núcleos fueron teñidos con TOPRO-3. La barra de
magnificación corresponde a 10 µm.
36
4.1.4 ESTUDIO DE LA REDISTRIBUCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA GLUT1 Y GLUT3 EN LA SUPERFICIE CELULAR MEDIANTE
MICROSCOPÍA DE REFLEXIÓN TOTAL INTERNA.
La microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRFM), se basa en el
principio de la reflexión total interna y generación de una onda evanescente. Cuando la
luz pasa de un medio con índice de refracción n1 a otro medio con índice de refracción
n 2 < n1, el ángulo de incidencia θ1 será menor que el de refracción, θ2. Por lo tanto,
existe cierto ángulo de incidencia llamado ángulo critico θc, para el cual el ángulo
refractado se hace igual a 90°, es decir, el rayo refractado se desliza a lo largo de la
superficie de separación de los medios sin entrar en el segundo medio. Cuando el
ángulo de incidencia es mayor θc entonces la totalidad de la luz será reflejada
internamente.
Un efecto secundario importante de la reflexión interna total es la propagación de
la onda evanescente a través de la superficie del límite entre los dos medios donde la
luz es reflejada. Aun cuando la onda entera del incidente se refleja internamente, existe
una cierta penetración en el segundo medio causando la excitación de aquellos
fluoróforos cercanos a dicho límite. De este modo, se logra la visualización de un
delgado corte óptico en la vecindad (150-200 nm) del límite entre los dos medios
mencionados anteriormente.
A partir de cultivos de células NG108 transfectadas con GLUT1-mCherry o
GLUT3-EGFP respectivamente, se realizaron análisis de Microscopía de Reflexión Total
Interna o TIRM (por sus siglas en inglés). TIRM permite evaluar una región de
37
aproximadamente 150 nm desde la interfase vidrio-cara-exofacial de la membrana
plasmática hacia el interior de la célula. De esta forma se pueden realizar ensayos en
células vivas evaluando solamente la superficie celular y una pequeña región
intracelular.
Las células fueron incubadas en concentraciones crecientes de glucosa (0 mM a
25 mM glucosa) y se registraron secuencias de imágenes en cada condición. Tanto
para GLUT1-mCherry como para GLUT3-EGFP no se observaron cambios significativos
en la localización a nivel de superficie celular. Además el posterior análisis de
intensidad de fluorescencia no revela diferencias significativas en las distintas
condiciones (Figura 4).
Tanto GLUT1 como GLUT3 han sido descritos en compartimentos resistentes a
detergentes o ricos en colesterol (Sakyo & Kitagawa, 2002; Rauch et al., 2006; Sakyo et
al., 2007). Por otro lado, se ha descrito que la composición lipídica de la membrana
puede modificar la funcionalidad de diversas proteínas (Dart, 2010; Saksena et al.,
2010; Butchbach et al., 2004; Barrantes, 2007, Nothdurfter et al., 2010; Barnes et al.,
2004; Simons & Toomre, 2000, Chini & Parenti, 2004). Por lo tanto, a pesar de no
observar cambios mediante inmunofluorescencia (Figura 3) ni microscopía de reflexión
total interna (Figura 4), puede existir una redistribución de los transportadores a un
compartimento de diferente composición lipídica como respuesta a la disponibilidad de
sustrato extracelular. Existe una técnica de microscopía de fluorescencia en célula viva
que es capaz de detectar la redistribución de una proteína a un compartimento de
diferente
38
Figura 4. Ensayos de microscopía de reflexión total interna para GLUT1-mCherry
y GLUT3-EGFP en células NG108 frente a incrementos de la concentración de
glucosa extracelular. Las imágenes de TIRM (arriba) muestran células NG108
expresando GLUT1-mCherry o GLUT3-EGFP. Cada imagen representa la suma de
100 cuadros registrados a 100 ms de exposición. Se puede observar la misma célula
en el tiempo mientras incrementa la concentración de glucosa. Los gráficos muestran
la intensidad de fluorescencia. Los datos representan la media ± DS de 10 células en
tres experimentos independientes.
39
diferente fluidez que el original y que podría dar cuenta de una translocación funcional
de los transportadores GLUT1 y GLUT3.
4.1.5 ANÁLISIS DE RECUPERACIÓN DE LA FLUORESCENCIA DESPUÉS DEL
FOTOBLANQUEO DE SVCT2-EGFP.
Para evaluar cambios en la movilidad de los transportadores se realizaron
análisis de Recuperación de la Fluorescencia Después del Fotoblanqueo o FRAP (por
sus siglas en inglés). FRAP se basa en la propiedad de los fluoróforos de tener un
número limitado de ciclos de excitación/emisión (ciclo de servicio). De esta manera se
excita una pequeña región de la célula (en este caso la membrana) por un corto tiempo
hasta que deja de emitir fluorescencia. Luego se evalúa la recuperación de la
fluorescencia en esa región, dado por el ingreso de fluoróforos vecinos a la región
inicialmente fotoblanqueada. Esta recuperación permite evaluar la movilidad o fracción
móvil de una proteína (unida a un fluoróforo) frente a distintas condiciones. Las gráficas
obtenidas, muestran curvas de la recuperación de la fluorescencia en función del
tiempo, estas curvas se ajustan a una curva de tipo exponencial, de la cual podemos
calcular la movilidad relativa de una proteína unida a un fluoróforo (ver sección
Materiales y Métodos). Para algunas proteínas la recuperación llega al 100%, entonces
hablamos de moléculas que son altamente móviles. En otros casos se observa una
recuperación que no supera el 50% lo que indica que estaríamos frente a una proteína
que tiene una movilidad intermedia. Si la recuperación es menor que el 50% entonces
se considera que las proteínas en cuestión son prácticamente inmóviles. Entonces el
40
porcentaje de recuperación que se obtiene de una proteína después del fotoblanqueo,
nos da la idea de la movilidad que tiene esa proteína y esto puede a cambiar según el
microambiente que rodee a dicha proteína.
Primero se estandarizó este tipo de análisis en células HEK293T transfectadas
transientemente con el co-transportador de ácido ascórbico y sodio, SVCT2, fusionado
a la proteína fluorescente verde (EGFP). Se realizó el análisis de FRAP en dos
condiciones, con o sin incubación previa con ácido ascórbico 1 mM. Al evaluar la
recuperación de la fluorescencia en ambas condiciones de observa un cambio en el
comportamiento de la fracción móvil (Figura 5). El posterior ajuste de la curva de
acuerdo a lo descrito por Kenworthy et al. (2007), permitió extraer las fracciones móviles
(Mf) para SVCT2-EGFP en ambas condiciones. Para 0 mM ascórbico la Mf fue de 102,0
± 9,9 % y para 1 mM ascórbico fue de 38,2 ± 13,5 %. El cambio de Mf describe una
disminución de un 60% de la movilidad relativa de SVCT2 frente a exposición previa a
ácido ascórbico (Acuña, Esparza, Kramm et al., 2012, manuscrito en preparación).
Estos resultados nos permitieron confirmar que el método de FRAP montado en nuestro
laboratorio era capaz de detectar cambios en la movilidad de proteínas de membrana
frente a determinados estímulos. Por lo tanto, procedimos a estudiar el comportamiento
de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3.
.
41
Figura 5. Análisis de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo
(FRAP) en presencia de ácido ascórbico en células HEK293T transfectadas con
SVCT2-EGFP. Curva de recuperación de la fluorescencia para SVCT2-EGFP expresado en
células HEK293T en ausencia (izquierda) y en presencia de ácido ascórbico 1 mM
(derecha). Sobre cada gráfica se muestra una secuencia de fotos representativas de cada
cinética de recuperación. Sobre cada curva se encuentra el valor para la fracción móvil (Mf)
calculadas desde los experimentos de FRAP. El F(t)norm corresponde a la normalización
de la fluorescencia según se indica en Materiales y Métodos. Los datos corresponden a la
media ± DS del análisis de 10 células en 4 experimentos independientes para cada caso
estudiado.
42
4.1.6 ANÁLISIS DE FRAP PARA GLUT1 Y GLUT3 FRENTE A DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA EN CÉLULAS NG108 EN CULTIVO.
Para evaluar el efecto del incremento de la concentración extracelular de glucosa
sobre la movilidad de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 se realizaron
ensayos de FRAP, método que habíamos logrado estandarizar inicialmente con SVCT2
(Figura 5). Los cultivos de células NG108 transfectadas con GLUT1-mCherry o GLUT3-
EGFP fueron incubados por 1 hora a diferentes concentraciones de glucosa extracelular
(5 mM a 25 mM glucosa). Concluida la incubación, se realizaron los ensayos de FRAP y
se observó la recuperación en el tiempo. La movilidad para GLUT1-mCherry presentó
un cambio desde un Mf de 56,9% en 5 mM a 59.7% en 25 mM. Por otro lado GLUT3-
EGFP presentó un cambio de Mf desde 89,1% en 5 mM a 109,7% en 25 mM. A pesar
de observarse una variación de un 20,5% para GLUT3-EGFP, no representa una
diferencia significativa. Estos ensayos dan cuenta de que el incremento de glucosa
extracelular no es capaz de provocar un cambio significativo de movilidad para GLUT1-
mCherry ni para GLUT3-EGFP (Figura 6). Sin embargo, a pesar de no observarse
cambios en la movilidad relativa (Figura 6), ni en la distribución subcelular (Figuras 3 y
4) es posible que existan cambios funcionales de los transportadores que no
representan un cambio en la movilidad de la proteína. Para evaluar esto decidimos
realizar ensayos de incorporación de glucosa en tiempo real.
43
Figura 6. Análisis de FRAP en presencia de distintas concentraciones de glucosa
extracelular células NG108 transfectadas con GLUT1-mCherry y GLUT3-EGFP.
Curva de recuperación de la fluorescencia para GLUT1-mCherry y GLUT3-EGFP
expresados en células NG108 incubadas en tampón de incubación conteniendo
glucosa 5 mM o glucosa 25 mM. Bajo cada curva se encuentra el valor para la fracción
móvil (Mf). Los datos corresponden a la media ± DS del análisis de 10 células en 3
experimentos independientes para cada caso estudiado
44
4.2 ANÁLISIS DE INCORPORACIÓN DE ANÁLOGOS DE GLUCOSA
FLUORESCENTE EN CÉLULAS HEK293T.
Para evaluar el transporte de glucosa en tiempo real, realizamos análisis de
incorporación de análogos de glucosa fluorescente en cultivos de células HEK293T.
Utilizamos dos análogos de glucosa fluorescente, 2-NBDG y 6-NBDG, los cuales han
sido utilizados como herramienta para el estudio funcional del transporte de glucosa
mediante microscopía de fluorescencia. La ventaja que poseen por sobre otros
análogos radica en que gracias a ser una molécula de mayor tamaño que la glucosa, el
transporte de NBDG es más lento, permitiendo observar la incorporación de glucosa en
tiempo real (Yamada et al., 2000; Cloherty et al., 1995).
Primero se evaluó la incorporación de 2-NBDG (análogo de glucosa fluorescente
fosforilable por hexoquinasa) y se pudo observar un aumento en la incorporación de 2-
NBDG en el tiempo, lo que indica que fue transportada al interior de la célula. También
se observa incorporación al utilizar un segundo análogo, 6-NBDG, que no es fosforilado
por hexoquinasa. Al evaluar las pendientes de la incorporación, obtenidas por regresión
lineal, se observa la presencia de dos pendientes en la incorporación de 2-NBDG
(Figura 7A). Podemos razonar que la primera pendiente da cuenta del transporte de 2-
NBDG y que la segunda pendiente dependería de la fosforilación de 2-NBDG. Si
consideramos que el segundo componente de incorporación de 2-NBDG es
dependiente de la fosforilación por hexoquinasa, entonces en el caso de 6-NBDG este
componente debería estar ausente. En efecto, al analizar la incorporación de 6-NBDG,
observamos una sola pendiente (Figura 7C), lo que nos confirma la idea de este
comportamiento bifásico para 2-NBDG.
45
Figura 7. Análisis de la incorporación de NBDG en células HEK293T. Incorporación
en el tiempo de 0,5 mM 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-2-deoxiglucosa
(2-NBDG, A y B), 0,5 mM 6-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-6-deoxiglucosa
(6-NBDG, C y D) en células HEK293T. Las dos fases presentes en la incorporación de
2-NBDG (transporte y fosforilación de glucosa) se muestran en distinto color. B y D, Las
células fueron incubadas con 10mM MβCD 15 minutos previos a la incorporación de
NDBG. Los datos representan la media ± SD de 12 células analizadas para cada
condición.
46
Se ha descrito que GLUT1 y a GLUT3 en encuentran en dominios resistentes a
detergentes, o ricos en colesterol (Sakyo & Kitagawa, 2002; Rauch et al., 2006, Sakyo
et al., 2007). Tomando en cuenta que la localización en balsas lipídicas se ha descrito
para diversas proteínas como un ambiente que modularía su funcionamiento,
disponibilidad en superficie celular, y activación de cascadas de señales (Dart, 2010;
Saksena et al., 2010; Butchbach et al., 2004; Barrantes, 2007; Nothdurfter et al., 2010;
Barnes et al., 2004; Simons & Toomre, 2000; Chini & Parenti, 2004), decidimos estudiar
la función del transporte de glucosa con respecto a la presencia de colesterol en la
membrana plasmática. Para evaluar la importancia del colesterol y la presencia de
estos transportadores en los dominios mencionados anteriormente sobre la
incorporación de glucosa se utilizó metil-β-ciclodextrina (MβCD). MβCD es un
oligómero cíclico que forma un centro hidrofóbico el cual le permite secuestrar
moléculas lipofílicas. Se ha demostrado que forma complejos con colesterol
aumentando su solubilidad, por lo que es capaz de remover colesterol de la membrana
plasmática (Pitha et al., 1988; Irie et al., 1992).
Cultivos de células HEK293T fueron incubadas con MβCD para secuestrar el
colesterol de las células y luego se evaluó la incorporación de ambos análogos de
glucosa fluorescente. Se logró observar incorporación de los análogos de glucosa en el
tiempo, sin embargo la incorporación en ambos casos fue menor que sin el tratamiento
con MβCD. Para el caso de 2-NBDG, se siguen observando los dos componentes pero
interesantemente la segunda pendiente cae en un orden de magnitud en presencia de
MβCD (Figura 7B). Por otro lado, la única pendiente de incorporación de 6-NBDG
sufre una disminución de un orden de magnitud (Figura 7D). Por lo tanto, la presencia
47
de colesterol en las membranas, y la presencia de dominios ricos en éste serían de
importancia para la función de los transportadores. Sin embargo no está claro si los
cambios funcionales también se reflejan en la disponibilidad a nivel de superficie
celular.
4.3 EFECTO DE LA ALTERACIÓN DEL CONTENIDO DE COLESTEROL EN
MEMBRANAS SOBRE LA DISTRIBUCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE
GLUCOSA GLUT1 Y GLUT3 EN LA SUPERFICIE CELULAR MEDIANTE TIRM.
A partir de cultivos de células NG108 transfectadas con GLUT1-mCherry o
GLUT3-EGFP se realizaron análisis de TIRM. Al igual que en el análisis de variación de
glucosa extracelular (Figura 4), los registros de imágenes fueron realizados de forma
secuencial en una célula por experimento individual para todas las condiciones. Las
células fueron inicialmente tratadas con MβCD para depletarlas de colesterol y luego
fueron nuevamente cargadas de colesterol. Se puede observar que GLUT1-mCherry no
parece sufrir mayores alteraciones en su localización en ausencia o presencia de
MβCD, lo mismo se puede observar al incubar las células con altas concentraciones de
colesterol (Figura 8A). Por otro lado GLUT3-EGFP en presencia de MβCD pareciera
disminuir en la superficie, pero al agregar colesterol en altas concentraciones se
observa una redistribución a nivel de superficie celular con un claro aumento en esta
región (Figura 8B). Al analizar la intensidad de fluorescencia bajo las distintas
condiciones podemos observar un aumento en la intensidad de GLUT1-mCherry tanto
en presencia de MβCD como a altas concentraciones de colesterol. En cambio GLUT3-
48
Figura 8. Análisis del efecto del colesterol sobre la distribución de GLUT1 y
GLUT3 en la membrana plasmática. Las imágenes registradas mediante
microscopía de TIRF muestran células NG108 expresando GLUT1-mCherry y GLUT3-
EGFP. Luego de incubar las células en medio carente de suero. Se realizaron
incubaciones para secuestrar (MβCD 10 mM, 15 min) o cargar (Synthechol/colesterol
30 µg/ml, 20 min) colesterol a las células. El gráfico de barras representa la intensidad
de fluorescencia. Los datos fueron tomados con un microscopio Olympus IX71 con un
objetivo Olympus de TIRF (60X, aceite, NA 1,49). El campo evanescente fue de 180
nm.
49
EGFP disminuye en presencia de MβCD y aumenta su intensidad a nivel de superficie
celular al aumentar la concentración de colesterol en el medio de incubación.
4.4 EXPLORANDO UNA POSIBLE INTERACCIÓN ENTRE GLUT3 y HEXOQUINASA
4.4.1 ANÁLISIS DE COLOCALIZACIÓN DE GLUT3 Y HEXOQUINASA TIPO I, II Y III.
Hemos observado un componente del transporte de glucosa que está asociado a
la fosforilación (Figura 7A). Además este componente se vería alterado al secuestrar el
colesterol de la membrana plasmática (Figura 7B). Se ha observado que hexoquinasa
se puede detectar en compartimentos membranosos como mitocondria, retículo
endoplasmático y membrana plasmática (Pedley et al., 1993; Sui & Wilson, 1997; Travis
et al., 1999). Considerando que se ha descrito que además de GLUT1 y GLUT3,
hexoquinasa I estaría compartimentalizada en dominios resistentes a detergentes y
ricos en caveolina-1 (Rauch et al., 2006), nos propusimos evaluar en una línea
neuronal, una posible interacción entre GLUTs y hexoquinasa mediante ensayos de
colocalización.
Cultivos de células NG108 fueron fijados para luego realizar una doble
inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos para GLUT3 en combinación con
hexoquinasa I, II o III (Figura 9). Las imágenes obtenidas mediante microscopía
confocal no revelaron una colocalización ente GLUT3 con hexoquinasa I, II o III.
Debemos mencionar que por un lado es posible que esta colocalización exista en
menor grado, pero la abundante presencia citoplasmática de hexoquinasa no permita
apreciarla. Por otro lado, la resolución espacial de la microscopía confocal no es capaz
50
Figura 9. Ensayo de colocalización de GLUT3 y hexoquinasa I, II y III mediante
inmunofluorescencia. Análisis de inmunofluorescencia para GLUT3, hexoquinasa tipo
I (HK-I), hexoquinasa tipo II (HK-II) y hexoquinasa tipo III (HK-III) en células NG108. Los
núcleos fueron teñidos con TOPRO-3. La barra de magnificación corresponde a 20 µm.
Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio OLYMPUS Fluoview 1000.
51
de resolver la membrana plasmática, región que necesitamos observar. Para resolver
esta interrogante decidimos continuar con una aproximación clásica, por lo que
realizamos ensayos de coinmunoprecipitación.
4.4.2 ANÁLISIS DE COINMUNOPRECIPITACIÓN DE HEXOQUINASA TIPO I Y
TRANSPORTADORES DE GLUCOSA GLUT1 Y GLUT3.
Debido a que en las condiciones utilizadas mediante inmunofluorescencia no fue
posible observar colocalización entre GLUT3 y hexoquinasa (Figura 9) decidimos
explorar una estrategia clásica para evaluar una posible interacción. Realizamos
ensayos de coinmunoprecipitación de hexoquinasa I y GLUT1 o GLUT3. Utilizando
anticuerpos monoclonales dirigidos contra hexoquinasa I se inmunoprecipitaron
extractos de proteínas totales de neuronas corticales. El inmunoprecipitado fue luego
analizado mediante Western blot para detectar tanto GLUT1 como GLUT3.
El ensayo de Western blot realizado a los inmunoprecipitados permitió mediante
el uso de anticuerpos contra GLUT1 detectar una banda de alrededor de 50 kDa
(Figura 10 carril 1), mientras que con un anticuerpo dirigido contra GLUT3 también se
logró reconocer una banda cercana a los 50 kDa (Figura 10 carril 2). Los resultados
observados sugieren la existencia de una interacción entre hexoquinasa I con GLUT1 y
también de hexoquinasa I con GLUT3. Esta posible interacción va de la mano con
publicaciones que han encontrado hexoquinasa I, GLUT1 y GLUT3 en compartimentos
ricos en caveolina (Sakyo et al., 2002; Rauch et al., 2006), además de coinmunoprecipi-
52
Figura 10. Ensayo de coinmunoprecipitación de hexoquinasa tipo I, GLUT1 y
GLUT3. El análisis de inmunoprecipitación se realizó a partir de cultivos de neuronas y
fue inmunoprecipitado utilizando un anticuerpo monoclonal contra hexokinasa tipo I
(HK-I). El Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra GLUT1 y GLUT3.
53
-tar GLUT1 y GLUT3 con hexokinasa-I en células de la línea germinal masculina (Rauch
et al., 2006).
4.4.3 ANÁLISIS CINÉTICO DEL TRANSPORTE DE GLUCOSA
Si la interacción que sugiere la figura 10 y Rauch et al. (2006) entre GLUTs y
hexoquinasa-I es una asociación funcional, los parámetros cinéticos del transporte de
glucosa deberían verse afectados (o por ejemplo ver la aparición de más de un
componente) si se utilizan y comparan análogos fosforilables con análogos no
fosforilables.
A partir de cultivos primarios de neuronas corticales se realizaron ensayos de
transporte con análogos radiactivos de glucosa. Para esto se utilizó 3H-o-metilglucosa
(OMG) que es un análogo de glucosa incorporado por GLUTs, pero no es metabolizado
por la célula y 3H-desoxiglucosa (DOG), el cual es un análogo de glucosa
metabolizable que es transportado por los GLUTs y fosforilado por hexoquinasa. Se
midió la entrada del análogo radiactivo en ausencia del sustrato en el espacio
intracelular (condiciones es zero-trans).
Se realizaron cinéticas de incorporación para DOG 0,5 mM a 20°C, mostrando
DOG una incorporación lineal hasta los 20 segundos y alcanzando un equilibrio desde
los 30 segundos en adelante (Figura 11 A). La velocidad inicial para DOG fue de 1176
± 156 pmoles/106celxmin. Se midió la incorporación durante 15 segundos a
concentraciones crecientes de DOG. Como era de esperar, se observó que el
transporte era saturable (Figura 11 B). Mediante una regresión hiperbólica se obtuvo
parámetros cinéticos, una Km aparente de aproximadamente 1,4 ± 0,2 mM y una Vmax
54
55
Figura 11. Análisis del transporte de glucosa en cultivo primario de neuronas
corticales. Se realizaron análisis de incorporación de 3H-desoxyglucosa (DOG, A, B, C)
y 3H-O-metil-glucosa (OMG, D, E, F) en cultivos primarios de neuronas corticales. A.
Cinética de incorporación de DOG (0,5 mM a 20°C). La línea corresponde al ajuste de
los datos a una exponencial (R=0,9939). B. Curva dosis respuesta para la incorporación
de DOG (15 s, 20°C). La línea corresponde al ajuste a una hipérbola rectangular
(R=0,9975) de la cual se obtuvieron los siguientes parámetros: Km=1,4. ± 0,2 mM y
Vmax= 1795 ± 80 pmoles/106celxmin. C. Gráfica de Eadie-Hofstee para los datos
obtenidos en B. Las líneas corresponden a la regresión lineal de las dos poblaciones de
puntos observadas, obteniéndose los siguientes parámetros (círculos vacios R=0,9904,
círculos llenos 0,9959). Km1= 0,5 ± 0,1 mM y Km2= 1,7 ± 0,5 mM. Vmax1= 980 ± 137
pmoles/106celxmin y Vmax2=900 ± 185 pmoles/106celxmin. D. Cinética de
incorporación de OMG (0,5 mM a 20°C). La línea corresponde al ajuste de los datos a
una exponencial (R=0,9997). E. Curva de dosis respuesta para la incorporación de
OMG (15 s, 20°C). La línea corresponde al ajuste a una hipérbola rectangular
(R=0,9956) se obtuvieron los siguientes parámetros: Km=0,7 ± 0,2 mM y Vmax= 1900 ±
114 pmoles/106celxmin. F. Gráfica de Eadie-Hofstee para los datos obtenidos en E. Las
líneas corresponden a una regresión lineal (R=0,9929) de la que se obtuvo Km= 0,8 ±
0,1 mM y Vmax= 1950 ± 121 pmoles/106celxmin. Los datos corresponden a la media de
tres experimentos independientes ± DS.
56
de 1795 ± 80 pmoles/106celxmin. Sin embargo, al evaluar el análisis de Eadie-Hofstee,
el transporte de DOG presentó dos componentes, uno de ellos con una Km aparente de
0,5 ± 0,1 mM y otro con una Km aparente de 1,7 ± 0,1 mM. Las velocidades máximas
obtenidas fueron 980 ± 137 pmoles/106celxmin y 900 ± 185 pmoles/106celxmin
respectivamente (Figura 11 C).
Las cinéticas de incorporación de OMG 0,5 mM se realizaron a 4ºC, mostrando
una incorporación lineal hasta los 15 segundos y alcanzando el equilibrio desde los 20
segundos (Figura 11 D). La velocidad inicial fue de 954 ± 180 pmoles/106celxmin. La
curva de saturación presentó un componente saturable (Figura 11 E). Los parámetros
cinéticos obtenidos fueron una Km aparente de 0,7 ± 0,2 mM y una Vmax de 1900 ±
114 pmoles /106celxmin. En el análisis de Eadie-Hofstee se observó un solo
componente, con una Km aparente de 0,8 ± 0,1 mM (Figura 11 F).
La importancia de la fosforilación de glucosa en los análisis cinéticos se puede
observar al evaluar los componentes de transporte presentes en la gráfica de Eadie-
Hofstee (Figura 11 C y F). A diferencia del análisis de incorporación de NBDG (Figura
7), a los tiempos que analizamos la incorporación sólo estamos evaluando transporte.
Para OMG, el análogo de glucosa que no es fosforilado, se observa un solo
componente de transporte y en el caso de DOG, el análogo fosforilado se observaron
dos componentes. Por lo tanto la fosforilación por hexoquinasa es capaz de influir en
los parámetros de afinidad del transporte de glucosa. No se puede descartar que exista
además de una proximidad funcional entre el transporte y fosforilación de glucosa. De
este modo, es posible especular una interacción directa o indirecta de hexoquinasa con
57
los transportadores de glucosa GLUT1 y/o GLUT3 (como la descrita previamente, ver
Figura 10) que se vea favorecida bajo una condición o estímulo y sea responsable de
uno de los componentes del transporte (transporte y fosforilación concertados).
En vista a estos resultados que sugieren una interacción estructural y funcional,
decidimos crear herramientas para medir la interacción GLUT-hexoquinasa en tiempo
real mediante FRET que nos permitirían analizar distintas combinaciones GLUT-
hexoquinasa (observando GLUT1, GLUT3 y HK-I, HK-II y HK-III). Si bien, por motivos
ajenos a nuestra voluntad no pudimos concretar estos estudios, a continuación se
describen los esfuerzos por lograrlo.
4.4.4 SECUENCIACIÓN DE VECTORES pcDNA3-HKI/HKII/HKIII.
Con el objetivo de evaluar el comportamiento de hexoquinasa I, II y III, nos
propusimos crear proteínas de fusión para poder realizar análisis en células vivas.
Además decidimos utilizar un vector fluorescente que nos permita realizar ensayos en
células que simultáneamente expresen GLUT1 o GLUT3 fusionados a una proteína
fluorescente. Decidimos utilizar el vector pEYFP ya que además de tener en nuestro
laboratorio los constructos GLUT1 y GLUT3 fusionados a mCherry (Figura 2), tenemos
también las proteínas de fusión con CFP, lo que nos permitiría realizar ensayos de
Trasferencia de Energía Resonante de Förster (FRET), los que pueden evaluar
proximidad de un par de fluoróforos, por ejemplo CFP y EYFP, y observar posibles
interacciones en tiempo real utilizando células vivas, en forma basal o en respuesta a
58
estímulos tales como alteraciones del estado energético de la célula o cambios en la
composición de la membrana.
Gracias al apoyo del Dr. John E. Wilson (Michigan State University) recibimos la
donación de tres vectores pcDNA3 que incluyen los cDNAs de hexoquinasa I, II y III
respectivamente. Sin embargo, para conocer con certeza la secuencia presente y
finalmente diseñar con seguridad la estrategia a seguir, decidimos secuenciar los
vectores. Debido a que el cDNA estaba inserto en un vector comercial, utilizamos parte
de la secuencia de éste para comenzar la secuenciación y realizar primer walking
consecutivos hasta abarcar todo el inserto. Utilizamos la secuencia del promotor de T7
como primer partidor. Los resultados recibidos de la secuenciación (Figura 12A) nos
permitieron obtener la secuencia de los insertos y parte del vector pcDNA3 (así conocer
qué sitios de corte del sitio de múltiple clonamiento permanecían en el vector (Figura
12B). Entonces, finalmente logramos armar los vectores con sus sitios de corte (Figura
12C).
4.4.5 DIGESTIÓN VECTORES HEXOQUINASA I, II Y III
La estrategia escogida fue cortar los vectores para liberar los insertos y
posteriormente fusionar cada inserto en un vector pEYFP-C1 previamente digerido. Las
enzimas que presentaban un único sitio de corte para los tres vectores son EcoRI y
XbaI (Figura 12C, ver nombres en rojo). La digestión con ambas enzimas de restricción
logró liberar un fragmento del tamaño esperado para los tres vectores. Se esperaba
para HK-I un inserto bajo las 3 kb (aprox. 2.900 pb). Por otro lado para HK-II y HK-III se
59
60
Figura 12. Secuenciación de los vectores pcDNA3-HKs. A. Los vectores recibidos
de la generosa donación del Dr. J.E. Wilson fueron enviados a secuenciar a Macrogen
(Seúl, Corea). B. Una vez recibidos todos los datos y los cromatogramas de la
secuenciación se arma la secuencia y se puede corregir algún error que no haya sido
detectado por el equipo debido a picos superpuestos, por ejemplo. C. La secuenciación
nos permitió confirmar que teníamos la secuencia correcta y que se habían realizado
pequeñas mutaciones puntuales a los cDNAs que permitieron eliminar sitios de corte
internos.
61
predecía un tamaño sobre las 3 kb, con 3.103 y 3.061 pares de bases respectivamente
(Figura 13). Aparentemente la reacción cortó por completo los vectores a excepción de
pcDNA3-HKIII que presenta una banda sobre las 8 kb que tendría el tamaño del vector
linearizado. Posteriormente se purificaron los insertos mediante un Kit de extracción de
DNA a partir de geles de agarosa.
El paso siguiente consiste en realizar la digestión del vector pEYFP-C1. Ligar el
inserto purificado con el vector pEYFP-C1 digerido con EcoRI y XbaI. Colonias
transformadas con el vector ligado deben ser seleccionadas con kanamicina y
posteriormente confirmar en un gel de agarosa el tamaño del vector que posee el
inserto. Para mayor seguridad se podría secuenciar una región del vector. Finalmente
los vectores contendrían la secuencia para proteínas de fusión fluorescentes para las
tres hexoquinasas. Posteriormente se debe confirmar la expresión, mediante
transfecciones en líneas celulares de modo de poder caracterizar su localización
mediante microscopía y actividad mediante ensayos cinéticos.
62
.
Figura 13. Digestión de los vectores pcDNA3-HKs con las enzimas de restricción
EcoRI y XbaI. Ensayo de digestión de los vectores pcDNA3 para liberar inserto que
posee; cDNA hexoquinasa I, hexoquinasa II y hexoquinasa III, respectivamente. Para
los tres casos se utilizó EcoRI y XbaI y se incubó a 37°C por 2 hrs. Carril St: estándar
de DNA 10 kb. Carril 1: pcDNA3-Hexoquinasa I. Carril 2: pcDNA3-Hexoquinasa II.
Carril 3: pcDNA3-Hexoquinasa III.
63
5. DISCUSIÓN
La glucosa es la principal fuente energética de todas las células de nuestro
organismo. Mediante procesos como la glicólisis, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y
la fosforilación oxidativa, la glucosa es utilizada en la producción de ATP (y otros
cofactores enzimáticos) para abastecer distintos procesos celulares (actividad de
enzimas, mantención del gradiente electrostático a través de la membrana,
polimerización del citoesqueleto y movimiento de cargos a través de motores
moleculares, etc). Además, los intermediarios de la glicólisis y TCA son utilizados en
diversas vías metabólicas como en la síntesis de aminoácidos, lípidos, glucógeno,
ácidos nucléicos, etc.
El adecuado suministro de sustratos energéticos se mantiene gracias a la
expresión de proteínas transportadoras. Los transportadores facilitativos de hexosas o
GLUTs realizan la translocación de las moléculas de glucosa (además de fructosa o
inositol en el caso de GLUT5 y HMIT/GLUT13 respectivamente) a través de la
membrana a favor del gradiente de concentración. De esta familia de transportadores
podemos destacar GLUT1 y GLUT3 por presentar altas constantes de afinidad para
glucosa. GLUT1 es un transportador ubicuo, lo cual lo hace responsable del consumo
basal de glucosa en la mayoría de las células. En cambio GLUT3 se expresa en tejidos
con una alta demanda energética encontrándose, por ejemplo, altamente expresado en
neuronas.
Se han descrito múltiples factores que modifican la expresión de diferentes
GLUTs, desde respuesta a hormonas y citoquinas (como hormonas tiroídeas, hormona
64
liberadora de corticotropina, insulina, IL-3) hasta condiciones patológicas como cáncer,
isquemia, diabetes o enfermedades neurodegenerativas (Castelló et al., 1994; Gao et
al., 2012; Zambrano et al., 2010; Beltrán et al., 2012).
Además se ha estudiado la presencia de GLUTs en la membrana plasmática y su
translocación desde el interior de la célula. Sin embargo, la mayoría de estos estudios
se han enfocado al transportador de glucosa sensible a insulina por excelencia, GLUT4
(Rea & James, 1997; Rice et al., 1996; Welsh et al., 2005; Yu et al., 2007). Algunos
estudios se han dedicado a explorar la disponibilidad de GLUT1 y GLUT3 en la
membrana plasmática en respuesta a diferentes estímulos como actividad sináptica,
citoquinas o insulina en diferentes tipos celulares pero no se ha evaluado si su propio
sustrato (glucosa) es capaz de modular la localización subcelular de estos
transportadores (Piper et al., 1991; Ferreira et al., 2011; Weisová et al., 2009,
Zambrano et al., 2010).
En el presente trabajo determinamos la expresión de GLUT1 y GLUT3 en las
células NG108. Además observamos que ambos transportadores se localizan tanto
intracelularmente como en la cercanía de la membrana plasmática. Tanto GLUT1 como
GLUT3 se localizan en compartimentos de apariencia punteada, probablemente
vesícular, lo que está de acuerdo con lo descrito en la literatura (Thoidis et al., 1999;
Kandror & Pilch, 1996; Heijnen et al., 1997; Fischer et al., 1997; Becker et al., 2001).
Además para el caso de GLUT3 se puede distinguir una localización marcada en la
membrana plasmática (o cercanía de ésta) además de compartimentos intracelulares.
La aparente mayor presencia de GLUT3 en membrana plasmática puede deberse al
65
linaje neuronal de la línea NG108, ya que GLUT3 es el principal transportador neuronal.
El patrón de GLUT3 en membrana no es homogéneo sino más bien segmentado o
punteado, lo que hace pensar que GLUT3 se encontraría en compartimentos discretos
de la membrana plasmática. Esta localización sugiere que tal como ha sido descrito,
GLUT3 estaría presente en compartimentos vesiculares y dominios resistentes a
detergentes o ricos en colesterol (como balsas lipídicas o caveolas) (Kandror & Pilch,
1996; Fischer et al., 1997; Becker et al., 2001; Rauch et al., 2006).
Para evaluar cambios en la localización y comportamiento subcelular de los
transportadores en respuesta a la presencia de sustrato, realizamos ensayos de
inmunofluorescencia, TIRM y FRAP a diferentes concentraciones de glucosa. No
encontramos cambios significativos en la localización subcelular de GLUT3 mediante
imunofluorescencia. La localización a nivel de superficie celular de GLUT1 y GLUT3
observada gracias a la microscopía TIRM tampoco se vio alterada. Por otro lado la
movilidad relativa de GLUT1 y GLUT3 analizada mediante ensayos de FRAP no
presenta grandes cambios a diferentes concentraciones de glucosa lo que apoya lo
observado con TIRM e inmunofluorescencia. La ausencia de cambios significativos en
presencia de las diferentes concentraciones utilizadas puede deberse a que la Km de
GLUT3 es alrededor de 1.5 mM por lo que concentraciones de glucosa sobre 5 mM no
modifican significativamente la velocidad de transporte. Sin embargo, ha sido descrito
que los cambios de concentración utilizados en el presente trabajo gatillan cambios en
la incorporación y la utilización de glucosa (John et al., 2008). Esto indicaría que hay un
mecanismo de sensing de la concentración de glucosa que no estaría mediado por una
translocación de los transportadores hacia la membrana plasmática.
66
Los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 han sido descritos formando
parte de compartimentos de la membrana plasmática como caveolas y dominios
resistentes a detergentes (Sakyo et al., 2002; Rauch et al., 2006; Sakyo et al., 2007).
Como fue mencionado anteriormente la localización de GLUT3 presenta un patrón en
membrana plasmática que sugiere su presencia en compartimentos discretos. Los
dominios ricos en colesterol o resistentes a detergentes han sido descritos como
compartimentos que permiten agrupar proteínas, facilitando su interacción o la función
de ellas. Es debido a esto que las balsas lipídicas se han estudiado como plataformas
de transducción de señales. Por otro lado, se ha descrito que la composición lipídica de
la membrana puede modificar la funcionalidad de diversas proteínas (Carruthers &
Melchior, 1984; Butchbach et al., 2004; Dart, 2010; Barrantes, 2007; Nothdurfter et al.,
2010; Barnes et al., 2004; Saksena et al., 2010; Simons & Toomre, 2000; Simons &
Sampaio, 2011; Saxena & Chattopadhyay, 2012; Chini & Parenti, 2004).
Ensayos de incorporación de análogos de glucosa fluorescente permitieron
evaluar en tiempo real el transporte de glucosa. La incorporación de 2-NBDG presenta
un comportamiento bifásico lo que revela la propiedad fosforilable de este análogo
(Porras et al., 2004; Barros et al., 2009, Beltrán et al., 2011). El primer componente
debería corresponder al transporte del análogo y el segundo componente la
fosforilación en el carbono-6 por la enzima hexoquinasa. De acuerdo a lo anterior, ya
que 6-NBDG es un análogo no fosforilable sólo se debería observar un componente de
incorporación. En efecto, la incorporación de 6-NBDG tiene un solo componente, lo que
daría cuenta del transporte de glucosa. Al secuestrar el colesterol de la membrana
plasmática con metil-β-ciclodextrina se observa una caída en la incorporación de tanto
67
2-NBDG como 6-NBDG. De hecho para 2-NBDG hay una disminución en un orden de
magnitud para el segundo componente, y un pequeño aumento en el primer
componente. Por un lado se ha descrito que MβCD aumenta la Vmax sin cambios de Km
para OMG en la línea celular epitelial Clone 9 que expresa GLUT1 (Barnes et al., 2004).
Por otro lado, en células espermátidas, las cuales presentarían una mayor expresión de
GLUT3, no hay cambios significativos para el transporte de OMG, pero sí para el de
DOG observándose la pérdida de un componente de alta afinidad en ausencia de
colesterol (Rauch et al., 2006). En HEK293 se observa una respuesta similar al
segundo caso para el análogo fosforilable, dónde observamos una caída del segundo
componente. En Rauch et al. (2006) se sugiere que la Km de alta afinidad puede
deberse a la función concertada GLUT-hexoquinasa (ver más adelante), de la misma
manera proponemos que el segundo componente es la fosforilación por hexoquinasa.
Es posible concluir que la presencia de colesterol o más bien la integridad de dominios
resistentes a detergentes estarían modulado la actividad de los transportadores de
glucosa. Sin embargo, esta modulación dependería del tipo celular y los
transportadores presentes.
Ya que los dominios ricos en colesterol suelen presentar patrones claros de
clustering o puncta en la membrana plasmática evaluamos la localización de GLUT1 y
GLUT3 a nivel de superficie celular mediante TIRM en presencia y ausencia de
colesterol, además de una sobrecarga del mismo (Figura 8). Aunque ambos
transportadores aparentemente aumentaron su localización frente a altas
concentraciones de colesterol, en ausencia del mismo presentan respuestas opuestas.
Observamos que a nivel de membrana plasmática, GLUT3 disminuye en ausencia de
68
colesterol y que hay un pequeño aumento de GLUT1 en la misma condición. Sin
embargo, no se puede descartar que lo observado frente a la sobrecarga de colesterol
sea un artefacto ya que la rigidez de membrana causada por el elevado colesterol
puede estar alterando la endocitosis.
La disminución del componente de fosforilación en la incorporación de 2-NBDG
en ausencia de colesterol apoya la idea del channeling metabólico. Debido a que el
transporte y fosforilación de glucosa están estrechamente ligados secuencialmente, es
posible que exista una proximidad física que ayude a realizar ambas reacciones de
forma concertada. De hecho en Rauch et al. (2006) describen que GLUT1 y GLUT3
coinmunoprecipitan con hexoquinasa I y caveolina-1 en células germinales masculinas,
sugiriendo que esta interacción directa o indirecta podría estar ocurriendo en caveolas,
que son dominios ricos en colesterol y resistentes a detergentes. Además, en ausencia
de colesterol las caveolas son desarmadas y se pierde la presencia de GLUT3 y en
menor medida, de GLUT1 en las fracciones correspondientes a dominios resistentes a
detergentes (Rauch et al., 2006; Hailstones et al., 1998).
Al evaluar la colocalización de hexokinasa I, II y III con GLUT3 mediante ensayos
de inmunofluorescencia, no se observa colocalización aparente. Sin embargo, al
realizar una coinmunoprecipitación para la hexoquinasa I o neuronal, fuimos capaces
de detectar tanto GLUT1 como GLUT3, indicando la existencia de una interacción
directa o indirecta entre GLUT1 o GLUT3 y hexoquinasa I que no se resuelve en las
imágenes de imunofluorescencia. Para poder evaluar la relación funcional de este
putativo complejo transportador-hexoquinasa realizamos análisis cinéticos con análogos
69
de glucosa radioactivos forforilables y no fosforilables por hexoquinasa. La cinética de
incorporación y saturación dieron cuenta de un transporte de alta afinidad para glucosa,
lo que era esperado en neuronas. Sin embargo, al realizar la curva de Eadie-Hoffstee
encontramos que DOG, el análogo de glucosa fosforilable presenta dos componentes
de alta afinidad (Km: 1,7 mM y Km: 0,5 mM). Al realizar este ensayo utilizando el
análogo no fosforilable sólo encontramos una Km de alta afinidad (Km: 0,8 mM).
Gracias a estos resultados podemos decir que la fosforilación de glucosa por
hexokinasa es capaz de modificar los parámetros cinéticos del transporte de glucosa
por GLUT1/GLUT3.
Es posible especular que para que esta interacción funcional ocurra, sea
necesaria una proximidad física como demostramos en la figura 10 y que esté
localizada en dominios ricos en colesterol. De hecho, como fue mencionado
anteriormente, en células germinales que a su vez presentan dos componentes de alta
afinidad, el tratamiento con MβCD es capaz de eliminar el segundo componente (Rauch
et al., 2006). Ya que se ha descrito que MβCD desarma las caveolas al secuestrar el
colesterol de la membrana plasmática (Hailstones et al., 1998) se puede sugerir que la
localización en caveolas favorece la formación de este complejo GLUT-hexoquinasa
que estaría modulando el transporte. La acción concertada del transporte y fosforilación
de la glucosa es una relación favorable ya que es la hexoquinasa la que se encarga de
fosforilar el carbono en posición 6 de la glucosa eliminando los sustratos intracelulares
del transportador facilitativo de glucosa.
Esta no sería la primera evidencia de una enzima glicolítica que forma parte de
un complejo con un transportador de glucosa. Se ha descrito que la enzima
70
gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa coinmunoprecipita con GLUT1 y GLUT4 (en
eritrocitos y células musculares, respectivamente). Además, hexoquinasa-II
coinmunoprecipita con GLUT4 y hexoquinasa-I coinmunoprecipita con GLUT1 y GLUT3
(en células musculares y células germinales masculinas, respectivamente) (Lachal et
al., 1990; Rauch et al., 2006; Zaid et al., 2009). En células musculares estimuladas con
insulina se ha descrito que en ausencia de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa se
observa la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática sin un correspondiente
incremento en la incorporación de glucosa, lo que apoya la idea de que formación de
estos complejos sería importante para la función de los transportadores Zaid et al.,
2009).
Mediante los experimentos realizados en esta tesis, encontramos que cambios
de la concentración de glucosa extracelular no fueron capaces de gatillar cambios en la
localización subcelular de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3. Sin
embargo, logramos encontrar que el transporte de glucosa está estrechamente
relacionado a la fosforilación por hexoquinasa, mediante una interacción directa o
indirecta de GLUT1/GLUT3 a hexoquinasa, que se correlaciona con la desaparición de
un componente cinético del transporte al utilizar análogos no fosforilables de glucosa.
Además destacamos el posible rol de compartimentos ricos en colesterol, ya que
tratamientos con MβCD se deja de observar un componente de la incorporación que
estaría asociado a la fosforilación. Al parecer existiría un crosstalk entre el transporte y
fosforilación de la glucosa, que permitiría favorecer la función concertada de los GLUTs
y hexoquinasa.
71
Estudios futuros deberían enfocarse en analizar la formación de este putativo
complejo GLUT-hexoquinasa y su regulación. Además queda por estudiar la formación
y localización de este complejo en dominios ricos en colesterol como caveolas y su rol
fisiológico en modelos neuronales. Es posible sospechar que hay componentes o
señales que dirijan la formación de estos complejos en respuesta a las necesidades de
la célula, por lo que se puede encontrar diferencias que sean específicas para un tipo
celular o tejido.
72
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