Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Caminos,
Canales y Puertos
Departamento de Ingeniería Hidráulica y Medio
Ambiente
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en
los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y
Digestión Anaerobia
Trabajo de investigación
Autor:
Mariela Beatriz Reyes Sosa
Directores:
José Ferrer Polo
Luis Borrás Falomir
Fotografías:
Mariela Beatriz Reyes Sosa
II
III
Agradecimientos
Le doy las gracias antes que nada a mi familia, por que a pesar de la
distancia me expresan su apoyo y me motivan a continuar.
También expreso mis agradecimientos a todas las personas que de
alguna manera han estado conmigo en la realización de este trabajo:
En primer lugar a mis tutores, Jóse Ferrer y Luis Borrás por su tiempo
y dedicación. Luis te agradezco la paciencia que me has tenido y espero
sigas con ella para lo que continua.
A la Doctora Aurora Seco por su apoyo y orientación en el punto
esencial de este trabajo.
A todos y cada uno de los chicos del laboratorio, ya que hicieron mas
agradable el tiempo que pasé en el laboratorio. Simplemente gracias por
esta alli y por estar pendientes.
A todos mis amigos tanto de México como los de Valencia, que estan
pendientes de mis avances y de mi, gracias por que no pasan el momento
para motivarme a seguir, por sus consejos y aportaciones. En especial quiero
agradecer a Rosa que siempre ha estado conmigo escuchandome y
aconsejandome. A Marcos por que es tan objetivo que siempre me hace
observaciones en mi trabajo. A Carles por ejercer cierta presión y
ayudarme con el resumen en Valenciano. A Mariam por que es mi compañia
en las buenas y en las malas, en las alegrías y en las decepciones. A todas las
demás personas que por falta de espacio omito nombres.
IV
i
RESUMEN
La creciente industrialización y desarrollo de las poblaciones ha producido un
importante aumento del uso del agua y una mayor contaminación de la misma. Por ello,
se ha visto la necesidad de depurar las aguas residuales.
La depuración de las aguas residuales domésticas y/o urbanas se ha basado
principalmente en la aplicación de procesos biológicos. Estos procesos dependen de las
poblaciones microbianas presentes en las aguas residuales y en los sistemas de
tratamiento. En función del tipo de proceso (Fangos activados y Digestión aerobia y/o
anaerobia), varía la población microbiana así como su abundancia, que se puede ver
favorecida de alguna u otra manera por las características del proceso de tratamiento
(Aerobio, Anaerobio y/o Anóxico).
En este trabajo se han identificado y cuantificado las poblaciones microbianas
más características de los procesos biológicos llevados a cabo en la EDAR (Estación
Depuradora de Aguas Residuales) de la Cuenca del Carraixet (Valencia), que incluye un
proceso de Fangos Activados y de Digestión Anaerobia. Con este trabajo se pretende
conocer de forma global las poblaciones microbianas y las diferencias que existen en
cuanto a presencia y abundancia en los procesos biológicos que se realizan en una
misma EDAR.
Para poder llevar a cabo la determinación de las poblaciones microbianas se
adaptó la técnica molecular FISH (Fluorescent in situ hybridization) a las muestras
examinadas, ya que, en el caso de muestras procedentes de digestores anaerobios, las
muestras no presentaban una señal con suficiente intensidad, por lo que se modificarón
los tiempos de fijación e hibridación con el fin de optimizar las señales de hibridación.
En los Fangos activados se detectaron bacterias amonio-oxidantes, nitrito-
oxidantes, PAO (bacterias acumuladoras de poli-fosfatos), GAO (bacterias
acumuladoras de glucógeno), bacterias desnitrificantes, bacterias metanotróficos,
organismos metanogénicos y bacterias sulfato-reductores (SRB). Entre estos
organismos, los que presentaron una mayor abundancia fueron las bacterias sulfato-
reductoras con un 27% (destacando el orden Desulfobacterales seguidas de las
Desulfovibrionales) seguidas de las bacterias desnitrificantes con 19% (en su mayoria
Azoarcus-Thauera-Castellaniella seguidas de Paracoccus). Los organismos
metanogénicos supusieron el 11% (Methanomicrobiales y Methanobacteriales), las
bacterias nitrificantes el 9%, las GAO el 4%, las PAO un 2% y las Metanotrófas un 1%.
El resto de bacterias no identificadas, supuestamente heterótrofas, corresponde a un
27%.
En la Digestión anaerobia se detectó un 30% de organismos metanogénicos
(Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Metahanobacteriales), un 20% de bacterias
sulfato-reductoras (Desulfovibrionales y Desulfobacterales) y un 10% de bacterias
desnitrificantes (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus y Azoarcus-Thauera-
Castellaniella). El resto de bacterias no identificadas (supuestamente acidogénicas)
corresponde a un 40%.
Cabe destacar que no era de esperar encontrar presencia de bacterias
desnitrificantes en el digestor anaerobio, ni bacterias sulfato reductoras y archaeas
ii
metanogénicas en el reactor aerobio. Por lo que su presencia e interacciones resultan un
punto importante dentro de la población microbiana y los diferentes ciclos que se
realizan durante el proceso biológico.
El conocimiento de las interacciones que tienen las bacterias en los diferentes
procesos de una EDAR nos permiten avanzar en las modelaciones y simulaciones de los
procesos para aproximarnos más a la realidad, y poder mejorar la operación de las
plantas.
iii
RESUM
La creixent industrialització i desenvolupament de les poblacions ha produït un
important augment de l’ús de l’aigua i una major contaminació de la mateixa. Per això,
s’ha vist la necessitat de depurar les aigües residuals.
La depuració de les aigües residuals domèstiques i/o urbanes s’ha basat
principalment en l’aplicació de processos biològics. Estos processos depenen de les
poblacions microbianes presents en les aigües residuals i en els sistemes de tractament.
En funció del tipus de procés (Fangs activats i Digestió aeròbia i/o anaeròbia), varia la
població microbiana així com la seua abundància, que es pot veure afavorida d’alguna o
una altra manera per les característiques del procés de tractament (Aerobi, Anaerobi i/o
Anòxic).
En este treball s’han identificat i quantificat les poblacions microbianes més
característiques dels processos biològics duts a terme en l’EDAR (Estació Depuradora
d’Aigües Residuals) de la Conca del Carraixet (València), que inclou un procés de
Fangs Activats i de Digestió Anaeròbia. Amb este treball es pretén conéixer de forma
global les poblacions microbianes i les diferències que existeixen en quant a presència i
abundància en els processos biològics que es realitzen en una mateixa EDAR.
Per a poder dur a terme la determinació de les poblacions microbianes es va
adaptar la tècnica molecular FISH (Fluorescent in situ hybridization) a les mostres
examinades, ja que, en el cas de mostres procedents de digestors anaerobis, les mostres
no presentaven un senyal amb suficient intensitat, per la qual cosa es van modificar els
temps de fixació i hibridació a fi d’optimitzar els senyals d’hibridació.
En els Fangs activats es van detectar bacteris amoni-oxidants, nitrit-oxidants,
PAO (bacteris acumuladors de poli-fosfatos), GAO (bacteris acumuladors de glucogen),
bacteris desnitrificants, bacteris metanotròfics, organismes metanogènics i bacteris
sulfat-reductors (SRB). Entre estos organismes, els que van presentar una major
abundància van ser els bacteris sulfat-reductors amb un 27% (destacant l’orde
Desulfobacterals seguides de les Desulfovibrionals) seguides dels bacteris
desnitrificants amb 19% (en la seu majoria Azoarcus-Thauera-Castellaniella seguides
de Paracoccus). Els organismes metanogènics van suposar 11% (Methanomicrobials i
Methanobacterials), els bacteris nitrificants el 9%, les GAO el 4%, les PAO un 2% i les
Metanotròfes un 1%. La resta de bacteris no identificats, suposadament heteròtrofes,
correspon a un 27%.
En la Digestió anaeròbia es va detectar un 30% d’organismes metanogènics
(Methanosarciales, Methanomicrobiales i Metahanobacteriales), un 20% de bacteris
sulfat-reductors (Desulfovibrionales i Desulfobacterales) i un 10% de bacteris
desnitrificants (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus i Azoarcus-Thauera-
Castellaniella). La resta de bacteris no identificats (suposadament acidogènics)
correspon a un 40%.
Cal destacar que no era d’esperar trobar presència de bacteris desnitrificants en
el digestor anaerobi, ni bacteris sulfat reductors i archaeas metanogènics en el reactor
aerobi. Pel que la seua presència i interaccions resulten un punt important dins de la
població microbiana i els diferents cicles que es realitzen durant el procés biològic.
iv
El coneixement de les interaccions que tenen els bacteris en els diferents
processos d’una EDAR ens permeten avançar en les modelacions i simulacions dels
processos per a aproximar-nos més a la realitat, i poder millorar l’operació de les
plantes.
v
SUMMARY
Increasing industrialization and development of populations has produced a
significant increase in water usage and pollution. Therefore, the need to purify
wastewater has become a major priority.
The purification of domestic and urban wastewater has been based mainly on the
application of biological processes. These processes depend on microbial populations.
Depending on the type of process (activated sludge and aerobic or anaerobic digestion),
the microbial populations and their abundance vary. This microbial populations can be
favored in some way or another by the characteristics of the treatment process (aerobic,
anaerobic or anoxic).
In this work, most characteristic microbial populations that are present in the
biological processes of a WWTP (Wastewater Treatment Plant) have identified and
quantified. The WWTP (Cuenca del Carraixet) is placed in Valencia (Spain), and
includes an activated sludge process and anaerobic digestion. This work is aimed to
determine the overall microbial populations and the abundance differences between the
biological processes that take place in a WWTP.
As samples from the anaerobic digester examined by FISH (Fluorescent in situ
hybridization) resulted in alow signal, it was necessary to adapt this molecular
technique to this kind of samples. As a result, the fixation and hybridization times were
changed.
In the activated sludge process, ammonia-oxidizing bacteria, nitrite-oxidizing,
PAO (poly-phosphates accumulating bacteria), GAO (glycogen accumulating bacteria),
denitrifying bacteria, methanotrophic bacteria, methanogenic organisms and sulfate-
reducing bacteria (SRB) were detected. Among these organisms, the highest abundance
was achieved by sulfate-reducing bacteria with a 27% (mainly Orders
Desulfovibrionales and Desulfobacterales) followed by denitrifying bacteria with a 19%
(mostly Azoarcus, Thauera, Castellaniella and Paracoccus). Methanogenic organisms
accounted for 11% (Methanomicrobiales and Methanobacteriales), nitrifying bacteria
were 9%, 4% of GAO, 2% of PAO 2%, 2% and 1% of methanotrophs. The other
unidentified bacteria, presumably heterotrophic, corresponding to 27%.
In the anaerobic digestion it was detected 30% of methanogenic organisms
(Methanosarciales, Methanomicrobiales and Metahanobacteriales), 20% of sulfate-
reducing bacteria (Desulfovibrionales and Desulfobacterales) and 10% of denitrifying
bacteria (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus, Azoarcus, Thauera, and
Castellaniella). The other unidentified bacteria (supposedly acidogenic bacteria) was
40%.
It should be noted that it was not expected to find denitrifying bacteria in the
anaerobic digester or sulfate reducing bacteria and methanogenic archaea in the aerobic
reactor. So their presence and interactions are an important point in the microbial
population and the different relationships that take place during the biological process.
Knowledge of the interactions between bacteria in the different biological
processes taking place in the WWTP allow us to advance on modeling and simulation
vi
of the biological processes. This information is usefull to get closer to reality and to
improve plant operation.
vii
INDICE
RESUMEN ....................................................................................................................................... I
RESUM ................................................................................................................................................. III
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1
1.1 CARACTERÍSTICAS TÍPICAS DE LAS AGUAS RESIDUALES ............................................................... 1 1.2 PROCESOS BIOLÓGICOS EN AGUAS RESIDUALES ........................................................................... 2 1.3 MICROORGANISMOS ..................................................................................................................... 3 1.3.1 Bacterias amonio-oxidantes (AOB) y bacterias nitrito-oxidantes (NOB) ................................ 5 1.3.2 Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) ....................................................................... 7 1.3.3 Bacterias acumuladoras de glucógeno (GAO) .......................................................................... 8 1.3.4 Bacterias desnitrificantes ........................................................................................................ 10 1.3.5 Bacterias acidogénicas/acetogénicas ...................................................................................... 12 1.3.6 Bacterias metanotrófas ........................................................................................................... 18 1.3.7 Bacterias sulfato-reductoras (SRB)......................................................................................... 19 1.3.8 Organismos metanogénicos .................................................................................................... 24 1.4 TÉCNICA MOLECULAR PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS.
HIBRIDACIÓN MOLECULAR FLUORESCENTE IN SITU (FISH) ......................................................................... 29 1.4.1 Fijación de la biomasa para la hibridación ............................................................................. 30 1.5 SONDAS ...................................................................................................................................... 32
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33
3 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 35
3.1 PROCEDENCIA DE LA MUESTRA .................................................................................................. 35 3.2 TOMA DE MUESTRA .................................................................................................................... 35 3.3 HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU, FISH .............................................................................. 36 3.4 PROCEDIMIENTO ........................................................................................................................ 36 3.5 SONDAS ...................................................................................................................................... 39 3.6 CUANTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS ........................................................................... 44
4 ADAPTACIÓN DE LA TÉCNICA FISH PARA MUESTRAS DE UN DIGESTOR
ANAEROBIO ........................................................................................................................................... 45
4.1 RECOMENDACIÓN A PROBLEMAS ASOCIADOS CON LA DETECCIÓN DE LA FLUORESCENCIA ........ 45 4.2 DETERMINACIÓN DE LOS TIEMPOS DE FIJACIÓN Y DE HIBRIDACIÓN ÓPTIMOS ............................. 46 4.3 CUANTIFICACIÓN DE LA SEÑAL DE HIBRIDACIÓN ....................................................................... 47 4.4 ANÁLISIS CUANTITATIVO ........................................................................................................... 48
5 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS DISTINTOS GRUPOS
BACTERIANOS PRESENTES EN LOS PROCESOS DE FANGOS ACTIVADOS Y DIGESTIÓN
ANAEROBIA............................................................................................................................................ 51
5.1 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS NITRIFICANTES ........................................... 51 5.2 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ACUMULADORAS DE POLI-FOSFATOS (PAOS)
Y ACUMULADORAS DE GLÚCOGENO (GAOS) .............................................................................................. 53 5.3 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS DESNITRIFICANTES .................................... 55 5.4 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS METANOTROFAS ........................................ 57 5.5 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS (SRB) .................. 58 5.6 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS METANOGÉNICAS ...................................... 62 5.7 COMPARACIÓN DEL TOTAL DE LAS POBLACIONES BACTERIANAS ENCONTRADAS EN EL FANGO
ACTIVADO Y EN LA DIGESTIÓN ANAEROBIA ................................................................................................ 64
6 CONCLUSIONES ................................................................................................................. 69
7 RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 71
8 REFERENCIAS .................................................................................................................... 73
ANEXO .......................................................................................................................................... 85
viii
INDICE FIGURAS
Figura 1. Reacciones llevadas a cabo en los fangos activados……………………………………...4
Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestión anaerobia. García 1991. ........................ 5
Figura 3. Clasificación de las Sondas metanogénicas en relación con las bacterias metanogénicas
que detectan . .............................................................................................................................................. 27
Figura 4. Esquema de la Hibridación Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es................................ 30
Figura 5. Diferencia estructural celular entre las gram positivas y las gram negativas . ................. 31
Figura 6. Representación esquemática de los peptidosglicanos . ................................................... 32
Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet. ................................................................................ 35
Figura 8. Hibridación Fluorescente FISH sin modificación de tiempos.. ........................................ 46
Figura 9. Esquema de trabajo para la adaptación de la técnica FISH a muestras del Digestor
anaerobio. 47
Figura 10. Hoja de calculó que genera el programa de cuantificación. ........................................... 48
Figura 11. Hibridación Fluorescente FISH con modificación de tiempos de fijación y de
hibridación.. ................................................................................................................................................ 49
Figura 12. Bacterias amonio-oxidantes en el Reactor aerobio.. ...................................................... 52
Figura 13. Bacterias nitrito-oxidantes en el Reactor aerobio.. ........................................................ 52
Figura 14. Bacterias PAO en el Reactor aerobio.. ........................................................................... 54
Figura 15. Bacterias GAO en el Digestor anaerobio.. ..................................................................... 54
Figura 16. Bacterias desnitrificantes.. ............................................................................................. 56
Figura 17. Bacterias Metanotrofas en el Reactor aerobio ............................................................... 58
Figura 18. Bacterias Sulfato-reductoras en el Digestor anaerobio. ................................................. 59
Figura 19. Bacterias Sulfato-reductoras en el Reactor aerobio.. ..................................................... 60
Figura 20. Bacterias Metanogénicas en el Digestos anaerobio.. ..................................................... 63
Figura 21. Bacterias Metanogénicas en el Reactor aerobio.. ........................................................... 64
Figura 22. Comparación de los grupos de bacterias en cada proceso analizado.. ........................... 65
ix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Bacterias acidogénicas hidrolíticas de la digestión Anaerobia ......................................... 14
Tabla 2. Bacterias acidogénicas fermentativas de la digestión anaerobia ...................................... 15
Tabla 3. Bacterias acetogénicas sintróficas obligatorias de la digestión anaerobia ........................ 16
Tabla 4. Bacterias homoacetogénicas de la digestión anaerobia ..................................................... 17
Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanogénicas ........................................................ 28
Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparación de la solución de hibridación ..... 38
Tabla 7. Cantidades de NaCl para la solución de lavado ............................................................... 39
Tabla 8. Sondas Generales .............................................................................................................. 40
Tabla 9. Sondas específicas para grupo Nitrificantes ...................................................................... 40
Tabla 10. Sondas específicas para el grupo PAO y GAO ............................................................... 41
Tabla 11. Sondas específicas para el grupo de las bacterias desnitrificantes .................................. 42
Tabla 12. Sondas específicas para el grupo de las bacterias metanotroficas ................................... 42
Tabla 13. Sondas específicas para las SRB ..................................................................................... 43
Tabla 14. Sondas específicas para las arqueas metanogénicas ........................................................ 44
Tabla 15. Promedio de las áreas (pixeles) ocupadas por las bacterias y error en la cuantificación
de la señal detectada en la muestra del digestor anaerobio para las bacterias SRB ................................... 49
x
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
1
1 Introducción
El agua como recurso natural se ha vuelto cada vez más escasa con la creciente
población mundial. El déficit del agua es debido, sobre todo, al aumento de las
necesidades surgidas del desarrollo económico y de la explotación demográfica. El
hombre ha utilizado el agua para fines cada vez más numerosos, por lo que ha crecido la
dependencia que tenemos hacia ella.
El agua al precipitar durante su ciclo, arrastra impurezas del aire, al circular en la
superficie se le añade otros contaminantes, más la contaminación generada por el
hombre, esta ultima sea por la actividad agrícola, ganadera o industrial, hace sobrepasar
el poder de autodepuración de la naturaleza. A causa de esto se hace necesario tomar
medidas para mitigar el problema de la contaminación del agua. Para ello se lleva a
cabo tratamientos físicos, químicos, mecánicos y biológicos para depurar las aguas
contaminadas generadas por las actividades humanas.
A las aguas contaminadas por las actividades del hombre se le denomina agua
residual. Las aguas residuales son el líquido recogido mediante la red de alcantarillado
para su envío a una planta de depuración (Mujeriego, 1990).
Se considera aguas residuales a las aguas provenientes de las zonas habitadas y
que son generadas principalmente por el desarrollo humano y por las actividades
comerciales o domésticas de limpieza y alimentación (Barajas, 2002).
Las aguas residuales urbanas (ARU), son generadas cuando dentro de la misma
red de alcantarillado que transporta el agua proveniente de las zonas habitadas, se vierte
aguas residuales de origen industrial. Estas últimas provienen de las instalaciones de
manufacturado y elaboración de alimentos. Así mismo las ARU pueden contener aguas
de escorrentía que acceden a la red de alcantarillado a través de los pozos de registro y
aguas subterráneas que se infiltran en la red a través de uniones deterioradas o de grietas
en las conducciones (Barajas, 2002).
1.1 Características típicas de las aguas residuales
La composición de un agua residual muestra un amplio margen de variación entre
las diferentes poblaciones. Esto se debe no solo a las influencias de origen industrial,
comercial y fluvial que pudiera presentar si no también a los usos públicos del agua en
función de la naturaleza de la población residente.
En términos generales, la mayor parte de los componentes presentes en un agua
residual son materia orgánica, nutrientes, metales, materia inorgánica y
microorganismos. Una considerable parte de estos componentes se encuentran en forma
particulada.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
2
1.2 Procesos biológicos en aguas residuales
Las sustancias orgánicas que se encuentran en las aguas residuales, sufren
cambios debido a la acción de los organismos vivientes que se encuentran en ellas.
Todos los procesos biológicos llevados a cabo en la depuración de las aguas
contaminadas con materias orgánicas biodegradables, se basan, en el proceso natural de
autodepuración de las aguas y por tanto en los requerimientos nutricionales de los
microorganismos (Catalán, 1997).
Los microorganismos en ausencia o presencia de oxígeno libre, descomponen la
materia orgánica obteniendo la energía necesaria para sus necesidades metabólicas y
para elaborar otros materiales que incorporan a sus propias células (Catalán, 1997).
El resultado final de la degradación total de la materia orgánica, en presencia de
oxígeno libre, es la formación de compuestos oxidados como fosfatos, nitratos, sulfatos,
anhídrido carbónico, etc. Cuando la degradación se realiza en ausencia o escasez de
oxígeno libre, o sea en un medio anaerobio, se obtienen compuestos intermedios como
amoniaco, metano, sulfuros, etc. (Catalán, 1997).
El objetivo fundamental del tratamiento biológico de las aguas residuales con
materias orgánicas biodegradables es estabilizar la materia orgánica. La estabilización
de la materia orgánica presente en el agua se realiza mediante la intervención de
microorganismos, por lo que el éxito de éste tratamiento radicará en favorecer la
proliferación de los mismos (Catalán, 1997).
Los tratamientos biológicos se prestan a diversas clasificaciones. Cabe distinguir
entre dos tipos claramente diferenciados (Ferrer, 2007):
1. Procesos Biológicos de cultivo en suspensión
2. Procesos Biológicos de soporte sólido
En todos estos procesos es preciso retener en el sistema la biomasa creada con el
objeto de que se produzca el proceso. En los de cultivo en suspensión se suele recurrir a
una decantación y recirculación de la biomasa, mientras que en la de soporte sólido la
retención de la biomasa queda asegurada por las características del propio proceso
(Ferrer, 2007).
Los sistemas más característicos de los procesos de cultivo en suspensión son los
fangos activados, las lagunas aireadas, el lagunaje y el tratamiento de fangos. Entre los
procesos de soporte sólido se encuentran los filtros percoladores, los biodiscos y los
lechos de turba (Ferrer, 2007).
Los fangos activados son los más usados en las depuradoras de aguas residuales,
así como también el tratamiento de fangos a través de la digestión.
En los sistemas de fangos activados, con las aguas residuales son introducidas
muchas especies de organismos. Muchas de ellas encuentran en ellas un medio
inadecuado y, como consecuencia de ello mueren; otras en cambio al ser favorables
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
3
persisten y se multiplican. La composición específica de los fangos activados estará
determinada por la velocidad relativa de crecimiento de las especies, la disponibilidad
de alimento en competición con otras especies del mismo nivel trófico y el efecto de la
prelación de los organismos de niveles tróficos más altos. Otros factores importantes
son, la disponibilidad de oxígeno, el pH, la temperatura y la presencia de agentes
inhibidores o tóxicos. De todas las especies de un mismo nivel trófico que compiten
por el mismo alimento la más fuerte y mejor adaptada de ellas se convertirá en
dominante. Esta situación debería conducir a la eliminación de las otras especies que
compiten. Esto no ocurre debido a las condiciones cambiantes que se dan conforme los
fangos pasan a través del sistema, que favorecen sucesivamente a diferentes especies, y
a la introducción constante de una población microbiana mixta que mantienen la
competición por el alimento (Ferrer, 2007).
Los microorganismos que se pueden encontrar en los sistemas de tratamiento de
aguas residuales son, bacterias, protozoo, algas, hongos, rotíferos y nemátodos. Siendo
las bacterias las que constituyen el 95% de la biomasa en el proceso de fangos activados
(Ferrer, 2007).
Este trabajo se ha centrado en estudiar la población bacteriana presente en los
procesos biológicos de una EDAR (Estación Depuradora de Aguas Residual),
describiendo algunos grupos funcionales de bacterias que se encuentran comúnmente en
las diversas aguas residuales en las plantas de tratamiento. Para la realización del trabajo
nos basamos en la filogenia bacteriana y en la técnica molecular FISH (Fluorescence in
situ Hybridization ).
1.3 Microorganismos
Las bacterias son microorganismos unicelulares, que se multiplican por escisión
celular, y son las principales responsables de la mineralización de la materia orgánica.
Desde el punto de vista metabólico, se clasifican en autótrofas y heterótrofas. La
principal ventaja competitiva de las bacterias, reside en su extraordinaria facultad
metabólica, es decir, su capacidad de adaptación a condiciones ambientales y sustratos
orgánicos muy variados. Ciertos alimentos o sustratos orgánicos estimulan
selectivamente la acción metabólica de algunas bacterias. De la misma forma, las
sustancias resultantes del metabolismo de un grupo de bacterias, estimulan a otros
grupos de bacterias a multiplicarse (Catalán, 1997).
Principales grupos de bacterias presentes en los procesos biológicos (fango
activado y digestión anaerobia) de una Estación depuradora de aguas residuales:
Bacterias amonio-oxidantes (AOB)
Bacterias nitrito-oxidantes(NOB)
Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO)
Bacterias acumuladoras de glucógeno (GAO)
Bacterias desnitrificantes
Bacterias acidogénicas/acetogénicas
Mariela Beatriz Reyes Sosa
4
Organismos metanogénicos
Bacterias metanotróficas
Bacterias sulfato-reductoras (SRB)
Los 5 últimos grupos corresponden a bacterias características de la digestión
anaerobia.
En la figura 1 se muestran las reacciones llevadas a cabo por las bacterias dentro
de los fangos activados.
Figura 1. Reacciones llevadas a cabo en los fangos activados. En las reacciones que llevan a
cabo las bacterias desnitrificantes son por enzimas estas son: 1. nitrito reductasa, 2. nitrito
reductasa, 3. oxidonitrico reductasa y la 4. oxidonitroso reductasa.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
5
Polímero Biológico
CH4 +
CO2
H2+CO2AcetatoCO2+H2O
CH4 +
CO2
CH4
+ CO2
CO2 +
H2O
Propionato
ButiratoValeratoCaproato
AcetatoFormato H2+CO2
CH4
+ CO2
Piruvato, SuccionatoLactato, Etanol
CO2+H2O
Monómeros
Acetato
Acetato
Bacterias hidrolíticas
Bacterias fermentativasBHA
Bacterias nitrato-reductorasNO2+N2O+N2
NH4+
Bacterias Sulfato-reductorasBSR
SO4 2-NO3 -
BSR
BMA
SO42-BSR
SO4 2-
Bacterias fermentativas
Bacterias homoacetogénicasBHA
Bacterias metanogénicasacetoclasticas
BMABacterias metanogénicas
hidrogenotróficas.
BMA
SO4 2-
Bacteriassincrónicas
BSR
SO4 2-
METANOGÉNESIS
ACETOGÉNESIS
HIDROLISIS
Y ACIDOGENESIS
En la figura 2 se muestran las reacciones que se dan dentro de un digestor
anaerobio.
Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestión anaerobia. García 1991.
En los apartados siguientes se describe cada grupo de las bacterias escritas
anteriormente.
1.3.1 Bacterias amonio-oxidantes (AOB) y bacterias nitrito-oxidantes (NOB)
Un grupo muy limitado de microorganismos autótrofos (bacterias nitrificantes)
lleva a cabo el proceso de la nitrificación. La nitrificación se produce en dos pasos, cada
uno de ellos realizado por un tipo específico de bacterias.
El primer paso se consiste en oxidar el amonio a nitrito, cuya reacción es (Ferre,
2007):
NH4+
+ 3/2 O2 → NO2- + 2H
+ + H2O
El grupo de bacterias que lleva a cabo esta oxidación son las bacterias del género
Nitrosomonas, Nitrosospira y Nitrosococcus (Teira, 1996).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
6
La clasificación taxonómica de estas bacterias basada en la segunda edición del
manual Bergey’s (Garrity et al., 2001) es la siguiente:
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase II: β-proteobacteria
Orden V: Nitrosomonadales
Familia I: Nitrosomonadaceae.
Género I: Nitrosomonas
Gérero II: Nitrosospira
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase III: γ-proteobacteria
Orden I: Chromatiales
Familia I: Chromatiaceae
Género X: Nitrosococcus
El segundo paso consiste en la oxidación de nitrito a nitrato. La reacción que se
lleva a acabo es la siguiente (Ferre, 2007):
NO2- + ½ O2 → NO3
-
El grupo de bacterias que participan en este proceso son las bacterias del género
Nitrobacter y Nitrospina (Teira, 1996).
La clasificación taxonómica es la siguiente (Garrity et al., 2001):
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase I: α-proteobacteria
Orden VI: Rhizobiales
Familia VII: Bradyrhizobiaceae
Género I: Nitrobacter
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase IV: δ-proteobacteria
Orden III: Desulfobacterales
Familia III: Nitrospinaceae
Género I: Nitrospina
Las bacterias nitrificantes se caracterizan por una baja tasa de crecimiento. Esto es
debido a la poca energía obtenida con las oxidaciones para la nitrificación en las plantas
de tratamiento biológico de aguas residuales (Teira, 1996).
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
7
Tanto las nitrosomonas como las nitrobacter son bacterias autótrofas
quimiosintéticas. Esto significa que obtienen la energía necesaria para sintetizar tejido
celular mediante reacciones de oxidación-reducción, y que la fuente de carbono que
utilizan para este fin es CO2 (inorgánico) que tiene que ser reducido antes de pasar a
formar parte de la biomasa celular. La desaparición de estos organismos por muerte o
lisis da lugar a la aparición en la disolución de sustrato lentamente biodegradable, que
es hidrolizado y consumido por los organismos heterótrofos (Ferrer, 2007).
1.3.2 Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO)
Se ha comprobado que la eliminación biológica de fósforo es llevada a cabo por
un grupo de bacterias denominadas PAO (Polyphosphate Accumulating Organisms).
Estas bacterias liberan y toman fósforo en condiciones anaerobias y aerobias
alternadas.
En condiciones anaerobias la materia orgánica fácilmente biodegradable es
descompuesta por las bacterias acidogénicas a ácidos grasos volátiles de cadena corta.
Estos ácidos grasos son absorbidos por las bacterias PAO y almacenados como poli-
hidroxi-butirato (PHB) y otros polihidroxialcanoatos (PHA). La energía necesaria para
el almacenamiento de los ácidos grasos, es obtenida de la descomposición de los
polifosfatos en condiciones anaerobias. Durante este proceso es cuando se produce la
descarga de fosfatos al medio.
Bajo condiciones aerobias, las bacterias PAO pueden utilizar el sustrato
almacenado (PHB) dando lugar a un crecimiento de las mismas. Así mismo, utilizan
parte de este sustrato almacenado para acumular fósforo intracelular en forma de poli-
fosfatos, asegurando las reservas de energía necesaria para la etapa anaerobia.
En un estudio en 1994 se utilizó la técnica FISH (Fluorescence in situ
Hybridization) para estudiar la comunidad microbiana en una planta de tratamiento de
aguas residuales en las que se producía el fenómeno de la eliminación biológica de
fósforo (Wagner et al., 1994). La población bacteriana resultó en su mayoría
Actinobacteria y β-proteobacteria, seguida de γ-proteobacteria, y en un mínimo de la
población la especie Acinetobacter.
Al año siguiente se realizaron estudios comparando la estructura de la comunidad
bacteriana de fangos con y sin eliminación de fosfatos (Bond et al., 1995). Se operaron
dos reactores de laboratorio con diferentes capacidades para la eliminación de fosfatos.
En ambos reactores, el grupo dominante de bacterias pertenecía a la clase β-
proteobacteria y dentro de esta clase, el genero Rhodocyclus se encontraba en mayor
proporción en el reactor que experimentaba mejor la eliminación de fósforo.
En 1999 un estudio indicó la posición filogenética definitiva del subgrupo β-
proteobacteria, como muy cercano al género Rhodocyclus. A este se le llamó
“Candidatus Accumulibacter Phosphatis” (Hesselmanm et al., 1999). Otro estudio
realizado un año mas tarde comprobó que Accumulibacter era capaz de realizar el
transito de los polifosfatos en el medio (Croccetti et al., 2000). Estos estudios
Mariela Beatriz Reyes Sosa
8
demostraron que Accumulibacter correspondía con el fenotipo de las PAO y que
predominan en los reactores tanto de laboratorio como los industriales.
Se han desarrollado diversas sondas para detectar los principales miembros de
Accumulibacter en las muestras de aguas residuales. Algunas de estas sondas son:
PAO462, PAO651, PAO846 (Croccetti et al., 2000). El uso conjunto de las sondas
forman la sonda PAOMIX que cubriría todas las secuencias conocidas de las bacterias
Accumulibacter en las muestras de fangos activados.
Las taxonomías de las algunas bacterias PAO según la segunda edición del
manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son:
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase II: β-proteobacteria
Orden VI: Sin clasificación en β-proteobacteria
Familia I: Candidatus Accumulibacter
Género: Candidatus Accumulibacter Phosphatis
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase II: β-proteobacteria
Orden VI: Rhodocyclales
Familia I: Rhodocyclaceae
Género I: Rhodocyclus
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase III: γ-proteobacteria
Orden IX: Pseudomonadales
Familia II: Moraxellaceae
Género II: Acinetobacter
La reacción de la degradación de polifosfato en condiciones anaerobias es (Ferrer,
2007):
2C2H4O2 + (HPO3) + H2O → (C2H4O2)2 + PO4-3
+ 3H+
La reacción de la toma de fosfatos en condiciones aerobias es (Ferrer, 2007):
(C2H4O2)2 + 0.2 PO4-3
+ 1.2 O2 + 0.16 NH4+ → 0.16C5H7NO2 + 1.2 CO2+ 0.2 (HPO3) +
0.44 OH- + 1.44 H2O
1.3.3 Bacterias acumuladoras de glucógeno (GAO)
Las bacterias GAO (Glycogen Accumulating Organisms) son bacterias que
compiten con las PAO. Poseen un metabolismo muy similar al de las PAO, ya que al
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
9
igual que ellas, utilizan los ácidos grasos volátiles para la producción de PHA en las
zonas anaerobias, y sintetizan glucógeno en las zonas aerobias.
El término GAO fue propuesto en 1995, definido como el fenotipo de organismos
que acumulan glúcogeno aeróbicamente, y lo consumen anaeróbicamente como fuente
de energía. Esto lo realizan con el fin de tomar fuentes de carbono y almacenarlas en
forma de PHA (Mino et al., 1995).
Existe gran diversidad filogenética entra las GAO, entre ellas Amaricoccus spp. y
Defluviicoccus vanus, de la clase de α-proteobacteria; Quadracoccus spp, de la clase β-
proteobacteria; algunas bacterias de la clase γ-proteobacteria y algunas Actinobacteria
como Tetrasphaera spp., Micropruina glycogenia y Kinosphaera limosa (Maszenan et
al., 1997; Shintani et al., 2000; Kong et al., 2001; Hanada et al., 2002; Liu et al., 2002).
En 1999 se diseñaron dos sondas FISH (Gam1019 y Gam1278) para hibridar
sobre las bacterias GAO pertenecientes a la clase γ-proteobacteria (Nielsen et al.,
1999). Estas sondas fueron utilizadas para un fango deteriorado de un proceso de
eliminación de fósforo y encontraron que el 35% de la población microbiana coincidían
con las bacterias GAO. Años mas tarde se realizo un estudio donde se utilizó un fango
enormemente deteriorado de un proceso de eliminación de fósforo (Crocetti et al.,
2002). Como resultado se diseño dos nuevas sondas (GAOQ431 y GAOQ989) que
hibridaban sobre bacterias pertenecientes a la clase γ-proteobacteria. Estas sondas
hibridaban bacterias pertenecientes al mismo grupo que se hibridaban con las sondas
diseñadas en 1999. Sin embargo se identificó claramente el fenotipo GAO en este grupo
de bacterias y las llamaron “Candidatus Competibacter phosphatis” (Crocetti et al.,
2002).
En el 2002 se realizó in minucioso estudio en el que se identificaron un nuevo
grupo de GAO compuesto por siete subgrupos dentro de la clase de γ-proteobacteria
(Kong et al., 2002). Se diseñaron 10 sondas FISH para hibridas específicamente sobre
este nuevo grupo de bacterias a diferentes niveles jerárquicos: GB, la sonda para el nivel
más general, fue dividida en GB_G1 (idéntica a GAOQ989), GB_G2 y GB_1-GB_7.
Las bacterias que hibridaban estas sodas mostraban morfologías de cocos y bacilos.
Otros dos subgrupos de la clase α-proteobacteria y próximos a Defluviicoccus
vanus, han sido relacionados con el fenotipo GAO. El primero de los subgrupos
comprende las bacterias que hibridan con las sondas TFO_DF218 y TFO_DF618
(Wong et al., 2004). Este grupo de bacterias mostró una importante presencia en los
reactores de laboratorio, pero no en plantas de tratamiento reales. A este grupo se le
conoce como “Defluviicoccus vanus Cluster 1”. El segundo subgrupo correspondía con
bacterias encontradas en reactores alimentados con propionato (Meyer et al., 2006). Las
sondas diseñadas para hibridar sobre este subgrupo fueron DF988 y DF1020. A este
grupo se le ha llamado “Defluviicoccus vanus Cluster 2”.
Las taxonomías de las bacterias GAO según la segunda edición del manual
Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son:
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase I: α-proteobacteria
Mariela Beatriz Reyes Sosa
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Orden III: Rhodobacterales
Familia I: Rhodobacteraceae
Género III: Amaricoccus
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase I: α-proteobacteria
Género: Defluviicoccus vanus
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase II: β-proteobacteria
Género: Quadracoccus spp.
Dominio: Bacteria
Phylum BXIV: Actinobacteria phy. nov.
Clase I: Actinobacteria
Subclase V: Actinobacteridae
Orden I: Actinomycetales
Suborden: Micrococcineae
Familia X: Intrasporangiaceae
Género VIII: Tetrasphaera
Dominio: Bacteria
Phylum BXIV: Actinobacteria phy. nov.
Clase I: Actinobacteria
Subclase V: Actinobacteridae
Orden I: Actinomycetales
Suborden IX: Propionibacterineae
Familia II: Nocardioidaceae
Género VI: Micropruina
Las reacciones que llevan a cabo son (Oehmen et al, 2005):
Condiciones anaerobias
C2H4O2 + 1.12CH10/6O5/6 → PHA(1.358PHB + 0.456PHV + 0.0367PH2MV) + 0.27CO2
Condiciones aerobias
4/3CH1.5O0.5 + 4/6 ATP + 5/6 H2O → CH10/6O5/6
1.3.4 Bacterias desnitrificantes
Existe un gran número de bacterias capaces de llevar a cabo el proceso de
desnitrificación, ya que muchas bacterias aerobias pueden utilizar los nitratos para su
respiración en condiciones anaerobias (anóxicas) (Barajas, 2002). Las bacterias que
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
11
llevan a cabo la desnitrificación pueden ser, tanto bacterias heterótrofas (utilizan el
Carbono de la materias orgánica para la síntesis celular y como fuente de energía) como
anaerobias facultativas (utilizan el oxígeno y el nitrato como aceptor de electrones)
(Barajas, 2002). Aunque existen bacterias autotrofas que también son capaces de llevar
a cabo la desnitrificación (Ferrer, 2007).
Las bacterias desnitrificantes son filogenéticamente diversas y están distribuidas
ampliamente en ecosistemas acuáticos y terrestres. El proceso de desnitrificación
ocurre en muchas especies de Eubacteria y en unas pocas Arqueobacterias. Las
Proteobacterias y las Enterobacterias son anaerobias facultativas, debido a que
cambian el aceptor de electrones como el oxígeno por óxidos de nitrógeno (NO2, NO3)
bajo condiciones anóxicas (Benavides et al., 2006).
Los típicos géneros desnitrificantes organotróficos de los sistemas de fangos
activados son: Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium,
Hypomicrobium, Moraxella y Pseudomonas (Wanner, 1994).
La estructura de la comunidad de bacterias desnitrificantes se ve afectada por las
diversas fuentes de carbono. Esto se demuestra por el enriquecimiento de las diversas
bacterias desnitrificantes con metanol y acetato (Ginige et al., 2004, 2005; Hallin et al.,
2006; Osaka et al., 2006; Morgan et al., 2008).
Se sospechaba que en las plantas de lodos activados para la eliminación de
carbono, nitrificación y desnitrificacion dominaban entre las desnitrificantes la β-
proteobacteria del género Aquaspirillus, seguidas de las Thauera y Azoarcus (Thomsen
et al., 2007). Sin embargo se ha observado que las Zoogloea junto con Azoarcus y
Thauera abundan y se cree que son las dominantes en la desnitrificacion de las plantas
de tratamiento industrial (Juretschko et al., 2002). Las β-proteobacteria del orden
Methylophilales del género Dechloromonas y Thauera fueron las bacterias
desnitrificantes dominantes en fangos activados con metanol (Ginige et al., 2004) y
acetato (Ginige et al 2005) respectivamente. Recientemente se han hallado otras β-
proteobacteria capaces de desnitrificar en el tratamiento de lodos activados, estas son:
Comamonadaceae y algunas Alphaproteobacterias Rhodobacteraceae (Osaka et al.,
2006).
Muchos investigadores han estudiado desnitrificar en presencia de azufre y
tiosulfato como donadores de electrones, esto con cultivos puros de Thiobacillus
desnitrificans y Paracoccus (Lee, et al., 2008). Thiobacillus desnitrificans es capaz de
crecer como anaerobios facultativos quimiolitotrofos, de oxidar compuestos inorgánicos
de azufre, nitrato y otros compuestos nitrogenados (Lee, et al., 2008).
Las taxonomías de los microorganimos desnitrificantes según la segunda edición
del manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son:
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase I: α-proteobacteria
Orden III: Rhodobacterales
Familia I: Rhodobacteraceae
Mariela Beatriz Reyes Sosa
12
Género XI: Paracoccus
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase II: β-proteobacteria
Orden II: Hydrogenophilales
Familia I: Hydrogenophilaceae
Género II: Thiobacillus
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase II: β-proteobacteria
Orden VI: Rhodocyclales
Familia I: Rhodocyclaceae
Género II: Azoarcus
Género IX: Thaurea
Las reacciones que se llevan a cabo en la desnitrificación son por vía enzimática
de las bacterias desnitrificantes (Sunil et al., 2010). Estas son:
1 2 3 4
NO3- → NO2
- → [NO] → N2O → N2
1. Enzima nitrato reductasa
2. Enzima nitrito reductasa
3. Enzima oxido nitrico reductasa
4. Enzima oxido nitroso reductasa
La reacción de reducción del nitrato a nitrógeno gas, utilizando metanol como
fuente de carbono puede representarse de la siguiente manera (Ferrer, 2007):
Primera fase:
6NO3- + 2CH3OH → 6NO2
- + 2CO2 + 4H2O
Segunda fase:
6NO2-+ 3CH3OH → 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OH
-
1.3.5 Bacterias acidogénicas/acetogénicas
Las bacterias acidogénicas o fermentativas producen ácidos grasos volátiles,
lactato, etanol, formato, hidrógeno y bióxido de carbono (Ramírez, 1992). En el caso de
la celulosa se pueden representar en tres niveles (Guyot, 1988):
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
13
Primer nivel: bacterias primarias. Son las que hidrolizan la celulosa a celobiosa,
glucosa, etanol, lactato, acetato, hidrógeno y bióxido de carbono.
Segundo nivel: bacterias secundarias. Son las que hidrolizan celobiosa + glucosa a
etanol, lactato, hidrógeno y bióxido de carbono,
Tercer nivel: bacterias auxiliares. Son las que transforman el etanol o el lactato a
acetato, hidrógeno y bióxido de carbono.
Además de las bacterias celulolíticas existen bacterias proteolíticas y lipolíticas
(Ramirez, 1992).
Dentro de las especies celulolíticas anaerobias más numerosas se encuentran el
género Clostridium (tabla 1).
La población bacteriana fermentativa varía mucho con el sustrato, en la tabla 2 se
muestran diversas bacterias y sus productos.
Las bacterias acetogénicas son a menudo llamadas bacterias homoacetogénicas.
Estos son organismos estrictamente anaerobios (Brauman et al., 1992), que utilizan la
vía del acetil-CoA para reducir las emisiones de CO2, y tienen como acetato su producto
principal de la respiración (Wood y Ljunadahl 1991; Drake 1994).
La mayoría de las bacterias acetogénicas se han aislado de hábitats anaerobios
estrictos, tales como, en sedimentos marinos o de estuarios, estanques de agua dulce o
los lodos de depuradoras anóxicas (Drake 1994; Schink 1994).
Filogenéticamente las bacterias acetogénicas no forma una unidad distinta, pero
están incluidas dentro del gran grupo filogenético de las Clostridios Gram-positivas
(Tanner y Woese 1994).
Las bacterias acetogénicas son muy particulares, ya que solamente pueden crecer
en presencia de otras bacterias anaerobias estrictas consumidoras de hidrógeno, como
las metanogénicas hidrogenotrofas o algunas sulfato-reductoras en presencia de sulfato.
El descubrimiento de estas bacterias puso en evidencia el proceso de transferencia de
interespecies de hidrogeno.
En la tabla 3 se muestra algunas bacterias acetogénicas y las reacciones que llevan
a cabo.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
14
Tabla 1. Bacterias acidogénicas hidrolíticas de la digestión Anaerobia (García, 1983)
Especie Sustrato
Acetivibrio cellulolyticus
Bacteroides succinogenes
Butyrivibrio fibrisolvens
Cillobacterium cellulosolvens
Ruminococcus Albus
Ruminococcus flavifaciens
Celulosa
Bacteroides ruminicola
Butyrivibrio fibrisolvens
Hemicelulosas
Bacillus spp.
Bacteroides spp.
Clostridium butyricum
Clostridium spp.
Lactobacillus spp.
Micrococcus spp.
Pseudomonas spp.
Almidón
Clostridium butyricum
Pectinas
Anaerovibrio lipolytica
Bacillus spp.
Lípidos
Clostridium acidi urici
Clostridium cylindrosporum
Micrococcus aerogenes
Micrococcus lactilycus
Compuestos nitrogenados
Bacillus spp.
Clostridium spp.
Bifidobacterium spp.
Peptococcus anaerobus
Staphylococcus spp.
Proteínas
Termofílicas
Clostridium thermocellum
Celulosa
Clostridium thermohydrosulfuricum
Almidón y Pectinas
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
15
Tabla 2. Bacterias acidogénicas fermentativas de la digestión anaerobia (García, 1983)
Especie Metabolitos
Acetobacterium woodii
Clostridium aceticum
Clostridium formiaceticum
Acetato
Butyribacterium methylotrophicum
Eubacterium sp.
Acidaminococcus sp.
Acetato, Butirato
Clostridium sp.
Acetato, Butirato, Etanol
Propionibacterium sp.
Anaerovibrio sp.
Veillonella sp.
Acetato, Propionato
Lactobacillus sp.
Acetato, Etanol, Lactato
Bifidobacterium sp.
Acetato, Lactato
Ruminococcus sp.
Acetato, Lactato, Formato
Leptotrichia sp.
Streptococcus sp.
Lactato
Succinivibrio sp.
Succinato
Butyrivibrio sp.
Fusobacterium sp.
Butirato
Megasphaera Butirato, Isobutirato, Valerato, Isovalerato,
Caproato
Termofílicas
Clostridium thermo-aceticum
Acetogenium kivui
Acetato
Thermo-anaerobium brockii
Lactato, Acetato, Etanol
Thermo-bacteroides acetoethilicus
Etanol, Acetato, Butirato, Isobutirato
Thermo-anaerobacter ethanolicus Etanol, Acetato, Lactato, Isobutirato,
Isovalerato
Clostridium thermo-saccharolyticum Etanol, Acetato, Lactato, Butirato, Formato
Mariela Beatriz Reyes Sosa
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Tabla 3. Bacterias acetogénicas sintróficas obligatorias de la digestión anaerobia (García, 1991)
Bacterias
Reacción
Organismos “S” (Pelobacter sp.)
Etanol+H2O→acetato+H2O
Syntrophobacter wolinii
Propionato+3 H2O→acetato+3 H2O+CO2
Syntrophomonas bryantii
sapovorans
wolfei sub. sp.
saponavida
wolfei sub. sp. Wolfei
Syntrophospora bryantii
Butirato+2 H2O→2 acetato+2 H2O
Syntrophus buswellii
Benzoato+7 H2O→3 acetato+3
H2O+CO2
Existen otras bacterias fermentativas (tabla 4) cuyas características son (Eichler y
Schink, 1984):
a). tres moles de acetato deben de ser formados a partir de la glucosa y fructosa.
b). no hay hidrógeno molecular producido.
c). el bióxico de carbono es necesario para el crecimiento.
d). el bióxico de carbono es incorporado al acetato dependiendo del sustrato
utilizado.
Estas bacterias se dividen en dos grupos, en la tabla 4 se divide los dos grupos de
acuerdo a la reacción para la formación del acetato.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
17
Tabla 4. Bacterias homoacetogénicas de la digestión anaerobia (García, 1991)
Grupo 1: H+ (reducción de un compuesto carbonado) + CO2 → acetato
Género Especie
Butyribacterium rettgeri
Clostridium acidiurici
cylindrospermum
formicoaceticum
magnum
thermoaceticum
Peptococcus glycinophilus
Grupo 2: H2 + CO2 → acetato
Género Especie
Acetoanaerobium noterae
Acetobacterium carbinolicum
malicum
termitida
wieringae
Woody
Acetofilamentum rigidum
Acetohalobium arabaticum
Acetothermus paucivorans
Acetitomaculum ruminis
Clostridium aceticum
ljungdahlii
mayombii
thermoautotrophicum
Eubacterium limosum
Sporomusa acidovorans
malonica
ovata
paucivorans
sphaeroides
termitida
Mariela Beatriz Reyes Sosa
18
1.3.6 Bacterias metanotrófas
Las bacterias oxidantes de metano (metanotrófos) son un único grupo de bacterias
metilotróficas que utilizan el metano y compuestos pequeños de carbono como su
fuente de energía (Murrell, 1994; Hanson and Hanson, 1996). Tras el análisis de 16s
rADN se definió las relaciones filogenéticas y ocho géneros de organismos
metanotrofos: Methylococcus, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter,
Methylocaldum, Methylosphaera, Methylocystic y Methylosinus.
Estos géneros se dividen en dos distintos grupos filogenéticos. Tipo I
(Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylocaldum, Methylosphaera),
este grupo capaz de asimilar el formaldehído producido a partir de la oxidación del
metano a través del metanol, y Tipo II (Methylocystis y Methylosinus), utilizan el grupo
de la serina para la asimilación del formaldehído (Hanson and Hanson, 1996; Bourne et
al., 2000). Los miembros del género Methylococcus poseen una combinación de
características tanto del Tipo I como del Tipo II metanotrofos.
El Tipo I (incluyendo Methylococcus) se encuentra en la subdivisión de γ-
proteobacteria de la clase proteobacteria, mientras que el grupo II se encuentra en a
subdivisión α-proteobacteria (Tsien et al., 1990; Brusseau et al. 1994; Bourne et al.,
2000).
Existen pocos estudios utilizando FISH para la detección específica de las
metanotroficas. Recientemente se ha aplicado la técnica FISH para determinar la
abundancia de diferentes grupos filogenéticos de metanotrofos en una turba de
Sphagnum al oeste de Siberia (Dedysh et al., 2001). El conjunto de sondas
metanotroficas incluyo sondas especificas para el Tipo I MOB (Methane Oxidising
Bacteria) (sonda M-84 y M-705) o para el grupo de Tipo II MOB
Methylosinus/Methylocystis (sondas Ma-464 MA-221 y M-450), así como las sondas
(Mcell_1026 y Mcell-181) para el methanotroph acidófilas palustris Methylocella
(Dedysh et al., 2000; Dedysh et al., 2003).
Hasta hace poco, las secuencias de genes de 16s rRNA de Tipo II MOB eran muy
poco representadas en la base de datos del dominio público. Esto hizo imposible
formular sondas permitiendo la diferenciación entre Methylocystis spp. y especies de
Methylosinus (Dedysh et al., 2003). Incluso una publicación reciente ha trabajado con
sondas de oligonucleótidos 16s rRNA dirigidas a un solo grupo (Gulledge et al., 2001).
La base de datos de las secuencias de 16s RADN del Tipo II MOB fue descrita en
un estudio en el 2002 (Heyer et al., 2002).
La reacción que se lleva a cabo por las bacterias metanotrofas es (Modin et al., 2007):
CH4 + 1.02 O2 + 0.786 NO3- + 0.786 H
+ → 0.393 N2 + 2.39 H2O + CO2
Las taxonomías de los distintos géneros de las bacterias metanotroficas según el manual
Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son:
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
19
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase I: α-proteobacteria
Orden VI: Rhizobiales
Familia V: Methylocystaceae
Género I: Methylocystis
Gérero III: Methylosinus
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov.
Clase III: γ-proteobacteria
Orden VII: Methylococcales
Familia I: Methylococcaceae
Género I: Methylococcus
Género II: Methylobacter
Género III: Methylocaldum
Género IV: Methylomicrobium
Género V: Methylomonas
Género VI: Methylosphaera
1.3.7 Bacterias sulfato-reductoras (SRB)
Llevan a cabo el ciclo del sulfuro, son importante reguladores de una variedad de
procesos esenciales como: descomposición de materia orgánica, biodegradación de
contaminantes cloro-aromáticos, metilación del mercurio (Fauque, 1995; Barton, 1995)
y remediación ambiental en diversos ambientes.
La reducción desasimilatoria del sulfato es un proceso clave en los ciclos
biogeoquímicos del azufre, del carbono y del hierro, oxidándose la materia orgánica de
forma anaerobia (Pallud & Van Cappellen, 2006). Los sustratos a partir de los cuáles las
bacterias sulfato reductoras obtienen energía directamente van desde el hidrógeno hasta
compuestos aromáticos, aunque la mayoría utiliza sustratos tales como acetato, lactato,
piruvato y etanol, que son compuestos comunes en los ecosistemas (Pallud & Van
Cappellen, 2006).
Las bacterias sulfato-reductoras que se conocen están divididas entre oxidadores
completos y en oxidadores incompletos. Las bacterias que se conocen como oxidadores
incompletos, tales como los Desulfovibrionales y la familia Desulfobulbeceae y
aquellas conocidas como oxidadores completos, principalemente representados por la
familia Desulfobacteraceae pueden vivir en ambientes extremos halófilos, esto indica
que existen SRB halofílicas tolerantes a las sales, las cuales posiblemente poseen
nuevas vías metabólicas, siendo capaces de degradar anaeróbicamente compuestos
complejos tales como la celulosa (Foti et al., 2007).
Las SRB también son importantes miembros de la comunidad microbiana
involucrada en la reducción de metales que ocurre en una variedad de ambientes
incluyendo plantas productoras de aceites y gas, aguas de desecho de origen doméstico,
industrial y de minas (Singleton, 1993).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
20
El sulfato es utilizado como un aceptor terminal de electrones, pero la mayoría de
las SRB también son capaces de crecer sobre una amplia variedad de otros aceptores de
electrones, tales como tiosulfato, sulfito, azufre elemental y nitrato (Bak et al., 1991).
Entre los dadores de electrones simples tenemos al etanol, lactato e hidrógeno hasta
compuestos más complejos como los hidrocarburos (Jorgensen, 1982; Rabus et al.,
1996; Krekeler et al., 1998; Krumholz et al., 1999; Steger et al., 2002; Kaksonen et al.,
2004). Se conocía la imposibilidad de las SRB de utilizar carbohidratos, sin embargo, se
han encontrado cepas de Desulfovibrio capaces de utilizar poliglucosa y nitrocelulosa
como fuente de carbono (Petrova et al., 2002). Además son capaces de oxidar acetato a
CO2 y reducir el sulfato a sulfuro (Krumholz et al., 1999) mediante el ciclo modificado
de ácidos tri-carboxílicos y vía acetil-CoA, siendo este ultimo el más empleado por las
SRB (Krumholz et al., 1999).
También se sabe que muchas cepas SRB pueden fijar N2 y usar el nitrógeno de los
aminoácidos como fuente de nitrógeno, algunas Desulfovibrio son capaces de utilizar
nitrato como aceptor final de electrones, otras reducen el nitrato a amonio (Lie et al.,
1999).
Adicionalmente las SRB pueden tolerar una variedad de metales pesados y sulfuro
disuelto, algunos de estos organismos son capaces de reducir Fe +3
a magnetita (Fe3O4)
o siderita (FeCO2) y U+4
a uranito (UO2), aunque no generen energía a partir de estos
procesos (Lovley et al., 1992; Chang et, al., 2001).
Los dadores de electrones utilizados por las SRB son principalmente compuestos
de bajo peso molecular y a la mayoría de estos son conocidos como productos
fermentativos de la degradación bacteriana de carbohidratos, proteínas y otros
compuestos de detritos. Unas pocas SRB son capaces de degradar complejos
moleculares como compuestos aromáticos (Widdel, 1988), siendo los dadores de
electrones más importantes el H2, acetato, lactato, butirato y propionato (Sorensen et al.,
1981; Postgate, 1984; Hao et al., 1996; Fukui et al, 1999).
Algunas de las reacciones más importantes que llevan a cabo las bacterias sulfato-
reductoras (Ruel et al. 2002) son:
C2H4O2 + SO42-
→ S2-
+ 2H2O + 2CO2
Ac. Acético
C3H6O2 + 3/4 SO42-
→ 3/4 S2-
+ C2H2O2 + H2O + CO2
Ac. Propiónico
C4H8O2 + 3/2 SO42-
→ 3/2 S2-
+ C2H2O2 + 2 H2O + 2 CO2
Ac. Butírico
Clasificación filogenética y taxonomía
Según los análisis de secuencias de RNAr permitió realizar la clasificación de
varias especies de SRB (Castro et al., 2000).
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
21
SRB gram-negativas mesofilicas.- Desulfobulbus, Desulfomicrobium,
Desulfomonas, Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfobacterium,
Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfosarcina.
SRB gram-positivas formadoras de esporas.- Desulfotomaculum
SRB termofilicas.- Thermodesulfobacterium
SRB arqueas termofilicas.- Archaeoglobus
Todos estos grupos se caracterizan por que utilizan el sulfato como aceptor de
electrones durante la respiración anaerobia con la consecuente producción de sulfuro de
hidrógeno H2S.
Daly et al., 2000, clasificó a las SRB más conocidas y representativas,
restringiéndose a géneros mesofílicos dentro de la subdivisión delta-proteobacteria y
gram (-/+), agrupándolos en seis grupos filogenéticos distintos:
Grupo 1. Desulfotomaculum (DFM).
Grupo 2. Desulfobulbus (DBB).
Grupo 3. Desulfobacterium (DBM).
Grupo 4. Desulfobacter (DSB).
Grupo 5. Desulfococcus, Desulfonema, Desulfosarcina (DCC).
Grupo 6. Desulfovibrio, Desulfomicrobium (DSV).
Grupo 1. Desulfotomaculum (DFM): son bacilos rectos o curvados, móviles por la
presencia de flagelos perítricos o polares, con pared celular, mesófilas, son las únicas
SRB gram-positivas de bajo contenido GC, no contienen desulfoviridina, además
forman esporas volviéndose de este modo resistentes a condiciones adversas
(desecación y oxidación del medio ambiente) y le permite subsistir en una gran variedad
de medios (Londry et al, 1997; Castro et al., 2000). Son capaces de utilizar hidrógeno
como fuente de energía, que les otorga un carácter quimiolitótrofo (Imachi et al., 2000).
Este genero tiene además la capacidad de realizar la dismutación de tiosulfato (Jackson
y Mclnermey, 2000).
Grupo 2. Desulfobulbus (DBB): ese grupo esta estrechamente relacionado con los
géneros Desulfocapsa, Desulforhopalus y Desulfofutis dentro de la familia
Desulfobacteriaceae. Este grupo presenta tres especies Desulfobulbus elongatus,
Desulfobulbus Marinus y Desulfobulbus propionicus, se caracteriza por ser células
ovoides, no forman esporas, no contiene desulfoviridina, presentan un flagelo polar
único, algunas especies presentan motilidad y otras no, tiene una posición dentro de la
subclase delta de las proteobacterias. A diferencia del grupo 1 de las Desulfotomaculum,
las Desulfobulbus es mesofilica de gram-negativo al igual que los demás grupos de
SRB (Balows et al., 1992), por lo que se desarrollan entre 20 a 40 ºC. Utilizan
propionato como donador de electrones oxidándolo de manera incompleta hasta acetato,
además son capaces de subsistir con lactato, etanol, H2, acetato, formato y bicarbonato
(Benoit et al., 2001; Ito et al., 2002), utilizando alguno de estos compuestos incluso en
ausencia de sulfato (Balows et al., 1992). También se ha visto que este grupo puede
utilizar nitrato (Ito et al., 2002) como aceptor final de electrones por lo que es capaz de
competir con las bacterias nitrificantes. Además, utilizan oxígeno adquiriendo un
carácter aerotolerante y probablemente facultativo (Ito et al., 2002), además el efecto
del oxigeno durante la formación de microcapas, produce etapas de latencia que
preceden una composición predominante de Desulfobulbus y Desulfovibrio, lo explica
su presencia en diversos ambientes debido a su adaptabilidad a la química de su entorno
Mariela Beatriz Reyes Sosa
22
(Santegoeds et al., 1999). Este grupo puede realizar la dismutación de azufre, sulfuro,
sulfito y tiosulfato (Finster et al., 1998), con azufre elemental como compuesto
intermediario. Por otra parte se ha reportado que Desulfobulbus propionicus realiza la
mutilación del mercurio en cultivos puros (Widdel y Bak 1991; Benoit et al., 2001).
Grupo 3. Desulfobacterium (DBM): este es un grupo nutricionalmente versátil,
con formas semejantes a bastoncillos de forma oval o casi esférica, presenta
capacidades especiales en cuanto a degradación de compuestos orgánicos, como la
descomposición de hidrocarburos. Las especies de este género son fundamentalmente
marinas y requieren elevadas concentraciones de cloruro de sodio. Al igual que
Desulfobacter, Desulfobacterium es potencialmente importante para la metilación del
mercurio y no tolera condiciones aerobias (Widdel y Bak, 1991; King et al., 2000).
Grupo 4. Desulfobacter (DSB): una de las características más sobresalientes de
este grupo es su capacidad de oxidar de manera completa y efectiva al acetato debido a
que poseen toda la maquinaria funcional para realizar el ciclo del ácido cítrico (Balows
et al., 1994). Además se ha visto la versatilidad de este grupo de utilizar gran variedad
de substratos. Son bacterias ovoides o semiesféricas parecidas a las Desulfovibrio,
normalmente motiles y se desplazan mediante un flagelo polar único, mesófilicas, no
producen esporas y no tienen desulfoviridina. Además se ha identificado al género
Desulfobacter com uno de los principales metiladores de mercurio en medios que
contienen lactato y acetato (Widdel y Bak 1991; King et al., 2000).
Grupo 5. Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina (DCC): los tres géneros de
este grupo son estructuralmente diferentes, Desulfococcus y Desulfosarcina se agrupa
en células coloides virtualmente inmóviles y Desulfonema es el único genero de SRB
multicelular filamentosa motil por deslizamiento. Sin embargo, el análisis mediante
16S de RNA relaciona a este grupo de manera estrecha con la familia
Desulfobacteriaceae en el orden Desulfobacterales que comparte con los géneros
Desulfobacterium, Desulfobacter, y de manera mas distante con Desulfobulbus.
Morfológicamente presentan formas de bastoncillos ovalados. La característica
metabólica de este grupo implica oxidación completa de substratos (Castro et al., 2000)
tales como formiato, acetato, acetona, propionato, butirato, isobutirato, valerato,
metilbutirato, caproato, malato, piruvato, succinato, fumarato, malato benzoato, etanol,
propanol, butanos, hidrógeno y CO2 (Fukui et al., 1999).
Algunas cepas han sido aisladas de medios contaminados por hidrocarburos.
Desulfococcus ha sido aislado de sedimentos de aguas dulces y también se desarrolla en
medios salinos; mientras que la desulfosarcina es primordialmente en medio marino.
Este grupo ha sido detectado en la quimioclina, entre ambientes aerobio y anaerobio,
por lo que podría tener la capacidad de tolerar el oxígeno (Widdel y Bak, 1991).
Desulfococcus es uno de los géneros más importantes en cuanto a la metilación del
mercurio, tercero después de Desulfomicrobium y Desulfobacter (Widdel y Bak, 1991;
King et al 2000).
Grupo 6. Desulfovibrio-Desulfomicrobium: la familia Desulfovibrionaceae
incluye a los géneros Desulfovibrio y Desulfomicrobium, aunque otros dos géneros
podrían ser incorporados dentro de la misma (Desulfohalobium y Desulfonatronum).
Morfológicamente son en general vidrioides, espiralados u ovoides, no forman esporas
contienen desulfoviridina, son motiles (Castro et al., 2000). Siendo la característica más
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
23
sobresaliente su capacidad de adaptarse a diversos hábitats gracias a sus intrincadas
estrategias metabólicas que les permite subsistir. Metabolitamente se diferencia de la
familia Desulfobacteriaceae por realizar la oxidación incompleta de los substratos con
la formación final de acetato durante la fermentación (Voordouw et al., 1995).
Una de sus características más importantes es su capacidad para tolerar oxígeno y
en algunos casos, incluso consumirlo (Zinkevich y Beech 2000; Loubinoux et al., 2002;
Fournier et al., 2006), son capaces de subsistir bajo estrés oxidante en presencia de
incluso 20 uM de O2 (la mayoría no sobrevive por encima de 0.24 a 0.48 uM) en el
torrente sanguíneo humano (Schoenborn et al. 2001).
El género se encuentra desde ambientes salinos, donde han sido más estudiados
hasta los sedimentos de agua dulce y son selectivamente aislados en medios que
contienen H2 y CO2, piruvato, malato, lactato y fumarato (Widdel y Bak 1991;
Voordouw 1995; Luca et al 2001; Steger et al., 2002; Foti et al., 2007). El género
Desulfomicrobium en cuanto a sus características fisiológicas y nutricionales es muy
similar a Desulfovibrio, tiene forma de bastoncillo y carece de desulfoviridina.
Según el manual Bergey’s la taxonomía de algunas sulfato reductoras queda de la
siguiente manera (Garrity et al., 2001):
Dominio: Bacteria
Phylum BXII: Proteobacteria
Clase VI: δ-proteobacteria
Orden II: Desulfovibrionales
Familia I: Desulfovibrionaceae
Género I: Desulfovibrior
Familia II: Desulfomicrobiaceae
Género I: Desulfomicrobium
Familia III: Desulfohalobiaceae
Género II: Desulfomonas
Orden III: Desulfobacterales
Familia I: Desulfobacteraceae
Género I: Desulfobacter
Género II: Desulfobacterium
Género III: Desulfobacula
Género V: Desulfococcus
Género VI: Desulfofaba
Género VII: Desulfofrigus
Género VIII: Desulfonema
Género IX: Desulfosarcina
Familia II: Desulfobulbaceae
Género I: Delsulfobulbus
Género II: Desulfocapsa
Género III: Desulfofustis
Género IV: Desulforhopalus
Orden IV: Desulfuromonadales
Familia I: Desulforomonadaceae
Género I: Desulfomonas
Mariela Beatriz Reyes Sosa
24
1.3.8 Organismos metanogénicos
La característica común de los organismos metanogénicos y de otros organismos
litotrófos, es el uso de hidrógeno como fuente de energía, y el dióxido de carbono como
aceptor de electrones. Este modo de generación de energía se ajusta a los definidos
como quimiolitótrofos.
Los organismos metanogénicos juegan un papel muy importante en el circuito
degradativo del ciclo del carbono. Estos utilizan como sustrato para generar metano, el
producto de degradación de las bacterias formadoras de ácidos. (Catalán, 1997).
El proceso que comprende la formación del metano a partir de acético y a partir
de hidrógeno se le llama metanogénesis. La metanogénesis es la única vía por las cuales
los organismos metanogénicos pueden obtener energía para su crecimiento y estos son
los únicos productores de metano como un producto catabólico final. Estas bacterias
solo pueden utilizar el acetato, H2, CO2, y/u otras fuentes de carbono como sustratos de
energía (Salazar 2008).
La clasificación taxonómica de las metanógenos se ha realizado mediante varios
métodos, entre los que se incluye el estudio de su morfología, motilidad, imágenes por
microscopia electrónica, morfología de la colonia, características nutricionales, tasa y
condiciones de crecimiento, productos metabólicos finales, tinción Gram,
susceptibilidad a lisis, análisis de lípidos, distribución de poliaminas, hibridación de
ácidos nucleicos, secuenciación del 16s rRNA entre otros estudios (Boone y Whitman,
1988). En 1977 (Woese, et al., 1997) clasificó a los metanogénicos como del domino
Archaea. Originalmente, sólo se clasificaron los metanógenos en este nuevo dominio, y
las arqueas eran consideradas extremófilos que sólo vivían en hábitats como aguas
termales y lagos salados. Se han definido 5 órdenes, 10 familias, 26 géneros y 74
especies validas (Boone et al., 1993; Salazar 2008).
Orden Methanobacteriales
Incluyen a dos familias, la familia Methanobacteriaceae y la familia
Metanothermaceae. La familia Methanobacteriaceae tiene cuatro géneros
morfológicamente distintos. Estos incluyen especies recuperadas de una variedad de
hábitats (agua dulces, rumen bovino, madera, intestino de termitas, etc.), las cuales son
capaces de utilizar sustratos como H2/CO2, 2-propanol, formato y metanol para producir
CH4. La familia Metanothermaceae consiste de un único género termófilo extremo
hidrógenotrofo.
Orden Methanococcales
Incluye a dos familias, Methanociccaceae y Methanocaldococcaceae, cada familia con
dos géneros, los cuatro géneros son hidrógenotrofos principalmente de ambientes
marinos y costeros. La mayoría de las especies son capaces de utilizar H2 y formato
como donadores de electrones.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
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Orden Methanomicrobiales
Comprende a tres familias y nueve géneros de matanogénicas hidrógenotrofas. La
familia Methanomicrobiaceae incluye a especies aisladas de varios ambientes. La
familia Methanocorpusculaceae incluye a tres géneros que utilizan H2/CO2 y formato
como sustrato. La famila Methanospirillaceae es una familia nueva con un único
género, sus miembros se han reportado en varios hábitats y son capaces de utilizar
diferentes donadores de electrones para la metanogénesis del CO2.
Orden Methanosarcinales
Boone (Boone et al., 1993) propuso reagrupar a todos las metanogénicas acetotroficas
y/o metilotroficas dentro de dos familias en este orden. La familia Methanosarcinaceae
que incluye a seis géneros de matanógenicas muy versátiles aisladas de varios hábitats y
que son capaces de utilizar H2/CO2, acetato o compuestos metil como sustratos. La
familia Methanosaetaceae incluye a un único género de metanógena acetotrofica
obligada.
Orden Methanopyrales
Es un nuevo arden de matanogenicas hipertermofilicas, las cuales no están relacionadas
con todas las otras metanogénicas conocidas. El orden incluye una única
Methanopyraceae y una especie Methanopyrus kandleri.
Se ha determinado la secuencia del DNA del genoma total Methanococcus jannaschii
(Bult et al., 1996) y Methanobacterium thermoautotrophicum (Smith et al., 1997).
Recientemente, la secuencia del DNA para archaeoglobul fulgidus también ha sido
publicado (Klenk et al 1997). Esta arquea sulfato-reductora filogenéticamente esta
estrechamente relacionada con el género Methanosarcinales, con quien comparte
muchas características bioquímicas en común.
Basándonos en el manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001), tenemos la siguiente
taxonomía de los organismos metanógenos:
Dominio: Archaea
Phylum AII: Euryarchaeota phy. nov.
Clase I: Methanobacteria class. nov.
Orden I: Methanobacteriales
Familia I: Methanobacteriaceae
Género I: Methanobacterium
Género II: Methanobrevibacter
Género III: Methanosphaera
Género IV: Methanothermobacter
Familia II: Methanothermaceae
Género I: Methanothermus
Clase II: Methanococci class. nov.
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Orden I: Methanococcales
Familia I: Methanococcaceae
Género I: Methanococcus
Género II: Methanothermococcus
Familia II: Methanocaldococcaceae
Género I: Methanocaldococcus
Género II: Methanotorris
Orden II: Methanomicrobiales
Familia I: Methanomicrobiaceae
Género I: Methanomicrobium
Género II: Methanoculleus
Género III: Methanofollis
Género IV: Methanogenium
Género V: Methanolacinia
Género VI: Methanoplanus
Familia II: Methanocorpusculaceae
Género I: Methanocorpusculum
Familia II: Methanospirillaceae
Género I: Methanospirillum
Orden III: Methanosarciales
Familia I: Methanosarcinaceae
Género I: Methanosarcina
Género II: Methanococcoides
Género III: Methanohalobium
Género IV: Methanohalophilus
Género V: Methanolobus
Género VI: Methanomicrococcus
Género VII: Methanosalsum
Familia I: Methanosaetaceae
Género I: Methanosaeta
Clase VII: Methanopyri class. nov.
Orden I: Methanopyrales
Familia I: Methanopyraceae
Género I: Methanopyrus
Las archaes metanogénicas fueron el primer grupo microbiano en tener su
taxonomía basada en la filogenia deducida por la secuencia de 16s rRNA (Balch et al.
1979; Raskin et al. 1994). La distribución limitada filogenética de las metanogénicas
sugirió que una base de datos de secuencia de rRNA podría ser la base para el diseño de
sondas que abarquen la mayoría de los miembros del grupo. Para esto se desarrolló y
caracterizó una colección de sondas metanogénicas (figura 3).
Entre las bacterias metanogénicas podemos distinguir 3 principales grupos nutricionales
(tabla 5):
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
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1. Archaeas metanogénicas hidrogenotrofas: Estas archaeas utilizan como sustrato
el hidrógeno más bióxido de carbono y algunas el formato.
2. Archaeas metanogénicas acetoclásticas: Estas archaeas utilizan el acetato como
sustrato y según las especies hidrógeno más bióxido de carbono y metilaminas.
3. Archaeas metanogénicas metilotrofas: estas utilizan como sustrato metanol,
metilaminas y metildisulfuros.
En las especies descritas hay 67% de hidrogenotrofas, 13% de acetoclásticas, 27%
de metilotrofas obligadas y el 3% son hidrógeno.metilotrofas y usan el hidrógeno para
reducir el metanol a metano. Algunas especies son alcoholotrofas y producen metano en
presencia de ciertos alcoholes como donadores de hidrógeno. El monóxido de carbono
puede también ser convertido en metano, pero no constituye un sustrato importante en
la metanogénesis.
Figura 3. Clasificación de las Sondas metanogénicas en relación con las bacterias
metanogénicas que detectan (Crocceti et al., 2006).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
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Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanogénicas (García, 1991)
1. Hidrogenotróficas
H2 + CO2 + formato según especies → CH4
Methanobacterium
Methanothermus
Methanococcus
Methanolacinia
Methanogenium
Methanospirillum
Methanoplasma
Methanobrevibacter
Methanopyrus
Methanomicrobium
Methanoculleus
Methanocorpusculum
Methanoplanus
2. Acetoclásticas
Acetato + según especies H2 + CO2 + Formato, Metanol y Metilaminas → CH4
Methanosarcina
Methanosaeta
Methanothix
3. Metilotroficas
Metanol + Metilaminas → CH4
Methanolobus
Methanohalophilus
Methanohalobium
Methanococcoides
Methanohalococcus
Methanobacterium
Methanogenium
Methanospirillum
Methanocorpusculum
4. Hidrogeno-metilotroficas
H2 + Metanol → CH4
Methanosphaera
5. Alcoholotróficas
CO2+ alcohol (2-propanol, 2-butanol, etanol)
Methanobacterium
Methanogenium
Methanospirillum
Methanocorpusculum
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
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1.4 Técnica molecular para la determinación de las poblaciones microbianas.
Hibridación molecular fluorescente in situ (FISH)
En la actualidad se hace uso de técnicas de biología molecular que permiten
estudiar la diversidad taxonómica y la estructura de comunidades microbianas, ya que
brindan la posibilidad de identificar poblaciones microbianas especificas en su hábitat
natural (sin necesidad de cultivarlas) generando resultados confiables y rápidos
(Cárdenas et al, 2006).
La hibridación molecular es una de las técnicas que permite la detección del
rRNA 16s empleando sondas marcadas con fluorocromos.
Las células de muchos microorganismos son muy ricas en RNA. En las bacterias
constituye el 20-25 % del peso seco. El RNA predominante es el ribosómico (rRNA)
que se presenta en varias especies moleculares (23s, 16s y 5s) que constituye el 80% del
RNA total (Parés Ramón/ Juárez Antonio). La presencia del 16S rRNA en grandes
cantidades en procariotas (Amman, R. I. et al., 1995), permitió desarrollar sondas
específicas para la secuencia 16S rRNA permitiendo el procesamiento de un gran
número de muestras requeridas para el estudio ecológico, al mismo tiempo que
posibilitó la detección directa de microorganismos concretos en las muestras (Salazar
2008).
La hibridación permitió mejorar las estimaciones de la abundancia microbiana,
mostrando una estratificación de los diferentes grupos filogenéticos de las comunidades
microbianas (Devereux et al., 1996; Ramsing et al., 1996).
La hibridación molecular fluorescente in situ (FISH) consiste en la detección de
una secuencia de nucleótidos dentro del genoma. Esta técnica utiliza fragmentos de
DNA (sondas) marcadas con fluorocromos, basandose en la hibridación específica de
dos secuencias de ácidos nucleicos complementarios entre la sonda marcada y la
bacteria diana, formando un hibrido DNA: RNA fácilmente detectable mediante un
microscopio de fluorescencia (Cárdenas et al 2006). La hibridación del 16S rRNA
genera valiosa información acerca de la caracterización y abundancia de comunidades
microbianas y en algunos casos acerca de la actividad bacteriana.
La fluorescencia se produce mediante el uso de los fluorocromos que son
sustancias que tienen la propiedad de absorber energía de una longitud de onda
específica y volverla a emitir con una determinada longitud de onda mayor (menor
energía). La cantidad de energía emitida y su longitud de onda depende del propio
fluorocromo. Los fluorocromos de última generación emiten señal fluorescente más
intensa y son más foto estables (Roncero, 2009).
En la figura 4, se muestra en que consiste generalmente la técnica de hibridación
FISH.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
30
Figura 4. Esquema de la Hibridación Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es
1.4.1 Fijación de la biomasa para la hibridación
La fijación debe realizarse inmediatamente después de coger la muestra
procedente de la planta de tratamiento de aguas residuales, para evitar las lesiones que
producirían cambios osmóticos y alteraciones estructurales y bioquímicos, fenómeno
conocido como autolisis.
La fijación de las células depende mucho de la estructura de su membrana celular,
la cantidad y la clase de proteínas de una membrana celular especifica depende del
ambiente en el que actúe la célula (Mc kee, et al., 2003).
Las Células gram positivas tienen paredes celulares de capa gruesa de
peptidoglucano, por el contrario de las células gram negativas que poseen una capa fina
de peptidoglucano (Mc kee,et al., 2003)(Figura 5). Para explicar la estructura de la
membrana celular en las bacterias y la diferencia entre gram positivas y gram negativas,
se describirán cuatro moléculas importantes: la mureína, el lipopolisacárido, los ácidos
teicoicos y los ácidos lipoteicoicos.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
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31
Figura 5. Diferencia estructural celular entre las gram positivas y las gram negativas (Saenz
1998-2008).
La mureína es un peptidoglicano que se encuentra en todas las bacterias, con
excepción de las arqueobacterias y los mollicutes (micoplasmas). Constituye la mayor
parte de la pared celular y es responsable de la forma de la célula y de su integridad
estructural, proporcionando rigidez a la misma. La mureína esta compuesta de restos de
N-acetilglucosamina (NAG) y de ácido N-acetil murámico (NAM) (Figura 6), unidos
alternativamente por enlaces β-1,4-glucosídicos. Hay un tetrapéptido unido al NAM que
puede unirse a su vez con el tetrapéptido de una cadena adyacente (Parés, et el., 1997).
La estructura del liposacárido (LPS) varía de una bacteria a otra, e incluso entre
diferentes cepas, pero se presenta en todas las bacterias gram negativas. El lípido A es
un disacárido de glucosamina fosforilado y esterificado con distintos ácidos
(docecanoico, tetradecanoico, hexadecanoico y 3-hidroxitetradecanoico). El núcleo es
un oligosacárido que comúnmente incluye L- glicero-d-manoheptosa y ácido ceto-
desoxi-octanoico. El lípido A y el núcleo corresponden al LPS de las distintas
enterobacteriáceas (Parés, et al., 1997).
Las gram positivas no tienen LPS, pero pueden presentar ácidos teicoicos
asociados a la mureína. Se trata de polímeros del glicerol o del ribitol unidos por
Mariela Beatriz Reyes Sosa
32
enlaces fosfodiéster y con uno o más aminoácidos como sustituyentes (Parés, et al.,
1997).
Tambien en las gram positivas se encuentran moléculas más complejas llamadas
ácidos lipoteicoicos (LTA) y los lipoglucanos, los cuales tienen carácter macroanfifílico
y están anclados en la membrana protoplamatica por interacción hidrofóbica con el resto
acil-grasos (Parés, et al., 1997).
Por las diferencias en las estructuras celulares de las bacterias, a la hora de fijar
las bacterias gram negativas se puede hacer con paraformaldehído, con un período de
tiempo menor que el necesario para fijar las bacterias gram positivas.
Las bacterias gram positivas no solo necesitan de mayor tiempo para fijar, si no al
ser hidrofóbicas es necesario fijarlas con etanol como se describe en el capitulo de
materiales y métodos.
Figura 6. Representación esquemática de los peptidosglicanos (Saenz 1998-2008).
1.5 Sondas
Las sondas o cadenas de oligonucleótidos son segmentos cortos de DNA de
cadena simple que contienen de 18 a 24 nucleótidos. Estas sondas solo hibridan con sus
secuencias complementarias en condiciones estrictas de hibridación (Hernández, 2005).
Mediante el análisis de las secuencias parciales del 16s rRNA, es posible
encontrar patrones de secuencias específicos para grupos y especies de bacterias
concretas. Para la identificación de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado
pequeñas sondas específicas. La hibridación con sondas específicas permite la
identificación rápida y directa de un gran número de microorganismos usando un
extremo de acido nucleico como diana. El uso combinado de sondas universales y
específicas permite estimar la fracción de determinados microorganismos dentro de un
conjunto (Hernández, 2005).
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
33
2 Objetivos
El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal identificar y cuantificar
las poblaciones microbianas presentes en los procesos biológicos (Fangos activados y
Digestión anaerobia) de la EDAR del CARRAIXET.
Los objetivos específicos que se pretenden alcanzar son:
1. Adaptación de la técnica molecular FISH a las muestras procedentes de la
Digestión anaerobia.
2. Identificación de las poblaciones microbianas en ambos procesos: fangos
activados y digestión anaerobia.
3. Cuantificación de los grupos de microorganismos en cada proceso estudiado.
4. Comparación de la población microbiana general entre ambos procesos.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
34
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
35
3 Materiales y Métodos
3.1 Procedencia de la muestra
Las muestras provienen de las instalaciones de la planta de tratamiento de aguas
residuales urbanas de la Cuenca del Carraixet, ubicada en la Comunidad Valenciana con
una capacidad de 100 000 habitantes-equivalentes.
El caudal de funcionamiento de la planta de tratamiento es de 38.551 m3/dia, el
rendimiento del tratamiento es del 98% de eliminación de los sólidos suspendidos, del
97% del DBO5 y el 94% de DQO.
El tratamiento biológico que se realiza es de fangos activados, en la línea de
fangos esta constituida por un espesador de gravedad y otro por flotación, que alimentan
la entrada del fango al tanque de digestión anaerobia (figura 7).
Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet.
3.2 Toma de muestra
La toma de muestra se realizó en el reactor aerobio y en el digestor anaerobio. La
muestra de ambos procesos es del mismo día.
Después de tomar la muestra, esta fue transportada para su posterior tratamiento
(fijación de las células y aplicación de la técnica de hibridación fluorescente in situ
FISH), a las instalaciones del laboratorio de química de la Universidad de Valencia.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
36
3.3 Hibridación Fluorescente in situ, FISH
Para hacer uso de la hibridación fluorescente in situ FISH con sondas marcadas
con fluorocromos se debe preparar la muestra. Esto implica la fijación y
permeabilización de la pared celular para inactivar las células microbianas y la actividad
enzimática. La permeabilización de la células tiene como objetivo ayudar a la
penetración de la sonda (Nielsen et al., 2009).
Una vez fijada las células se aplica la técnica de hibridación FISH, lo que permite
realizar un análisis cualitativo de la población microbiana presente en la muestra
tratada. La hibridación se realiza mediante diferentes sondas (fragmentos de DNA), el
uso de cada sonda depende de cada grupo de bacterias y permite identificar las bacterias
presentes en la muestra.
3.4 Procedimiento
La fijación celular se realiza de la siguiente manera:
Para las bacterias Gram negativas se realiza la fijación con Paraformaldehído
(PFA al 4%).
- Añadir 3 volúmenes de PFA (750 µl) a 1 volumen de muestra (250 µl) y
mantener a 4 ºC durante 1-3 horas
- Someter las células a centrifugación (5000 x g durante 3 minutos) y eliminar
el paraformaldehído
- Lavar las células PBS 1X (fosfato búfer salino), centrifugar (5000 x g
durante 3 minutos) y eliminar el sobrenadante
- Repetir el paso anterior si es necesario
- Resuspender las células en PBS 1X (añadir 500 µl) para tener una
concentración de 108-10
9 células/ml en la muestra fijada y añadir 1 volumen
(500 µl) de etanol absoluto frío (4ºC)
- Guardar a -20ºC
Para las bacterias Gram positivas se realiza la fijación con etanol absoluto frío.
- Añadir 1 volumen de etanol absoluto (500 µl) a 1 volumen de muestra ( 250
µl muestra + 250 µl de PBS, para mantener la misma concentración de
células que las gram negativas) y mantener a 4 ºC durante 4-16 horas
- Centrifugar ( 5000 xg durante 3 minutos) y eliminar el fijador
- Lavar las células con PBS 1X (500 µl) dos veces
- Resuspender en PBS 1X (añadir 500 µl), para tener una concentración de
108-10
9 células/ml en la muestra fijada y añadir 1 volumen (500 µl) de etanol
absoluto frío (4ºC)
- Guardar a -20ºC
Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
37
El tratamiento de los portaobjetos tiene como objetivo el poder mantener sobre el
mismo la mayor cantidad de células posibles y por más tiempo, evitando la perdida de
las células por los lavados posteriores a la visualización en el microscopio.
El tratamiento se lleva a cabo de la siguiente manera:
- Lavar con agua y detergente neutro
- Enjuagar con agua destilada
- Secar en estufa a 46 ºC (es importante secar completamente)
- Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0.1% con sulfato
potásico cromato 0.01% (preparada en el momento, T= 60 ºC)
- Secar al aire (proteger del polvo ambiental)
Hibridación in situ FISH
1. Aplicación de la muestra en los portaobjetos cubiertos de teflón
- Poner un volumen de 5 µl de muestra fijada en cada pocillo del portaobjetos
- Secar al aire
- Deshidratar en etanol al 50% durante 3 minutos por inmersión
- Deshidratar en etanol al 80% durante 3 minutos por inmersión
- Deshidratar en etanol al 98% durante 3 minutos por inmersión
- Después del deshidratado se deja secar y los portaobjetos pueden ser
conservados indefinidamente a -20ºC
2. Hibridación “in situ”
Las reacciones de hibridación se hacen a concentraciones altas de sal y en
presencia de agentes desnaturalizantes (formamida). La sal y el porcentaje de
formamida hacen que la hibridación sea estable.
Para ello se prepara la solución de hibridación:
a). Preparar solución de hibridación (tubo eppendorf 2 ml)
- Añadir 360 µl de NaCl 5M
- Añadir 40 µl TrisHCl 1M
- Añadir formamida según tabla 6
- Añadir agua MilliQ según tabla 6
- Añadir 2 µl de SDS al 10%
- Mezclar cuidadosamente
Mariela Beatriz Reyes Sosa
38
Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparación de la solución de hibridación
Cantidad de
formamida (µl)
% formamida para
la sonda
Cantidad de agua
MilliQ (µl)
0 0 1598
100 5 1498
200 10 1398
300 15 1298
400 20 1198
500 25 1098
600 30 998
700 35 898
800 40 798
900 45 698
1000 50 598
1100 55 498
1200 60 398
Una vez preparada la solución de hibridación se procede del siguiente modo:
- Poner 8 µl de la solución de hibridación en cada pocillo del portaobjeto que
lleve muestra
- Poner 1 µl de la sonda a utilizar y repartir homogéneamente por todo el
pocillo
- Introducir el portaobjetos con la solución de hibridación y las sondas a la
camara de hibridación (tubo tipo falcon de 50 ml previamente preparado con
papel de celulosa dentro). Una vez dentro el portaobjetos a hibridar el tubo se
debe mantener siempre en posición horizontal
- Incubar a 46ºC durante 1-2 horas
Con el fin de eliminar los restos de sondas no hibridadas y la formamida de los
portaobjetos se prepara una solución de lavado.
b). Preparación de solución de lavado
- En un tubo tipo falcon de 50 ml añadir según tabla 7, las cantidades
indicadas de NaCl 5M dependiendo del porcentaje de formamida utilizada en
la solución de hibridación.
- Añadir 1 ml de TrisHCl
- Añadir EDTA si según tabla 7 se requiere
- Aproximar a 50 ml con aguan MilliQ
- Añadir 50 µl de SDS 10%
- Mezclar cuidadosamente
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
39
Tabla 7. Cantidades de NaCl para la solución de lavado
%
formamida de la
sonda
NaCl (M) NaCl 5M
(µl)
EDTA 0.5
M (µl)
0 0.900 9000 ---
5 0.636 6300 ---
10 0.450 4500 ---
15 0.318 3180 ---
20 0.225 2150 500
25 0.159 1490 500
30 0.112 1020 500
35 0.080 700 500
40 0.056 460 500
45 0.040 300 500
50 0.028 180 500
55 0.020 99 500
60 0.014 41 500
Terminado el tiempo de incubación del portaobjetos donde están las células a
hibridar se procede a:
- Sacar de la incubadora el portaobjetos. Con la ayuda de un cuentagotas y la
solución de lavado previamente preparada eliminar la formamida que aun
este en los pocillos, para eliminar las sondas no hibridadas introducir el
portaobjetos dentro del tubo con la solución de lavado y mantenerlo en un
baño de agua a 48 ºC durante 10- 15 min, protegido de la luz.
- Una vez concluido el tiempo de lavado, se saca el portaobjetos de la solución
de lavado y se sumerge en un vaso con agua MilliQ fria durante 1 segundo
- Secar el portaobjetos a temperatura ambiente protegiéndolo de la luz
- Si no se observa inmediatamente en el microscopio, guardar a -20ºC
3.5 Sondas
Las sondas utilizadas en este trabajo, se han adquirido ya marcadas, a través de
Thermo Scientific.
En la tabla 5, se muestran las sondas generales usadas en este trabajo así como su
referencia de uso.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
40
Tabla 8. Sondas Generales
Sonda Secuencia Organismo Referencia
EUB 338
GCTGCCTCCCGTAGGAGT Muchas bacterias Amman, et al., 1990
EUB 338II
GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetales Daims, et al., 1999
EUB 338III
GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrucomicrobiales Daims, et al., 1999
ARCH915 GTGCTCCCCCGCCAATTCCT Archaeas Stahl y Amman 1991
Para el uso de las sondas EUB 338, EUB 338II y la EUB 338III, se realizó una
mezcla de ellas, la sonda EUB MIX, la mezcla tiene como fin cubrir el mayor número
de bacterias posibles en la muestra. Las hibridaciones para la población general del
flóculos se utilizó EUM MIX + ARCH915.
En la tabla 9, 10, 11, 12, 13 y 14 se describen las sondas específicas de cada grupo
de bacterias estudiadas en el presente trabajo.
Tabla 9. Sondas específicas para grupo Nitrificantes
SONDA
SECUENCIA
BACTERIA
%FA
REFERENCIA
NSO 1225
LNA
TACGGATTTCAC TCCT Betaproteobacterial
ammonia.oxidizing
bacteria
45
Alonso, et al.,
2009
Ntspa712
CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC Muchos miembros
de Nitrospirae
50
Daims et al., 2001
Ntspa712
compet
CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC
NIT3
CCTGTGCTCCATGCTCCG Nitrobacter spp.
40
Wagner et al.,
1996
NIT3
compet
CCTGTGCTCCATGCTCCG
Las sondas de la tabla 9 se usan con un alto porcentaje de formamida, lo cual son
muy restrictivas en el momento de la hibridación. Mientras mas restrictivas son las
hibridaciones es más confiable el resultado hibridado.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
41
Tabla 10. Sondas específicas para el grupo PAO y GAO
SONDA
SECUENCIA
BACTERIA
%FA
REFERENCIA
PAO462
CCGTCATCTACWCAGGGTATTAAC Candidatus
Accumulibacter
phosphstis
35
Crocetti et al.,
2000
PAO651
CCCTCT GCCAAACTCCAG Candidatus
Accumulibacter
cluster
35 Crocetti et al.,
2000
PAO846
GTTAGCTACGGCACTAAA AGG Candidatus
Accumulibacter
phosphstis
35 Crocetti et al.,
2000
GAOQ431
TCCCCGCCT AAAGGGCTT Candidatus
"Competibacter
phosphatis"
35
Crocetti et al.,
2000
GAOQ989
TTCCCCGGATGTCAAGGC Candidatus
"Competibacter
phosphatis"
35 Crocetti et al.,
2002
GB
CGATCCTCTAGCCCACT grupo
gammaproteoba
cterial
35 Kong et al.,
2002
TFO_DF218
GAAGCCTTTGCCCCTCAG Defluviicoccus
cluster 1
25-
35
Wong et al.,
2004
TFO_DF618
GCCTCACTTGTCTAACCG Defluviicoccus
cluster 1
25-
35
Wong et al.,
2004
DF 988
GATACGACGCCCATGTCAAGGG Defluvicoccus
vanus cluster 2
35
Meyer et al.,
2004
DF 1020
CCGGCCGAACCGACTCCC Defluvicoccus
vanus- cluster 2
35 Meyer et al.,
2004
H966 (DF
988 compet)
CTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGC
35
H1038 (DF
988 compet
2)
AGCAGCCATGCAGCACCTGTGTGG
CGT
35
Las sondas de la tabla 10, tienen un porcentaje de trabajo muy similar, con lo que
para facilitar su uso, se mezclan en grupos:
La sonda PAOMIX, es una mezcla de las sondas:
1. PAO462
2. PAO651
3. PAO846
Mariela Beatriz Reyes Sosa
42
La sonda GAOMIX es una mezcla de las sondas:
1. GAOQ431
2. GAOQ989
3. GB
Las sondas DEFMIX 1 es una mezcla de las sondas:
1. TFO_DF218
2. TFO_DF618
La sonda DEFMIX 2 es una mezcla de las sondas:
1. DF988
2. DF1020
Tabla 11. Sondas específicas para el grupo de las bacterias desnitrificantes
SONDA
SECUENCIA BACTERIA %FA REFERENCIA
AT1458
GAATCTCACCGTGGTAAGCGC Azoarcus-Thauera-
Castellaniella
50
Rabus et al.,
1999
PAR651
ACCTCTCTCGAACTCCAG Paracoccus
40
Neef et al., 1996
TBD1419
ACTTCTGCCAGATTCCAC Thiobacillus
denitrificans
50
Fernández et al.,
2008
En la tabla 11 podemos observar que las tres sondas para la detección de las
desnitrificantes de interes tienen un alto porcentaje de trabajo, esto nos da mayor
confianza de hibridación.
Tabla 12. Sondas específicas para el grupo de las bacterias metanotroficas
SONDA
SECUENCIA
BACTERIA
%FA
REFERENCIA
Ma464
TTATCCAGGTACCGTCATTA
Tipo II methanotrophs.
Methylocystaceae
20
Eller et al., 2001
Mg84
CCACTCGTCAGCGCCCGA
Tipo I methanotrophs.
Methylococcaceae
20
Eller et al., 2001
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
43
Tabla 13. Sondas específicas para las SRB
SONDA
SECUENCIA
BACTERIA
%FA
REFERENCIA
DSV687
TACGGATTTCACTCC T
Desulfovibrio spp.,
Desulfomonas,
Desulfuromonas,
Desulfomicrobium
15 Devereux et al.
1992
Dsb804 CAACGTTTACTGCGTGGA
Some
Desulfobacteraceae
(Desulfobacter,
Desulfosarcina,
Desulfocccus)
10 Devereux et al.
1992
DNMA657
TTCCGCTTCCCTCTCCCATA
some Desulfonema 30 Fukui et al. 1999
DBB660
GAATTCCACTTTCCCCTCTG
some Desulfobulbus 60 Devereux et al.
1992
Dtm230 TAATGGGACGCGGACCCA
Many Desulfotomaculum
cluster I and other
Firmicutes (G+)
10 Hristova et al.
2000
SRB385 CGGCGTCGCTGCGTCAGG
Most Desulfovibrionales
and other Bacteria
35 Amann et al.
1990
SRB385Db CGGCGTTGCTGCGTCAGG
Desulfobacteracea
(Desulfobacterales,
Desulfuromonales,
Syntrophobacterales,
Myxococcales, and other
Bacteria)
30 Rabus et al. 1996
En la detección del grupo de las SRB, la bibliografia describen como sondas
generales para este grupo en particular, las sondas SRB385 y SRB385Db, estas sondas
se han usado junto con otras sondas para la detección de familias o especies de las SRB.
Para las hibridaciones de las Arqueas Metanogénicas se usarón sondas por
ordenes de estas arqueas. En general estas sondas tienen porcentajes altos de formamida
para la hibridación.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
44
Tabla 14. Sondas específicas para las arqueas metanogénicas
SONDA
SECUENCIA
BACTERIA
%FA
REFERENCIA
MSMX860
GGCTCGCTTCACGGCTTCCCT
Methanosarcinales
45
Devereux et al.,
1992.
MG1200b
CRGATAATTCGGGGCATGCTG
Methanomicrobiales
20
Devereux et al.,
1992
MB311
ACCTTGTCTCAGGTTCCATCTCC
Methanobacteriales
30
Devereux et al.,
1992
MC504
GGCTGCTGGCACCGGACTTGCCCA
Methanocaldococcaceae
55
Devereux et al.,
1992
MC504
Compet
GGCTGCTGGCACCGGACTTGCCCA
MC1109
GCAACATAGGGCACGGGTCT
Methanococcales
45
Fukui et al.,
1999
3.6 Cuantificación de los Microorganismos
Para la cuantificación de las células después de la aplicación de la técnica FISH,
se lleva a cabo la observación en el microscopio y toma de imágenes.
La observación se realiza en un microscopio de fluorescencia modelo Leica
DM2500, con cámara digital integrada (Leica 420 C), cuyos filtros usados son N2.1 y I3
La toma de imágenes se realiza a 20 campos distintos y representativos de la
muestra hibridada.
Se realiza un análisis de las imágenes, para esto se hace uso de un programa
(MATLAB 7.1), el programa descompone la imagén capturada en escala de grises,
donde los valores irán de 0 (Negro) a 255 (blanco). El cambio de las imágenes de color
a escala de grises facilita el conteo de pixeles (figura 8).
Las imágenes capturadas son introducidas en el software de cuantificación
desarrollado para este fin en la tesis doctoral de Borrás, 2008. El software realiza un
informe donde se da los porcentajes de las áreas ocupadas por las bacterias hibridadas
acompañado del error de la medida. Este último se calcula como n
, donde:
σ: desviación estándar
n: número de campos
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
45
4 Adaptación de la técnica FISH para muestras de un
digestor anaerobio
Las muestras provenientes de la digestión anaerobia presentan diversos obstáculos
asociados con el método FISH, los principales son: la permeabilidad de la célula,
insuficiencia en el contenido de los ribosomas, inaccesibilidad al ribosoma por la sonda
y muestras que emiten auto fluorescencia (suciedad en la muestra).
En las muestras procedentes de la digestión anaerobia, la aplicación del protocolo
estándar FISH para la visualización de las bacterias, da señales de hibridación muy
débiles (figura 8). Esto se debe a varios de los obstáculos que ya se han mencionado.
4.1 Recomendación a problemas asociados con la detección de la fluorescencia
La inaccesibilidad de las sondas al ribosoma puede causar señales con ausencia o
baja fluorescencia. Esto puede remediarse mediante la aplicación de sondas helpers
(sondas de ayuda). Las sondas helpers se diseñan para hibridar sin marcar sobre
secuencias de rRNA junto a la sonda FISH en su lugar de destino. Las sondas de ayuda
abren las estructuras secundarias y terciarias de la base de los nucleótidos para que con
ello se aumente la accesibilidad de la sonda FISH (Nielsen et al., 2009).
Otra solución para hibridar sobre los sitios de difícil acceso ha sido alargar el
tiempo de hibridación (hasta 72 horas), lo cual mejora la difusión de la sonda en la
célula y disminuye las barreras cinéticas de la accesibilidad del lugar de destino. De esta
forma se consigue una mejor eficiencia de hibridación y, en general, las señales de
fluorescencia aumentan de intensidad (Nielsen et al., 2009).
La señal de hibridización también puede incrementarse debido a la unión no
específica de las sondas a los contaminantes unidos sobre la membrana celular, como
pudieran ser sustancias húmicas y trozos de DNA unidos a la membrana celular. Esto
inmoviliza al rRNA y puede producir un incremento de la hibridización (falsos
positivos) debido a la unión no específica de la sonda. También es posible, sin
embargo, que las sutancias húmicas o los trozos de DNA interfieran con la hibridización
de la sonda al rRNA. De esta manera la señal de hibridización disminuye (Salazar
2008).
Para no perder la intensidad de fluorescencia se debe evitar la exposición
demasiado larga a fuentes de luz fuertes, almacenar siempre los portaobjetos FISH en
la oscuridad, retirar con cuidado todas las trazas de etanol de muestras almacenadas, ya
que el etanol puede hacer desaparecer la señal de fluorescencia. Por último, se debe
evitar los tiempos de fijación demasiado largos (sobre todo para la fijación mediante
PFA), ya que los tiempos excesivos pueden reducir la permeabilidad de la célula por la
sonda (Nielsen et al., 2009).
Basándonos en las recomendaciones antes descritas y los problemas presentes en
las muestras, se modificaron los tiempos requeridos para la fijación e hibridación en el
protocolo FISH para poder aumentar las señales de hibridación (figura 9).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
46
En este capitulo se pretende optimizar los tiempos de fijación y de hibridación en
las muestras procedentes del Digestor Anaerobio de la planta de tratamiento de aguas
residuales Carraixet, para establecer los tiempos requeridos en las hibridaciones
posteriores. Para llevar a cabo el establecimiento de los tiempos se ha realizado una
cuantificación de la señal detectada en cada tiempo evaluado.
Figura 8. Hibridación Fluorescente FISH sin modificación de tiempos. A) Hibridación con
sonda específica SRB385 en el canal rojo. B) hibridación con sonda general de bacterias EUBMIX
en el canal verde. Imágenes capturadas a 630x.
La figura 8 esta compuesta de dos imágenes. En la primera imagen (A), podemos
observar la poca intensidad fluorescente al aplicar la sonda para bacterias sulfato-
reductoras (SRB385), lo que dificulta enormemente la cuantificación de los
microorganismos. En la imagen B, podemos ver que el problema de baja fluorescencia
en la hibridación es también notoria para la sonda general de bacterias (EUBMIX);
también se observan señales rojas que corresponden a la sonda específica y que se
deben a falsos positivos presentes en la muestra.
4.2 Determinación de los tiempos de fijación y de hibridación óptimos
Mediante la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) y utilizando sondas
marcadas con fluorocromos (FAM y TAMRA) que emiten fluorescencia bajo
condiciones apropiadas de excitación, se hace posible la visualización de los
microorganismos con secuencias de oligonucleotidos determinados, dependiendo de las
sondas utilizadas (análisis cualitativo). Para ello se ha utilizado un microscopio de
fluorescencia (Leica DM 2500) con cámara integrada (Leica DFC 420 C), y las sondas
SRB385 (bacterias sulfato reductoras, SRB) y EUBMIX (dominio eubacteria).
Para determinar los tiempos requeridos en la ténica FISH (el de fijación y el de
hibridación), se ha realizado en este trabajo evaluaciones y análisis de una misma
muestra (Digestor anaerobio Carraixet) a diferentes tiempos. En la fijación se evaluaron
los tiempos de 30, 45, 60, 90, 120 y 180 min. De las muestras resultantes de las
fijaciones se evaluaron los tiempos de hibridación 60, 90 y 120 min a cada una.
En la figura 9, se muestra el esquema de los análisis realizados para las muestras
del digestor anaerobio.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
47
Figura 9. Esquema de trabajo para la adaptación de la técnica FISH a muestras del Digestor
anaerobio.
4.3 Cuantificación de la señal de hibridación
Para el propósito de la cuantificación de la señal emitida por la florescencia de los
microorganismos se realizó la evaluación de la intensidad captada mediante el software
MATLAB 7.1 y el algoritmo de cuantificación, realizando fotos a 20 campos distintos y
en los dos canales, verde y rojo (cada canal con el filtro correspondiente para cada
fluorocromo). Un canal es para las sondas de interés marcadas con el fluorocromo
TAMRA (rodamina) con una longitud de onda de absorción de 555 nm y de emisión
580 nm (de color rojo), y el otro canal para la sonda general marcada con el
fluorocromo FAM (fluoresceína) con una longitud de onda de 494 nm y de emisión de
518 nm (de color verde). Las imágenes se tomaron de campos representativos de la
hibridación (con presencia bacterias).
Las imágenes se introducen en un software de cuantificación (Borrás 2008) y el
programa realiza un promedio de la intensidad detectada en el canal de la sonda de
interés con respecto al canal de la sonda general.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
48
4.4 Análisis Cuantitativo
El programa genera una hoja de cálculo, donde se pueden ver el informe detallado
de los resultados de la cuantificación (áreas ocupadas por las bacterias presentes en la
muestra hibridada) para cada campo y para el total de las imágenes, así como también
un gráfico de los porcentajes hibridados (figura 10).
El resultado final es un número que representa el porcentaje en área de una
especie bacteriana en la muestra, acompañado del error de cuantificación (Borrás,
2008).
Figura 10. Hoja de calculó que genera el programa de cuantificación.
En la tabla 9, se muestran los resultados obtenidos de la cuantificación realizada
con la ayuda del software de cuantificación (Borrás 2008). Para los tiempos de fijación
y de hibridación evaluados, en la tabla se muestra la media aritmética y la incertidumbre
de las áreas detectadas para las SRB (bacterias sulfato reductoras detectadas con la
sonda SRB385, orden desulfovibrionales), con respecto al total de bacterias detectadas
con la sonda EUBMIX (general para las bacterias que comprende EUB338; EUB338II y
EUB338III, dominio eubacteria).
Con los resultados obtenidos y reportados en la tabla 15, podemos observar que
entre los tiempos de fijación hay un incremento de los promedios de las áreas (pixeles)
conforme aumentamos el tiempo de fijación. Este incremento llega hasta los 90 min,
luego hay un decremento hasta los 180 min. Esta tendencia de la señal detectada se
presenta para los tres tiempos de hibridación evaluados.
En cuanto a los tiempos de hibridación evaluados, hay un incremento de la señal
detectada (expresada como promedio de las áreas) entre el tiempo de 60 min y el de 90
min, sin embargo entre los tiempos de 90 min y el de 120 min la señal detectada
decrece.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
49
Tabla 15. Promedio de las áreas (pixeles) ocupadas por las bacterias y error en la cuantificación
de la señal detectada en la muestra del digestor anaerobio para las bacterias SRB
Tiempo hibridación
Tiempo fijación
60 min 90 min 120 min
30 min 8 +/- 2 6 +/- 1 8 +/- 2
45 min 8 +/- 3 9 +/- 2 7 +/- 2
60 min 11 +/- 3 12 +/- 2 6 +/- 1
90 min 9 +/- 3 14 +/- 2 9 +/- 3
120 min 8 +/- 2 12 +/- 2 8 +/- 2
180 min 10 +/-2 9 +/- 2 10 +/- 4
En el tiempo de hibridación de 90 min se registran las incertidumbres más
estables y las mayores señales detectadas (figura 11).
Entre los tiempos de fijación, el de 90 min reporta mayor señal detectada.
Por tanto se ha decidido trabajar con tiempos de hibridación de 90 min y de
fijación de 90 min ya que estos tiempos se obtiene la señal más alta.
Figura 11. Hibridación Fluorescente FISH con modificación de tiempos de fijación y de
hibridación. A) Hibridación con sonda específica SRB385.Vista en el canal rojo. B) Hibridación con
sonda general de bacterias EUBMIX. Vista en el canal verde. 630x.
La figura 11 esta compuesta de dos imágenes: la imagen A correspondiente a la sonda
específica y de interés (SRB385), y la imagen B correspondiente a la hibridación con la
sonda general. Si comparamos las dos imágenes de la figura 11 con las de la figura 8 se
observa un notable incremento de la intensidad de fluorescencia.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
50
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
51
5 Detección y cuantificación de los distintos grupos
bacterianos presentes en los procesos de Fangos
activados y Digestión anaerobia
En este capitulo se describen para cada grupo bacteriano, los resultados obtenidos
en las hibridaciones asi como en el análisis de cuantificación realizado.
La detección de cada uno de los distintos grupos de bacterias se realizó tanto en
las muestras del Fango activado como en las de la Digestión anaerobia.
Los resultados de las cuantificaciones se expresan como porcentajes de
abundancia del grupo funcional de interes.
5.1 Detección y cuantificación de las bacterias nitrificantes
Para las hibridaciones correspondientes a la detección de las bacterias
nitrificantes, tanto amonio-oxidantes como nitrito-oxidantes, se usaron las sondas
específicas que se mencionan en la tabla 9 descrita en el apartado de materiales y
métodos.
La sonda NSO1225 LNA, detecta bacterias amonio-oxidantes, mientras las sondas
Ntspa712 y NIT3 detectan las bacterias nitrito-oxidantes. Las tres tienen un porcentaje
alto de formamida por lo que son muy restrictivas en la hibridación, lo que las hace muy
fiables.
En las muestras procedentes del Digestor anaerobio las tres sondas usadas dan
resultados negativos. Las bacterias que llevan a cabo la nitrificación tienen una tasa de
crecimiento lento, y estas solo crecen cuando las condiciones son las adecuadas para
ellas (temperatura, pH, edad del fango, oxígeno disuelto, etc.). La nitrificación se da en
la mayoría de los tratamientos aerobios cuando las condiciones ambientales y las de
funcionamiento son las adecuadas (Ferrer, 2007).
Para las muestras del reactor biológico de fangos activados, fueron positivos los
resultados de las hibridaciones con la sonda NSO1225LNA y Ntspa712.
En la detección de estas bacterias se observó que las amonio-oxidantes se agrupan
en flóculos definidos y gruesos (figura 12), mientras que las nitrito-oxidantes se agrupan
en flóculos pequeños (figura 13).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
52
Figura 12. Bacterias amonio-oxidantes en el Reactor aerobio. Las señales en verde
corresponden a diversas bacterias mientras que las señales en rojo corresponden a las AOB.
Imagen a 630x.
Figura 13. Bacterias nitrito-oxidantes en el Reactor aerobio. Las señales en verde
corresponden a las diversas bacterias presentes en la muestra, mientras que las señales en rojo
corresponden a las NOB. Imagen a 630x.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
53
Comparando las figuras 12 y 13 podemos ver que hay más abundancia de las
Amonio-oxidantes que de las nitrito-oxidantes. Sin embargo ambas forman el grupo de
las bacterias nitrificantes, que es el grupo de interés.
Las bacterias nitrificantes en el reactor aerobio estan presentes en un 9% (+/- 1%).
Este grupo de bacterias se disponen en el flóculos de manera aglomeradas entre ellas,
dentro del mismo floculo.
5.2 Detección y cuantificación de las bacterias acumuladoras de poli-fosfatos
(PAOs) y acumuladoras de glúcogeno (GAOs)
Las sondas específicas usadas para este análisis se muestran en la tabla 10, como
ya se ha mencionado antes y para facilitar las hibriaciones se han usado mezclas de las
sondas, tanto para las PAO como para las GAO. Las hibridaciones se realizaron tanto en
las muestras del Digestor anaerobio como para la muestra procedente del Reactor
aerobio.
En el digestor anaerobio no se detectó presencia de las bacterias PAO y GAO, lo
que parece lógico, ya que estas bacterias no son capaces de crecer en condiciones
anaerobias. Así, estas bacterias presentan una clara desventajas con respecto a otros
grupos bacterianos capaces de utilizar los ácidos grasos volátiles presentes en la
digestión anaerobia.
En el reactor aireado de fangos activados se ha obtenido señal positiva para las
PAO y para las GAO pertenecientes a los organismos defluvicoccus cluster II.
Con ayuda del programa de cuantificación, se hizo el análisis cuantitativo de las
muestras que resultaron positivas.
Las bacterias PAO resultarón un 2% (+/- 1), mientras que las GAO fuerno un 4%
(+/- 2) del total de las bacterias hibridadas con las sondas generales de dominio
eubacteria y archaea (EUBMIX + ARCH915).
Como se puede observar, hay mayor porcentaje de la presencia de las GAO
cluster II que las PAO, sin embargo entre las dos tienen poca presencia en la población
microbiana. Realizando el análisis cuantitativo de la presencia de estas bacterias
podemos observar que no hay un porcentaje alto de ellas, en total representan un 6% de
la población total de bacterias que hay en el fango activo.
En cuanto a las observaciones ambas bacterias son pequeñas de tamaño, la
diferencia es que las PAO se agrupan de froma muy densa, mientras que las GAO están
de más dispersas (figura 14 y 15).
La presencia de estas bacterias en el tanque aerobio puede deberse a que existen
zonas anaerobias dentro del reactor.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
54
Figura 14. Bacterias PAO en el Reactor aerobio. La señal en verde corresponde a diversas
bacterias presentes en la muestra. La señal en rojo corresponde a las bacterias PAO. Imagen a
630x.
Figura 15. Bacterias GAO en el Digestor anaerobio. La señal en verde corresponde a la
población bacteriana presente en la muestra. La señal en rojo corresponde a las bacterias GAO.
Imagen a 630x.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
55
5.3 Detección y cuantificación de las bacterias Desnitrificantes
Para las hibridaciones de las bacterias desnitrificantes se usaron 3 sondas
específicas que se muestran en la tabla 11 descrita en materiales y métodos.
En ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio) se detectó presencia de
las bacterias desnitrificantes.
Existen muchas bacterias con capacidad para cambiar su metabolismo pasando de
utilizar oxígeno como aceptor final de electrones a utilizar nitrato (Ferrer, 2007).
La utilización de oxígeno se ve favorecida frente a la de nitrato, por lo que si
existen ambos compuestos, no se producirá la desnitrificación. Sin embargo bajas
concentraciones de oxígeno disuelto se pueden encontrar en determinadas zonas del
reactor, debido a la configuración que pudiera tener, o dentro del flóculos (fango
granular) debido a una limitación en la transferencia de oxígeno en el interior del
mismo. En ambos casos aparecen zonas donde se da la desnitrificación (Ferrer, 2007).
Utilizando el software de cuantificación, se realizó el análisis cuantitativo de las
muestras que resultaron positivas, tanto en el digestor anaerobio como las del reactor
aerobio.
En el Digestor anaerobio la presencia de las bacterias dsnitrificantes es del 10%
(+/- 5), mientras que para el Reactor aerobio estas bacterias estan presentes con un 19%
(+/- 2) del total de bacterias hibridadas con las sondas EUB MIX y ARCH 915.
Las bacterias desnitrificantes tanto en el reactor aerobio como en el digestor
anaerobio se encuentran dispersas y algunas formando flóculos, excepto para las
bacterias Thiobacillus que son filamentosas (figura 16).
La presencia de bacterias desnitrificantes se puede ver afectada por varios
factores, siendo alguno de ellos:
1. Presencia de oxigeno disuelto: las concentraciones superiores a 0.3-1.5 mg
O2/l inhiben el mecanismo de la desnitrificación. El oxígeno impide la formación de la
nitrato reductasa, enzima que cataliza el paso de nitrato a nitrito bloqueando el proceso
de desnitrificación (Barajas, 2002).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
56
Figura 16. Bacterias desnitrificantes. A) Bacterias Azoarcus-Thauera-Castellaniella cluster en
el Digestor anaerobio. B) Bacterias Azoarcus-Thauera-Castellaniella cluster en el Reactor aerobio.C)
Bacterias Paracoccus en el Digestor anaerobio. D) Bacterias Paracoccus en el Reactor aerobio. E)
Bacterias Thiobacillus en el Digestor anaerobio. Las señales en verde son la población bacteriana
mientras q las señales en rojo son las bacterias desnitrificantes. Imagenes a 630x.
2. Fuente de carbono orgánico: diversos grupos de bacterias compiten con las
desnitrificantes para utilizar el nitrato y transformarlo en otros productos distintos al N2.
Por tanto es importante la existencia de una relación C/N adecuada y una fuente de
carbono fácilmente biodegradable. Las fuentes de carbono propuestas (García, 1997)
para llevar a cabo la desnitrificación son variadas y entre ellas destacan el metanol, el
acido acético, el etanol, la acetona y algunos azúcares, así como fuentes de carbono
interno del proceso como la materia orgánica del agua residual, el carbono endógeno e
incluso el metano que se produce en el proceso anaerobio. Se han llevado a acabo
estudios para utilizar fango hidrolizado para llevar a cabo el proceso de desnitrificación
ya que contiene fuentes de carbono fácilmente biodegradables (Henze, 1991).
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
57
3. Temperatura: Henze (1991) encontró que a medida que aumenta la temperatura,
el rendimiento de la desnitrifiacion aumenta. La desnitrificación es el proceso que tolera
un rango de temperatura amplio, ya que existen bacterias con temperaturas óptimas de
crecimiento de 28 a 32ºC (Kelly et al., 2000).
En el digestor anaerobio las bacterias desnitrificantes hallan las condiciones para
su crecimiento ya que no hay oxígeno que inhiba su proceso, cuentan con fuente de
carbono fácilmente biodegradable, se encuentran en temperaturas óptimas, así como
también influye que en el reactor aerobio se produce la nitrificaión, de forma que al
digestor le llegan nitratos, lo cual favorece el desarrollo de las desnitrificantes en el
digestor.
Se realizó un análisis de corroboración de los resultados obtenidos en la muestra
del digestor anaerobio, por lo que se tomó una muestra de la EDAR CARRAIXET con
6 meses de diferencia con la primera muestra. A esta nueva muestra se le realizó el
mismo procedimiento de fijación y de hibridación que a la primera muestra y se analizó
cuantitativamente obteniendo los resultados muy similares a los de la primera muestra
hibridada. Por lo que la presencia de las bacterias desnitrificantes en el Digestor
Anaerobio no se debe a algo puntual.
5.4 Detección y cuantificación de las bacterias Metanotrofas
Con las dos sondas que se reportan en la tabla 12 se cubre todos los géneros
conocidos y reportados en bibliografia como bacterias metanotrofas.
Estas bacterias no es muy común hallarlas en los sitemas convencionales de fango
activo. Las hibridaciones correspndientes se realizaron para ambas muestras (Digestor
anaerobio y Reactor aerobio). Para las muestras del digestor anaerobio, las
hibridaciones resultaron negativas. En las muestras del reactor aerobio la sonda Ma464
que pertenecen a las metanotrofas del tipo II, da señal positiva, mientras que con la otra
sonda, se detecta tan solo una muy baja presencia.
Con el software de cuantificación, se realizó el análisis cuantitativo de las
muestras que resultaron positivas del reactor aerobio.
Las bacterias metanotrofas se encuentran en la muestra del Reactor aerobio con
una abundancia del 1 +/- 1% (figura 17).
Se ha reportado que la temperatura óptima para la metano oxidación es de 25ºC
(Hanson et al., 1996). Las Metanotrofas del tipo II se ven favorecidas frente a las del
tipo I en condiciones de bajo contenido de metano. Además, tambien influye si está
limitado el medio en nitrógeno (Hanson et al., 1996). La hipótesis es que la
concentración de metano y oxígeno combinado con nitrógeno, son los factores
determinantes del tipo de metanotrofa que se encuentre (Hanson et al., 1996).
Mariela Beatriz Reyes Sosa
58
Figura 17. Bacterias Metanotrofas en el Reactor aerobio. La señal en verde corresponde a la
población de bacterias presentes en la muestra. La señal en rojo corresponde a las bacterias
metanotrofas presentes en la muestra. Imágenes a 630x.
5.5 Detección y cuantificación de las bacterias Sulfato-reductoras (SRB)
Para la detección de las bacterias Sulfato reductoras se hace uso de las sondas de
la tabla 13 antes descrita.
Las sondas SRB385 y la SRB385Db son sondas que detectan tipos de bacterias
sulfato reductoras de la clase deltaproteobacteria, pero no todas las deltaproteobacteria y
demás sulfato reductoras fuera de la clase deltaproteobacteria (Ashelford et al 2002;
Loy et al 2002; Lücker et al 2007). Rabus (1996) comparó la detección de ambas
sondas entre una gran cantidad de bacterias. El resultado fue que la sonda SRB385Db
detecta más familias de sulfato reductoras que la sonda SRB385. Las demás sondas son
mas restrictivas en cuanto a la detección de familias o géneros de las bacterias sulfato
reductoras dentro de la clase deltaproteobacteria.
Se detectaron señales positivas para ambas muestras (Digestor anaerobio y
Reactor aerobio), con las sondas generales de sulfato reductoras. La diferencia entre
ambas muestras es la abundancia de bacterias (figura 18 y 19).
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
59
Figura 18. Bacterias Sulfato-reductoras en el Digestor anaerobio. A) Muchas
Desulfovibrionales y otras Bacterias. B) Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales,
Syntrophobacterales, Myxococcales, y otras Bacterias. C) Desulfonema. Las señales en verde
corresponden a la poblción bacteriana presente en la muestra, mientras q las señales en rojo
corresponden a las bacterias SRBs. Imágenes a 630x.
En las anteriores imágenes se puede ver que las bacterias, en su mayoría, se
encuentran dispersas, y unas pocas agrupadas en pequeños flóculos.
El análisis cuantitativo se realiza con la ayuda del software de cuantificación para
todas las muestras que dieron un resultado positivo.
Las sulfato reductoras en el Digestor anerobio es un 20% (+/- 4) de la población
de bacterias total hibridada con las sondas generales de dominio (EUBMIX +
ARCH915). Mientras que la presencia de bacterias sulfato reductoras en el Reactor
aerobio es de un 27% (+/- 4). Ambos resultados son significativos.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
60
Figura 19. Bacterias Sulfato-reductoras en el Reactor aerobio. A) Muchas Desulfovibrionales
y otras Bacteria. B) Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales,
Myxococcales, y otras Bacterias. C) Desulfonema. Las señales en verde corresponden a la poblción
bacteriana presente en la muestra, mientras q las señales en rojo corresponden a las bacterias
SRBs. Imágenes a 630x.
En general, en las muestras del Digestor Anaerobio, las señales de hibridación
eran menos intensas que las del Reactor Aerobio. También en las muestras del Digestor
anaerobio se detectan menores señales fluorescentes en comparación con las del Reactor
aerobio.
En principio, no cabría esperar una presencia tan elevada de bacterias SRB en el
reactor aerobio (27%), que incluso es mayor que en el digestor anaerobio (20%). A
continuación, se discuten las posibles causas de este hecho.
Aunque tradicionalmente se considera a las SRB anaerobias estrictas, en los
ultimos años se ha reportado actividad sulfato reductora en ambientes aerobios,
demostrando el amplio rango ecológico de las SRB (Baumgartner et al., 2006).
Un estudio realizado en 1985, demuestra que varias cepas de SRB pueden
sobrevivir periodos largos en zonas óxicas y mantener su capacidad para la reducción
del sulfato (Cypionka et al., 1985). Más tarde se estudió la capacidad de las SRB para
reducir el oxígeno y el nitrato en los procesos aerobios (Dillin y Cypionka 1990;
Dannenburg et al., 1992). En otro estudio realizado años más tarde, se demostró que las
SRB utilizan distintos aceptores de electrones en función de su rendimiento energético:
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
61
el oxígeno en primer lugar, a continuación el nitrato/nitrito y luego los compuestos de
azufre (sulfato, sulfito, tiosulfato y azufre elemental) (Krekeler y Cypionka 1995).
Otros estudios realizados se centraron en los procesos bioquímicos durante la
reducción del oxigeno por SRB (Baumgartner et al., 2006). Chen et al., (1993)
descubrieron que Desulfovibrio gigas utiliza un par de proteinas para reducir el oxigeno
mientras oxida NADH (dinucleotido de nicotiamida adenina oxidada).
Otros estudios demostrarón que las SRB contienenen superoxidos que protegen
a la célula cuando se encuentra en ambientes de estrés oxidativo (Louro, 2009). Estos
superóxidos reductasas participan en las reacciones redox (Carvajal, et al., 2008), y los
que podemos encontrar en las SRB son, neelaredoxina, desulfoferredoxina y
rubredoxina (Fauque y Olliver, 2004).
En ausencia de sulfatos, ciertas SRB pueden utilizar compuestos carbonatados
simples como dadores y aceptores de electrones por un proceso llamado dismutación.
Es decir, ciertas SRB son capaces de desproporcionar compuestos intermediarios de
azufre. Las desproporción se refiere a desintegrar compuestos reducidos de azufre, tales
como tiosulfato, sulfito o azufre elemental (S0), a un nuevo compuesto, el cual está más
oxidado y/o reducido comparado con el substrato original (Salazar, 2008).
Por otro lado, al igual que las archaeas metanogénicas, algunas SRB se agrupan,
por lo que pueden quedar en las capas mas profundas de los gránulos en
microambientes anaerobios. Sin embargo, en ninguna de las muestras se observó fango
granular.
La presencia de estas bacterias en el reactor aerobio, como en el caso de las
archaeas metanogénicas, se debe, entre otras causas, a la existencia de la recirculación
del fango del digestor al decantador primario. Tambien se debe tomar en consideración
que las aguas de la zona son ricas en sulfatos, lo que proporciona una relación DQO/S
baja, favoreciendo la proliferación de las SRB.
Por otr parte, existe en el proceso un paso de sulfato a sulfuro (proceso
biológico) pero tambien existe un paso de sulfuro a sulfato (proceso químico), dando así
un ciclo continuo y proporcionando el medio adecuado para la existencia de las SRB.
Para corroborar los resultados obtenidos en el Reactor aerobio, se repitió el
análisis con fango procedente de la planta del CARRAIXET con 6 meses de diferencia
con la primera muestra. A esta nueva muestra se le sometió al mismo procedimiento que
a la primera muestra en cuanto a fijación e hibridación. Los resultados son muy
similares, esto queda confirmado que en ambas muestras se detectan las sulfato
reductoras de manera muy abundante.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
62
5.6 Detección y cuantificación de las bacterias Metanogénicas
Las sondas específicas correspondientes para las hibridaciones de las archaeas
metanogénicas se detallan en la tabla 14 descrita en el capitulo de materiales y métodos.
En las muestras del Digestor anaerobio tres de las sondas (MSMX860, MG1200b
y MB311) dan señal positiva y de mucha intensidad, por lo que se ha de suponer que el
porcentaje de presencia de las bacterias metanogénicas es significativo en la población
microbiana total.
En las muestras del Reactor aerobio dos de las sondas dan resultados positivos
(MG1200B y MB311), aunque las dos sondas dan poca señal de hibridación en
comparación a la hallada en el Digestor anaerobio.
Utilizando el software de cuantificación, se realizó el análisis cuantitativo de las
muestras que dieron señales positivas tanto del digestor anaerobio como las del reactor
aerobio.
Los resultados de la cuantificación para el Digestor anaerobio muestran un 30%
(+/- 6) de abundancia y un 11 % (+/- 2) de abundancia para el Reactor aerobio. Los
resultados muestran porcentajes de presencia altos en ambos procesos.
Cabría esperar una ausencia total de organismos metanogénicos en el Reactor
aerobio, sin embargo, un 11% supone una presencia importante de estos organismos. A
continuación se discuten las causas más probables de este hecho.
En el digestor anaerobio, la mayoría de estas bacterias, se agrupan de forma muy
peculiar, pues aparentan racimos no muy grandes. También hay algunas bacterias que
forman cadenas y otra parte que están dispersas (figura 20). En el reactor aerobio se
visualizan bacterias agrupadas y bacterias dispersas. Los organismos metanogénicos
encontrados en el reactor aerobio parecen ser de menor tamaño que los encontrados en
el digestor anaerobio (figura 21).
En el Reactor aerobio una concentración de O2 disuelto inferior o igual a 0.1-1
mg/l, puede inhibir el crecimiento de las bacterias aerobias, pero se sabe que
concentraciones alrededor de 0.01-0.001 mg/l, puede inhibir el crecimiento de algunos
organismos metanogénicos hidrogenotróficos y la producción de CH4 (Macarie, et al.,
1996). Sin embargo, un número elevado de organismos metanogénicos, así como
bacterias acetogénicas anaerobias estrictas, han sido encontrados en los fangos
activados de varias plantas de tratamiento aerobio (Macarie, et al., 1996).
La presencia de microorganismos anaerobios estrictos en ambientes aerobios
corresponde a la formación de micronichos anaerobios. Los micronichos se relacionana
con la formación de los gránulos en los que se ve limitada la transferencia de O2 al
interior de él (Macarie, et al., 1996).
Varios trabajos han demostrado que los flóculos desarrollados presentan una
organización multicapas de su población bacteriana (Macarie, et al., 1996). Las
bacterias fermantativas, las cuales son en parte anaerobias facultativas, se encuentran
exclusivamente en la parte externa del gránulo, mientras que los microorganismos más
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
63
sensibles al O2 (metanogénicos, tanto acetoclásticos como hidrogenotroficos) se ubican
en las capas más profundas del gránulo (Macarie, et al., 1996).
Figura 20. Bacterias Metanogénicas en el Digestos anaerobio. A) Methanosarcinales. B)
Methanomicrobiales. C) Methanobacteriales. Las señales en verde corresponden a toda la población
bacteriana presente en la muestra, mientras que las señales en rojo corresponden a las archaea
metanogénicas. Imágenes a 630x.
En los resultados de un estudio realizado por Anzola (Anzola, et al., 2008) sobre
reactores anaerobios-aerobios de lecho fijo, se muestra que el contenido del O2 disuelto
en una de las zonas del reactor no afectó la metanogénesis, sino que aumentó la
velocidad y mejoró la producción de CH4.
Sin embargo en las muestras analizadas en el presente trabajo no se visualizó
fango granular. Por lo que la causa más probable de la presencia de estas archaeas se
debe a que en la EDAR existe la recirculación de los fangos del digestor hasta la
decantación primaria. Llegamos a detectar estas archaeas debido que el tiempo de
retención celular del reactor aerobio es bajo, por lo que no da tiempo a que
desaparezcan todas estas especies.
Se realizó una prueba para corroborar los resultados obtenidos en el Reactor
aerobio en cuanto a la presencia de los organismos metanogénicos.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
64
Se tomo una muestra del reactor aerobio de la planta del CARRAIXET con una
diferencia de fechas de 6 meses. La muestra se sometío al mismo procedimiento de
fijacion e hibridación que las muestras anteriores y se le realizó la cuantificación.
Figura 21. Bacterias Metanogénicas en el Reactor aerobio. A) Methanomicrobiales. B)
Methanobacteriales. Las señales en verde corresponden a toda la población bacteriana presente en
la muestra, mientras que las señales en rojo corresponden a las archaea metanogénicas. Imágenes a
630x.
Los resultados de estas pruebas fueron similares a las primeras hibridaciones con
lo que se corrobora la presencia y porcentajes significativos en ambas muestras.
En las figuras 20 y 21 podemos observar que las metanogénicas podemos
encontrarlas dispersas, aglomeradas y formando filamentosas.
5.7 Comparación del total de las poblaciones bacterianas encontradas en el
Fango activado y en la Digestión anaerobia
En la figura 22 se puede ver la comparación de los distintos grupos de bacterias
tanto en la muestra del Reactor aerobio como en la del Digestor anaerobio.
Comparando los microorganismos detectadas en las hibridaciones realizadas se ha
encontrado que la población bacteriana con la que cuenta el reactor aerobio (figura 22)
es:
1. Bacterias nitrificantes
2. Bacterias PAO
3. Bacterias GAO
4. Bacterias desnitrificantes
5. Bacterias metanotrofas
6. Bacterias sulfato-reductoras
7. Archaeas metanogénicas
8. Restos de población heterotrofa
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
65
Mientras que la población microbiana del Digestor anaerobio (figura 22) esta
formado por:
1. Bacterias desnitrificantes
2. Archaeas metanogénicas
3. Bacterias sulfato-reductoras
4. Resto de población anaerobia
Figura 22. Comparación de los grupos de bacterias en cada proceso analizado. En la gráfica
de arriba, población microbiana en el Reactor aerobio. En la gráfica de abajo, población
microbiana del Digestor anaerobio.
Porcentaje por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Digestor
anaerobio
10%
30%
20%
40%
Presencia por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Reactor
aerobio
9% 2%4%
19%
1%
11%27%
27%
Bacterias Nitritrificantes Bacterias PAO Bacterias GAO
Bacterias Desnitrificantes Bacterias Metanotrofas Archaeas Methanogénicas
Bacterias SRB Resto de bacterias
Porcentaje por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Digestor
anaerobio
10%
30%
20%
40%
Mariela Beatriz Reyes Sosa
66
Los resultados obtenidos están dentro de lo esperado, sin embargo, existen tres
grupos de microorganismos (desnitrificantes, metanogénicos y sulfatoreductores) que a
priori no deberían aparecer en ambos procesos simultáneamente. A continuación, se
exponen las razones que justifican la presencia de estos organismos en ambos procesos:
a) Bacterias Desnitrificantes.- se observan 3 grupos de desnitrificantes
(Azoarcus-Thauera-Castellaniella, Paracoccus y Thiobacillus) en el Digestor anaerobio
con un porcentaje de abundancia de 10%, mientras que en el Reactor aerobio tan solo se
han encontrado 2 grupos (Azoarcus-Thauera- Castellaniella, Paracoccus) con un 19%
de abundancia. El grupo de estas bacterias del que carece el reactor (Thiobacillus) forma
filamentosas. En principio, no se esperaba la presencia de bacterias desnitrificantes en el
digestor anaerobio.
La elevada presencia de bacteris desnitrificantes en el digestor anaerobio se
debe, principalmente, a que se detectó una alta concentración de nitratos a la entrada del
digestor anaerobio, lo que favorecería el desarrollo de estas bacterias.
En cuanto a las especies concretas, la bacteria Paracoccus puede crecer bajo
diferentes concentraciones de O2, utilizando N-óxidos como aceptores de electrones y
con una variedad de fuentes de carbono incluyendo aminas y alcoholes (Beker et al.,
1998). Se ha visto que especies como Paracoccus solventivorans crecen con acetona,
Paracoccus aminovorans y aminophilus con dimetilformamida, Paracoccus thiocynatus
con tiocinato y Paracoccus desnitrificans puede usar disulfuro como fuente de carbono
(Beker et al., 1998). La Paracoccus denitrificans usa tanto compuestos de sulfuro
como tiosulfato como dadores de electrones en la desnitrificación (Lee et al, 2008). Su
capacidad de utilización de diferentes dadores de electrones hace posible encontrar estas
bacterias en ambientes anóxicos.
Las bacterias Azoarcus y Thauera consumen una amplia gama de acidos grasos
de cadena corta (Morgan et al., 2008). Esta característica permite encontrarlas tando en
el reactor como en el digestor anaerobio. Sin embargo la abundancia de la bacteria
Azoarcus en los reactores de plantas a gran escala varia entre un 3-16% de la biomasa
total (Thompsen et al., 2007). Si además las plantas cuentan con adición de Metanol
como fuente de carbono, esta abundancia puede llegar a superar el 30% (Hagman et al.,
2008). La abundancia de la Thaurea en plantas a gran escala varia entre un 2-11% del
total de la biomasa (Thompsen et al., 2007).
La bacteria Thiobacillus puede crecer tanto en medios aerobios como anaerobios,
sin embargo, su temperatura óptima es de 28 a 32ºC con un pH de 6 a 8 (Kelly et al.,
2000). Como la temperatura del reactor aerobio es de aproximadamente 20 ºC, no se
favorece el desarrollo de Thiobacillus en él. Estas bacterias se han encontrado en aguas
residuales, lagunas de tratamiento de residuos industriales y en los tanques de digestión
especialemente bajo condiciones de anoxia (Kelly et al., 2000). La especie Thiobacillus
denitrificans crece como los organismos autótrofos quimiosintéticos en medios
anaerobios (anóxicos) utilizando tiosulfato, tetrationato, tiocinato, sulfuro o azufre
elemental mediante el uso de nitrato, nitrito u óxido nitroso como aceptores de
electrones (Kelly et al., 2000; Lee et al, 2008).
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
67
Por otra parte, las bacterias Thiobacillus y Paracoccus juegan un papel importante
en el digestor anaerobio ya que participan en el ciclo del azufre estableciendo una
relación con la presencia de las SRB. Por lo que su presencia en el Digestor anaerobio
es justificable.
b) Archaea Metanogénicas.- Se observan que son 3 grupos de estos
microorganismos (Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Methanobacteriales) en el
Digestor anaerobio y tan solo 2 en el Reactor aerobio (Methanomicrobiales y
Methanobacteriales). El grupo del que carece el Reactor aerobio (Methanosarcinales),
forma filamentosas y se agrupa, a diferencia de todos los demás microorganismos
hallados en las muestras, en forma de racimos. En principio, no cabría esperar la
presencia de organismos metanogénicos en el reactor aerobio. Sin embargo, la
existencia de una recirculación de fangos del digestor anaerobio al decantador primario
de la EDAR, hace que sea posible su presencia en el reactor aerobio.
Estos microorganismos no llegan a desaparecer completamente en el reactor
aerobio debido a que el tiempo de retención celular es bajo, aunque se llega a obtener
una disminución aproximada de un 60% (30% de estas archaeas en el digestor y 11% en
el reactor).
En cuanto a la diferencia de especies, hay que decir que los microorganismos
Methanosarcinales son acetotróficos. Etos estan presentes en el Digestor anaerobio pero
no en el Reactor aerobio, lo que se puede deber a que en el Reactor aerobio no exista
acético sufiente para la proliferación de estas archaeas, ya que pueden entrar en
competencia por el acético con las bacterias PAO, GAO y otros organismos. Además, la
velocidad de crecimiento de los organismos metanogénicos acetotróficos es más lenta
que la de los hidrogenotróficos.
c) Bacterias Sulfato-reductoras.- encontramos los mismos grupos de estas
bacterias (Desulfovibrionales y Desulfobacteraceae) en los dos procesos estudiados
(Digestor anaerobio y Reactor aerobio). La diferencia está en que las bacterias del
Reactor aerobio son más grandes y abundantes (27%) que las que aparecen en el
Digestor anaerobio (20%). En principio, se puede pensar que no debería haber muchas
de estas bacterias en el Reactor aerobio. Sin embargo, existen una serie de factores que
hacen posible su proliferación en este tipo de ambientes.
En primer lugar, ya se ha comentado que existe una recirculación de los fangos
del digestor anaerobio al decantador primario, lo que hace posible la presencia de estas
bacterias en el reactor.
En segundo lugar, las aguas residuales que llegan a la EDAR del Carraixet
contienen gran cantidad de sulfatos, dando una relación DQO/S baja, lo que favorece el
desarrollo de estos microorganismos en el reactor aerobio. Además, cabe destacar que el
sulfato que es transformado a sulfuro por estas bacterias, pasa de nuevo a sulfato por la
presencia de oxígeno en el reactor aerobio. Esto hace que siempre exista una fuente de
sulfatos en el reactor, favoreciendo así el crecimiento de las SRB, lo que no ocurre en el
digestor anaerobio.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
68
Por otra parte, algunas SRB no son completamente dependientes del sulfato. Estas
pueden usar como aceptor de electrones alternativamente Fe(III) y nitrato, pueden
desproporcionar compuestos sulforados y pueden crecer bajo condiciones fermentativas
(Ravenschlang et al, 2000). Se ha observado que las SRB tienen la capacidad de
utilizar diversos dadores de electrones para la reducción de sulfatos. Entre estos dadores
cabe destacar: hidrógeno, ácidos grasos y subproductos orgánicos formados por las
bacterias aerobias durante su crecimiento (Rabus et al. 1996). En el anexo se muestran
algunas de las reacciones más importantes que se llevan a cabo durante el ciclo del
azufre.
Es de suponer que las bacterias no detectadas mediante las sondas utilizadas
corresponden al “resto de población bacterian”, probablemente bacterias heterótrofas.
Em el caso de la población de las bacterias em el Digestor anaerobio, las bacterias no
detectadas y reportadas como “Resto de población bacteriana” están asociadas con
bacterias acidogénicas.
A la vista de los resultados obtenidos, cabe destacar que la diversidad de
microorganismos es mayor en el reactor aerobio que en el digestor anaerobio.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
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6 Conclusiones
Las principales conclusiones que se pueden extraer de este trabajo se detallan a
continuación.
Debido a la falta de intensidad en la señal de hibridación, la cuantificación de los
microorganismos en el reactor aerobio es más fácil que la cuantificación de los
microorganismos del digestor anaerobio. Las muestras del digestor anaerobio emiten
poca fluorescencia debido a obstáculos como suciedad (material no biodegradable
inerte) y el poco contenido de ribosomas.
Variando los tiempos de fijación e hibridación se puede llegar a mejorar la
fluorescencia emitida por las muestras del digestor anaerobio (aumento de la intensidad
lumínica). Esto ayuda en el momento de la cuantificación de los microorganismos. Los
tiempos óptimos para nuestra muestra son 90 min. de fijación y 90 min. de hibridación.
En el reactor aerobio las especies más abundantes de microorganimos
identificados son: 27% de bacterias SRB, 19% de bacterias desnitrificantes, 11% de
archaeas metanogénicas, un 9% de bacterias nitrificantes, 4% de bacterias GAO, 2% de
bacterias PAO, 2% y un 1% de metanotrofas.
Los microorganismos identificados en el digestor anaerobio son: 30% de archaeas
metanogénicas, 20% de bacterias SRB y 10% de bacterias desnitrificantes.
Muchas de las poblaciones presentes en el digestor anaerobio, como los
microorganismos metanogénicos y las bacterias sulfato reductoras, llegan a los Fangos
activados por la recirculación de los fangos que se lleva cabo en la planta. Sin embargo
estas permanecen con abundancias importantes por diversas razones:
Las archaeas metanogénicas son detectadas con una abundancia del 11%
en el reactor aerobio y un 30% en el digestor anaerobio. Esto se debe, entre otras
cosas, a que el tiempo de retención celular del reactor aerobio es bajo y por tanto
no es tiempo suficiente para que estos microorganismos lleguen a desaparecer
completamente.
En el caso de las bacterias sulfato reductoras, estas estan presentes en el
fango activado debido a que muchas especies toleran el oxigeno, llegando a
detectar un 27% en el reactor aerobio y un 20% en el digestor anaerobio. En el
reactor aerobio se detecta incluso mayor porcentaje de SRB por que las aguas son
ricas en sulfatos. Además, su capacidad para utilizar una gran diversidad de
dadores de electrones hace que el medio sea apropiado para su proliferación y que
puedan entrar en competencia con las demás bacterias.
Tambien en el digestor anaerobio se observa la presencia de las bacterias
desnitrificantes. Esto se debe principalmente a que al digestor llega una elevada
concentración de nitratos. Además, existe una gran diversidad de bacterias
desnitrificantes entre las que podemos encontrar, aerobias o anaerobias facultativas, esto
hace que las podamos encontrar tanto en el Reactor aerobio como en el Digestor
anaerobio. En el caso de la especie Thiobacillus su rango de temperatura (28-32ºC) es
Mariela Beatriz Reyes Sosa
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un poco más alto que las temperaturas normales que se encuentran en los reactores
aerobios, por lo que es más fácil encontrarlas en los digestores. Las bacterias
Paracoccus tienen un amplio rango de sustratos, crecen bajo diferentes condiciones de
O2 utilizando nitratos como aceptores de electrones, esto hace posible encontrarlos tanto
en el reactor aerobio como en el digestor anaerobio con presencia de nitratos (anóxicos).
Un punto muy importante sobre las desnitrificantes Thiobacillus y Paracoccus es que
pueden realizar la desnitrificación usando como dadores de electrones compuestos
inorganicos de azufre, por lo que juegan un papel importante en el ciclo del azufre y
tienen relación con la presencia de SRB en los procesos anaerobios.
En el reactor aerobio hay más diversidad de grupos de microorganismos que en el
digestor anaerobio. Comparando las distintas poblaciones, en cada uno de los procesos
estudiados (Fango activado y Digestor anaerobio), se comprueba la diversidad de los
microorganismos y la abundancia de cada especie desarrollada. Además, es posible
relacionar la presencia de algunas especies, ya que subproductos de alguna especie
pueden ser el sustrato o el aceptor de electrones de otras especies, estableciendo una
relación simbiotica entre ellas.
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
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7 Recomendaciones
Con la información y los datos obtenidos es un poco difícil dar una explicación
concreta de lo que está sucediendo en los procesos biológicos, por lo que se recomienda
hacer un análisis de los grupos de microorganismos faltantes en cada uno de los
procesos, tales como las bacterias acidogénicas y demás organismos heterótrofos que no
se realizaron en este estudio. Esto nos ayudaría a detallar más la población y ver si
exiten especies de bacterias que no se han detectado de los grupos estudiados en el
presente trabajo. También se recomienda realizar analisis de sulfatos, nitratos y oxígeno
en las entradas de los procesos estudiados (reactor aerobio y digestor anaerobio).
La realización de un estudio más amplio sobre las poblaciónes microbianas en los
procesos biológicos en otras plantas de tratamiento de aguas residuales con distintas
características de agua residual (con y sin sulfatos) y esquemas de tratamiento (con y sin
recirculación de fangos desde el digestor), permitiría establecer las relaciones entre las
especies bacterianas presentes y así entender mejor lo que ocurre durante cada proceso
biológico.
El conocimiento de las relaciones simbióticas entre los microorganismos dentro
de la población total, es importante por que con ello se obtendría la información
necesaria para poder completar los modelos matemáticos que permiten simular el
comportamiento de los procesos biológicos, permitiendo optimizar el funcionamiento
de las plantas de tratamiento de aguas residuales.
Por último se recomienda no sólo una busqueda exhaustiva de sondas para
analizar los microorganismos faltantes en este trabajo, si no la realización y diseño de
sondas específicas nuevas para detectar las especies de interés. Esto permitirá afinar el
análisis de las posibles bacterias y archaeas que pudieran encontrarse en los procesos
biológicos de las aguas residuales y que no estan reportadas en la bibliografía.
Mariela Beatriz Reyes Sosa
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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
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Anexo
Reacciones de las Bacterias
Amonio-oxidantes
NH4+ + 3/2 O2 → NO2
- + 2H
+ + H2O (Ferrer et al, 2007)
Bacterias:
Nitrosomonas
Nitrosospira
Nitrosococcus
Nitrito-oxidantes
NO2- + ½ O2 → NO3
- (Ferrer et al, 2007)
Bacterias:
Nitrobacter
Nitrospira
PAO
Condiciones anaerobias
2C2H4O2 + (HPO3) + H2O → (C2H4O2)2 + PO4-3
+ 3H+ (Ferrer et al, 2007)
Condiciones aerobias
(C2H4O2)2 + 0.2 PO4-3
+ 1.2 O2 + 0.16 NH4+ → 0.16C5H7NO2 + 1.2 CO2+ 0.2 (HPO3) +
0.44 OH- + 1.44 H2O (Ferrer et al, 2007)
HPO3= Poli-p
C2H4O2= Acido acético
C5H7NO2= Biomasa
GAO
Condiciones anaerobias
C2H4O2 + 1.12CH10/6O5/6 → PHA(1.358PHB + 0.456PHV + 0.0367PH2MV) + 0.27CO2
(Oehmen et al, 2005)
Condiciones aerobias
4/3CH1.5O0.5 + 4/6 ATP + 5/6 H2O → CH10/6O5/6 (Oehmen et al, 2005)
CH10/6O5/6 = Glicógeno
CH1.5O0.5 = PHA
Desnitrificantes
6NO3- + 2CH3OH → 6NO2
- + 2CO2 + 4H2O (Ferrer et al, 2007)
Mariela Beatriz Reyes Sosa
86
6NO2-+ 3CH3OH → 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OH
- (Ferrer et al, 2007)
CH3OH= Metanol
Bacterias:
Paracoccus.- Fuentes de carbono: glicerol, glucosa, succinato, citrato, acetato, etanol,
metanol, formiato (Takaya et al., 2003).
Azoarcus y Taurea.- Tienen una amplia gama de acidos grasos de cadena corta como
fuente de carbono como el acetato (Morgan et al., 2008) y metanol (Hagman, 2008).
Thiobacillus.- Su fuente de carbono son compuestos inorgánicos (Kelly et al., 2000).
Reaccion enzimática que se realiza por las desnitrificantes es (Sunil et al., 2010):
Nitrato Nitrito Oxido nitrico Oxido nitroso
reductasa reductasa reductasa reductasa
NO3
- → NO2
- → [NO] → N2O → N2
Metanotrofas
CH4 + 1.02 O2 + 0.786 NO3- +0.786 H
+ → 0.393 N2 + 2.39 H2O + CO2
(Modin et al., 2007)
Metanogénicas
Bacterias:
Hidrogenotrofas
H2 + CO2 + formato según especies → CH4 (García, 1991)
Grupo Methanomicrobiales y Methanobacteriales (Methanobrevibacter)
Acetoclásticas
Acetato + según especies H2 + CO2 + Formato, Metanol y Metilaminas → CH4
(García, 1991)
Grupo: Methanosarciales
Metilotroficas
Metanol + Metilaminas → CH4 (García, 1991)
Grupo: Methanobacteriales (Methanobacterium)
Hidrogeno-metilotrófica
H2 + Metanol → CH4 (García, 1991)
Grupo: Methanobacteriales (Methanosphaera)
Alcoholotróficas
CO2+ alcohol (2-propanol, 2-butanol, etanol) (García, 1991)
Grupo: Methanobacteriales (Methanobacterium)
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales:
Fangos Activados y Digestión Anaerobia
87
Methanomicrobiales (Methanogenium, Methanocorpusculum, Methanospirillum)
Sulfato Reductoras (SRB)
CH3COO- + SO4
2- → HS
- + 2HCO3
- (Hidalgo et al., 2001)
4H2 + H+ + SO4
2- → HS
- + 4H2O (Hidalgo et al., 2001)
Pueden tener variedad de aceptores de electrones, tales como tiosulfato (S2O32-
); sulfito
(SO32-
); azufre y nitrato, de hecho pueden usar el Fe (III) y disproporcionar compuestos
de azufre (Ravanschlag et al., 2000). Como fuente de carbono usan una variedad de
ácidos grasos volátiles, alcoholes y compuestos aromáticos.
Sin embargo en el ciclo del azufre podemos encotrar una gran variedad de
microorganismos, tales como Thiobacillus y Paracoccus.
Procesos que ocurren en el ciclo del azufre (Kelly, 1999; Kelly et al., 2000; Peréz.
2008):
Oxidación del azufre
Este proceso consiste en: H2S → S0→ SO42-
Las reacciones de la sulfuro oxidación son:
H2S+1/2 O2 → S0 +H2O
S0+3/2 O2 +H2O → SO4H4
Algunas bacterias que realizan este proceso son:
Thiobacillus
S2-
→ S0
S2-
+ 3H2O → SO32-
+6H+ + 6e- →SO42-
Paracoccus
S2O3 2--
+2 O2+ H2O→ 2SO4 2-
+ 2H+
El paso del tiosulfato a sulfato puede darse de dos maneras estas son:
→S0 → SO4
2-
S2O32-
→SO32-
+ SO42-
S2O32-
= Tiosulfato
SO32= Sulfito
Mariela Beatriz Reyes Sosa
88
Reducción del Azufre
Este proceso es el paso de un compuesto oxidado a otro menos oxidado:
SO4- -
→ H2S
S0
→ H2S
SO4 -- →R-SH→H2S
Reacciones de la sulfato reducción:
H2+SO4 2→ H2S+2H2O+OH
CH3COOH+2H2O+S0→4 H2S+2CO2
CH3COOH= Ácido acético
Estas reaciones son las de las SRB.
Desproporción del Azufre (algunas SRB)
S2O3 2-
+ H2O → SO4 2-
+ H2S
4SO3 2-
+ 2H+ → 3SO4
2- + H2S
4S0+2H2O + MnO2→ 3H2S+SO4
2- +2H
+ + Mn
2+ + 2OH
-