Replicación del DNA
DNA RNA proteina
transcripción traducciónreplicación
Transcripción
inversa
Dogma Central
Cromosomas Procariontes
Cromosoma lineal eucarionte
Semi-conservativa Bidireccional Semi-continua ó semi-
discontinua Alta fidelidad
Características Generales de la Replicación
Replicación semiconservativa
Replicación bidireccional
7
Replicación semidiscontinuala polimerización se llevaa cabo en dirección 5´--3´
Replicación del DNA y ciclo celular
Etapas de la Replicación
I. Inicio: es el punto en donde se regula el proceso
II. Elongación
III.Terminación
I. Inicio de la replicación
Secuencia rica en T-A
Ori C
Minicromosomas para determinar el origen mínimo
DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción
DNA plasmídico + Enzima de restricción
+
+
ligasa
origen
RR
Transformar bacterias
Medio con antibiótico
mezclado
E. coli
R
Ori-coli
X DNA
NO se replica
Se replica
Medio con antibiótico
Metodo de footprinting para determinar el sitio de origen de la replicación
Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación
1) Nucleasa + DNA Ori2) Dna A + DNA Ori3) DnaB + DNA Ori4) DnaC + DNA Ori 245
1
1 2 3 4
Secuencia del origen de Replicación bacteriano
Región de los treceámeros (tres repeticiones de 13 nucleótidos), 70% AT
5 Nonámeros o cajas DnaA
once sitios GATC en la secuencia de 245pb
Organización del OriC
DUE: DNA unwinding elementIHF: Integration host factorFIS factor
R1=R4>R2>R3=R5
DnaA
DiaA: DnaA initiator-associating proteinIHF: Integration Host factor
1) Activación 20-30DnaA
Arginina 285 es importante en la oligomerización
Proteína DnaA
• Monómero 52kDa• Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas
dnaA • Estequiometria de hasta 20-30 subunidades de DnaA por oriC• Une ATP y lo hidroliza a una velocidad muy baja• Una vez abiertos los treceámeros, DnaA reconoce las cajas
presentes en el DUE y se une a la cadena sencilla estabilizandola.
Regulación negativa del inicio de la replicación
1) Hda (RIDA: regulatory inactivation of DnaA)
2) dat locus (DnaA titulación): sitio en el cromosoma que une grandes cantidades de proteína DnaA
Aproximadamente 200-300 moléculasde DnaA pueden unirse al locus dat.El locus dat (1kb) contiene 5 cajas DnaA y un sitio para IHF
DDAH: dat dependent DnaA-ATP hydrolisis
3) Interacción de OriC con SeqA y la membrana
Regulacion de la expresión de DnaA
Regulación de DnaAPromotor de DnaA tiene cajas DnaA y secuenciasGATC.
Reactivación de DnaA-ADP a DnaA-ATP
DARS: DnaA reactivation sequence: sitios en el cromosoma que contienen cajas DnaAen orientaciones diferentes
DiaA: DnaA initiator-associating proteinIHF: Integration Host factor
1) Activación 20-30DnaA
2. Formación del pre-primosoma
HELICASA DnaB
C-terminal ATPasaSe mueve en dirección 5´---3´
DnaB• Monómeros de 60kDa que
forman un homohexámero• Actividad de helicasa• Dominios para : Unión a DNA de cadena
doble Unión a DNA cadena sencilla Interacción con DnaC y DnaA Hidrólisis de NTPs (ATP)
• Monómeros de 28 kDa• Homohexámero que
permite la llegada de DnaB• ATPasa: al hidrolizar ATP
pierde afinidad por DnaB
Dna C
Pre-primosoma y primosoma
II. Elongación
La replicación del DNA requiere un cebador catalizado por la DNA Primasa
• Dna G, Primasa, ≈ 60 kDa
• RNA polimerasa
• Sintetiza cebador de ≈ 12nt
• DNA Primasa reconoce a DnaB
Proteínas de unión a cadena sencilla: SSB
Las proteínas SSB se unen con alta afinidad al DNA de cadena sencilla y lo protegen de nucleasas y de asociaciones intracatenarias
DNA polimerasas de bacterias
Reacción de polimerización
DNA polimerasas en E. coli
Características de la DNA polimerasa I
Actividades de la DNA polimerasa I
• Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables”, por lo tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa (pero no soportan deleciones del gen).
• Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado.• La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA.
Las mutaciones son letales.
• Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia de DNA que sirve como molde
• La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10
• Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles.
Por qué no existe una DNA polimerasa 3´--5´?
DNA polimerasa III holoenzima
an asymmetric dimer
Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli
sub # por holoenzima
Mr Función
dnaE α 2 132,000 Subunidad catalítica
dnaQ ε 2 27,000 Proofreading
holE θ 2 10,000 Acoplador
dnaX 2 71,000 Dimerización
dnaX 1 48,000
holA δ 1 35,000
holB δ´ 1 33,000
holC χ 1 15,000
holD ψ 1 12,000
dnaN β 4 37,000 Procesividad
Pol III Núcleo 10-15 nuc/seg
Abrazadera que carga las subunidades β al DNAComplejo ó complejo
Pol III’
Pol III*
Pol III holo
1,000 bases/seg
Procesividad de la polimerasa III
La procesividad de la DNApol lII* aumenta de 50 nts a más de 50,000 nts gracias a la subunidad β
Modelo del dímero
Cuál es la participación de las DNA polimerasas en la replicación?
DNA polimerasa I ayuda a remover el cebador con su actividad de exonucleasa 5´-3´ Actividad de polimerasa reemplaza los nucleótidos eliminados ≈17
DNA ligasa cataliza la formación de enlace fosfodiéster
Maduración de los fragmentos de Okazaki
DNA ligasa
DNA topoisomerasas
Topoisomerasas en E. coli
TOPOISOMERASAS I
Topoisomerasa I
Topoisomerasa III
Topoisomerasa II (DNA Girasa)Topoisomerasa IV
IA. 5´
IB 3´
IIA.
IIB
TOPOISOMERASAS II
III. Termino de la replicación
ORIGEN DE REPLICACION EUCARIONTE
Solo uno o múltiples?Tiempo de replicación/tamaño de genomaMúltiples orígenes?/Orígenes diferenciales?Encendido durante el ciclo
Existe una secuencia única?Experimentos con plásmidosLevaduras vs eucariotes superiores
Replicación una vez por ciclo?Depende del ciclo celular?
Inicio de la replicación en eucariotes
Mas de 10 kpb
En S. cerevisiae en promedio cada 30,000. En mamíferosse encuentran entre 100,000 a250,000.La tasa de replicación es aprox. 2000bp/min.
No todos los orígenes se activan al mismo tiempo
Eucromatina se duplica primero, heterocromatina al final
Ensayos para identificar secuencias que actúen como orígenes
Inicio de la replicación en eucariontes:Saccharomyces cerevisiae
ATTTAATATTTTGGA
ARS: Autonomously replicating sequence
% of origin function
Mutaciones en A abaten la función.En B sólo se reduce
ARS
Proteínas ORC
ORC1-6
Cdc6 Cdt1
ORC1-6
Origin recognition complex (ORC)complejo que se une a A y B1
Se encuentra unido durante todoel ciclo celular
Orc 6 es estructuralmente relacionada a TFIIB
Estructura y formación de la helicasa Mcm2-7
Traslocación 3´--5´
Pre-RC
Activación:eventos de fosforilación
Iniciación
Complejo CMG: Cdc45-Mcm-GINSa través de Sld2 y Sld3
“licencia para replicar”
Psf1 GINS Psf2 Psf3 Sld5
+ Cdc45+ MCM2-7 CMG
Complejo CMG
Incrementan la actividad de la helicasa al inicio para abrir las cadenas ypermanecen a lo largo de la elongación
Control del inicio de la replicacióna lo largo del ciclo celular
Cdt1 y geminina limitan la replicación del DNA
MCM8 (primasa)
PCNA
(Helicasa)(PCNA-like)
Pol -cadena laggingPol -cadena líder
Proliferating Cell Nuclear AntigenPCNA
Proteína 29kDa
Incrementa procesividad de la DNA polimerasa
Forma un homotrímero alrededor del DNA
RFC: “ clamp loader” de PCNA
Polimerasas de eucariotes
Horquilla de la Replicación Eucarionte
Procesamiento de los fragmentos de Okazaki
Terminación en eucariontes:El dilema de los cromosomas lineales
Telomerasa
Telomerasa GGTTAG
T-loop