Desarrollo de recursos para Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: estudios genómicos en cítricos:
creación decreación deuna colección de una colección de ESTsESTs y una y una
micromatriz de micromatriz de cDNAcDNAProyecto de Genómica Funcional de Cítricos
IBMCPInstituto de Biología Molecular y
Celular de Plantashttp://www.ibmcp.upv.es
Instituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos
http://www.iata.csic.esInstituto Valenciano de
Investigaciones Agrarias http://www.ivia.es
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es
Red Valenciana de Genómica y Proteómica, octubre 2004
Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosObjetivos GeneralesObjetivos Generales
1. Generación de una colección de ESTs representativadel conjunto total de genes expresados por los cítricos.
2. Caracterización del transcriptoma de los cítricos duranteel crecimiento, diferenciación y desarrollo vegetativo y reproductivo, y en respuesta a diferentes condiciones de estrés biótico y abiótico, mediante el desarrollo y uso de microarrays de cDNA.
3. Desarrollo de herramientasgenómicas para la mejorade los cítricos
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosGenotecas de Genotecas de cDNAcDNA estándar construidasestándar construidas
29 genotecas a partir de: Diferentes estreses bióticosInfección por viroide de la Exocortis de los
citricos (hojas)Infección por viroide HSVdInfección por virus de la tristeza (hojas y tallos)Infección por Phytophthora citrophthora (raíces
de variedad sensible)Infección por Phytophthora citrophthora (raíces
de variedad resistente)Infección por Penicillium digitatum (frutos)
Diferentes tejidos y estados de desarrolloTallos vegetativos e internodosHojasRaícesOvarios (senescentes)Ovarios (sin polinizar)Ovarios (diferentes zona de abscisión)Inflorescencias y floresFlavedo de frutos en maduraciónFlavedo de frutos senescentesFrutos enteros Diferentes estreses abióticos
Estrés salino corto (hojas)Estrés salino prolongado (hojas)Estrés hídrico (hojas)Estrés hídrico (raíces)Estrés hídrico y rehidratación (hojas)Estrés hídrico y rehidratación (zona abscisión de hojas)Estrés hídrico y rehidratación (raíces)Deficiencia en hierro (hojas)Deficiencia en hierro (raíces)Almacenamiento en frío (frutos)Tratamiento térmico y almacenamiento en frío (frutos)
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosGenotecas enriquecidas en clones de longitud completaGenotecas enriquecidas en clones de longitud completa
y/o normalizadasy/o normalizadas
12 genotecas a partir de:
Diferentes tejidos y estados de desarrolloOvariosMezcla de diferentes tejidos
Diferentes estreses bióticosInfección por viroide de la Exocortis de los
citricos (hojas)Infección por viroide HSVd (hojas)Infección por virus de la tristeza (hojas)Infección por virus de la tristeza (brotes)Infección por Phytophthora citrophthora (raíces)Infección por Penicillium digitatum (frutos)
Diferentes estreses abióticosEstrés salino e hídrico y deficiencia en hierro (hojas)Estrés salino e hídrico y deficiencia en hierro (raíces)Almacenamiento en frío (frutos)
Clones de longitud completa
Genotecas estándar
19 %
Genotecas enriquecidas en clones de longitud completa
54%
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosESTsESTs obtenidasobtenidas
31.462 Secuencias con una media de 500 pares de bases de alta calidad
+10.337 singletons 4.896 contigs
15.233 putativos genes únicos (UniGenes)(aprox. la mitad del número estimado de genes en cítricos)
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAnotación funcional de las secuenciasAnotación funcional de las secuencias
con clasificación MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) y GO (Gene Ontologies)
el 32% de los unigenes no poseen proteína similar en Arabidopsis thaliana
se han identificado genes de cítricos implicados en todas las categorías funcionales descritas por MIPS, y en proporción similar a A. thaliana, indicando una colección de ESTs representativa del genoma completo de cítricos
0 5 10 15 20 25 30 35
Unclassified protein
Cell type differentiation
Tissue differentiation
Storage proteins
Transposable elements and viral proteins
Development (systemic)
Transport facilitation
Control of cellular organization
Cell fate
Regulation of / Interaction with environment
Cellular transport and transport mechanisms
Energy
Protein synthesis
Signal transduction
Protein fate
Cell cycle and DNA processing
Transcription
Metabolism
% of unigenes
Arabidopsis thalianaCitrus spp.
No similar protein31,9%
Metabolism22,3%
Energy1,7%
Signal transduction2,7%
Cell cycle and DNA processing
4,9
Transcription6,2%
Protein synthesis and processing
8,7%
Development0,4%
Regulation of / Interaction with
environment1,0%
Transposable elements and viral
proteins0,2%
Unclassified16,0%
Structural components
0,5%Cellular
differentiation0,5%
Intracellular transport
1,8%
Defense1,8%
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosConstrucción del primer Construcción del primer microarraymicroarray de cítricosde cítricos
- 12672 puntos
- 6865 Unigenes(5403 singletons + 1462 contigs)
- 18 genotecas- 35% hojas- 27% flores- 22% raíces- 16% flavedo
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAnálisis de la respuesta a estrés hídrico en Análisis de la respuesta a estrés hídrico en CitrusCitrus sppspp..
(Cinta Gimeno, Ramón Serrano)
Caracterización del transcriptoma en C. clementina injertada sobre C. reshni
Riego
Estrés hídrico
Raíces/Hojas
5 h, 10 h, 24 h
0 h
5 h, 10 h, 24 h
Inducción transitoria
•Diseño de referencia•3-4 réplicas biológicas por tiempo•20 hibridaciones
Inducción progresiva Inducción rápida
0h 5h 10h 24h
DehidrinaInositol P sintasaProteína LEA
•Aumento significativo de genes en la categoría funcional “Defensa”
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAnálisis de la respuesta a infección por el virus de laAnálisis de la respuesta a infección por el virus de la
Tristeza de los cítricosTristeza de los cítricos (Mónica Gandía, José Guerri)
A B
•Experimento con 5 plantas de lima infectadas con el aislado agresivo de CTV T-305 frente a 4 plantas control sanas
•Cada planta infectada es hibridada frente a un pool de todas las plantas control realizando un marcaje reverso en cada caso
•5 réplicas biológicas
•10 hibridaciones
ABC transporter family protein
60S acidic ribosomal protein P1
Glutathione S-transferase GST 22
Sodium/dicarboxylatecotransporter
Tubulin beta-2 chainLYTB-like protein precursor
Putative ABC transporter family
protein
60S ribosomal protein L31Geranyl diphosphatesynthase small subunit
Lethal leaf spot 1-like protein
Transporte
Chlorophyllase 1GSH-dependent dehydroascorbate
reductase 1
Thioredoxin H-type
40S ribosomal protein S3ACooper/zinc superoxide dismutase
Stress related protein
40S ribosomal protein S25ACC oxidaseDehydrin
Histone deacetylase-like protein
Putative glutathione S-transferase T3
Glutathione S-transferase GST 14
Ribosomal protein RL5Anthranilatephosphoribosyltransfer
ase
Aldehydedehydrogenase 1
precursor
Chlorophyll a/b-binding protein type III precursor
LipoxygenasePutative Pi starvation-induced protein
40S ribosomal protein S11Lipid transfer proteinCytosolic class I small heat-shock protein
HSP1
40S ribosomal protein S9S-adenosyl-L-methionine: salicylic
acid carboxyl
Miraculin-like protein
Ribosomal proteinControlCooper chaperoneMetabolismo
Germin-like proteinStress
CONTIGS SOBREEXPRESADOS
GRUPO FUNCIONAL
CONTIGS SOBREEXPRESADO
S
GRUPO FUNCIONAL
CONTIGS SOBREEXPRESADOS
GRUPO FUNCIONAL
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales durante elIdentificación de genes diferenciales durante el
desarrollo vegetativo y genes específicos de tejidodesarrollo vegetativo y genes específicos de tejido(Laura Huertas, José Luis García-Martinez)
Material vegetal y diseño experimental
H1 H5
E1 E5E1 E5
H5
H1
2-3 cm 6-8 cm
Diseño en bucle condoble marcaje
8 micromatrices
Confirmación de datos mediante análisis Northern
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C08004D02
C04011H07
C08002D06
rRNA
C20003D02
C01011D02
C20005D04
rRNA
E1 E2 E3 E4 E5 H1 H2 H3 H4 H5 N5 P5 E1 E2 E3 E4 E5 H1 H2 H3 H4 H5 N5 P5
hojas entrenudos
C20003D02
C01011D02
C20005D04
rRNA
E: entrenudos; H: Hojas; N: Nervios; P: Peciolos. .
Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales durante fructificaciónIdentificación de genes diferenciales durante fructificación
(Raquel Arribas, M.Angel Pérez-Amador)
Evolución temporal de frutos +GA3
67 52 23 18
0 11 42
16 9 23 47
27 54 24 61
39
Log 2
Rat
io (6
35/5
32)
0.0
0.5
1.0
1.5
AAA-type ATPase
0.0
0.5
1.0
1.5
Rubisco y CBP
-4
-2
0At1g70540 Unknown
0 7 14 21Dias +GA3
4 réplicas biológicasAnálisis con referencia común
Cuantificación de los niveles de mRNA durante el desarrollodel fruto de 6 genes mediante micromatrices o en geles de RNAOv F1 F2Ov F1 F2
C20006G11
C02015B09
C20010B07
EtBr
C20007E03
C20001C03
C01006G06
EtBr
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales durante maduraciónIdentificación de genes diferenciales durante maduración
(Manuel Cercós, Manuel Talón)
log2 ( breaker / verde )
-5 -4 -3 -2 -1 0 1
leucine-rich repeat proteincytochrome P450
cellulose synthaseearly light induced proteinvacuolar processing enzyme
acid phosphatasewound-induced basic protein40S ribosomal protein S16miraculin-like protein
lectin-related protein
log2 ( fase III / Fase II )
-6 -4 -2 0 2 4 6
beta-D-xylosidaseglycosyl-transferasethioredoxin HMajor allergen Pru ar 1phenylcoumaran benzylic ether reductaselipid-transfer proteinglycine-rich proteinchalcone synthase 2peroxidaseL-ascorbate oxidase
-Diseño de referencia-Réplicas biológicas: 4 por muestra-Identificación de genes diferencialmenteexpresados mediante análisis de diferenciasde medias (p<0.001)
GR
OW
TH (%
)
0
20
40
60
80
100
DAYS AFTER ANTHESIS
60 120 180 240
I II III
-Pulpa: fase II frente a fase III-Flavedo: verde frente a breaker
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales duranteIdentificación de genes diferenciales durante
almacenamiento en frío en períodos postalmacenamiento en frío en períodos post--cosechacosecha(Carolina Royo, Antonio Granell)
Frutos de Clementina de Nules almacenados a 2ºC 5
6d
28d
14d
9d
24
tc0d0 h 1 9 14 28 56
Tiempo a 2ºC
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Referencia común: 0, 2, 4, 6 y 24h, y 9, 14, 28 d.4 réplicas/ muestra
0días 2, 4, 6 h 9 d24 h 56 d14 d 28 d
Referencia
Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosDiferenciación Diferenciación varietalvarietal en Clementinas (I)en Clementinas (I)
(Gema Ancillo, José Guerri, Luis Navarro)
Clemenules
Hernandina
Marisol
Fina
20
20
20
•68 variedades en el banco de Germoplasma del IVIA
•Diferencias en tamaño y época de maduración del fruto
Julio de 2003
Octubre de 2003Invernadero 1(Avasa-Alcocebre)
Invernadero 2(Vinaroz) Julio de 2003
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosDiferenciación Diferenciación varietalvarietal en Clementinas (II)en Clementinas (II)
(Gema Ancillo, José Guerri, Luis Navarro)
Muestras del primer vivero. Julio 2003
a) Elaboración del modelo (aprendizaje del algoritmo)b) Validación del modelo con muestras ciegas
Agrupamiento génico supervisado
HH14
HH29
HH11
HH9
HH21
SS9
SS32
SS31
SS21
SS5
PREDICCIONMUESTRA
HH14
HH29
HH11
HH9
HH21
NN33
NN27
HN20
NN21
NN37
PREDICCIONMUESTRA
SS9
SS32
SS31
SS21
SS5
NN33
NN27
NN21
NN20
NN37
PREDICCIONMUESTRA
Clemenules/Hernandina Clemenules/Marisol Marisol/Hernandina
Las variedades Nules, Marisol y Hernandina pueden ser diferenciadas en base a su perfil de expresión génica utilizando modelos de agrupamiento supervisado.
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosTrabajo en cursoTrabajo en curso
Incrementar la colección de ESTs- alcanzar 20.000 unigenes a finales de 2004- aumentar la proporción de ESTs procedentes de clones de longitud completa- aislar ESTs procedentes de genes de muy baja expresión mediante el uso de
genotecas normalizadas
Caracterizar el transcriptoma de los cítricos usando el microarray de cDNA construido- experimentos de análisis del transcriptoma durante la infección por el hongo
Phytophthora, en variedades sensibles y tolerantes- experimentos de análisis del transcriptoma durante estrés salino, en variedades
sensibles y tolerantes- experimentos de análisis del transcriptoma en condiciones de deficiencia de cloruro
(hambre prolongada y hambre más aplicación de cloruro)- experimentos de análisis del transcriptoma durante la
infección por viroides (CEVd)Construcción de un microarray de segunda generación
- representando un mayor número de genes de cítricos (>15.000)
- con selección de los mejores representantes de cada contig
- con resecuenciación de una determinada proporción de los clones depositados en el chip
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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAgradecimientosAgradecimientos
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos
http://www.iata.csic.es
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas
http://www.ibmcp.upv.es
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias
http://www.ivia.es
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Desarrollo de recursos para Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: estudios genómicos en cítricos:
creación decreación deuna colección de una colección de ESTsESTs y una y una
micromatriz de micromatriz de cDNAcDNAProyecto de Genómica Funcional de Cítricos
IBMCPInstituto de Biología Molecular y
Celular de Plantashttp://www.ibmcp.upv.es
Instituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos
http://www.iata.csic.esInstituto Valenciano de
Investigaciones Agrarias http://www.ivia.es
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es
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