TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interésestructural, basados en secuencias ricas en glicinas
Laura García García
MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA
Tutores: Jesús Manuel Peregrina García y Francisco Corzana LópezFacultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Curso 2011-2012
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interés estructural, basados ensecuencias ricas en glicinas, trabajo fin de estudios
de Laura García García, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García y Francisco CorzanaLópez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA Centro de Investigación en Síntesis Química (CISQ) Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interés estructural,
basados en secuencias ricas en glicinas.
Trabajo de investigación Proyecto Fin de Máster
Laura García García Junio 2012
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CSI
A mis padres, por su cariño y apoyo en todo momento
A mi hermano, por su comprensión y su afecto
A mi novio, por su cariño y por su ánimo incondicional
A mi familia y amigos, que siempre están ahí
Apenas han pasado dos años desde que formo parte de este grupo y en
este tiempo he aprendido multitud de cosas, tanto a nivel académico como a nivel
personal, la convivencia diaria, el compañerismo y la ayuda que siempre que la he
necesitado se me ha prestado.
En primer lugar agradecer a Alberto, Pere, Héctor y Marimar los
conocimientos adquiridos durante mi primera etapa de licenciatura y su confianza
y formación en esta segunda etapa. Y especialmente a Paco, por su paciencia, su
ayuda en todo momento tanto dentro como fuera del laboratorio y por transmitir
ese entusiasmo por la Química que le hace tan especial.
Y por supuesto a todos mis compañeros, empezando por Victor S. y
Nuria que me han ayudado mucho en mi trabajo. A David e Ivan por sus risas y
buen humor. A Victor R. por su gran responsabilidad y comportamiento modelo, y
por ayudarme a quitar burbujas cuando el ultrasonidos no podía con ellas. A
Claudio e Ismael por compartir mañanas y tardes intensas de máster y de
laboratorio. Sin olvidarme de los más veteranos (Lara, Charlie, Eva y Fer) y de los
que acaban de llegar (Iris, Victor P. y Nuria). Muchas gracias chicos.
También agradecer a mis vecinos fotoquímicos Alegría, Héctor, Marina,
Pedro, Miguel Ángel, Diego y Anselmo los momentos compartidos.
Al resto de mis compañeros del máster, analítica e inorgánicos: Laura,
Rocio, Justo, Jesús y Sábel.
Sin olvidar a mis padres y a mi hermano, gracias a vosotros estoy donde
estoy y sin vuestro cariño, animo, afecto y comprensión no estaría aquí, aunque
no entendaís de química
A mi novio, por su cariño, su paciencia, y sobre todo por sus abrazos
cuando más lo he necesitado.
Por último a toda mi familia (especialmente a mi abuela) y a mis amigos,
que no han dejado de apoyarme en ningún momento.
Finalmente, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la
ayuda económica aportada a la realización de este proyecto:
Gobierno de La Rioja, por la concesión del proyecto COLABORA
2010/05.
Ministerio de Ciencia e Innovación, por la aportación económica al
proyecto CTQ2009-13814/BQU.
Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y científico
idóneo para el desarrollo de este trabajo.
ÍNDICE
Abreviaciones I
1. Introducción y objetivos 1
2. Antecedentes 13
2.1. Estructura de péptidos y glicopéptidos 18
2.2 Síntesis
2.2.1. Formación del enlace peptídico 28
2.2.2. Síntesis de péptidos en fase sólida 31
2.2.3. Formación del enlace O-glicosídico 34
2.3. Trabajos previos 38
3. Discusión de resultados 43
4. Conclusiones 61
5. Experimental 65
6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 87
I
Abreviaciones
desplazamiento químico 1H RMN resonancia magnética nuclear de protón
13C RMN resonancia magnética nuclear de carbono-13
Ac acetilo
Ac2O anhídrido acético
AcOEt acetato de etilo
Ala, A alanina
Arg, R arginina
Asp, D ácido aspártico
Bn bencilo
Boc terc-butoxicarbonilo
Boc2O di-terc-butil dicarbonato
BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris(dimetilamino)fosfonio tBu terc-butilo
BuOH butanol tBuOK terc-butóxido potásico
c concentración (g/100 mL)
col. colaboradores
COSY COrrelated SpectroscopY d doblete, día
DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida
DCM Diclorometano
dd doblete de dobletes
DIC N, N’-diisopropilcarbodiimida
DIEA diisopropiletilamina
DM dinámica molecular
DMF dimetilformamida
Et etilo
Et3N trietilamina
EtOH etanol
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo
II
GalNAc N-acetilgalactosamina
Gly, G glicina
HBTU hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-
dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio
His, H histidina
HOBt 1-hidroxibenzotriazol
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
J constante de acoplamiento
M molaridad
m multiplete
Me metilo
MeOH metanol
MeONa metóxido de sodio
MeSer metilserina
MeSer * metilserina glicosilada con α-O-GalNAc
mmol milimol
NMP N-metilpirrolidona
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
Pro, P prolina
PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris(pirrolidin)fosfonio
R sustituyente alquilo o arilo, arginina
RMN resonancia magnética nuclear
s singlete, ázucar (del inglés, sugar)
Ser, S serina
Ser* serina glicosilada α-O-GalNAc
SPPS solid-phase peptide synthesis
t triplete, tiempo
TBTU tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N´,N´-
tetrametiluronio
TFA ácido trifluoroacético
TfO triflato
THF tetrahidrofurano
TIS triisopropilsilano
Thr, T treonina
III
Thr* treonina glicosilada α-O-GalNAc
TMS trimetilsililo, tetrametilsilano
TSP Propionato de trimetilsililo
Val, V valina
1. Introducción y objetivos
3 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Actualmente se sabe que todos los seres vivos están formados por el
mismo tipo de moléculas y que éstas gobiernan cada una de sus funciones. En
este contexto, la Química ha tratado de correlacionar las funciones que realizan
las biomoléculas con su estructura. En concreto, a esta característica se la conoce
como relación estructura-actividad. Este concepto ya fue estudiado a finales del
s.XIX por Emil Fisher (1852-1919), quien propuso el famoso modelo de la llave-
cerradura en 1884 (Figura 1a). Este modelo considera que la estructura del
sustrato y del centro activo enzimático son complementarias, del mismo modo
que una llave encaja en su cerradura. Con esto, la estructura de la enzima es
rígida, es un modelo válido en muchos casos, pero no siempre es acertado.
Posteriormente, en la década de los 60, Daniel Koshland, propuso el modelo de
ajuste inducido que considera que el centro activo adopta la conformación idónea
sólo en presencia del sustrato (Figura 1b), se considera por lo tanto a la enzima
flexible y capaz de cambiar de forma al interaccionar con el sustrato adecuado.
a b
Figura 1. Modelos enzimáticos de llave-cerradura (a) y ajuste inducido (b)
4 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Por lo tanto, hoy en día, es muy importante conocer la estructura de las
biomoléculas para así poder inducir en ellas cambios estructurales que
modifiquen y mejoren sus funciones biológicas.
En este sentido, la estructura de una proteína viene definida en 4 niveles
independientes. Estos niveles son:
Estructura primaria. Corresponde a la secuencia de
aminoácidos, unidos entre sí por enlaces amida. Nos indica qué
aminoácidos forman parte de la cadena polipeptídica y el orden
en que están unidos
Figura 2. Estructura primaria de un péptido simulado
Estructura secundaria. Consiste en el plegamiento de la
cadena polipeptídica gracias a la formación de puentes de
hidrógeno entre los átomos del enlace peptídico; apareciendo
estructuras de menor energía libre, y por tanto más estables,
como hélices α y láminas β.
5 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 3. Estructuras secundarias de péptidos, a la izquierda una hélice α y la derecha
una lámina β.
Estructura terciaria. Informa sobre la disposición de la
estructura secundaria del polipéptido, al plegarse sobre sí
misma, originando una conformación globular o fibrilar.
Figura 4. Mioglobina humana, ejemplo de estructura terciaria
6 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Estructura cuaternaria. Está representada por el
acoplamiento de varias cadenas polipeptídicas iguales o
diferentes, con estructuras terciarias que quedan
autoensambladas.
Figura 5. Hemoglobina, ejemplo de estructura cuaternaria.
En la actualidad, las técnicas más utilizadas para la determinación
estructural de biomoléculas son la resonancia magnética nuclear (RMN) y la
difracción de rayos X. Si bien, esta última sólo aporta información del estado
sólido, mientras que la RMN es una técnica capaz de determinar la estructura en
disolución acuosa, reproduciendo así el medio en el que se encuentran estos
compuestos.
Los estudios estructurales de RMN en proteínas constan, en general, de
tres fases. La primera es la adquisición de espectros; la segunda consiste en la
asignación y extracción de información estructural útil y la tercera consiste en el
“modelado” de la molécula, de acuerdo con la información experimental. Estas
tres etapas no son totalmente independientes. Así, a veces puede ser necesario
realizar cálculos preliminares para ayudar en la asignación, o adquirir
7 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
experimentos en diferentes condiciones para discernir alguna restricción que
puede resultar clave en el cálculo de la/s estructura/s.
Las principales fuentes de información estructural de las que se dispone con la
técnica de RMN1 son las medidas de efecto nuclear Overhauser (NOE), las
constantes de acoplamiento escalar (3J), tanto homo- como heteronucleares, y los
desplazamientos químicos (δ) homo- y heteronucleares. Todos estos parámetros
están promediados para todas las posibles conformaciones presentes en
disolución.
Si nos centramos en los desplazamientos químicos, pese a que son
fácilmente asequibles, su relación con la estructura tridimensional es compleja, ya
que sus valores son afectados por muchos factores como son las corrientes de
anillo, efectos electrostáticos y anisotropía de enlace, entre otros. Por tanto, su
uso en determinación estructural de biomoléculas ha sido, hasta ahora, muy
limitado, y se han aplicado principalmente al estudio de proteínas. En este
sentido, los desplazamientos químicos de los aminoácidos proteicos comunes,
formando parte de pequeños péptidos sin estructura (random coil), son la
referencia básica para el análisis de las proteínas.
1 (a) Neuhaus, D.; Williamson, M. P. “The Nuclear Overhauser Effect in Structural and
Conformational Analysis”, VCH Publishers, New York, 1989. (b) Wijmenga, S. S.; Mooren, M. M. W.; Hilbers, C. W. “NMR in Macromolecules”, 1993, G. C. Robert, IRL, Press, Oxford. (c) Case, D. A.; Dyson, A. J.; Wright, P. E. “Methods in enzymology”,1994, 239C, 392-416. (d) Seip, S.; Balbach, J.; Kessler, H. J. Magn. Reson. B. 1994, 104, 172-179. (e) Haselhorst, T.; Weimar, T.; Peters, T. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10705-10714. (f) Dyson, H. J.; Wright, P. E. Annu. Rev. Biophys. Chem. 1991, 20, 519-538. (g) Marco, A.; Llinas, M.; Wuthrich, K. Biopolymers. 1978, 17, 617-636. (h) Vuister, G. W.; Bax, A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7772-7777.
8 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La identificación de una conformación preferente en un péptido (estructuras
secundarias fundamentalmente) a partir de los desplazamientos químicos se basa
en la existencia de una diferencia apreciable entre los desplazamientos químicos
observados de cada uno de los aminoácidos en el péptido investigado y los de un
péptido de referencia sin estructura (random coil):
Δδ = (δ - δR) ppm.
Este concepto recibe el nombre de “índice de desplazamiento químico”
abreviado como CSI (las siglas de Chemical Shift Index).2
Este índice nos permite la identificación de estructuras secundarias en
péptidos teniendo en cuenta el desplazamiento químico de distintos núcleos
(1Hα, 13Cα) del esqueleto peptídico, comparándolos con los valores de referencia.
(Figura 2).
2 3. (a) Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. J. Mol. Biol. 1991, 222, 311-333. (b)
Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. Biochemistry 1992, 31, 1647-1651. (c) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1994, 4, 171-180. (d) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. Methods in Enzymol. 1994, 239, 363-392. (e) Wishart, D. S.; Bigam, C. G.; Holm, A.; Hodges, R. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1995, 5, 67-81. (f) Ösapay, K.; Case, D. A. J. Biomol. NMR 1994, 4, 215-230. (g) Wishart, D. S.; Nip, A. M. Biochem. Cell Biol. 1998, 76, 153-163. (h) Schwarzinger, S.; Kroon, G. J. A.; Foss, T. R.; Wright, P. E.; Dyson, H. J. J. Biomol. NMR. 2000, 18, 43-48. (i) Wishart D. S.; Case D. A. Meth. Enzymol. 2001, 338, 3-34. (j) Schwarzinger, S.; Kroon, G. J. A.; Foss, T. R.; Chung, J.; Wright, P. E.; Dyson, H. J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2970-2978. (k) Mielke, S. P.; Krishnan, V. V. J. Biomol. NMR. 2004, 30, 143–153. (l) Dyson, J. H.; Wright, P. E. Chem. Rev. 2004, 104, 3607-3622. (m) Dyson, J. H.; Wright, P. E. Methods Enzymol. 2005, 394, 299-321. (n) Avbelj, F.; Kocjan, D.; Baldwin, R. L. PNAS 2004, 101, 17394-17397. (o) Montgomerie, S.; Sundararaj, S.; Gallin, W. J.; Wishart, D. S. BMC Bioinformatics. 2006, 7, 301-314. (p) Carlisle, E. A.; Holder, J. L.; Maranda, A. M.; De Alwis, A. R.; Selkie, E. L.; McKay, S. L. Biopolymers. 2007, 85, 72-80.
9 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 6. Estructura del aminoácido serina en el que se han etiquetado
algunos átomos relevantes de este trabajo
Los pentapéptidos en forma de diamidas Ac-Gly-Gly-Xxx-Gly-Gly-NH2,
donde Xxx representa a cada uno de los 20 aminoácido protéicos, se han
propuesto como las mejores referencias por no estar influenciados por los grupos
carboxilo- o amino-terminales. Análisis estadísticos de los desplazamientos
químicos de 1H, 13C y 15N tanto de los péptidos referencia anteriores como del
gran número de proteínas asignadas en los últimos años han puesto de manifiesto
la existencia de una correlación entre el tipo de estructura secundaria (hélice α o
lámina β) y Δδ. Esta correlación permite identificar elementos de estructura
secundaria de una proteína. Por ejemplo, uno de los resultados más interesantes
que surgen de estos trabajos es el hallazgo de que los 20 aminoácidos naturales
experimentan un ΔδHα aproximado de 0.39 ppm hacia campos más altos cuando
se encuentran en conformación helicoidal. De la misma manera, se encuentra
ΔδHα químico promedio de 0.37 ppm hacia campos más bajos cuando el residuo
se dispone en conformación extendida. También se observan cambios similares
para desplazamientos químicos de 13C y 15N.
En la figura 3 se muestra la representación gráfica del CSI de un péptido
simulado con distintas estructuras secundarias, donde las hélices-α tienen valores
de CSI negativos y las láminas-β tienen valores positivos.
10 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 7. Representación del valor CSI de disitintos residuos de un péptido con la correspondiente
estructura secundaria (valores positivos dan láminas-β y valores negativos dan hélices-α)
Es importante resaltar que no existen estudios exhaustivos al respecto
para el caso de péptidos con aminoácidos no naturales, como por ejemplo los
que incorporan aminoácidos cuaternarios en sus estructuras y mucho menos para
el caso de glicopéptidos. Es más, en la bibliografía científica se han publicado
trabajos donde se aplica el protocolo de las proteínas a las glicoproteínas, con el
correspondiente error que ello conlleva. Ya que la presencia del carbohidrato
puede afectar al desplazamiento químico, por lo que es necesario profundizar en
el estudio de RMN de glicopéptidos.
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-0.2
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CSI
11 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo del presente trabajo es la
síntesis de los tres glicopéptidos (compuestos 1, 2 y 3) representados en la figura
4 con secuencias ricas en glicinas. Con el fin de establecerlos como glicopéptidos
de referencia para la identificación de una estructura preferente en
glicoproteínas. De esta forma obtendremos los CSI de los glicosilaminoácidos
derivados de α-GalNAc, los cuales aparecen en un gran número de glicoproteínas
con interesantes propiedades biológicas, como son las mucinas y las proteínas
anticongelantes. Adicionalmente, con fines comparativos, se sintetizaron y
estudiaron también los péptidos análogos sin glicosilar (compuestos 1´, 2´ y 3´).
12 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 8. Glicopéptidos y péptidos objeto de síntesis y estudio (* = α-O-GalNAc).
2. Antecedentes
15 ANTECEDENTES
En el presente capítulo se describe la importancia de los glicopéptidos en
los procesos biológicos y su importancia estructural así como las técnicas para su
elucidación estructural y los procedimientos sintéticos más habituales para la
formación de enlaces peptídicos y glicosídicos, algunos de los cuales han sido
empleados para la obtención de los glicopéptidos objetivo de este trabajo.
Además se recoge una breve explicación de la síntesis en fase sólida, así como de
los trabajos previos y conclusiones importantes en este campo.
De entre todas las biomoléculas conocidas, las glicoproteínas son
compuestos de suma importancia biológica, están formadas por una parte
peptídica unida a un carbohidrato de naturaleza simple o compleja, mediante un
enlace denominado glicosídico.1
Figura 1. Glicoproteina MUC 1, donde la cadena peptídica se encuenta glicosilada en el
fragmento PDTR.
1 (a) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol.
Biol. 1998, 33, 151–208. (b) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683–720. (c) Angata, T.; Varki, A. Chem. Rev. 2002, 102, 439–470. (d) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317–11362. (e) Helzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495–4537. (f) Nicolaou, K. C.; Mitchell, H. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 1576–1624. (g) Pratt, M. R.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58–68. (h) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97–130.
16 ANTECEDENTES.
Existen numerosos tipos de glicoproteínas importantes, entre ellas están
las glicoproteínas anticongelantes,2 que permiten sobrevivir a temperaturas muy
bajas a muchos animales que habitan en aguas polares, ya que dichas proteínas
evitan la congelación de los fluidos de estos organismos inhibiendo el crecimiento
de cristales de hielo en su interior. Estas proteínas están siendo muy estudiadas
ya que tienen aplicaciones muy importantes, como es la mejor conservación de
células, tejidos,2c alimentos2d e incluso la destrucción de tumores.2e
Otras de las glicoproteínas de suma importancia son las mucinas, las
cuales están involucradas en diversos procesos biológicos,3 como la inflamación,
la respuesta inmunológica, la comunicación célula-célula, el crecimiento celular, la
adherencia celular y la actividad anticongelante, entre otros. Además, las mucinas
son moléculas de gran interés desde el punto de vista terapéutico,4 especialmente
en el desarrollo de vacunas para el tratamiento del cáncer.5
2 a) Chen, L.; Devries, A. L.; Cheng, C.-H. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 3817-3822; b) Tsvetkova, N. M.; Phillips, B. L.; Krishnan, V. V.; Feeney, R. E.; Fink, W. H.; Crowe, J. H.; Risbud, S. H.; Tablin, F.; Yeh, Y. Biophys. J. 2002, 82, 464-473; c)F. Tablin, A. E. Oliver, N. J. Walker, L. M. Crowe, J. H. Crowe,J. Cell Physiol. 1996, 168, 305–313; d)J. H. Wang, Cryobiology 2000, 41, 1–9; e) R. E. Feeney, Y. Yeh, Trends Food Sci. Technol. 1998, 9, 102–106; f)Y. Tachibana, G. L. Fletcher, N. Fujitani, S. Tsuda, K. Monde,S. I. Nishimura, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 856–862.3 a) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683-720; b) Sears, P.; Wong, C.-H. Cell. Mol. Life Sci. 1998, 54, 223-252. 4 a) Davis, B. G. Chem. Rev. 2002, 102, 579-601; b) Watt, G. M.; Lund, J.; Levens, M.; Kolli, V. S. K.; Jefferis, R.; Boons, G.-J. Chem. Biol. 2003, 10, 807-814; c) Lui, H.; Wang, L.; Brock, A.; Wong, C.-H.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1702-1703; d) Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 116, 827-833; e) Davis, B. G. Science 2004, 303, 480-482. 5 a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200-205; b) Moingeon, P. Vaccine 2001, 19, 1305-1326; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 836-863; d) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054; e) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7630-7635; f) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Glycobiology 2006, 16, 113R-136R; g) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nature Rev. 2005, 4, 477-488; h) Hollingsworth, M. A.; Swanson, B. J. Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 45-60; i) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; j) Kim, Y. J.; Varki, A. Glycoconjugate J. 1997, 14, 569-576; k) Trap, M. A.; Clausen H. Biochim. Biophys. Acta 2008, 1780, 546-563.
17 ANTECEDENTES
Atendiendo a la naturaleza del enlace glicosídico, tenemos dos grandes
grupos de glicoproteínas (figura 2):
N-Glicoproteínas: En ellas, el carbohidrato se
encuentra unido mediante un enlace N-glicosídico a un residuo
de asparragina (Asn) de la cadena peptídica.
O-Glicoproteínas: El carbohidrato se une al resto
peptídico mediante un enlace O-glicosídico con el grupo
hidroxilo de la serina (Ser) o de la treonina (Thr) de la cadena
peptídica.
Figura 2 Tipos principales de glicosilación atendiendo a su naturaleza.
Por otro lado, atendiendo a la disposición espacial del enlace glicosídico,
éste puede ser de tipo α ó β; según el enlace se encuentre en axial (α) o en
ecuatorial (β) del carbohidrato (Figura 3).
18 ANTECEDENTES.
Figura 3. Aminoácidos Ser/Thr glicosilados con N-acetilgalactosamina (GalNAc) y glucosa
(Glc) mediante un enlace α-O-glicosídico y β-O.glicosídico, respectivamente
ESTRUCTURA DE PÉPTIDOS Y GLICOPÉPTIDOS .
La actividad biológica que presentan los péptidos y proteínas está
estrechamente relacionada con su estructura tridimensional, de hecho, la
estructura terciaria de una proteína puede definirse como la conformación
tridimensional biológicamente activa. En este sentido, un péptido o proteína sólo
puede asumir un número limitado de conformaciones a pesar de que cada uno de
los residuos que componen la cadena puede adoptar, por separado, varias
conformaciones posibles.
La conformación de cada residuo es función de una serie de ángulos de
torsión. Para poder conocer la estructura de un péptido o glicopéptido es
importante conocer los ángulos diedros que son relevantes desde el punto de
vista conformacional. Así, el carbono α del aminoácido va a actuar como pivote
que conecta dos planos contiguos, teniendo cada plano la posibilidad de rotación
alrededor del enlace que lo conecta con el carbono α. El ángulo de rotación del
enlace entre el Cα y el NH se denomina , mientras que el ángulo de rotación en
torno al enlace Cα y el C=O se denomina (Figura 4).
19 ANTECEDENTES
Figura 4. Ángulos / que definen la conformación del esqueleto peptídico.
Existe un gran número de combinaciones para los valores que
pueden tomar los ángulos y , sin embargo, sólo algunas de ellas van a dar lugar
a conformaciones energéticamente favorables. En este sentido, el bioquímico G.
N. Ramachandran ideó un gráfico bidimensional para representar la conformación
de una cadena polipeptídica de una manera más intuitiva.6 En dicho gráfico se
representan los valores de los ángulos diedros y de cada uno de los residuos
que componen la cadena peptídica. En el de la figura 5 se muestra la
representación de varias conformaciones consideradas plegadas, como la hélice
α, tanto levógira como dextrógira, así como las conformaciones extendidas,
fundamentalmente láminas β y la hélice denominada poliprolina de tipo II (PPII).
Esta última, a pesar de ser una hélice, se considera extendida debido que se
asemeja a un muelle muy extendido.
6 Ramachandran, G. N.; Sasisekharan, V. Adv. Prot. Res. 1968, 23, 283-438.
20 ANTECEDENTES.
Figura 5. Diagrama de Ramachandran donde se representan las
conformaciones más habituales para los péptidos.
Este tipo de conformaciones suelen estar conectadas entre sí mediante
secuencias pequeñas de aminoácidos que a su vez muestran unas conformaciones
determinadas, denominadas giros. En función de los valores de los ángulos
diedros y de cada uno de los aminoácidos que comparten el giro, éstos se
clasifican en distintos tipos, denominados giros α, β, ɣ y fundamentalmente, si
bien los más importantes suelen ser los giros de tipo β.
hélice (levógira)
hélice (dextrógira)
Lamina β
PP II
Conformaciones extendidas
Conformaciones plegadas
21 ANTECEDENTES
Figura 6. Ejemplos de estructuras de proteínas donde aparecen Hélices α y láminas beta
conectadas mediante giros.
Por otro lado, otro factor que también va a influir en la conformación de
cada residuo y por tanto en la de los péptidos o glicopéptidos de los que forme
parte, es la disposición espacial de la cadena lateral.7 Para la cadena lateral se
define el ángulo de rotación alrededor del enlace Cα-Cβ, tal como se muestra
en la figura 7.
Figura 7. Ángulo que define la conformación de la cadena lateral.
7 (a) Hruby, V. J.; Li, G.; Haskell- Luevano, C.; Shenderovich, M. Pept. Sci. 1997, 43, 219-266; (b) Hruby, V. J.; Cowell, S. M.; Lee, Y. S.; Cain, J. P. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 2785-2789.
Hélice α Lámina β (en amarillo)
Giro
22 ANTECEDENTES.
Por último, para el caso de los glicopéptidos existe un factor
adicional a tener en cuenta. Es la disposición espacial del carbohidrato, que va a
venir dada por los dos ángulos diedros. El ángulo diedro alrededor del enlace
entre el Cβ del péptido y el O del enlace glicosídico se denomina , mientras que
el diedro entre el O del enlace glicosídico y el C anomérico del carbohidrato se
denomina (figura 8). Para no confundirlos con los ángulos diedros que definen la
conformación del esqueleto peptídico, a partir de ahora se denominarán s y s,
donde la letra ‘s’ hace referencia a sugar, y los de la parte peptídica serán p y p,
donde la letra ´p´ hace referencia a peptide.
En general s, es un enlace rígico, débil al efecto exo-anomérico. Así para
enlaces glicosídicos α toma un valor próximo a 80o, mientras que para enlaces β el
valor es próximo a -80o. Por otro lado, s suele tomar, en general, valores
próximos a 180o.
Figura 8. Ángulos s/s que definen la conformación del enlace glicosídico.
Por tanto, en resumen, se puede concluir diciendo que la estructura
secundaria de péptidos y glicopéptidos es función, en último término, de los
valores de los ángulos diedros p, p, 1, s y s.
Para conocer estos valores de los ángulos diedros p, p, 1, s y s de
los péptidos y glicopéptidos y poder determinar su estructura existen varias
23 ANTECEDENTES
técnicas. En el caso del estudio en estado sólido, la técnica más potente es la
difracción de rayos X, mientras que para el estudio en disolución, la técnica más
empleada es, además de la espectroscopia de infrarrojo o el dicroísmo circular, la
resonancia magnética nuclear (RMN), complementada con cálculos teóricos como
la dinámica molecular.
Técnicas de información estructural basadas en RMN
Las principales fuentes de información estructural de las que disponemos
con la técnica de RMN son las medidas del efecto nuclear Overhauser (NOE),8 las
constantes de acoplamiento escalar (3J), tanto homo- como heteronucleares,9 y
los desplazamientos químicos (δ) homo- y heteronucleares.10 Todos estos
parámetros están promediados para todas las posibles conformaciones presentes
en disolución.
Efecto NOE
La principal fuente de información estructural viene dada por el
denominado efecto NOE.94 El efecto NOE es el resultado del cambio observable de
la intensidad de la señal de resonancia de un núcleo debido a la transferencia de
la magnetización, a través del espacio, de un spin a otro. Es una interacción
dipolo-dipolo y como tal, depende de la distancia (r-6). La intensidad del NOE entre
dos protones está relacionada con la distancia promedio que los separa. En
general, los protones situados a más de 5 Å de distancia proporcionan una señal
demasiado débil para ser observada.
8 Neuhaus, D.; Williamson, M. P. “The Nuclear Overhauser Effect in Structural and Conformational Analysis”, VCH Publishers, New York, 1989. 9 (a) Wijmenga, S. S.; Mooren, M. M. W.; Hilbers, C. W. “NMR in Macromolecules”. 1993, G. C. Robert, IRL, Press, Oxford; (b) Case, D. A.; Dyson, A. J.; Wright, P. E. “Methods in enzymology”. 1994, 239C, 392-416; (c) Seip, S.; Balbach, J.; Kessler, H. J. Magn. Reson. B. 1994, 104, 172-179. 10 (a) Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. Biochemistry. 1992, 31, 1647-1651; (b) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1994, 4, 171-180.
24 ANTECEDENTES.
Existen algunos patrones NOE característicos como son los patrones NOE
secuenciales, es decir NOEs de protones de aminoácidos unidos directamente en
la secuencia peptídica, que son claves en el estudio estructural de péptidos y
proteínas.
Constantes de acoplamiento
Las constantes más fáciles de obtener son las constantes entre protones
vecinales conectados por tres enlaces (3J). Estas constantes están relacionadas
con los correspondientes ángulos diedros de torsión a través de las ecuaciones de
Karplus,11 donde los valores de las constantes se ajustan empíricamente a cada
caso particular. En el caso de las proteínas, las constantes 3JNH,Hα dan información
acerca de la conformación del esqueleto peptídico (ángulo diedro p), mientras
que las constantes 3JHα,Hβ están relacionadas con la conformación de la cadena
lateral (ángulo 1).
Figura 9. Relación entre constantes de acoplamiento
3JH,H y ángulos diedros.
11 (a) Marco, A.; Llinas, M.; Wuthrich, K. Biopolymers. 1978, 17, 617-636; (b) Vuister, G. W.; Bax, A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7772-7777.
25 ANTECEDENTES
Desplazamientos químicos
Los desplazamientos químicos de 1Hα Y 13Cα de los aminoácidos proteicos
comunes, cuando forman parte de pequeños péptidos cuya cadena polipeptíditca
no muestra estructura (random coil), son la referencia básica para cualquier
análisis espectroscópico de las proteínas. La identificación de la presencia de una
conformación preferente en un péptido a partir de los desplazamientos químicos
se basa en la existencia de una diferencia apreciable entre los desplazamientos
químicos observados de cada uno de los aminoácidos en el péptido investigado y
los de un péptido de referencia sin estructura (random coil): = (ref) ppm.
Este concepto recibe el nombre de “índice de desplazamiento químico”
abreviado como CSI (del inglés Chemical Shift Index)12 como ya se ha mencionado
en la introducción.
Finalmente, es importante señalar que el análisis de moléculas pequeñas
basado en el efecto NOE13 y en las constantes de acoplamiento escalar (J)14 es a
menudo insuficiente para determinar las preferencias conformacionales de estas
moléculas. Además, la RMN falla a la hora de describir las propiedades dinámicas,
entre las que destacan las interacciones con el agua. Así, en este caso es necesaria
la utilización de cálculos computacionales para explicar correctamente los datos
experimentales provenientes de RMN. En este sentido, la dinámica molecular
(DM) permite introducir flexibilidad a la hora de interpretar los datos
experimentales, por lo que ha sido empleada con éxito en numerosos estudios
conformacionales.15
12 (a) Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. Biochemistry. 1992, 31, 1647-1651; (b) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1994, 4, 171-180. 13 Kroonbatenburg, L. M. J.; Kroon, J.; Leeflang, B. R.; Vliegenthart, J. F. G. Carbohydr. Res. 1993, 245, 21-42. 14 Bose, B.; Zhao, S.; Stenutz, R.; Cloran, F.; Bondo, P. B.; Bondo, G.; Hertz, B.; Carmichael, I.; Serianni, A. S. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11158-11173. 15 Adcock S.A.; McCammon, J. A. Chem. Rev. 2006, 106, 1589-1615.
26 ANTECEDENTES.
Estudios de dinámica molecular (DM)
La DM es una herramienta para el estudio teórico de propiedades
dinámicas de las moléculas que ha tenido un gran desarrollo en el ámbito de las
biomoléculas a partir de los años 80. Al igual que en mecánica molecular (MM),
está basada en las ecuaciones de la mecánica clásica por lo que los átomos se
consideran esferas rígidas con una carga puntual centrada y los enlaces como
muelles. De esta forma, el orden de enlace está relacionado con una constante
elástica (figura 9).16
Figura 10. En MM y DM los átomos son considerados como esferas y los enlaces como
muelles.
El aspecto más importante de la DM es el campo de fuerzas (force field en
inglés). Está formado por las ecuaciones matemáticas que describen la energía
potencial (E) del sistema en función de las coordenadas atómicas y por un
16 (a) Machida K. “Principles of Molecular Mechanics”, Kodansha/John Wiley & Sons, Tokyo/New York, 1999; (b) Haile, J. M. “Molecular Dynamics Simulation” , John Wiley and Sons, New York, 1992; (c) Alexander, D.; Mackerell, J. R. J. Comput. Chem. 2004, 25, 1584-1604.
27 ANTECEDENTES
conjunto de parámetros necesarios para describir de forma correcta dicha energía
(figura 10). Los parámetros se obtienen de datos experimentales (rayos X, IR, etc.)
o bien de cálculos ab initio.
Figura 11. Ecuación general de un campo de fuerzas donde se desglosan los distintos
términos que contribuyen a la energía potencial.
Para mejorar los resultados obtenidos con este método se combina la
RMN con los cálculos de DM, introduciéndose como restricciones los datos
experimentales disponibles de RMN
28 ANTECEDENTES.
SÍNTESIS
Formación del enlace peptídico.
El enlace peptídico se forma a partir de los grupos amina y ácido
carboxílico de los aminoácidos. Para que se dé este enlace, se necesita activar
previamente el grupo carboxilo para hacerlo más electrófilo frente al ataque
nucleófilo de la amina. 17
Para lograr dicha activación, se suelen utilizar agentes de acoplamiento,
siendo las carbodiimidas los más empleados en la síntesis de péptidos
convencional. Concretamente la N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC) fue la
primera descrita y todavía hoy sigue siendo la más popular. Sin embargo, uno de
los problemas asociados a su uso es la alta epimerización. Otra de las
carbodiimidas más empleadas es la N,N´-diisopropilcarbodiimida (DIC), debido a la
gran solubilidad de las ureas que se forman como subproductos. Cuando se
emplean las carbodiimidas como agentes de acoplamiento, se recomienda el
empleo de aditivos como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt),18 que aceleran la
reacción y reducen el riesgo de racemización. En la figura 11 se muestran las
estructuras de estos compuestos.
Figura 12. Estructura de las carbodiimidas y aditivos utilizados en la síntesis de péptidos.
17
Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537. 18
Konig, W.; Geiger, R. Chem. Ber. 1970, 103, 788-798.
29 ANTECEDENTES
En los últimos años, han surgido nuevos reactivos que funcionan como
agentes de acoplamiento y que minimizan la formación de subproductos no
deseados a la vez que reducen los tiempos de reacción, lo que hace que su
utilización se haya extendido considerablemente (Figura 12).
Figura 13. Estructura de algunas sales de fosfonio (BOP,PyBOP) y sales de uronio (HBTU,
TBTU) utilizadas como agentes de acoplamiento
La mayoría son sales de fosfonio o uronio que, en presencia de una base,
pueden convertir el carboxilato del aminoácido protegido en una especie
activada. Las más empleadas son el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris (dimetilamino)fosfonio (BOP) y el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il- N-
oxil-tris(pirrolidin)fosfonio (PyBOP),19 derivadas del HOBt. Entre las sales de
uronio se encuentran el hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-
19 Martínez, J.; Bali, J. P.; Rodríguez, M.; Castro, B.; Magous, R.; Laur, J.; Lignon, M. F. J. Med. Chem. 1985, 28, 1874-1879.
30 ANTECEDENTES.
dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio (HBTU)20 y el tetrafluoroborato de N-
óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio
(TBTU)21 entre los más comunes.
Esta metología, basada en los agentes de acoplamiento, ha sido muy
utilizada por nuestro grupo de investigación, en particular el empleo de TBTU y
HBTU, ya que se obtienen buenos rendimientos, especialmente cuando se
intentan acoplar aminoácidos que presentan Cα cuaternarios y por tanto
impedidos estéricamente. Por ello, es el procedimiento que se empleará en este
estudio para la formación del enlace peptídico (Esquema 1).
Esquema 1.
20 Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth, W.; Gillessen, D. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930. 21 Poulain, R. F.; Tartar, A. L.; Deprez, B. P. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1495-1498.
31 ANTECEDENTES
Otro factor que se debe tener en cuenta para la formación del enlace
peptídico es que, tanto la cadena peptídica creciente, como el aminoácido que se
desea incorporar a la misma son compuestos bifuncionales que posen un grupo
ácido y un grupo amino en sus extremos. Para asegurarnos de la formación del
enlace amida entre los grupos deseados, y evitar reacciones laterales y
polimerizaciones incontroladas, debemos bloquear o proteger convenientemente
la amina y el carboxilato que no deseamos que reaccionen. De este modo, en la
construcción de la cadena peptídica, se deben ir alternando pasos de protección,
formación de enlaces amida y desprotección, para liberar los grupos reactivos que
van a participar en la formación del siguiente enlace.
Los grupos protectores de aminas más empleados suelen ser el 9-
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), sensible al medio básico o el terc-butoxicarbonil
(Boc), sensible al medio ácido, estos grupos dan lugar a carbamatos , fácilmente
eliminables cuando no son necesarios. Los grupos ácidos carboxílicos se protegen
comúnmente en forma de ésteres: terc-butílico (CO2tBu), alílico (CO2Allyl) ó
bencílico (CO2Bn), entre otros ejemplos.
Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, Solid-phase peptide synthesis)
En este trabajo la síntesis de péptidos se lleva a cabo en fase sólida (SPPS),
por lo que es importante hacer una breve introducción de la misma y ver qué
ventajas presenta sobre la síntesis clásica de péptidos (en disolución).
Cuando Bruce Merrifield se introdujo en el área de síntesis de péptidos, se
dio cuenta de lo extenuante y largo que significaba obtener el producto deseado,
por lo que imaginó que este proceso podría simplificarse. Así en 1963, describió
por primera vez la idea de una síntesis de péptidos en fase sólida22 (en inglés,
SPPS: solid-phase peptide synthesis) que actualmente es la manera más habitual y
sencilla de obtener péptidos. Este método se basa en la unión del aminoácido a
través del grupo carboxilo terminal a un soporte insoluble (denominado resina),
con lo cual la cadena peptídica iría creciendo anclada al soporte sólido mediante
22
Merrifield, R.B. J.Am.Chem.Soc.1963, 85, 2149-2154
32 ANTECEDENTES.
una estrategia de elongación secuencial, aminoácido tras aminoácido. Finalmente,
el producto deseado es desprendido del soporte, y su purificación y
caracterización se llevan a cabo en disolución. Esto permite que haya una rápida
filtración y lavados para deshacerse de reactivos y subproductos después de cada
etapa de síntesis, en consecuencia no habrá que purificar el producto intermedio.
El método de síntesis de péptidos en fase sólida presenta numerosas ventajas
respecto a la síntesis peptídica en disolución:
Buenos rendimientos ya que, debido a la fijación del péptido
al soporte sólido, se pueden emplear excesos de reactivos
que se eliminan fácilmente tras sencillos y rápidos procesos
de filtración y lavado. No se producen pérdidas de péptido
ya que éste está anclado al soporte sólido.
Las operaciones de lavado y filtrado son más sencillas y
susceptibles de automatización.
No hace falta purificar los productos intermedios, esto se
traduce en una reducción de tiempo y en un aumento de la
producción.
El crecimiento de la cadena peptídica siempre se da por el extremo amino
terminal mediante la adición sucesiva de aminoácidos que tienen el grupo ácido
libre, mientras que el extremo amino y las cadenas laterales están
convenientemente protegidos.
En función de los grupos protectores empleados, existen distintas
estrategias de trabajo; en este caso se ha empleado la conocida como Fmoc/tBu
que emplea el Fmoc como grupo protector temporal del grupo amino y grupos de
tipo terc-butil para la protección de las cadenas laterales de los aminoácidos.
La cadena peptídica se sintetiza sobre un soporte polimérico insoluble
(resina) por la unión del aminoácido C-terminal. El crecimiento de la cadena tiene
lugar desde el extremo carboxilo hacia el extremo amino del péptido. El conector
33 ANTECEDENTES
entre el soporte sólido polimérico y el primer aminoácido variará dependiendo del
tipo de péptido que se desee obtener (carboxilo, amida, aldehído, etc.).
Las etapas que se llevan a cabo en la síntesis en fase sólida son las
siguientes: desprotección de la resina para que quede libre el extremo amino y
pueda unirse el primer aminoácido mediante el grupo carboxilo, el extremo amino
está convenientemente protegido con Fmoc, a continuación el Fmoc se elimina
antes de la unión del siguiente aminoácido. La eliminación del Fmoc se realiza en
medio básico, con piperidina. Una vez que el grupo amino se encuentra libre, se
une al aminoácido siguiente, previa activación, al aminoácido anterior formando
el enlace peptídico. El proceso de acoplamiento requiere la activación del grupo
carboxilo del aminoácido entrante de modo que éste sea susceptible de
reaccionar con el grupo amino de la cadena de péptido creciente. Este proceso de
desprotección y acoplamiento se repite tantas veces como sea necesario hasta
completar la secuencia del péptido deseado. Una vez sintetizada la cadena
peptídica, ésta se separa del soporte polimérico y se eliminan los grupos
protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos, habitualmente en una
única etapa.
En el siguiente esquema se muestra una visión general de cómo es la
secuencia de reacciones que tienen lugar desde que se introduce la resina al
sintetizador junto con los aminoácidos hasta la obtención del péptido.
34 ANTECEDENTES.
Esquema 2- Etapas llevadas a cabo en SPPS para la obtención de un dipéptido.
Formación del enlace O-glicosídico
En las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran unidos a las
cadenas peptídicas mediante enlaces denominados glicosídicos.
En la formación de un enlace O-glicosídico pueden obtenerse dos
estereoisómeros distintos: los anómeros α y β. En general, para una silla 4C1,
35 ANTECEDENTES
presente en la mayor parte de los monosacáridos, el enlace α tiene el grupo OR
en axial, mientras que el enlace β-O-glicosídico tiene el grupo OR en posición
ecuatorial (Figura 13).
Figura 13. Anómeros y para un enlace O-glicosídico, en una silla 4C1.
El enlace O-glicosídico entre el GalNAc y el grupo hidroxilo de la L-serina o
la L-treonina muestra generalmente una configuración α. En la bibliografía ya se
han publicado varias revisiones acerca de la formación de enlaces O-
glicosídicos.1,23
A continuación, se describen algunas de las metodologías más habituales
para la formación del enlace α-O-glicosídico, con GalNAc.
Método del tricloroacetimidato
Uno de los métodos para obtener mayoritariamente el anómero α es el
desarrollado por Wong y colaboradores,24 utilizando el tricloroacetimidato como
activador para la glicosilación de un derivado de treonina. Con esta metodología
se forma el enlace -O-glicosídico en dos pasos, mejorando el rendimiento global
23
a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362; b) Boons, G. –J. Tetrahedron 1996, 52, 1095-1121; c) Davis, B. G. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000, 2137-2160; d) Arsequell, G.; Valencia, G. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 2839-2876; e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; f) Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4538. 24 Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y-Y.; Case D.A.; Wong C-H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 13527-13536.
36 ANTECEDENTES.
y obteniendo los anómeros y en proporción 2:1, respectivamente
(Esquema 3).
Esquema 3
Otro ejemplo en el que se obtiene mayoritariamente el anómero α a
partir de tricloroacetimidatos es el realizado por Toyokuni y col., para la serina
debidamente protegida, donde la mezcla de anómeros se separa por
cromatografía flash (esquema 4).25
Esquema 4
25 Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673-2676.
37 ANTECEDENTES
Metodología de Schmidt
Otra de las metodologías más conocidas para la obtención del enlace α-O-
glicosídico con GalNAc es la metodología de Schmidt.26,27
Este método se basa en una adición de tipo Michael, en medio básico, por
parte del grupo alcohol de serina o treonina al 2-nitro-D-galactal adecuadamente
protegido, formándose los correspondientes productos de glicosilación (esquema
5).
Esquema 5
En general, este método permite obtener mayoritariamente el anómero
, si bien, el control de la selectividad depende de la base empleada. Así, se
obtiene una alta selectividad con bases fuertes como tBuOK, mientras que las
bases tipo amina, como Et3N, favorecen la formación del anómero
Metodología de Koenigs-Knorr
El método Koenigs-Knorr es uno de los procedimientos más antiguos y
sencillos de glicosilación.28 Se basa en el empleo de haluros derivados de
26
Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609-1613. 27
Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706-707. 28
Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981.
38 ANTECEDENTES.
carbohidratos, como grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo
aceptor. Un ejemplo de glicosilación α, mediante la metodología Koenigs-Knorr,
es el utilizado por Liebe y Kunz en la síntesis de un antígeno asociado a tumores
(esquema 6).29
Esquema 6
Este es el procedimiento experimental que se ha empleado en el presente
trabajo para la síntesis de los building blocks que aparecen en los compuestos
sintetizados.
TRABAJOS PREVIOS
Como se ha comentado anteriormente, los parámetros más accesibles y
fácilmente medibles en RMN son los desplazamientos químicos.
Cómo se ha mostrado en numerosas revisiones,30 existen numerosos
métodos (empíricos, mecano-cuánticos, tablas de desplazamiento químico,
compuestos de referencia, gráficas de referencia…) para el análisis de casos por
RMN. Con todo este abanico de opciones no existe dificultad a la hora de elegir un
método para un caso determinado, pero sí existe dificultad en seleccionar el
correcto.
29 Liebe, B; Kunz, H. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621. 30
a) Wishart, D.S; Skyes,B.D. Methods. Enzymol. 1994, 239, 363-392; b) Old field, E. J Biomol. NMR. 1995, 5, 217-225. c) Williamson, M.P; Asakamura, T. Methods Mol. Biol, 1997, 60, 53-59.
39 ANTECEDENTES
En la literatura existen 2 tipos de tablas de desplazamientos químicos de
aminoácidos: las tablas estadísticas y las tablas experimentales. En general las
tablas experimentales son más fiables que las anteriores.
En este sentido, es importante señalar que es fundamental controlar
tanto la temperatura como el pH a la hora de determinar el desplazamiento
químico de un Aa, especialmente para aquellos casos en los que los aminoácidos
poseen grupos funcionales cargados. Además, es necesario utilizar un compuesto
como referencia externa, siendo el más empleado el propionato de trimetilsililo
(TSP).
En la siguiente tabla se muestra el trabajo desarrollado por Wishart y
colaboradores, 31 donde aparecen los desplazamientos químicos de 1Hα Y 13Cα de
los 20 aminoácidos proteicos cuando forman parte de pequeños péptidos sin
estructura definida (“random coil”) a pH= 5 y 25o C, usando a TSP como referencia
externa.
31
Wishart, D.S; Nip, A.M. Biochem. Cell. Biol . 1998, 76, 153-163.
40 ANTECEDENTES.
Tabla 1. Desplazamientos de 1Hα y
13Cα para los 20 Aa
Curiosamente, no existen trabajos en la bibliografía para el caso de
glicopéptidos. Así, las estructuras secundarias de estos compuestos son calculadas
teniendo en cuenta los valores de referencia de péptidos y el error que ello
conlleva al no tener en cuenta la parte carbohidrato en el desplazamiento
químico. Asimismo, tampoco existen trabajos acerca de péptidos con aminoácidos
no naturales, en este sentido, nuestro grupo de investigación lleva varios años
realizando la síntesis de-aminoácidos -disustituidos, tal y como aparece en
Aa 1Hα 13Cα
Cys(red) 4.55 58.2
Cys(oxd) 4.71 55.4
Asp 4.64 54.2
Glu 4.35 56.6
Phe 4.62 57.7
Gly 3.96 45.1
His 4.73 55.0
Ile 4.17 61.1
Lys 4.32 56.2
Leu 4.34 55.1
Met 4.48 55.4
Asn 4.74 53.1
Pro 4.42 63.3
Gln 4.34 55.7
Arg 4.34 56.0
Ser 4.47 58.3
Thr 4.35 61.8
Val 4.12 62.2
Trp 4.66 57.5
41 ANTECEDENTES
las recientes revisiones,32 y más concretamente de aminoácidoshidroxi-
disustituidos.33
32 a) Cativiela, C.; Díaz-de-Villegas, M. D. Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 3517–3599; b) Cativiela, C.; Díaz-de-Villegas, M. D. Tetrahedron: Asymmetry. 2000, 11, 645–732; c) Cativiela, C.; Díaz-de-Villegas, M. D. Tetrahedron: Asymmetry. 2007, 18, 569–623; d) Vogt, H.; Bräse, S. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 406–430. 33 a) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. J. Org. Chem. 1999, 64, 8220-8225; b) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry. 1999, 10, 4653-4661; c) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry. 2000, 11, 2195-2204; d) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 949-957; e) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Cativiela, C.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry. 2003, 14, 399-405; f) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 719-724; g) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Synthesis. 2005, 575-578.
3. Discusión de resultados
45 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Como ya se ha comentado en el capítulo introducción, el objetivo de este
trabajo es la síntesis de tres glicopéptidos (compuestos 1, 2 y 3) con secuencias
ricas en glicinas de la forma Ac-Gly-Gly-Xxx-Gly-Gly-NH2 donde Xxx es serina,
treonina ó -metilserina glicosilados con α-O-GalNAc, con el fin de establecerlos
como glicopéptidos de referencia para la identificación de estructuras preferentes
en glicoproteínas.
1
3 2
Figura 1. Pentapéptidos objeto de síntesis y estudio (*= α-O-GalNAc)
La estrategia sintética seguida para la obtención de los glicopentapéptidos
fue idéntica para los tres y consistió en la síntesis del building block
correspondiente, acondicionando convenientemente el carbohidrato y el
aminoácido para llevar a cabo el acoplamiento de ambos mediante la reacción de
Koenigs-Knorr.
46 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El siguiente paso es la síntesis en fase sólida (SPPS) combinada con la
síntesis en disolución para el acoplamiento de los building blocks, para la
obtención de los glicopentapéptidos deseados.
A Síntesis de los building blocks
Los glicosil-aminoácidos 4, 5 y 6 que aparecen en la figura 2 son el
objetivo de este apartado. Éstos serán los que se empleen para la síntesis de los
glicopentapéptidos objeto de estudio.
Figura 2. Building blocks empleados en la síntesis de los compuestos 1, 2 y 3
47 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A.1 Preparación del carbohidrato
Para la síntesis de los building blocks, el primer paso es el
acondicionamiento del carbohidrato, para ello el galactal 7 se hace reaccionar
con nitrato de cerio y amonio (CAN) y azida de sodio (NaN3) a -20o C bajo
atmósfera inerte. Esta metodología1 ha demostrado ser bastante eficaz en este
tipo derivados, ya que tras su purificación por columna cromatográfica se obtiene
el compuesto 8 con un 56% de rendimiento (Esquema 1).
Esquema 1
El compuesto 8, que se obtiene como mezcla de varios isómeros posibles,
se hace reaccionar con LiBr y se obtiene el derivado que posee el bromo en α
(Esquema 2).2 La bromoazida (compuesto 9), es sensible a la luz y a la humedad.
Esquema 2
1 a) Lemieux, R. U.; Ratcliffe, R. M. Can. J. Chem. 1979, 57, 1244.
b) Heggemann, C.; Budke, C.; Schomburg, B.; Majer, Z.; Wißbrock, M.; Koop, T.; Sewald, N.Amino Acids. 2010, 38, 213-222. 2 Liu, M.; Young Jr, V. G.; Lohani, S.; Live, D.; Barany, G.Carbohyd. Res. 2005, 340, 1273-
1285.
48 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A.2 Preparación del aminoácido
Para que la reacción de acoplamiento con el carbohidrato 9 sea óptima, el
aminoácido debe acondicionarse con los grupos funcionales adecuados. En este
caso como grupos protectores se han empleado Fmoc (para el grupo amino) y el
éster terc -butílico (CO2tBu) para la protección del grupo carboxilo.
Afortunadamente, los aminoácidos adecuadamente protegidos, derivados
de serina y treonina 10 y 11, están disponibles comercialmente (Figura 3).
Figura 3. Aminoácidos derivados de serina (Ser) y treonina (Thr), adecuadamente
protegidos, empleados en la síntesis de los compuestos 1, 2 y 3.
Sin embargo, para la síntesis del building block de -metilserina
(compuesto 6), ha sido necesaria la síntesis previa del aminoácido no natural
mediante la metodología descrita por nuestro grupo de investigación.3 Asimismo,
se han protegido los grupos amino y carboxilo en forma de carbamato (Fmoc) y
éster terc-butílico (CO2tBu),4 respectivamente (Esquema 3).
3 a) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M.
Synthesis 2005, 575-578. b) Aydillo, C.; Avenoza, A; Peregrina J.M; Busto, J.H; Zurbano, M.M; Jiménez Osés, G. Chem. Eur. J. 2007, 13, 4840-4848 4 Schultz, M; Kunz, H. Tetrahedron: Asymmetry. 1993, 4, 1205-1220
49 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 3
A.3. Acoplamiento mediante koenigs-Knorr
Una vez obtenido el producto 9, se sigue la metodología descrita por
Koenigs-Knorr5 que emplea haluros de plata para que la reacción con los
compuestos 10, 11 y 12 tenga lugar con un rendimiento aceptable, como se
ilustra en el Esquema 4, obteniéndose el precursor del building block 4.
5 a) Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber.1901, 34, 957-981; b) Liebe, B.; Kunz, H. Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.
50 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 4. Reacción de Koenigs-Knorr
A continuación, es necesario transformar la azida del carbohidrato a
amina para posteriormente acetilarla. El primer paso se realiza con Zn/HCl y AcOH
en mezcla de agua y THF a 0 oC,6 desechando dos métodos que antes se habían
empleado y fueron menos eficaces dando rendimientos más bajos (disolución de
trifenilfosfina 1M en agua7 ó ácido tioacético para reducir y acetilar en un solo
paso8).
Finalmente, el tratamiento de la amina resultante con anhídrido acético y
piridina, seguido de una posterior etapa de desprotección del grupo ácido con TFA
y CH2Cl2,permiten obtener el compuesto 4. Después de realizar una purificación
por columna cromatográfica se consigue aislar dicho compuesto con un
rendimiento del 64 % (Esquema 5).
6 Geiger, J.; Reddy, B.G.; Winterfeld, G.A.; Weber, R.; Przbylski, M.; Schmidt, R.R. Journal of
Organic Chemistry.2007, 72, 4367-4377 7 Avenoza, A.; Peregrina, J. M.; San Martín, E.Tetrahedron Lett.2003, 44, 6413-6416.
8 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron. 1997, 53, 369-390.
51 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 5.
El producto 4 es el building block adecuado para obtener el
glicopentapéptido 1.
Los productos 5 y 6 (Building blocks de Ser y MeSer, repectivamente) se
sintetizaron del mismo modo que el producto 4. En el Esquema 6 se muestra un
resumen de la síntesis de los 3 building blocks, junto con los rendimientos
obtenidos.
52 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 6. Ruta sintética para la obtención de los glicosilaminoácidos 4, 5 y 6
B Síntesis en fase sólida (SPPS) automática y manual
Una vez obtenidos los building blocks (compuestos 4, 5 y 6), el siguiente
paso es la construcción del esqueleto peptídico mediante SPPS al que
posteriormente se acoplará el building block mediante la síntesis manual, también
en fase sólida. La finalidad es mejorar el rendimiento en el acoplamiento,
utilizando en este caso un menor número de equivalentes.
En el capítulo anterior se ha explicado la metodología de SPPS de un
modo ilustrativo ahora se aborda desde un punto de vista más práctico.
53 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Una de las etapas clave en la síntesis en fase sólida es la elección de la
resina ya que, por un lado, determina cómo se va a obtener el extremo C-terminal
(en nuestro caso –CONH2) y, por otro, condiciona la etapa de cleaveage
(liberación del péptido) que en la mayoría de los casos desprotege
simultáneamente las cadenas laterales de los aminoácidos. El paso siguiente es la
activación de la resina, esto consiste en la liberación del grupo protector del grupo
amino, en nuestro caso –Fmoc, con piperidina (base) en DMF y así tener
preparada la resina para acoplar el primer aminoácido.
Figura 4. Resina utilizada en SPPS (Rink Amide MBHA resin, Novabiochem®)
A continuación, siguiendo la estrategia de Fmoc/tBu, se añade la glicina,
que es el primer aminoácido que se quiere acoplar, con el grupo amino protegido
en forma de –NHFmoc. Para que la unión sea efectiva se añade HBTU como
agente de acoplamiento y diisopropiletilamina (DIEA) como base en
dimetilformamida (DMF) como disolvente. Hay que tener en cuenta que se
trabaja con 10 equivalentes de amina por cada equivalente de resina.
Seguidamente, para que el proceso continúe, hay que desproteger el
grupo N-terminal de forma análoga a la desprotección de la resina.
El proceso de acoplamiento y desprotección de Fmoc se repite tantas
veces como aminoácidos se acoplen; en nuestro caso, sintetizamos previamente
un dipéptido de glicinas se repetirá dos veces este ciclo.
Posteriormente, se lleva a cabo el acoplamiento del building block de
forma manual. Para ello se disuelven 0,3 equivalentes de building block en 1mL de
DMF y se añaden 114mg (0,3 equivalentes) de HBTU y 1mL de DIEA, se deja
54 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
agitando durante media hora a temperatura ambiente. A continuación, el
dipéptido obtenido en fase sólida (Gly-Gly-resina) se trata con esta disolución y se
deja agitando suavemente a temperatura ambiente durante 4 horas. Después, el
tripeptido unido a la resina se pasa nuevamente al sintetizador, uniendo en éste y
de forma automatizada las dos glicinas restantes.
De este modo tendríamos sintetizado nuestro glicopentapéptido con el
extremo N-terminal en forma de amina. Posteriormente, se procede a la
acetilación del último residuo con anhídrido acético y piridina (figura 5).
Figura 5. Acetilación del último residuo de la cadena peptídica
Finalmente, se procede a la liberación o cleavage del péptido de la resina
mediante la combinación de ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano (TIS) y agua
(Figura 6). Después se añade éter frío y precipita el péptido que posteriormente se
purificará por HPLC.
Figura 6. Proceso de liberación del (Glico)péptido ( Cleavage).
Al introducir el building block como glicosil-aminoácido, los grupos hidroxilo del
carbohidrato están protegidos en forma de acetatos, esto implica una etapa extra de
liberación de los mismos con una mezcla de MeO-/MeOH que se añade antes de la
purificación del péptido.
55 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En el apartado Experimental se encuentra explicado detalladamente el proceso
para cada uno de los glicopéptidos sintetizados de este trabajo. El esquema de la síntesis
de estos compuestos se refleja a continuación (Esquema 9).
56 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 9. Estrategia sintética de obtención de los glicopentapéptidos
57 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Finalmente se sintetizaron los 3 péptidos siguiendo la metodología SPPS
(para el caso de los compuestos 1´ y 2´) y para el compuesto 3´ se combinó la
metología SPPS con el acoplamiento del aminoácido no natural fuera del
sintetizador.
En el siguiente esquema se muestra la síntesis de 3´, donde el
acoplamiento del aminoácido no natural α-MeSer se realiza fuera del sintetizador.
Esquema 10. Estrategia sintética de obtención del péptido 3´
58 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Determinación del desplazamiento químico
Para determinar el desplazamiento químico de los 1H y 13C de los
aminoácidos L-Thr, Ser y (S)-MeSer, cuando éstos forman parte de los péptidos o
glicopéptidos sintetizados, estos compuestos se disolvieron en agua deuterada, se
ajustó el pH a 5.2, se utilizó TSP como referencia externa y se realizaron los
correspondientes experimentos de RMN.
A partir de los espectros de RMN de 1H y 13C de los compuestos objeto de
este estudio, se obtuvieron los datos de desplazamiento químico de 1Hα y 13Cα y
se compararon con los datos bibliográficos.9
En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos:
COMPUESTO 1Hα 13Cα 1Hα 13Cα
1 4.65 60.50 -- --
2 4.71 * -- --
3 -- 62.86 -- --
1´ 4.41 62.40 4.35 61.8
2´ 4.50 58.38 4.47 58.3
3´ -- 63.45 -- --
Tabla 1. Tabla de resultados obtenidos, en rojo se muestran los resultados bibliográficos
En vista a los resultados obtenidos, se observa que los desplazamientos
químicos de 1Hα y 13Cα de los compuestos glicosilados (1, 2 y 3) difieren de sus
análogos sin glicosilar (1´, 2´ y 3´) y de los expresados en la bibliografía.
Este hecho sugiere que en aquellas ocasiones en las que se ha
determinado la estructura de glicoproteínas mediante el método CSI para
aminoácidos Ser y Thr glicosilados, se ha incurrido en errores. Así, para obtener el
valor adecuado de CSI, habría que haber restado de estos nuevos valores y no de
9 Wishart, D.S; Nip, A.M. Biochem. Cell. Biol. 1998, 76, 153-163.
59 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
los tabulados en la bibliografía; ya que no se estaba teniendo en cuanta el efecto
del carbohidrato sobre la conformación de la cadena peptídica.
Por tanto, se proponen estos nuevos valores como referencia para el
cálculo de CSI, al menos para el caso de proteínas glicosiladas con carbohidratos
que presenten enlaces α-O-glicosídicos.
Como continuación lógica de estas investigaciones y ya fuera del ámbito
de este Trabajo de Fin de Máster, en el futuro se estudiará el análisis
conformacional de los 6 péptidos presentados. Para ello, se hará uso de la DM y
de la RMN, especialmente de los datos proporcionados por los experimentos de
tipo NOESY.
4. Conclusiones
63 CONCLUSIONES
Se ha llevado a cabo la síntesis de los glicopentapéptidos (compuestos 1,
2 y 3) así como sus análogos sin glicosilar (compuestos 1´, 2´ y 3´)( Figura 1).
La síntesis de los glicopentapéptidos se ha realizado mediante una
metodología en fase sólida donde el primer paso ha sido la preparación del
building block a partir del carbohidrato GalNAc y el aminoácido correspondiente,
usando la reación de Koenigs-Knorr. Posteriormente, se llevó a cabo la síntesis en
fase sólida y el building block se incorporó fuera del sintetizador automático de
péptidos empleando HBTU como agente de acoplamiento y DIEA como base. Para
los péptidos no glicosilados la síntesis se ha llevado a cabo usando la metodología
en fase sólida.
Figura 1. Glicopéptidos y péptidos objeto de síntesis y estudio (* = α-O-GalNAc).
64 CONCLUSIONES
Todos los compuestos que aparecen en la Figura 1 fueron caracterizados
por técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y análisis de masas. Asimismo, se
ha determinado experimentalmente los desplazamientos químicos de 1Hα y 13Cα.
5. Experimental
67 EXPERIMENTAL
Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se realizaron en un
espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los
desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes
de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo,
con TMS como referencia interna y agua deuterada, con TSP como referencia
externa.
Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se
realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización
ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.
La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel
(Polychrom SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz
ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido
fosfomolíbdico en etanol.
La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06
mm (230-240 mesh).
Todas las reacciones se llevaron a cabo empleando disolventes secos.
La síntesis en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Model
433A Peptide Synthesizer de Applied Biosystems, cuyo tratamiento de datos se
hizo con el software SynthAssist 2.0.
68 EXPERIMENTAL
Nitrato de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi--D-galactopiranosa (8)
Se añaden en un schlenk nitrato de cerio y amonio (30.20 g, 55.1 mmol)
y azida de sodio (1.90 g, 27.5 mmol) bajo atmósfera inerte a -20 °C. Se adiciona
gota a gota una disolución de tri-O-acetil-D-galactal (5.00 g, 18.6 mmol),
compuesto 7, en CH3CN seco (50 mL) dejándose 10 h en agitación. Se extrae con
éter (50 mL) y con H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con
Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de
columna sobre gel de sílice [hexano/AcOEt (6:4)] obteniéndose el compuesto 8
(3.2 g, 56.40%) como un aceite amarillo. Sus propiedades físicas y datos
espectroscópicos son idénticos a los descritos en la bibliografía.1
1 Liu, M.; Young Jr., V.G.; Lohani, S.; Live, D.; Barany, G. Carbohydrate Research. 2005, 340,
1273-1285
69 EXPERIMENTAL
-D-Tri-O-acetil-2-azido-1-bromo-2-desoxigalactosa (9)
Se hace reaccionar bajo atmósfera inerte y durante 8 h una disolución
del compuesto 8 (3.8 g, 6.68 mmol) en CH3CN seco (50 mL) con LiBr (2.90 g, 33.4
mmol). Se añade CH2Cl2 (100 mL) y H2O (50 mL), extrayéndose la fase orgánica con
H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se
filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de columna sobre gel
de sílice en [hexano/AcOEt (1:1)] obteniéndose el compuesto 9 (3.4 g, 85%) como
un aceite amarillo. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos
a los descritos en la bibliografía.1
70 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Thr(-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (13)
Se añade el compuesto 10 (1.22 g, 3.04 mmol) y tamiz molecular a una
disolución de tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL), bajo atmósfera de argón, y la mezcla
se agita durante 1h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (922.74 mg,
3.35 mmol) y AgClO4 (81.15 mg, 0.393 mmol), manteniéndose la agitación durante
1 h. Se añade el compuesto 9 (1.2 g, 3.04 mmol) disuelto en una mezcla de
tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8 h de reacción, se filtra en tierra de
diatomeas, se evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100
mL) y H2O (2 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4
anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de
sílice [Tolueno/AcOEt (8:2)], obteniéndose el compuesto 13 (954 mg, 44%) como
una espuma blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son
idénticos a los descritos en la bibliografía.2
2 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron. 1997, 53, 369-390.
71 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Thr(-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (4)
En un baño a 0 oC se disuelve el compuesto 13 (954 mg, 1.34 mmol) en
100 mL de THF, a continuación se añaden 40 mL de H2O, 4 mL de HCl y 24 mL de
AcOH. Seguidamente se añade Zn en polvo (2,11 g, 32.21 mmol), la mezcla se
agita durante 2h y el exceso de Zn se elimina por filtración. Se diluye la mezcla de
reacción con CH2Cl2 y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 y H2O hasta que el pH
de la fase acuosa quede neutro. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro, se
filtra y se evapora, obteniéndose el compuesto 16. Después se añade Ac2O (3 mL)
y piridina (6 mL) se deja reaccionar durante 2 h, se evapora y se purifica por
cromatografía sobre gel de sílice [AcOEt: Hexano (8:2)]. Finalmente, se añade TFA
(2.5 mL) en CH2Cl2 (2.5mL), se agita durante 1 h y se evapora el TFA con ayuda de
éter dietílico, obteniéndose el compuesto 4 (0.590 g, 70%) como un sólido
blanco. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los
descritos en la bibliografía.2
72 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Ser(-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (14)
Se añade el compuesto 11 (2.04 g, 5.32 mmol) y tamiz molecular a una
disolución de tolueno (15 mL) y CH2Cl2 (25 mL), bajo atmósfera de argón, y la
mezcla se agita durante 1 h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (1.61
g, 5.86 mmol) y AgClO4 (142 mg, 0.685 mmol), manteniéndose la agitación
durante 1 h. Se añade el compuesto 9 (2.1 g, 5.33 mmol) disuelto en una mezcla
de tolueno/CH2Cl2 1:1 (50 mL). Después de 8h, se filtra en tierra de diatomeas, se
evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100 mL) y H2O (2 x
100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y
se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice [hexano/AcOEt
(6.5:3.5)], obteniéndose el compuesto 14 (1.76 g, 47%) como una espuma
blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los
descritos en la bibliografía . 2
73 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Ser(-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (5)
En un baño a 0 oC se disuelve el compuesto 14 (1.76 g, 2.53 mmol) en
250 mL de THF, a continuación se añaden 75 mL de H2O, 7.6 mL de HCl y 45.5 mL
de HAcO. Seguidamente se añade Zn en polvo (4 g, 60.63 mmol), la mezcla se
agita durante 2h y el exceso de Zn se elimina por filtración. Se diluye la mezcla de
reacción con CH2Cl2 y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 y H2O hasta que el pH
de la fase acuosa quede neutro. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro, se
filtra y se evapora, obteniéndose el compuesto 17. Después se añade Ac2O (6 mL)
y piridina (12 mL), se deja reaccionar durante 2 h, se evapora y se purifica por
cromatografía sobre gel de sílice [AcOEt: Hexano (8:2)]. Finalmente, se añade TFA
(2.5 mL) en CH2Cl2 (2.5mL), se agita durante 1 h y se evapora el TFA con ayuda de
éter dietílico, obteniéndose el compuesto 5 (1.16g, 75%) como un sólido blanco.
Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la
bibliografía.2
74 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)-MeSer-O
tBu (12)
Se parte de α-MeSer (1.32 g, 11.08 mmol), sintetizada siguiendo la
metodología descrita por nuestro grupo de investigación,3 se añade NaHCO3
(2.33g, 27.70 mmol) y 50 mL de H2O y se comprueba que el pH sea básico. A
continuación se añaden 100 mL de CH3CN y FmocOSuc (5.61 g, 16.62 mmol). La
disolución se mantiene en agitación y calentamiento a 35 oC durante 2 días. Se
evapora el CH3CN, se hacen extracciones con éter y la fase acuosa se acidifica con
HCl, hasta pH neutro y se hacen extracciones con CHCl3/ iPrOH. La fase orgánica se
seca, y se evapora obteniéndose un sólido blanco (2.177g, 60%). Este sólido se
adiciona disuelto en CH2Cl2 seco bajo atmósfera inerte sobre una disolución de
DCC (4.863 g, 23.53 mmol), CuCl (52.3 mg, 0.523 mmol) y tBuOH (2.85 mL, 30.338
mmol) que había estado bajo agitación y atmósfera inerte durante 5 días.4 Se deja
bajo agitación durante 4 h. Se filtra con diatomeas y se hacen extracciones con
NaHCO3 (3x50 mL). Se seca la fase orgánica con Na2SO3 anhidro y se evapora. El
residuo corresponde al compuesto 12 (950 mg, 38 %) y se utiliza en la siguiente
reacción sin purificación previa.
3 a) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M.
Synthesis 2005, 575-578. b) Aydillo, C.; Avenoza, A; Peregrina J.M; Busto, J.H; Zurbano, M.M; Jiménez Osés, G. Chem Eur J. 2007, 13, 4840-4848 4 Schultz, M; Kunz, H. Tetrahedron: Asymmetry. 1993, 4, 1205-1220
75 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)-MeSer(-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (15)
Se añade el compuesto 12 (950 mg, 2.39 mmol) con tamiz molecular,
tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL) bajo atmósfera de argón y la mezcla se agita
durante 1h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (750.30 mg, 2.65
mmol) y AgClO4 (64.24 mg, 0.309 mmol), manteniéndose la agitación durante 1 h.
Se añade el compuesto 9 (950 g, 2.41 mmol) disuelto en una mezcla de
tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8 h de reacción, se filtra en tierra de
diatomeas, se evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100
mL) y H2O (2 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4
anhidro, se filtra y se evapora. El residuo corresponde al compuesto 15 (672mg,
40%) como una espuma blanquecina y se utiliza en la siguiente reacción sin
purificación previa.
76 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)-MeSer(-O-D-tri-O-acetil- N-acetilgalactosaminil)-tBu (6)
En un baño a 0 o C se disuelve el compuesto 15 (672m g, 0.942 mmol) en
75 mL de THF, a continuación se añaden 30 mL de H2O, 3 mL de HCl y 18 mL de
HAcO. Seguidamente, se añade Zn en polvo (1.48 g, 22.69 mmol), la mezcla se
agita durante 2h y el exceso de Zn se elimina por filtración. Se diluye la mezcla de
reacción con CH2Cl2 y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 y H2O hasta que el pH
de la fase acuosa quede neutro. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro, se
filtra y se evapora, obteniénsose el compuesto 18. Después se añade Ac2O (2 mL)
y piridina (4 mL) se deja reaccionar durante 2 h, se evapora y se purifica por
cromatografía sobre gel de sílice [AcOEt : hexano (8:2)]. Finalmente se añade TFA
(2 mL) en CH2Cl2 (2 mL), se agita durante 1 h y se evapora el TFA con ayuda de
éter dietílico, obteniéndose el compuesto 6 (355mg, 55 %) como un sólido
blanco.
77 EXPERIMENTAL
Procedimiento general para la obtención de péptidos y glicopentapéptidos por
SPPS.
En el reactor tipo Vessel del sintetizador automático de péptidos se
introduce la resina Rink Amide MBHA de Novabiochem® (178 mg, 0.1 mmol de
NH2). En los diferentes cartuchos se introduce 1 mmol del correspondiente
aminoácido o glicosil-aminoácido convenientemente protegidos.
El proceso se inicia lavando la resina con una disolución al 22% de
piperidina en N-metilpirrolidona (NMP) durante 10 minutos. Posteriormente, el
equipo expulsa el cartucho de iniciación y añade al reactor el del primer
aminoácido junto con DIEA (1 mL), HBTU (3.4 mg) y DMF (2 mL). Después de 10
min, hace lavados sucesivos con piperidina (1 mL) y DMF (3 mL) durante 30 min.
El proceso continúa con la expulsión del cartucho cogiendo el siguiente,
repitiéndose el proceso tantas veces como (glicosil) aminoácidos haya para
acoplar. Cuando se opera con un glicosil-aminoácido, el tiempo de acoplamiento
se eleva a 60 min. En este trabajo el acoplamiento del glicosil-aminoácido se ha
realizado fuera del reactor, para ello en primer lugar se retira la resina del reactor
y se introduce en un tubo de plástico. A continuación en un matraz se disuelven
0.3 equivalentes del glicosil-aminoácido en 1mL de DMF, se le añaden 114 mg (0.3
equivalentes de HBTU) como agente de acoplamiento y 1mL de DIEA, pasada
media hora de agitación se añade al tubo de plástico con la resina y se deja bajo
agitación 4 horas.
Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y con CH2Cl2 y se
introduce de nuevo al reactor, repitiendo el proceso de acoplamiento dentro del
sintetizador automático.
78 EXPERIMENTAL
Por último, se retira la resina del reactor y se introduce en un tubo de
plástico añadiéndose piridina (1 mL) y Ac2O (2 mL) manteniéndose la agitación
durante 2 h. A continuación, se filtra y se lava con DMF y CH2Cl2.
Seguidamente, se añade TFA (1.90 mL), TIS (50 L) y H2O (50 L) y se
deja agitando durante 2 h. Transcurrido este tiempo, se añade éter frío a la
mezcla, observándose la precipitación del péptido. Seguidamente, se filtra
lavándose con éter. El sólido se desecha y se lava con H2O, recogiéndose esta
disolución acuosa para obtener, tras la purificación por HPLC semipreparativo, el
péptido o glicopéptido deseado.
Si se trata de un glicopéptido, antes de la purificación se añade MeOH (2
mL) y una mezcla 0.5 M en MeO-/MeOH (1 mL) en agitación durante 1h. A
continuación, se añade resina Dowex®, que previamente ha sido lavada con DMF
y CH2Cl2, hasta que se comprueba que el pH es neutro. Finalmente, se filtra y se
lava con H2O, obteniéndose el glicopéptido tras su evaporación.
En la Imagen 1 se puede observar el modelo utilizado para llevar a cabo
la SPPS así como las diferentes partes y reactivos de las que dispone.
79 EXPERIMENTAL
Imagen 1. Fotografía del dispositivo instrumental Model 433A Peptide Synthesizer de Applied
Biosystems, utilizado para la síntesis de péptidos en el presente trabajo.
80 EXPERIMENTAL
N-Acetil-glicinil-glicinil-L-treoninil(-O-D-N-acetilgalactosaminil)-glicinil-
glicinamida (1)
Ac-Gly-Gly-L-Thr(-O-D-GalNAc)-Gly-Gly-NH2
Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS, se
introduce en dos cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), seguidamente se acopla
el building block de Thr (compuesto 4) (189 mg, 0.3 mmol) fuera del sintetizador
usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y DIEA (1 mL)
durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y se introduce
de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol).
Posteriormente se realizan los pasos de acetilación, liberación de la resina
(cleveage) y desprotección de los acetatos, obteniéndose el glicopéptido 1 que
se purifica por HPLC semipreparativo.
HRMS (ESI) (m/z) 592.2676 [M+H]+; calculado C22H37N7O12 +: 592.2587 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.30 (d, 3H, CH3 Thr), 2.05 (s, 3H, COCH3), 2.08 (s, 3H, COCH3), 3.75-3.79 (m, 2H, 2H6S), 3.89-4.13 (m, 12H, 4 CH2 Gly, H2S, H3S, H4S, H5S), 4.38-4.52 (m, 1H, Hβ Thr), 4.65 (d, 1H, J = 2.2 Hz, Hα Thr), 4.96 ( d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S). 13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 20.31 (CH3 Thr), 24.4, 24.75 (2 CH3CO), 44.88, 45.2, 45.5 (4CH2 Gly), 52.77 (C2S), 60.5 (Cα Thr), 64.1 (C6S), 70.46 (C3S), 71.45 (C4S), 74.29 (C5S), 78.12 (Cβ Thr), 101.68 (C1S), 173.69, 174.36, 174.97, 175.34,177, 177.98 (7 CO)
81 EXPERIMENTAL
N-Acetil-glicinil-glicinil-L-serinil(-O-D-N-acetilgalactosaminil)-glicinil-
glicinamida (2)
Ac-Gly-Gly-L-Ser(-O-D-GalNAc)-Gly-Gly-NH2
Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS, se
introduce en dos cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), seguidamente se acopla
el building block de Thr (compuesto 5) (185 mg, 0.3 mmol) fuera del sintetizador
usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y DIEA (1 mL)
durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y se introduce
de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol).
Posteriormente se realizan los pasos de acetilación,liberación de la resina
(cleveage) y desprotección de los acetatos, obteniéndose el glicopéptido 2 que
se purifica por cartucho C18.
HRMS (ESI) (m/z) 600.2350 [M+Na]+; calculado C21H35N7O12 Na+: 600.2344
1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 2.04 (s, 3H, COCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 3.69-
4.07 (m, 15H, 4CH2 Gly, 2Hβ Ser, H3S, H4S, 2H6S, H5S), 4.13-4.28 (m, 1H, H2S), 4.71 (m,
1H, Hα Ser), 4.90 (d, 1H, J< 3 Hz, H1S).
*falta 13C
82 EXPERIMENTAL
N-Acetil-glicinil-glicinil-(S)-MeSer(-O-D-N-acetilgalactosaminil)-glicinil-
glicinamida (3)
Ac-Gly-Gly-(S)-MeSer(-O-D-GalNAc)-Gly-Gly-NH2
Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS, se
introduce en dos cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), seguidamente se acopla
el building block de MeSer (compuesto 6) (189 mg, 0.3 mmol) fuera del
sintetizador usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y
DIEA (1 mL) durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y
se introduce de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg,
1mmol). Posteriormente se realizan los pasos de acetilación,liberación de la resina
(cleveage) y desprotección de los acetatos, obteniéndose el glicopéptido 3 que
se purifica por HPLC semipreparativo.
HRMS (ESI) (m/z) 592.2695 [M+H]+; calculado C22H37N7O12 +: 592.2587 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.54 (s, 3H, CH3 α-MeSer), 2.06 (s, 3H, COCH3), 2.07
(s, 3H, COCH3), 3.57-4.07 (m, 15H, 4CH2 Gly, 2H6S, H3S, H4S, H5S), 4.12-4.23 (m, 1H,
H2S), 4.90 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S)
13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 22.93 (CH3 MeSer), 24.37 (COCH3), 24.90 (COCH3), 45.17, 45.66, 45.75, 45.97 (4CH2 Gly), 52.72 (C2S), 62.86 (Cα MeSer), 64.31 (C6S), 70.37 (C3S), 71.58 (C4S), 73.2 (Cβ MeSer), 74.45 (C5S), 100.61 (C6S), 174.29, 175.27, 175.64, 176.92, 177.60, 177.98 (7 CO).
83 EXPERIMENTAL
N-Acetil-glicinil-glicinil-L-treoninil-glicinil-glicinamida (1´)
Ac-Gly-Gly-L-Thr-Gly–Gly-NH2
Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS,
se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1
mmol), Thr(OtBu)-Fmoc (341 mg, 1 mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol) y Gly-Fmoc
(297 mg, 1 mmol) . Finalmente, tras los pasos de acetilación y liberación de la
resina (cleaveage) se obtiene el péptido 1´ que se purifica por HPLC
semipreparativo.
HRMS (ESI) (m/z) 411,1584 [M+Na]+; calculado C14H24N6O7 Na+: 411,17
1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.23 (d, 1H, J= 6.4 Hz, CH3 Thr), 2.07 (s, 3H,
COCH3), 3.84-4.10 (m, 8H, 4CH2 Gly), 4.24-4.35 (m, 1H, Hβ Thr), 4.41 (d, 1H, J = 3.9 Hz,
Hα Thr)
13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 21.90 (CH3 Thr), 24.91 (COCH3), 44.49, 45.97 (4
CH2 Gly), 62.4 (Cα Thr), 69.95 (Cβ Thr), 174.98, 175.66, 177.31, 178.29 (5 CO).
84 EXPERIMENTAL
N-Acetil-glicinil -glicinil-L-serinil-glicinil-glicinamida (2´)
Ac-Gly-Gly-L-Ser-Gly–Gly-NH2
Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS,
se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1
mmol), Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol) y Gly-
Fmoc (297 mg, 1 mmol) . Finalmente, tras los pasos de acetilación y liberación de
la resina (cleaveage) se obtiene el péptido 2´ que se purifica por HPLC
semipreparativo.
HRMS (ESI) (m/z) 397,1427 [M+Na]+; calculado C13H22N6O7 Na+:397,15
1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 2.08 (s, 3H, COCH3), 3.83-4.08 (M, 10H, 4CH2 Gly,
2Hβ Ser), 4.50 (t, 1H, J = 5.0 Hz, Hα Ser).
13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 24.38 (COCH3), 44.33, 45.13 (4 CH2 Gly), 58.38 (Cα
Ser), 63.42 (Cβ Ser), 173.79, 174.28, 175.08, 176.30, 177.59 (5 CO).
85 EXPERIMENTAL
N-Acetil-glicinil-glicinil-(S)-MeSer-glicinil-glicinamida (3´)
Ac-Gly-Gly-(S)-MeSer-Gly–Gly-NH2
Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS, se
introduce en dos cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), seguidamente se acopla
el aminoácido no natural de α-MeSer (compuesto 12) (189 mg, 0.3 mmol) fuera
del sintetizador usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y
DIEA (1 mL) durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y
se introduce de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg,
1mmol). Finalmente, se realizan los pasos de acetilación y liberación de la resina
(cleaveage) para obtener el compuesto 3´ que se purifica por HPLC
semipreparativo.
HRMS (ESI) (m/z) 411,1609 [M+Na]+; calculado C14H24N6O7 Na+: 411,17
1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.45 (s, 3H, CH3 MeSer), 2.05 (s, 3H, COCH3), 2.07
(COCH3), 3.90-4.16 (m, 10H, 4 CH2 Gly, 2Hβ MeSer).
13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 21.92 (CH3 MeSer), 24.575 (COCH3), 44.14, 45.50,
45.80 (4 CH2 Gly), 63.45 (Cα MeSer), 67.01 (Cβ MeSer), 173.95, 174.93, 176.96, 177.27,
178.32 (5CO).
6. Anexo: Espectros de Resonancia
Magnética Nuclear
89 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
A continuación se presentan los espectros de RMN 1D y 2D de los
productos glicosilados (1, 2, 3) y sus análogos sin glicosilar (1´, 2´, 3´).
Los espectros de 1H, 13C, COSY y HSQC fueron tratados y representados
con el software MestreNova (5.2).
90 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13
C RMN 100 MHz en D2O
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
f1 (ppm)
- 0 . 0 0
2 0 . 3 5
2 4 . 3 5
2 4 . 8 8
4 4 . 2 0
4 5 . 2 3
4 5 . 6 9
5 2 . 5 1
6 0 . 2 8
6 4 . 2 8
6 9 . 8 3
7 1 . 1 0
7 4 . 1 1
7 8 . 3 9
1 0 1 . 0 0
1 7 3 . 8 1
1 7 4 . 3 0
1 7 4 . 5 9
1 7 5 . 3 3
1 7 7 . 8 5
91 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
1.2 1.
4 1.6 1.
8 2.0 2.
2 2.4 2.
6 2.8 3.
0 3.2 3.
4 3.6 3.
8 4.0 4.
2 4.4 4.
6 4.8 5.
0 5.2 5.
4 5.6 5.
8
20
40 50 60 70 80 90 100
f 1 ( p m
0.5 1.
0 1.5 2.
0 2.5 3.
0 3.5 4.
0 4.5 5.
0 5.5 6.
0 6.5 7.
0 7.5 f2
(ppm)
1
2
3
4
5
6
7
8
f 1 ( p p m )
92 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
COSY en D2O
*Falta HSQC y 13C
1.
5 1.
7 1.
9 2.
1 2.
3 2.
5 2.
8 3.
0 3.
2 3.
4 3.
6 3.
8 4.
0 4.
2 4.
4 4.
6 4.
8 5.
0 5.
2 f1 (ppm)
5 . 5 0 1 5 . 0 0
1 . 0 7 1 . 0 8
1 . 0 4
2 . 0 5 2 . 0 6 3 . 7 4 3 . 7 5 3 . 8 6 3 . 9 1 3 . 9 3 3 . 9 5 3 . 9 8 4 . 0 1 4 . 0 2 4 . 0 4 4 . 7 0 4 . 7 9 4 . 9 0
93 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13
C RMN 100 MHz en D2O
0 1
0 20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200 f1
(ppm)
0 . 4 8 2 3 . 2 7
2 4 . 9 5
2 5 . 7 8
4 4 . 9 3
4 5 . 4 8
5 3 . 6 6
6 2 . 6 3
6 4 . 0 6
7 0 . 8 0
7 1 . 6 8
7 4 . 7 2
1 0 0 . 5 9
1 7 4 . 6 3
1 7 5 . 1 9
1 7 5 . 7 2
1 7 7 . 4 0
1 7 8 . 0 0
1 7 8 . 2 7
-0.4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2 f1
(ppm)
3 . 1 6
5 . 3 1
1 5 . 0 0
1 . 0 9
1 . 0 4
0 . 0 0
1 . 5 5
2 . 0 6
2 . 0 7
3 . 7 7
3 . 7 9
3 . 9 1
3 . 9 5
3 . 9 7
3 . 9 9
4 . 1 5
4 . 1 8
4 . 8 1
4 . 9 1
94 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
95 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13
C RMN 100 MHz en D2O
96 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
0.6 0.8 1.0 1.2 1.
4 1.6 1.8 2.0 2.
2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.
2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.
2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.
2 f2 (ppm)
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
f 1 ( p p m )
97 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13C RMN 100 MHz en D2O
98 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
99 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13
C RMN 100 MHz en D2O
-0.4 -
0.2 0.0 0.
2 0.4 0.
6 0.8 1.
0 1.2 1.
4 1.6 1.
8 2.0 2.
2 2.4 2.
6 2.8 3.
0 3.2 3.
4 3.6 3.
8 4.0 4.
2 4.4 4.
6 4.8 5.
0 f1 (ppm)
2 . 1 6 3 . 0 0 1 0 . 2 0
0 . 0 0 1 . 4 7 2 . 0 7 3 . 7 8 3 . 8 0 3 . 8 5 3 . 9 4 3 . 9 5 3 . 9 9 4 . 0 0 4 . 0 5 4 . 8 1
100 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O