Microbiología General
Seminario Nro. 1Esterilización y Bioseguridad
Algunos conceptos básicos...
Esterilización: eliminación o muerte de todostodos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia.
Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias
Bacteriostático: Agentes que inhiben el crecimiento de las bacterias
Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo.
Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas
Esterilización
Criterio de muerte para un microorganismo
Perdida irreversibleirreversible de su capacidad de reproducción
Cinética de Muerte de un MO
La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética exponencialcinética exponencial.
dN
dt= - K´N
Nº ufc
tiempo
Cinética de Muerte de un MO
Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad).
El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.
VALOR D : Tiempo de reducción decimal
VALOR D : Tiempo de reducción decimal
Efecto de la Temperatura
log
nº
m.o
. via
ble
s
tiempo
60 ºC
100
10
1
70 ºC
50 ºC ¿ A que temperatura es menor el valor de D?
D es un parámetro de la sensibilidad de un Microorganismo determinado al efecto de la temperatura
log
nº
MO
via
ble
s
tiempo
B
100
10
1 C
A ¿Cuál es el MO más sensible al tratamiento?
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial.
VALOR Z
donde ∆T es el incremento de temperatura, y DT1 y DT2 los valores de D a las dos temperaturas estudiadas.
Efecto de la Temperatura sobre características de los alimentos
Efecto de la carga inicial (No)
0
12
34
5
67
8
0 20 40 60 80
Tiempo (min)
log
Nº
so
bre
viv
ien
tes
Esterilización en Microbiología de
Alimentos
Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele
requerir un tratamiento 12D de los productos susceptibles de
ser portadores de gérmenes patógenos (o que puedan dar
lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 órdenes
de magnitud el número de supervivientes o bien, visto de otra
forma, reduce en un factor de 10-12 la probabilidad de
supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos
que un solo microorganismo contaminaba una unidad (una lata,
por ejemplo) del alimento inicial, después de un tratamiento
12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se
reduce hasta 10-12.
D121 = 0.20 minNo = 3.5 x 10 5 ufc/lataTiempo de tratamiento a 121°C = 2 minNF = ¿?
Clostridium botulinum
3.5 x 10 15 ufc/ lata
6
5
4
3
2
1
0
5
4
3
6 2
11 2 3 4 5 6 7
Log 10
Tiempo (min)
AB
Rec
uen
to d
e vi
able
s
Pro
bab
ilid
ad d
e so
bre
vivi
ente
s
Log 10
0
Valor D=1 minuto105
12
10
8
6
4
2
01 2 3 4 5 6 7
Log 10
Tiempo (min)
Rec
uen
to d
e vi
able
s
Pro
bab
ilid
ad d
e so
bre
vivi
ente
s
Log 10
10
8
6
12 4
2
0
MO B
D=0.5 min a 121 ºC
MO A
D=1 min a 121 ºC
Ejercicios– Si se ha determinado que para esporas de Clostridium botulinum
suspendidas en buffer fosfato el D121 = 0.204 min, ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121°C?
– Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10ºC. ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111°C?
– La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento tiene una carga bacteriana de 4x105ufc/ml. La leche se va a procesar a 79ºC por 21 segundos. Si el valor D promedio para la población bacteriana a 65ºC es de 21 segundos y el valor Z es de 7ºC, cuántos microorganismos quedarán luego del tratamiento a 79ºC?¿Cuánto tiempo se requeriría para lograr el mismo grado de letalidad a 65ºC?¿Cuánto tiempo llevaría reducir la concentración a 1ufc/100ml con un tratamiento a 65ºC?
Agentes Físicos
•CALOR
•RADIACIONES
•FILTRACIÓN
Calor
• Calor húmedo
• Calor seco Ambos pueden ser utilizados en procesos
de esterilización
Calor húmedo
PROCESOS
• Esterilización: Vapor saturado a presiones mayores que la
atmosférica Tindalización (fraccionada por vapor)
• Pasteurización• UHT
MECANISMOS DE ACCIÓN
• Desnaturalización de proteínas• Destrucción de ácidos nucleicos
Pasteurización
•LHT (low temperature holding)
30 minutos a 62.8ºC
•HTST (high temperature short time)
15 segundos a 71.6ºC
•Solo destruye patógenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium
tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro.
NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN
•Usos: leche, lácteos, jugos de fruta
Louis Pasteur
UHT (Ultra high temperature)
• 140ºC-150ºC durante pocos segundos
• Proceso continuo
• Necesita envasado aséptico
• Si es un proceso de esterilización
Tindalización
•100 ºC 30 min, 3 días sucesivos
•Proceso discontinuo con períodos de incubación intercalados
•Usos: esterilización de productos de baja resistencia
térmica, cuando no existe otra opción
John Tyndall
Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica
• Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de 100ºC
(PRECAUCIÓN: eliminación total del aire)
• Equipo: Autoclave
• Alcance: Se puede conseguir esterilización
• Usos: Esterilización de materiales y productos termoestables ( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminación de desechos biológicos.
Autoclave
Condiciones :
• 121ºC durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas
• 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales altas
Indicadores:
• Físicos: Temperatura y/o presión
• Químicos
• Indicador biológico: Geobacillus stearotermophilus (D 121ºC=1.5 minutos)
Tamaño del inóculo: 104 esporas
Autoclave
Perfil de temperatura de un proceso de esterilización por calor húmedo
Tem
pera
tura
ºC
100
110
120
15
Tiempo (min.)
Etapa de calentamiento
Etapa de mantenimiento
Etapa de enfriamiento
1 2 3
Calor Seco
•Mecanismo de acción: Procesos de oxidación
•Controles de proceso de esterilización
Indicadores físicos y químicos
Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis var. niger (D 160ºC = 0.3 a 1.8 min, Z=20ºC, tamaño del inóculo: 105 esporas)
Calor Seco
Aire caliente:
Equipo:Hornos eléctricosAlcance: Se consigue esterilización (170ºC, 60 minutos o 160ºC,
120 minutos)Usos:
a) Esterilización de:
• Materiales resistentes al calor• Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos,
siliconas, vaselina líquida) • Polvos
b) Despirogenizacion (250ºC 45 minutos o 180ºC 4hs, o 650 1 min)
• Incineración: Destrucción de material contaminado
Flameado :
Desinfección
Resistencia a calor
PrionesEndosporas bacterianasMycobacteriaVirus sin envoltura lipídicaHongosBacteriasVirus con envoltura lipídica
RESISTENCIA
+
_
La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros medicamentos, etc.
Esterilización por filtración
Filtros de profundidad:Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes.
Filtros de superficie:Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través de ellos es lenta. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo.
FILTRACIÓN DE AIRE
•Filtros HEPA (HHigh EEfficiency PParticulate AAir)•Remoción de hasta el 99.97% de partículas mayores de 0.3 micrones de diámetro
•Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminarflujo laminar
CONTROL •Retención Mínima de un 99.97% de partículas generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un diámetro de 0.3 micrones.
SE USAN PARA Lograr ambientes con número de partículas controlado: FLUJOS LAMINARES AREAS DE TRABAJO
Cabinas de Flujo Laminar Vertical
Entrada de aire
Salida de aire
Protege la muestra, el
operador y el medio ambiente
Actividad antimicrobiana
Alta energía
Baja energía
Dos tipos: Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes
Esterilización por radiaciones
Radiaciones Ionizantes
Características:• Alta energía, baja longitud de
onda• Gran poder de penetración• Ionizan átomos y moléculas• No requieren altas
temperaturasTipos:• Rayos gamma (60Co o 137Cs)• Rayos catódicos (electrones
acelerados)• Partículas beta
Mecanismos de acción:• Formación de radicales libres• Daño al ADN, ARN
Resistencia:PrionesDeinococcus radioduransEnterococcus faecium Esporas bacterianasVirusHongos Bacterias (en gral)
D (kGy) m.o.3 Bacillus pumilus1.2 Staphylococcus spp.
Desventajas:Equipo especial, personal entrenadoNo todos los materiales resisten el tratamientoReacciones no deseadas en alimentos
Radiaciones no Ionizantes
Características:• Baja energía, sin poder ionizante• Sin poder penetranteSin poder penetrante• Máxima eficiencia biocida a 260nm
Mecanismos de acción:• Sitio blanco ADN• Formación de dímeros de timina
Usos:• Desinfección de superficies• Desinfección de aire y agua
NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA:
Luz ultravioleta
La radiación ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por más de 30 años.
La acción de los rayos ultravioleta se debe a la producción de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución de 1 x 40.000. Los aminoácidos aromáticos de las proteínas y las bases puricas y primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto blancos afectados por la acción bactericida de la acción ultravioleta. Evitando la replicación de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en mutaciones mortales.
Dímeros de timina
ESTERILIZACIÓN POR RADIACION UV
Procesos de esterilización
UsosCondicionesAgente
Material filtrable0.22 micras de poro
Filtración
Material termosensibleResistente al tratamiento
25KGy45KGy
Radiaciones ionizantes
Material termoestableNo penetrable por vapor
160ºC 2 horas180ºC 1 hora
Calor seco
Material termoestablePenetrable por vapor
121ºC 15 min.(o equivalente)
Calor húmedo
Control de Esterilización
• Controles del proceso Indicadores: Físicos Químicos Biológicos
• Post-proceso: TEST DE TEST DE ESTERILIDAD !!!ESTERILIDAD !!!
Indicador físico Ej: Temperatura, presión
Indicador químico Cambio de color
Controles del proceso
Indicador biológico Microorganismo resistente
Antisépticos
Alcoholes
Iodo
Órgano-Mercuriales
Colorantes
Desinfectantes y/o Esterilizantes
Cloro y Compuestos clorados
Aldehídos
Oxido de Etileno
Compuestos Fenólicos
Agentes químicos de esterilización y control del
crecimiento
•Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas. Desorganizan la estructura fosfolipídica de la membrana.
•No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta.
•Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%.
•Los más utilizados son el etanol e isopropílico.
•Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc.
•Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante.
•Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre
Iodo
Alcoholes
•Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres.
•Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biológicos debido a que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído.
•Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas.
•Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate.
Órgano-Mercuriales
Peróxido de Hidrógeno
Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámico en UDP-acetilmuramil-péptido.
Colorantes
R = HSO4- Verde Brillante
R = Cl- Verde de Malaquita Violeta de Genciana
El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.
El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporasincluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua.
El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del 0.1-0.5% de Cloro activo.
Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica
Cloro y sus derivados
Aldehídos
•Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática.
•Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas.
•El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío.
•El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc.
•El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados.
Glutaraldehido Paraformaldehido Formaldehido
•Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
•Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso
Oxido de Etileno
Compuestos Fenólicos
•Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos.
•El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies.
•Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas.
Coeficiente del fenol
BIOSEGURIDAD
Bioseguridad
•Contención primariaContención primaria:: protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos.
•Contención secundaria:Contención secundaria: Protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos
•Equipos de Seguridad (Barreras PrimariasBarreras Primarias). Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos.
•Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Barreras
SecundariasSecundarias)
•Riesgo BiológicoRiesgo Biológico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, o toxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos.
Niveles de Bioseguridad
Bioseguridad
Agentes de Riesgo
Bioseguridad
Se entiende por agente de riesgo biológico
cualquier microorganismo -incluyendo de los
genéticamente modificados- cultivo celular,
animal o planta o producto de estos, capaz de
producir cualquier tipo de infección, alergia o
toxicidad en humanos, animales u otros seres
vivos.
Agentes de Riesgo - Grupo I
Bioseguridad
Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos sanos y existe un potencial mínimo de peligro para el personal del laboratorio y el ambiente.
Bacillus subtillisNaegleria gruberivirus de la hepatitis canina infecciosa
Agentes de Riesgo - Grupo II
Bioseguridad
Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestión o exposición percutánea o mucosa.Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos animales pero es poco probable que sea un problema para los trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las medidas preventivas están disponibles, el riesgo de dispersión de la enfermedad es limitado.
Salmonella spp. Virus de la Hepatitis B Toxoplasma spp.Bacillus anthracisBordetella pertussis
Agentes de Riesgo - Grupo III
Bioseguridad
Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de transmisión por aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal.Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y humanos pero que comúnmente no se propagan de un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo están disponibles.
Brucella bortusCoxiella burnetiiMycobacterium
Agentes de Riesgo - Grupo IV
Bioseguridad
Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o que se desconoce su riesgo de transmisión.Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no están disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo.
Virus de Marburg EbolaVirus Junín
Gabinetes de seguridad biológicaClase I (Campana)
Bioseguridad
A. Apertura frontal
B. VentanaC. Filtro deEscape HEPA
D. Pleno de Escape
Gabinetes de seguridad biológicaClase II (Flujo Laminar)
Bioseguridad
A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de escape HEPA; D. Pleno posterior; E. Filtro HEPA de Suministro; F. Ventilador
A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de Presión Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA adicional para enviar aire.
Gabinetes de seguridad biológicaClase III (Flujo Laminar)
Bioseguridad
A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes del largo del brazo al gabinete;B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D. Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.
Transporte de material riesgoso
Bioseguridad
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