Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Brian Alejandro Castro Agudelo
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2014
Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Brian Alejandro Castro Agudelo
Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Química
Director (a):
César Augusto Sierra Ávila, Ph.D.
Línea de Investigación:
Síntesis Química
Grupo de Investigación:
Grupo de investigación en Macromoléculas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2014
Y vosotros, rosal florecido,
lebreles sin amo, luceros, crepúsculos,
escuchadme esta cosa tremenda: ¡He Vivido!
He vivido con alma, con sangre, con nervios, con
músculos,
y voy al olvido...
Porfirio Barba Jacob
Agradecimientos
El autor expresa su más sincero agradecimiento al departamento administrativo de
ciencia, tecnología e innovación, COLCIENCIAS por la financiación recibida a través del
proyecto No. RC0041-2013 y agradezco a la Vicerrectoría de Investigación de la
Universidad Nacional de Colombia por la financiación recibida a través de los proyectos
16060 y 16071. También agradezco a la Facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional de Colombia por el financiamiento otorgado durante mi maestría a través de la
beca auxiliar docente.
Agradezco primeramente a mi Familia, a mis hermanos, que ha sido mi apoyo
incondicional. A mi madre Adriana Agudelo y a mi hermana Lorena Castro, porque han
sido mujeres profundamente inspiradoras en mi vida. Agradezco a la Universidad
Nacional de Colombia, que es y siempre será mi Alma Mater. Agradezco muchísimo al
profesor César Sierra, pues él me dio la oportunidad de trabajar, y siempre me depositó
su voto de confianza. Agradezco a todos mis amigos del grupo de investigación en
Macromoléculas: Melissa, Diana, Camilo y William, y todos de quienes me nutrí como
científico y ser humano. Agradezco mucho a mis amigos incondicionales que me dieron
su apoyo durante estos años de construcción, a Diana, Nicolás, Alberto, Laura, Yina,
Luisa, Nicolás, Lina, Félix, Jorge, en y en general a todo el equipo. También agradezco a
Alejandra y Lucía quienes fueron apoyo durante este proceso.
VIII Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o aceptar
protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Resumen y Abstract IX
Resumen
Fueron sintetizados 3 sistemas fenilenvinileno empleando la reacción de Mizoroki-Heck y
sus propiedades optoelectrónicas fueron determinadas. Pudo ser establecido que tienen
características ideales para ser probadas como matrices MALDI. Se realizaron
experimentos empleando 4 péptidos como analitos y los fenilenvinileno como matrices
MALDI de transferencia protónica. Se determinó que los péptidos no podían ser
ionizados por los fenilenvinileno, debido a que los fenilenvinileno no formaban cationes
protonados sino que formaban cationes radicales y por tanto no cumplían el objetivo de
servir como matrices de transferencia protónica. Debido a su tendencia a formar cationes
radicales, los fenilenvinileno se establecieron como potenciales matrices de transferencia
electrónica y se probaron con 4 analitos modelo de hidrocarburos policíclicos aromáticos.
Los resultados mostraron que los fenilenvinileno se comportaban como excelentes
matrices de transferencia electrónica, aumentando la señal del ion molecular y
disminuyendo la fragmentación de cada analito.
Como respuesta a la búsqueda de matrices de transferencia protónica, objetivo inicial de
esta investigación, se sintetizaron 6 derivados de ácido acrílico y se emplearon como
matrices con tres péptidos. Los resultados muestran un alto potencial como matrices de
transferencia protónica y uno de estos derivados presentó resultados comparables a la
matriz comercial más usada.
Palabras clave: Mizoroki-Heck, fenilenvinileno, ácidos acrílicos, matriz, MALDI,
Knoevenagel, hidrocarburo policíclico aromático, péptido.
X Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o aceptar
protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Abstract
Three phenylenevinylene systems were synthesized using the Mizoroki-Heck cross
coupling and their optoelectronic properties were determined. It could be established that
FV have ideal properties for to be tested as MALDI matrices. Experiments were made,
using 4 peptides as analytes and FV as proton transfer MALDI matrices. It was
determined that peptides could not be ionized due FV do not form protonated ions, but
form radical cations and therefore they do not accomplished the objective of to be used
as transfer proton matrices.
Due to radical cations FV were established as potential electron transfer matrices and
they were tested with 4 polycyclic aromatic hydrocarbons model-analytes. Results
showed that FV that FV have a good behavior as electron transfer matrices, rising up
signal to noise ratio and suppressing fragmentation for analytes.
As response to quest of proton transfer matrix, that was an initial objective for this
research, 6 acrylic acid derivatives were synthesized and their absorption properties were
determined. They were used in experiments with 3 peptides and satisfactory results were
found. Then almost compound made proton transfer process and one derivative showed
results comparable to commercial matrix.
Keywords: Mizoroki-Heck, phenylenevinylene, acrylic acid, matrix, MALDI,
Knoevenagel, Polycyclic aromatic hydrocarbon, peptide.
Contenido XI
Contenido
................................................................................................................ Pág.
Resumen .................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................ XIV
Lista de tablas ............................................................................................................ XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................. XVIII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Síntesis de sistemas FV ......................................................................................... 15 1.1 Materiales ...................................................................................................... 15
1.1.1 Reactivos ............................................................................................ 15 1.1.2 Equipos ............................................................................................... 15
1.2 Síntesis de estirenos precursores .................................................................. 16 1.2.1 4-Cloroestireno.................................................................................... 17 1.2.2 p-Divinilbenceno .................................................................................. 17
1.3 Yodación de compuestos aromáticos ............................................................ 18 1.3.1 1,4-Diyodo-2,5-dimetoxibenceno ......................................................... 18 1.3.2 1,4-Diyodo-2,5-dimetilbenceno ............................................................ 18
1.4 Esterificación de ácido vinilbenzóico .............................................................. 19 1.4.1 metil-4-vinilbenzoato ........................................................................... 19
1.5 Reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck ................................................ 19 1.5.1 E,E-2,5-Dimetoxi-1,4-bis[2-(4-cloroestiril)] benceno (FVCl) ................. 20 1.5.2 E,E-1,4-Bis[2-(4-metil carboxilatoestiril)] benceno (FVCOOMe) .......... 20 1.5.3 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-metil carboxilato estiril)] benceno (FV-COOMe-CH3) .................................................................................................... 21
1.6 Hidrólisis de ésteres FV ................................................................................. 21 1.6.1 E,E-1,4-Bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH) .......................... 21 1.6.2 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH CH3) 22
1.7 Discusión de resultados para la síntesis de FV .............................................. 22 1.7.1 Síntesis de sistemas FV ...................................................................... 22
2. Caracterización optoelectrónica de los sistemas FV ........................................... 29 2.1 Materiales y métodos ..................................................................................... 29
2.1.1 Absortividad molar .............................................................................. 29 2.1.2 Rendimientos cuánticos de fluorescencia............................................ 29
2.2 Resultados de propiedades optoelectrónicas ................................................. 30
XII Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
3. Análisis de Espectrometría de masas MALDI usando los sistemas FV como matrices. 37
3.1 Análisis de proteínas empleado sistemas FV como matrices MALDI .............37 3.1.1 Materiales y Métodos ...........................................................................37 3.1.2 Resultados y discusión ........................................................................38
3.2 Análisis de hidrocarburos policíclicos aromáticos ...........................................45 3.2.1 Materiales y métodos ...........................................................................46 3.2.2 Resultados y discusión de análisis de HPA .........................................47 3.2.2.1 Naftopireno ............................................. ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2.2 Hexafenilbenceno ................................................................................49 3.2.2.3 Rubreno ...............................................................................................52 3.2.2.4 Porfirina de Níquel-Pireno (PNP) .........................................................54 3.2.2.5 Efectos positivos de los FV como matrices en MALDI de analitos HPA57
4. Síntesis y caracterización de derivados de Ácido acrílico ..................................62 4.1 Materiales y Reactivos ...................................................................................62
4.1.1 5-yodotiofeno-2-carboxaldehido ...........................................................63 4.1.2 Equipos................................................................................................63 4.1.3 Absortividad molar ...............................................................................63
4.2 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos acrílicos ...............................64 4.2.1 Ácido acrílico de furano (AFu): (ácido 3-(furan-2-il)-2-propenóico) .......64 4.2.2 Ácido acrílico de tiofeno (ATio): (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-propenóico) ....65 4.2.3 Ácido acrílico de yodotiofeno (AItio): (ácido 3-(5-yodotiofen-2-il)-2-propenóico) ........................................................................................................65
4.3 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos cianoacrílicos: .....................65 4.3.1 Ácido cianoacrílico de furano (AFuCN): (ácido 3-(furan-2-il)-2-cianopropenóico) ...............................................................................................66 4.3.2 Ácido cianoacrílico de tiofeno (ATioCN): (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-cianopropenóico) ...............................................................................................66 4.3.3 Ácido cianoacrílico de yodotiofeno (AITioCN): (ácido 3-(5-yodotiofen-2-il)-2-cianopropenóico) ........................................................................................67
4.4 Resultados y discusión ...................................................................................68 4.4.1 Síntesis ................................................................................................68 4.4.2 Caracterización de absortividad molar .................................................74
5. Derivados de ácido acrílico como matrices MALDI para procesos de transferencia protónica .................................................................................................79
5.1 Materiales y métodos .....................................................................................79 5.1.1 Experimentos de espectrometría de masas MALDI .............................79 5.1.2 Cálculos computacionales ...................................................................80
5.2 Resultados y discusión ...................................................................................80
6. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................94 6.1 Conclusiones ..................................................................................................94 6.2 Recomendaciones ..........................................................................................95
A. Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de los compuestos .....................97
Bibliografía ................................................................................................................. 113
Contenido XIV
Lista de figuras
............................................................................................................... Pág.
Figura i-1. Esquema general del proceso de ionización, arriba métodos clásicos, abajo
MALDI. 1
Figura i-2. Micrografías tomadas con resoluciones de nanosegundos, durante un
experimento de MALDI 2
Figura i-3. Mecanismo de ionización basado en la generación de clústeres 4
Figura i-4. Proceso de transferencia de carga en forma de un protón. 5
Figura i-5. Posibles interacciones intermoleculares del ácido ciano hidroxicinámico
5
Figura i-6: Esquema de ionización por transferencia electrónica. 8
Figura i-8: Esquema general de un oligómero de fenilenvinileno 8
Figura i-9: Estructura general de un derivado de ácido acrílico heterocíclico 12
Figura 1-1: Esquema general de síntesis de sistemas FV 16
Figura 1-2: Síntesis de los estirenos 17
Figura 1-3: Esquema general de la reacción de yodación 18
Figura 1-4: Esterificación del ácido vinilbenzóico 19
Figura 1-5: Reacciones de Mizoroki-Heck para los distintos FV sintetizados 19
Figura 1-6: Espectro de 1H RMN del compuesto FVCl 23
Figura 1-7: Espectro de 13C RMN del compuesto FVCl 25
Figura 1-8: Espectro de masas LDI del compuesto FVCl 26
Figura 2-1: Espectro de absorción de los sistemas FV sintetizados 31
Figura 2-2: Espectro de emisión de los sistemas FV sintetizados 33
Contenido XV
Figura 3-1: Fotoionización y protonación del FVCOOH y la posterior transferencia del
protón al péptido. 38
Figura 3-2: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz
CHCA 39
Figura 3-3: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz
FVCOOH 40
Figura 3-4: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz
FVCOOH-CH3 40
Figura 3-5: Espectro de masas LDI del FVCOOH con adición de ácido trifluoroacético
(10% vol) 41
Figura 3-6: Espectro de masas LDI del FVCOOH-CH3 con adición de ácido
trifluoroacético (10% vol)
42
Figura 3-7: Acercamiento a las señales correspondientes a los experimentos de LDI,
donde se aprecia que las intensidades encontradas. 42
Figura 3-8: Dos posibles caminos de fotoionización del FVCOOH el primero es el de
protonación y el segundo corresponde a la formación del catión radical. 43
Figura 3-9: Espectro de masas MALDI de naftopireno 47
Figura 3-10: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando Naftopireno y
diferentes FV 48
Figura 3-11: Espectro LDI del HFB usando el 60% de la potencia del láser 49
Figura 3-12: Comparación del espectro LDI del HFB usando el 30% de la potencia del
láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH 50
Figura 3-13: Comparación del espectro LDI del HFB usando el 30% de la potencial del
láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH-CH3 51
Figura 3-14: Relación señal/ruido para experimentos MALDI de HFB usando FV como
matriz 51
Figura 3-15: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando Naftopireno 52
Figura 3-16: Espectros de análisis por masas MALDI con fluencia de láser del 30% para
el Rubreno 53
Figura 3-17: Porfirina de Níquel y sus rupturas más relevantes 54
XVI Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Figura 3-18: Espectro de masas LDI de la Porfirina de Níquel (arriba) y espectro de
masas MALDI 55
Figura 3-19: Relación/señal ruido, para la señal 898 m/z 56
Figura 3-20: Fotoionización de la matriz FV 58
Figura 4-1: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico 63
Figura 4-2: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico 65
Figura 4-3: Estructuras de los derivados de ácido acrílico sintetizados. 67
Figura 4-4: Estructura de AFu y las señales esperadas para los experimentos de
resonancia protónica. 68
Figura 4-5: Espectro de resonancia protónica para AFu. 69
Figura 4-6: Estructura de AFu y asignaciones para los carbonos. 70
Figura 4-7: Espectro de resonancia magnética de carbono para AFu 71
Figura 4-8: Espectro de masas LDI para AFu. 74
Figura 4-9: Espectros de absorción para los seis derivados de ácido acrílico. 75
Figura 5-1: Espectro MALDI de tres péptidos evaluados usando CHCA como matriz 81
Figura 5-2: Espectro LDI de ATio y espectro de masas MALDI de tres péptidos 82
Figura 5-3: Acercamiento al Espectro LDI de ATio 82
Figura 5-4: Estructura del péptido bradiquinina 84
Figura 5-5: Estructuras más estables encontradas para ATio 85
Figura 5-6: Espectro LDI de AFu y espectro de masas MALDI de tres péptidos 86
Figura 5-7: Estructuras más estables encontradas para AFu y AFuCN 87
Figura 5-8: Espectro LDI de AFuCN y espectro de masas MALDI de tres péptidos 88
Figura 5-9: Estructura del péptido bombesina 89
Figura 5-10: Espectro LDI de ATioCN y espectro de masas MALDI de tres péptidos 90
Figura 5-11: Estructuras más estables encontradas para ATioCN 91
Figura 5-12: Estructura más estable encontrada para CHCA 92
Contenido XVII
Lista de tablas
................................................................................................................ Pág.
Tabla i-1: Características de los compuestos más usados como matrices de MALDI para
donación a abstracción de protones. 6
Tabla 1-1: Comparación de rendimientos de síntesis 22
Tabla 1-2: Corrimientos de 1H RMN encontrados para las señales vinílicas de los FV
21
Tabla 2-1: Coeficientes de absortividad molar a 355nm para los sistemas FV sintetizados
y los reportados para las tres matrices MALDI más comunes 32
Tabla 2-2: Eficiencias cuánticas radiativas y no radiativas para los sistemas FV
sintetizados y los reportados para dos matrices MALDI comunes. 34
Tabla 3-1: Potenciales de ionización calculados para los tres FV y valor experimental
reportado para el antraceno, matriz MALDI común 45
Tabla 4-1: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido acrílico 69
Tabla 4-2: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido cianoacrílico 70
Tabla 4-3: Coeficientes de absortividad molar a 355 nm para cada uno de los derivados
de ácido acrílico 74
Tabla 5-1: Energías de afinidad protónica para las matrices empleadas en los
experimentos MALDI 91
Contenido XVIII
Lista de Símbolos y abreviaturas
A continuación se presenta la lista de símbolos y abreviaturas empleadas en el presente
trabajo.
Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI Definición
Da Unidad de masa atómica Kg 1.66×10−27
M Concentración Molar mol/m3 n/V
cm Centímetro M
Hz Unidad de frecuencia s 1/s
ppm Corrimiento químico Hz
h Hora S
eV Energía del electrón J 1.6×10−19 J
Ha Energía atómica J 4.35×10−18 J
Kcal Energía termodinámica J 4.184 J
Símbolos con letras griegas Símbolo Término Unidad SI Definición
micro 1/1000000
Orbital pi
conductividad kg−1·m−2·s3·A2
Coeficiente de absortividad molar M.cm-1
Contenido XIX
Subíndices Subíndice Término
Em Emisión
Abs Absorción
Rad Radiativo
Nrad No radiativo
Abreviaturas Abreviatura Término
FV Fenilenvinileno
FVCOOH Fenlenvinileno con ácidos en sus extremos
FVCl Fenilenvinileno con Cloro en sus extremos
MALDI Matrix assisted laser desorption/ionization
EM Espectrometría de masas
LDI Laser desorption/ionization
RMN Resonancia Magnética Nuclear
1H Resonancia Protónica
13C Resonancia de Carbono
Pf Punto de fusión
CHCA Ácido alfa ciano hidroxicinámico
AFu Derivado de ácido acrílico-Furano
AFuCN Derivado de ácido cianoacrílico-Furano
XX Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Abreviatura Término
ATio Derivado de ácido acrílico-Tiofeno
ATioCN Derivado de ácido cianoacrílico-Tiofeno
AITio Derivado de ácido acrílico-yodotiofeno
AITioCN Derivado de ácido cianoacrílico-yodotiofeno
NdYAG Granate de Neodimio, itrio y aluminio
Pd(dba)2 Bis(dibenzilidenoacetona)paladio(0)
Lit. Literatura
CCD Cromatografía de capa delgada
s Singlete
d Doblete
dd Doble doblete
DCTB trans-2-[3-(4-tert-Butilfenil)-2-metil-2-
propenilideno]malononitrilo
LED Diodo de emisión de luz
DFT Teoría funcional de densidad
B3LYP Becke, 3-parametro, Lee-Yang-Parr
HPA Hidrocarburo policíclico aromático
HFB Hexafluorobenceno
PNP Porfirina de Níquel-Pireno
Introducción
Para la espectrometría de masas, se emplean mayoritariamente metodologías de
ionización clásicas, pues se basan en un haz de electrones que impacta al analito
directamente, para generar el ión molecular de interés; debe tenerse en cuenta que éste
proceso no es selectivo y puede producir distintas especies o productos de
fragmentación. Este tipo de ionización clásica, resulta ser inoficioso para moléculas de
gran tamaño, como las proteínas que al ser impactadas por los electrones generan
demasiadas rupturas no específicas,1 y dificultan la determinación de la señal
correspondiente al ión de la molécula o ion molecular.
Debido a las limitaciones de las técnicas clásicas de ionización se ha intentado
establecer un camino para encontrar una herramienta que permita el análisis de
sustancias lábiles o susceptibles a reacciones de recombinación. Desde su
descubrimiento en 19852 por Hillenkamp y Karas la técnica de MALDI (Matrix assisted
laser ionization/desorption, por sus siglas en inglés) ha tomado una gran importancia y se
ha convertido en una herramienta casi inalienable de la bioquímica analítica y en el
análisis de policiclos aromáticos,3 debido a que ésta presenta una gran ventaja pues en
esta se tiene una ionización asistida por una matriz, en la que fotones de un láser
impactan sobre el analito que se encuentra disperso en fase sólida junto con una matriz,
y esta matriz ayuda en el proceso de desorción, además de ser partícipe y protagonista
del proceso de ionización. En la Figura i-1 se muestra un esquema que resume el
mecanismo general de ionización en MALDI respecto a la mayoría de técnicas clásicas
de ionización.
2 Introducción
Figura i-1: Esquema general del proceso de ionización. Arriba métodos clásicos, abajo
MALDI, donde A, B y C representan fragmentos del analito.
Una de las principales funciones de la matriz en el proceso MALDI, es la de absorber la
energía emitida por el láser empleado en el instrumento, donde los más comunes son el
de nitrógeno (N2, em= 337nm) y el de neodimio, dopado con itrio y aluminio (NdYAG,
em= 355nm). Una vez la matriz ha absorbido la luz del haz, la mayor parte de esta
energía es convertida en calor o puede emplearse en procesos de descomposición de la
matriz en múltiples productos gaseosos como CO2, los cuales han sido caracterizados
experimentalmente,4 y que terminan siendo los causantes de la desorción de la matriz
remanente, así como del analito. La desorción de estos productos gaseosos y los
remanentes genera una nube de matriz, analito y productos de descomposición. En la
Figura i-2, se aprecia a la izquierda (a y b) una serie de micrografías tomadas con
resoluciones de nanosegundos, durante un experimento de MALDI, empleando un láser
de NdYAG, en las que se puede ver la generación de la nube de compuestos, producidos
de la desorción; causada por el impacto del láser. Se muestra la evolución de la nube a
medida que transcurre el tiempo, siendo el tiempo inicial y final del experimento; 3 y 160
ns, respectivamente; a la derecha se aprecia una representación esquemática del
proceso de desorción y las posibles especies formadas.
Introducción 3
Figura i-2: Micrografías tomadas con resoluciones de nanosegundos, durante un
experimento de MALDI (izquierda)5 y esquema general del proceso de desorción y las
especies formadas (derecha).
Por su parte, el proceso de ionización no ha sido claramente definido aún, y se han
propuesto una variedad de modelos4 para explicar la generación de las especies
cargadas que posteriormente pasan al analizador de masas. Estos modelos tienen
algunas convergencias entre sí y estipulan que el proceso MALDI consta de dos pasos,
el primero es en el que se absorbe la luz durante la irradiación con el láser, y el cual debe
tener una duración del orden de décimas de nanosegundos. El segundo es el de las
reacciones secundarias, el cual ocurre durante la expansión de la nube generada, y que
toma tiempos de microsegundos.5
En el primer paso, se ha determinado para los distintos modelos propuestos, que las
moléculas de la matriz absorben la energía del láser, cumpliendo una función de buffer
en el que almacenan la energía. Debido a la generación de moléculas de matriz en
estado excitado, se encuentra que éstas después podrán transferir dicha energía a otras
moléculas, o disiparla en procesos radiativos como la emisión de luz o en procesos no
radiativos como la generación de calor. Por tanto es importante notar que en el primer
paso se obtiene la energía para generar las especies cargadas, y por esto la importancia
de que la matriz posea un alto coeficiente de absortividad molar, así como bajas
Láser de N2
Matriz y Analito
co-cristalizados
Matriz
excitada
Analito
cargado
Electrón
Protón
Analito
4 Introducción
eficiencias cuánticas radiativas. Se han propuesto mecanismos en los que se generan
clústeres de matriz, analito, y matriz cargada, en los que por medio de procesos de
transferencia de carga dentro del clúster, se generan especies del analito cargadas, que
posteriormente son desolvatadas de dicho clúster y son haladas hacia el analizador de
masas. En la Figura i-3 se muestra un esquema de la posible ruta de generación de
iones a partir de clústeres. 5
Figura i-3: Mecanismo de ionización basado en la generación de clústeres.5
Donde A
representa al analito, m representa la matriz, R especies radicales formadas en el evento
MALDI, mH+ la matriz protonada, x(m), y(m) y z(m) representan agregados de moléculas
de matriz y protones o algunos otros metales.
A las reacciones secundarias, la mayoría de modelos atribuyen la generación de las
especies cargadas del analito. Cuando la matriz se encuentra excitada, se espera que
para que pueda retornar a su estado basal, realice una transferencia de carga, que
puede ser en forma de electrón o en forma de protón. Si la matriz realiza la transferencia
de un electrón, es entonces conocida como una matriz de transferencia electrónica,
mientras que si esta dona o recibe un protón, es conocida como una matriz de
transferencia protónica.
Para el caso de la transferencia protónica, se dará sí la matriz cuenta con los grupos
sustituyentes apropiados para recibir un protón. Ésta durante el evento MALDI se
fotoexcitará, generando la especie protonada en la nube después de la expulsión de la
superficie del sólido. Luego durante las reacciones secundarias decaerá, transfiriendo la
Transferencia
de carga
dentro del
clúster
Ablación
Expansión Clústeres en
estado gaseoso Desolvatación
Suave
Fuerte
Sólido
Matriz-Analito
Introducción 5
carga en forma de protón según se muestra en la Figura i-4 debido a que el catión
protonado de la matriz en estado excitado, es mucho más ácido que la matriz en estado
basal.6
Figura i-4: Proceso de transferencia de carga en forma de un protón. Se presenta con el
CHCA que es la matriz MALDI de transferencia protónica más común.
M-H++A M + AH
+
Este proceso podrá darse con cualquier matriz que tenga los grupos funcionales con la
acidez suficiente en estado fotoexcitado para donar un protón o la menor energía de
afinidad protónica, y además la matriz debe interaccionar con los protones del analito a
ionizar, siendo las interacciones intermoleculares facilitadoras del proceso de
transferencia. En la Figura i-5 se muestra un esquema del ácido -ciano hidroxicinámico
(la matriz MALDI más común, CHCA por sus siglas en inglés), y las posibles
interacciones con una proteína. Donde el enlace peptídico en las subunidades proteicas
es uno de los lugares en los que mejor se puede realizar dicha interacción,7 así como
sobre los distintos grupos funcionales de cadenas laterales de los aminoácidos en los
péptidos.
Figura i-5: Posibles interacciones intermoleculares del CHCA, cuando es empleado
como matriz durante el análisis de una proteína.7
6 Introducción
En la Tabla i-1 se muestran las matrices más comúnmente empleadas en los análisis por
MALDI, con sus estructuras químicas. De la tabla se puede concluir que aún no existe
una matriz universal o de uso general con un numero apreciable de analitos y que
además, la selección de la matriz esta grandemente influenciada por la naturaleza
química del analito.
Tabla i-1: Características de los compuestos más usados como matrices de MALDI para
donación o abstracción de protones.
Compuesto Solvente Estructura Longitud
de onda
(nm) de
trabajo
Aplicación
Ácido 2,5-
dihidroxi
benzoico
acetonitrilo,
agua,
metanol,
acetona,
cloroformo
337, 355,
266
péptidos,
nucleótidos,
oligonucleótidos
oligosacáridos
Ácido 3,5-
dimetoxi-4-
hidroxicinámico
acetonitrilo,
agua,
acetona,
cloroformo
337, 355,
266
péptidos,
proteínas,
lípidos
Introducción 7
Ácido 4-hidroxi-3-
metoxicinamico
acetonitrilo,
agua,
propanol
337, 355,
266
proteínas
Continuación Tabla i-1
Ácido α-ciano-4-
hidroxicinámico
CHCA
acetonitrilo,
agua, etanol,
acetona
337, 355 péptidos,
lípidos,
nucleótidos
Ácido picolínico etanol
266 oligonucleótidos
Ácido 3-hidroxi
picolínico
etanol
337, 355 oligonucleótidos
Si la matriz no tiene grupos funcionales capaces de realizar la donación o la recepción
del protón, pero es una molécula que cumple con los requisitos anteriormente nombrados
y además posee un alto potencial de ionización, es probable que cuando alcance el
estado excitado, al estar el electrón en un nivel de energía alto, al que los químicos se
refieren como LUMO y al que los físicos denominan banda de conducción, pueda
transferirse el electrón de este orbital a otras moléculas de matriz, a productos de
descomposición, o que termine haciendo parte de los agregados o clústeres formados,
proceso conocido como fotoionización.4 La molécula de matriz fotoionizada se convierte
en un catión radical (A*+) altamente reactivo que puede seguir al segundo paso del
proceso MALDI, debido a que al tener un mayor potencial de ionización (PI) que los
8 Introducción
analitos, reaccionará con estos para restablecer su estabilidad, por medio de la recepción
de un electrón del analito. En la Figura i-6 se esquematiza el proceso de fotoionización, y
la ionización del analito.
Figura i-6: Esquema de ionización por transferencia electrónica.
M + nhv M*+
Fotoionización
M*+
+ A M + A*+
Ionización del analito
Limbach y col.8 han sugerido que la formación del catión radical del analito sólo ocurre si
la energía de recombinación de la matriz excede a la energía de recombinación del
analito. Estas energías de recombinación pueden ser relacionadas a los PI de la matriz
(M) y el analito (A); de allí que se tenga el conocido criterio postulado por ellos
PI(M)>PI(A), es decir, el potencial de ionización de la matriz debe ser siempre superior al
del analito a ionizar, y se tiene que a mayor diferencia entre dichos potenciales se
encontrará un aumento en la señal del ión molecular.
Las matrices más convencionalmente usadas son el antraceno (para transferencia
electrónica) y el CHCA (para transferencia protónica), pero estas dos matrices, así como
las anteriormente descritas; pueden presentar problemas de compatibilidad con el tipo de
moléculas a analizar.2 Estos problemas de compatibilidad suelen relacionarse con la
estructura química, puesto que en los procesos de transferencia protónica y electrónica la
interacción del analito y la matriz es fundamental para que se dé el proceso de
transferencia de carga.3-7 Es por esto que la investigación para la generación de nuevas
matrices es urgente e importante, ya que la concepción de nuevas matrices MALDI
permitirá ampliar el espectro de posibles analitos.
Sistemas fenilenvinileno (FV)
Figura i-8: Estructura general de un oligómero de FV.
Introducción 9
Los sistemas fenilenvinileno (FV) se encuentran entre los sistemas electrónicamente
conjugados más estudiados para la construcción de polímeros y oligomeros con
potenciales y comprobadas aplicaciones optoelectrónicas.9-11 Es bien conocido que los
procesos de fotoluminiscencia y electroluminiscencia dependen de múltiples factores
fisicoquímicos, entre los que se encuentran los coeficientes de absortividad molar, los
rendimientos cuánticos de fluorescencia y las longitudes de absorción máxima en el
espectro UV-Vis, entre otros. Los FV se presentan como óptimas estructuras químicas
con alta posibilidad de ajuste fino de las propiedades antes mencionadas.11,12
Si analizamos información experimental y teórica publicada en la literatura acerca de las
propiedades de los FV, podemos encontrar que Praveen y col.13 reportan una serie
interesante de oligómeros de FV con capacidad de hacer procesos de trasferencia de
energía en estado excitado, los mismos procesos que se considera que suceden en la
“nube” enunciada anteriormente durante el proceso MALDI. Además se encuentra
evidencia experimental publicada por Samori y col.14 en la que se muestra que sistemas
electrónicos conjugados como los estilbenos producen cationes radicales al ser
irradiados con un láser NdYAG a 355 nm.
Grozema y col.15 han descrito a partir de cálculos computacionales la formación de
especies positivas cargadas (cationes radicales) derivados de FV, que en estado
excitado mantienen altos coeficientes de absortividad molar y cambios menores en su
estructura molecular.
Los FV, son sin duda compuestos muy versátiles, pues mediante procedimientos
sintéticos se pueden obtener un sinnúmero de sistemas con gran variedad de grupos
sustituyentes y arquitecturas moleculares novedosas. Haciendo uso de esta versatilidad,
se han reportado sistemas FV con ajustes predeterminados en los corrimientos de los
máximos de absorción, emisión y Band-Gap a partir de la correcta funcionalización
química.16,17
Una interesante serie de estudios estableció que los FV presentan propiedades
promisorias en estado sólido: Amrutha y col.18 han descrito la formación de agregados de
FV a través de apilamiento y el mejoramiento de las propiedades optoelectrónicas
10 Introducción
debidas a éste fenómeno. Tretiak y col.19 han modelado procesos de excitación en
cadenas de polímeros de FV intercaladas entre sí, con distintas distancias entre las
cadenas; encontrando que la eficiencia de los procesos de transferencia de carga es
altamente efectiva. También se puede apreciar en la literatura, que se ha descrito
extensivamente la capacidad de los FV para realizar procesos de transferencia de carga
intra e intermolecular fotoinducidos.17-20
Todas estas propiedades tienen un rol importante en el proceso MALDI, y por eso se
puede plantear a los FV como potenciales y novedosas matrices. En el presente estudio
se mostrará cómo algunos sistemas FV que se sintetizaron a lo largo de este trabajo,
exhibieron interesantes posibilidades de aplicación como matrices de transferencia
electrónica. Cabe destacar que hasta ahora no existe en la literatura reporte alguno en el
que se haya empleado matrices MALDI basadas en FV de 2½ unidades de conjugación o
estructuras similares, así que el presente trabajo de investigación es pionero en el
empleo de estos FV y busca generar conocimiento fundamental a través de la
implementación de este tipo de sistemas no convencionales en esta rama importante de
la espectrometría de masas.
Derivados de ácido acrílico
En el capítulo 3 del presente documento el lector podrá encontrar los resultados de los
experimentos de transferencia protónica al emplear los FV como matrices MALDI. Debido
a que estos resultados no fueron tan contundentes como se esperaba y uno de los
objetivos de este trabajo era poder realizar experimentos de transferencia protónica, los
derivados de ácido acrílico surgieron como una posible respuesta a esta parte inconclusa
del trabajo.
Como se mostró con anterioridad en este documento, la estructura molecular de las
matrices MALDI más empleadas en experimentos de transferencia protónica se
caracteriza por tener al menos un anillo aromático. Esto ya había sido establecido con
anterioridad para las matrices, pues en 1996 Krause y col.21 realizaron un estudio
comparativo entre compuestos con alto potencial como matrices MALDI y encontraron
que uno de los requisitos imprescindibles de cualquier compuesto a evaluar como matriz,
Introducción 11
era la presencia de enlaces conjugados, debido a la necesidad de procesos de absorción
de energía proveniente del láser, el cual se encuentra en la región del UV. Sí se evalúa la
literatura publicada en la última década, no es posible encontrar una cantidad importante
de moléculas postuladas como matrices MALDI que presenten nuevas estructuras, y por
el contrario, la mayoría de estos reportes se basan en estructuras análogas al CHCA. Un
claro ejemplo de esto son los artículos de Jaskolla y col.22,23 en los que se reporta como
promisorio el ácido ciano clorocinámico, difiriendo del CHCA solamente en el
sustituyente, puesto que presenta en su estructura un átomo de cloro en lugar del grupo
hidroxilo en la posición 4 del anillo.
En este aspecto, sólo se puede destacar como novedoso el aporte hecho por Francese y
col.24 en el que encontraron que la curcumina presentaba un potencial uso como matriz
MALDI con algunos tipos de proteínas. Aunque debe tenerse en cuenta que la estructura
de la curcumina es análoga a la de las matrices convencionales, ya que podría verse
como la unión de un par de derivados cinámicos y por tanto se podría decir que sigue el
patrón de la mayoría de matrices de transferencia protónica.
Anteriormente en los trabajos de Jaskolla y col.23 se encontró que la modulación del
máximo de absorción de las moléculas análogas al CHCA por funcionalización química
del anillo bencénico fue poco eficiente, y en todas las moléculas sintetizadas generó
resultados de absorción inferiores al CHCA. Por tanto es importante establecer si el uso
de otro tipo de anillo aromático en lugar del anillo bencénico en la estructura molecular
del CHCA puede llevar a mejorías en las propiedades de absortividad molar, así mismo
como en las energías de afinidad protónica y por ende aumentar su eficiencia como
matriz MALDI.
Un buen indicio de que el cambio en el anillo aromático es un excelente camino a seguir
es el hecho de que ácidos acrílicos con estructura análoga al CHCA, pero con anillos de
tiofeno o furano en lugar del anillo bencénico han exhibido propiedades interesantes de
absortividad.25 Adicionalmente Paizs y col.25 encontraron que los derivados acrílicos con
tiofeno y furano presentaban interacciones moleculares con la fenilalanina de una serie
de péptidos. Así mismo Sharma y col. 26 determinaron la afinidad que presentan este tipo
de derivados de ácido acrílico con lipasas porcinas. Todas estas posibles interacciones
postulan a los derivados de ácido acrílico como moléculas con potencial de establecer
12 Introducción
interacciones moleculares que son necesarias durante el proceso de protonación de
péptidos y proteínas durante el proceso MALDI.
Por todo lo anterior, este trabajo busca establecer si los derivados de ácido acrílico que
tengan en su estructura anillo aromático con heteroátomos pueden ser matrices MALDI
de transferencia protónica eficientes.
Figura i-9: Estructura general de un derivado de ácido acrílico heterocíclico.
Alcance esperado del trabajo
Actualmente las matrices MALDI disponibles en el mercado (mostradas anteriormente en
la Tabla i-1) presentan limitaciones respecto a la estructura química del analito con las
cuales se pueden utilizar, principalmente debido a parámetros de solubilidad y a la
metodología de ionización a la que sea susceptible el analito. Por lo tanto, el presente
trabajo busca establecer la relación de la estructura química de las moléculas diseñadas
con sus propiedades y su capacidad de realizar procesos de transferencia electrónica o
protónica en procesos MALDI.
En el campo de las matrices de transferencia protónica, este tipo de investigación es
importante en nuestro país, puesto que el desarrollo de nuevas matrices MALDI que
puedan realizar transferencia protónica podría dotar a los investigadores en biotecnología
y ciencias biológicas del país con una matriz accesible y producible en nuestro territorio.
Además puede generar como aporte nuevas estructuras químicas que permitan a la
Introducción 13
comunidad científica en general aumentar el espectro de analitos que sean susceptibles
a ser evaluados por estas metodologías analíticas.
El desarrollo de esta investigación también llevo a aportar en otra área muy importante
para el país: el análisis de crudos pesados del petróleo. En esta área se usan matrices
de transferencia electrónica, pero las tres matrices más utilizadas en esta técnica
también presentan grandes limitaciones en cuanto a la cantidad de analitos que pueden
identificar.
Según el informe de 2013 de la agencia nacional de hidrocarburos la producción de
crudo pesado representa cerca del 40% del volumen total de crudo producido en
Colombia.26 Esto es sin duda un problema porque este tipo de crudos es rico en
compuestos policíclicos aromáticos, de los cuales en su mayoría se desconoce su
estructura química y su masa molecular. Dotar al país con una matriz que permita
desarrollar análisis de perfiles de masa molecular de los componentes presentes en este
tipo de crudos significaría un avance tecnológico muy importante, a razón de que el
procesamiento de este tipo de crudos por métodos de hidrogenación es más eficiente si
se conoce el perfil de masas moleculares del crudo.
Se espera que con los resultados de la presente investigación se pueda generar
conocimiento que lleve al desarrollo de nuevas matrices MALDI que puedan ser
implementadas para el análisis de distintos tipos de analitos de importancia para el país,
así como al desarrollo universal del campo.
1. Síntesis de sistemas FV
En el presente capítulo se presentan los procesos de síntesis y caracterización
estructural para los FV, realizados a lo largo del presente trabajo de investigación. Se
describen además los procesos para la obtención de los distintos precursores
empleados.
1.1 Materiales
1.1.1 Reactivos
Los compuestos necesarios para la síntesis de los distintos precursores y productos
fueron adquiridos como se describe a continuación: p-xileno, tereftalaldehido,
dimetoxibenceno, tert-butóxido de potasio, cloroformo, hexano, acetato de etilo y
metanol fueron adquiridos de Merck (Darmstadt, Alemania). Paladio tipo Pd(dba)2, trifenil
fosfito y ácido 4-vinil benzóico fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Nueva Jersey,
EEUU). El bromuro de metil trifenilfosfonio, 4-yodo benzoato de metilo, peryodato de
sodio y tetrahidrofurano fueron adquiridos de Panreac (Barcelona, España).
1.1.2 Equipos
Los puntos de fusión (P.f) fueron medidos en un fusiómetro Stuart SMP10. Los espectros
de resonancia magnética nuclear (RMN) fueron tomados en un espectrómetro Bruker
Avance 400 usando TMS como estándar interno. Para las pruebas de espectrometría de
masas MALDI se empleó un espectrómetro de masas Bruker UltraFlex con analizador de
tiempo de vuelo. Se realizó un barrido entre 180-2000Da, usando el analizador en modo
reflectrón y el detector en modo positivo. La intensidad del láser fue del 5% por encima
del umbral de ionización para cada muestra, con el fin de reducir la fragmentación y
aumentar la resolución. Para determinar el peso molecular de los FV se usó la técnica
LDI (laser desorption/ionization) puesto que no se usó matriz, sino que ellos cumplieron
también esta función.
16 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Figura 1-1: Esquema general de síntesis de sistemas FV.
Se realizó la síntesis de tres sistemas FV, partiendo de los aldehídos correspondientes
para la síntesis de los estirenos necesarios en la reacción de acoplamiento.
Paralelamente, se sintetizaron dos compuestos yodo aromáticos necesarios a través de
una reacción de sustitución electrofílica aromática. Una vez caracterizados las dos series
de precursores necesarios se procedió a la realización de la reacción de acoplamiento
carbono-carbono a través de la reacción de Mizoroki-Heck y así se obtuvieron los
sistemas FV objetivo.
1.2 Síntesis de estirenos precursores
Procedimiento general:
Bajo una atmósfera de N2 a temperatura ambiente, 1 equivalente de bromuro de metil
trifenilfosfonio fue agregado lentamente a una solución de 2 equivalentes de tert-
butóxido de potasio en THF. La mezcla de reacción fue agitada durante 15 minutos antes
de la adición de 1 equivalente del respectivo aldehído 4-sustituido. La mezcla resultante
se agitó a 60°C durante 18 horas, al cabo de ese tiempo se dejó enfriar a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción resultante se filtró, y el sólido obtenido se lavó 3 veces
con n-hexano. El filtrado y los lavados con hexano fueron combinados. Empleando
destilación a presión reducida el solvente se retiró, obteniendo un sólido blanco-crema.
Finalmente, una purificación por cromatografía en columna con el eluyente descrito para
Capítulo 1 17
cada uno, y la posterior concentración de las fracciones permitió obtener el respectivo
estireno.
Figura 1-2: Síntesis de los estirenos.
1.2.1 4-Cloroestireno
Se partió de un equivalente de 4-clorobenzaldehido y uno de bromuro de metil
trifenilfosfonio. Este estireno se obtuvo como un aceite incoloro. Eluyente: acetato de
etilo:n-hexano (2:9). Rendimiento: 78%. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 5.29 (d, 1H
J=10.6 Hz), 5.75 (d, 1H J=17.2 Hz), 6.69 (dd, 1H J=17.2 Hz), 7.29 (d, 2H), 7.31 (d, 2H).
RMN 13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 114.4, 127.4, 128.4, 133.4, 135.7, 136.0. FTIR (cm-
1): 3098-3012 (C-H), 1641 (C=C), 743 (C-Cl).
1.2.2 p-Divinilbenceno
Se partió de 1 equivalente de tereftalaldehido y 2 equivalentes de bromuro de metil
trifenilfosfonio. Este estireno se obtuvo como un sólido blanco de bajo punto de fusión
(aprox. 30°C). Eluyente: n-hexano. Rendimiento: 68%. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, :
ppm): 5.28 (d, 2H), 5.79 (d, 2H J=17.6 Hz), 6.75 (dd, 2H J=17.6 Hz), 7.41 (s, 4H). RMN
13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 113.7, 126.4, 136.5, 137.1. FTIR (cm-1): 3025-2980 (C-
H), 1612 (C=C).
18 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
1.3 Yodación de compuestos aromáticos
Procedimiento general:
En un balón de tres bocas, una mezcla de 2 equivalentes de yodo, 1 equivalente de
peryodato de potasio y 1 equivalente del respectivo dialquil o dialcoxi benceno, se agitó
en una solución de ácido acético glacial, agua y ácido sulfúrico (10:1:0.1). La mezcla se
llevó a reflujo durante 12 horas. Luego fue enfriada hasta temperatura ambiente y una
solución del bisulfito de sodio (10%) fue adicionada. El producto fue aislado por filtración,
y posteriormente se lavó tres veces con agua destilada. La recristalización usando el
solvente descrito permitió obtener el producto esperado.
Figura 1-3: Esquema general de la reacción de yodación.
1.3.1 1,4-Diyodo-2,5-dimetoxibenceno
Se partió de 1,4-dimetoxibenceno. Recristalización en etanol-cloroformo (1:1) dio el
compuesto en forma de sólido blanco crema. Rendimiento: 75%. P.f. 174-176 °C Lit. 102-
103 °C27. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 3.81 (s, 6H), 7.67 (s, 2H). RMN 13C
(CDCl3, 100 MHz, : ppm): 26.9, 100.7, 139.3, 140.6. FTIR (cm-1): 3012-3085 (C-H arom),
2948-2896 (C-H alq), 1498 (C=C), 1060 (C-O), 812 (C-I)
1.3.2 1,4-Diyodo-2,5-dimetilbenceno
Se partió de 4-dimetilbenceno. Recristalización en ciclohexano dio el compuesto como un
sólido en forma de agujas blancas. Rendimiento: 78%. P.f. 103-104 °C. Lit. 102-103 °C27
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 2.36 (s, 6H), 7,67 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 100
Capítulo 1 19
MHz, : ppm): 26.9, 100.7, 139.3, 140.6. FTIR (cm-1): 3052-2890 (C-H), 1468 (C=C), 842
(C-I)
1.4 Esterificación de ácido vinilbenzóico
1.4.1 Metil-4-vinilbenzoato
Una mezcla de ácido 4-vinilbenzoico y ácido sulfúrico (1% mol) en metanol fue puesta en
reflujo durante 12 h. Después de enfriarse, la mezcla resultante fue extraída con
diclorometano, y la fase orgánica lavada con bicarbonato de sodio (10%, 3x10mL) y
secada con sulfato de sodio anhidro, para posteriormente remover el solvente por
destilación a presión reducida, para dar el éster como un sólido blanco de bajo punto de
fusión y aroma a anís. P.f. 30°C. Lit. 29-30ºC.28 RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 3.91
(s, 3H), 5.40 (dd, 2H), 5.86 (dd, 2H), 6.74 (dd, 1H), 7.46–7.44 (m, H), 8.03–7.98 (m, H).
RMN 13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 52.2, 116.6, 126.2, 129.4, 130.0, 136.1, 142.0,
167.0.
Figura 1-4: Esterificación del ácido vinilbenzóico.
1.5 Reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck
Procedimiento general:
A una mezcla de Pd(dba)2 (1% mol), trifenilfosfito (10% mol) y trietilamina (5
equivalentes) en DMF seco bajo atmósfera de N2, fueron adicionados el estireno
apropiado y el respectivo derivado yodoaromático en las relaciones molares establecidas
en cada caso. La mezcla se agitó a 120ºC hasta la desaparición de los precursores
según seguimiento por cromatografía en capa delgada (CCD). La mezcla de reacción se
20 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
dejó enfriar a temperatura ambiente, y luego fue vertida en HCl (5%), para dar un
precipitado, el cual fue colectado, lavado, secado y resolubilizado. La solución obtenida
se filtró sobre celita y el solvente se retiró por destilación a presión reducida.
Figura 1-5: Reacciones de Mizoroki-Heck para los distintos ésteres de FV sintetizados
1.5.1 E,E-2,5-Dimetoxi-1,4-bis[2-(4-cloroestiril)] benceno (FVCl)
Se partió de 2 equivalentes de 4-cloroestireno y 1 equivalente de 1,4-diyodo-2,5-
dimetoxibenceno. Tiempo de reacción: 32 h. Sólido verde brillante, recristalizado en
metanol. Rendimiento: 95%. P.f. 220-223ºC, Lit. 212ºC.29 RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, :
ppm): 3,95 (s, 6H), 7,09 (d, 2H, J= 16,4Hz), 7,12 (s, 2H), 7,34 (d, 4H), 7.48 (m, 6H). RMN
13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 56.2, 109.7, 123.7, 126.3, 127.8, 128.8, 132.9, 136.0,
151.5. Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 410.081 Encontrado: 410.087. FTIR
(cm-1): 3030-2912(C-H), 1501(C=C), 976 (trans alqueno), 756 (C-Cl).
1.5.2 E,E-1,4-Bis[2-(4-metil carboxilatoestiril)] benceno (FVCOOMe)
Se partió de 1 equivalente de 1,4-diyodo-2,5-dimetilbenceno y 2 equivalentes de metil-4-
vinilbenzoato. Tiempo de reacción: 48 h. Sólido amarillo claro recristalizado en tolueno.
Rendimiento: 91%. P.f. 232-234ºC. Lit. 236-237°C.30 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, :
ppm): 4.33 (s, 6H), 7.32 (d, 2H J=16.8 Hz), 7.41 (d, 2H J=16.8 Hz), 7,68 (s, 4H), 7,97 (d,
4H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 20.13, 61.5, 126.9, 128.06, 128.96, 129.3,
129.89, 130.6, 134.55, 136.11, 142.62, 166.98. Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado:
398.152. Encontrado: 398.156.
Capítulo 1 21
1.5.3 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(metil-4-carboxilato estiril)] benceno (FVCOOMe-CH3)
Se partió de 1 equivalente de divinilbenceno y 2 equivalentes de metil-4-yodobenzoato.
Tiempo de reacción: 46 h. Sólido azul recristalizado en tolueno. Rendimiento: 88%. P.f.
243-245ºC. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 2.45 (S, 6H), 4,39 (s, 6H), 7,28 (d,
2H J=16.2 Hz) 7,52 (d, 2H J=16.2 Hz), 7.62 (s, 2H), 7.76 (d, 4H), 7.93 (d, 4H). RMN 13C
(DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 20.11, 60.83, 125.93, 127.32, 127.93, 129.40, 130.18,
130.68, 136.55, 141.89, 167.86. Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 426.183
Encontrado: 426.191.
1.6 Hidrólisis de ésteres FV
Puesto que con la reacción de Mizoroki-Heck se obtuvieron dos ésteres FV precursores,
se realizó la hidrólisis de cada uno de estos para obtener lo respectivos ácidos FV de
interés.
Procedimiento general:
A una solución de un equivalente del respectivo FV éster en THF:H2O:MeOH (1:1:1) se
agregaron 5 equivalentes de KOH. La mezcla resultante se agitó a reflujo durante la
noche; luego se neutralizó con HCl (10% vol). El precipitado fue colectado y purificado
por recristalización en tolueno.
1.6.1 E,E-1,4-Bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH)
Se partió de FVCOOMe, después de 14h de fuerte agitación se evidenció la aparición de
un sólido azul claro, el cual fue recristalizado en tolueno. Rendimiento: 97%. P.f. 271-273
Lit 270-272 °C.53 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 7.38 (d, 2H J=16.8 Hz), 7,45 (d,
2H J=16.8 Hz), 7,69 (S, 4H), 7,74 (d, 4H), 7,95 (d, 4H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :
ppm): 126.7, 127.5, 127.9, 129.8, 130.0, 130.8, 136.7, 141.7, 167.3. FTIR (KBr, cm-1):
3253 (O-H), 3073 (C-H arom.), 2919 (C-H alquil), 1673 (C=O), 1035 (C-O), 952 (C=C
trans). Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 370.121, Encontrado: 370.156.
22 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
1.6.2 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH-CH3)
Se partió de FVCOOMe-CH3, después de 16 h de fuerte agitación se pudo apreciar la
aparición de un sólido verde claro. Recristalizado en tolueno. Rendimiento: 98%. P.f. 258-
260. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 2,45 (s, 6H), 7,26 (d, 2H J=16.2 Hz), 7.53 (d,
2H J=16.2 Hz), 7,61 (s, 2H), 7,76 (d, 4H), 7,94 (d, 4H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :
ppm): 19.0, 126.5, 127.2, 127.9, 129.7, 133.7, 167.1. FTIR (KBr, cm-1): 3233 (O-H), 3018
(C-H arom.), 2943 (C-H alquil), 1678 (C=O), 1072 (C-O), 953 (C=C trans). Peso
Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 398.152, encontrado: 398.114.
1.7 Discusión de resultados para la síntesis de FV
Todos los precursores sintetizados fueron caracterizados y los que ya habían sido
reportados fueron comparados respecto a la literatura. Todas las reacciones fueron
realizadas con precursores de identidad comprobada, como se describe en cada uno de
ellos. Los espectros resultantes de las caracterizaciones, en aras de la brevedad, pueden
ser encontrados en el anexo 1 de este documento.
1.7.1 Síntesis de sistemas FV
Para la síntesis de los sistemas FV se partió de condiciones experimentales previamente
evaluadas en el grupo de investigación en macromoléculas de la Universidad Nacional de
Colombia.31 Para la reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck, se encontró que bajo las
condiciones empleadas el producto presentaba poca solubilidad, permitiendo separar un
producto de alta pureza que no requería purificación por procedimientos engorrosos
como la cromatografía en columna, sólo una simple recristalización fue necesaria para
cada compuesto. Por lo anterior, los rendimientos que se obtuvieron fueron altos y
superiores a los reportados en literatura, como se evidencia en la Tabla 1-1.
Capítulo 1 23
Tabla 1-1: Comparación de rendimientos de síntesis
FV Rendimiento Obtenido (%) Rendimiento Reportado (%)
FVCl 95 4029
FVCOOH 91 5330
FVCOOH-CH3 88 No se ha reportado
Los resultados de síntesis obtenidos fueron satisfactorios, y aunque se realizó evaluación
espectroscópica de todos los sistemas FV obtenidos, se presentan y discuten a
continuación solamente los resultados para el compuesto FVCl, por similitud con los otros
FVs y sencillez del texto. Los análisis estructurales para los otros sistemas hacen parte
del anexo 1 del presente trabajo.
Para el compuesto FVCl se encontraron todas las señales esperadas en el análisis por
resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMN 1H), los cuales son mostrados en la
Figura 1-6. En estos se aprecia la aparición de una señal tipo singlete a 3.95 ppm
correspondiente a los tres hidrógenos del metoxilo sustituyente del anillo central del
sistema FV. La primera señal vinílica se aprecia como un doblete a 7.09 ppm con
constante de acoplamiento de 16.4 Hz, que da clara muestra de que el producto tiene los
dobles enlaces en configuración trans como se espera debido a la estereoselectividad de
la reacción de Mizoroki-Heck usada en la síntesis. La segunda señal vinílica F del
compuesto FVCl aparece a 7.46 ppm solapada con la señal correspondiente a los
hidrógenos orto respecto al cloro en los anillos de los extremos de la molécula que en la
Figura 1-6 aparece como la señal E (7.48 ppm). Finalmente, las otras dos señales
aromáticas; una correspondiente a los hidrógenos en orto al grupo metoxilo del anillo
central, aparece a campo más bajo debido a la influencia del grupo electrodonor metoxilo
que activa en orto y por eso aparece a 7.12 ppm como un singlete; mientras que la
segunda señal correspondiente a los hidrógenos en meta respecto al cloro de los anillos
de los extremos de la molécula, aparece como un doblete a 7.34 ppm.
24 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Para los otros dos sistemas FV sintetizados en este trabajo (FVCOOH y FVCOOH-CH3)
se presenta en la Tabla 1-2 los valores de las señales vinílicas y sus respectivas
constantes de acoplamiento, permitiendo comprobar la conformación trans de los
sistemas sintetizados.
Figura 1-6: Espectro de RMN 1H del compuesto FVCl
.
Tabla 1-2: Corrimientos de 1H RMN encontrados para las señales vinílicas de los FV
FV Señal vinílica (ppm)
Constante acoplamiento (Hz)
FVCl 7.09, 7.46 16.4
FVCOOH 7.38, 7.45 16.8
FVCOOH-CH3 7.26, 7.56 16.2
El análisis de resonancia magnética de carbono (RMN 13C) para la molécula FVCl
(Figura 1-7), permitió corroborar la estructura molecular del compuesto, pues en primer
lugar se evidencia la señal a 56 ppm correspondiente a los carbonos de los grupos
metoxilos del anillo central de la molécula y la señal de 151.5 ppm correspondiente al
A
C
B
D
F
E
Capítulo 1 25
carbono en el que se encuentra el grupo metoxilo en el anillo aromático central. La señal
correspondiente al carbono del anillo aromático unido al cloro fue asignada siguiendo los
valores reportados en literatura para moléculas análogas,30 correspondiendo a la señal de
136.0 ppm. Otra señal importante es la del carbono H, que es el carbono en posición orto
a los sustituyentes metoxilo que presenta un corrimiento a 109 ppm debido al efecto de
estos grupos, que son electrodonores y realizan efecto en posición orto, y por tanto
aumentan la densidad electrónica de dicho carbono, haciendo que la señal se desplace a
campos más bajos. Las demás señales correspondientes a los corrimientos a 123.7,
126.3, 127.8, 128.8 y 132.9 ppm, son corrimientos típicos para carbonos que hacen parte
de sistemas conjugados; destacándose la aparición de señales muy similares y cercanas
correspondientes a los carbonos vinílicos en 126.3 y 127.8 ppm.
Estas caracterizaciones espectroscópicas permitieron determinar la formación del enlace
carbono-carbono a través de la reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck y por tanto
permitieron demostrar el éxito de las síntesis realizadas en la primera parte del presente
trabajo de investigación. El análisis por espectrometría de masas permitió además
comprobar el doble acoplamiento durante la reacción para obtener un producto de peso
molecular correspondiente a 410,051 m/z y con una distribución isotópica como se
esperaría para un producto con dos cloros sustituyentes con una intensidad de 100%
para el ion molecular de los isotopos más comunes y la presencia de las señales a
410.051 m/z (100%) y 412.049 m/z (63%), permitiendo identificar la molécula sintetizada
como se aprecia en la Figura 1-8.
26 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Figura 1-7: Espectro de 13C RMN del compuesto FVCl
Es importante tener en cuenta que este análisis se realizó por la técnica LDI empleando
un equipo de espectrometría de masas MALDI, en el que la muestra se prepara sin el
uso de matriz, pues se espera un proceso de autoionización,4 es decir, la misma
molécula funciona como matriz, ionizándose y permitiendo ver el ión molecular de sí
misma. Igual procedimiento se llevó a cabo para identificar los otros dos FV. En el tercer
capítulo del presente trabajo se abordarán en detalle los resultados para los análisis por
espectrometría de masas MALDI cuando estos FV actúan como matrices, así como los
novedosos resultados encontrados en esta investigación.
I
A
B
C
G H F
E
H
Capítulo 1 27
Figura 1-8: Espectro de masas LDI del compuesto FVCl
En la Tabla 1-3 se muestran los valores m/z de la señal esperada y encontrada para el
ión molecular de los tres FV. Todos corresponden adecuadamente a los valores
esperados. Como se pudo demostrar en este capítulo haciendo uso de las herramientas
de caracterización estructural, la síntesis de los tres sistemas FV fue exitosa y permitió
seguir adelante con los objetivos de esta investigación.
Tabla 1-3: Señales del ion molecular encontradas para los FV
FV Señal m/z encontrada Señal m/z esperada
FVCl 410.051 410.084
FVCOOH 370.156 370.121
FVCOOH-CH3 398.114 398.152
410.051
412.049
682.097512.093578.063
0
2
4
6
8
4x10
Inte
ns. [a
.u.]
200 300 400 500 600 700 800 900m/z
28 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Capitulo 2 29
2. Caracterización optoelectrónica de los sistemas FV
En este capítulo se detallan los resultados correspondientes a las pruebas de
caracterización optoelectrónica que permitieron determinar los coeficientes de
absortividad molar a 355 nm; así como los resultados de la determinación de las
eficiencias cuánticas radiactivas para los sistemas FV sintetizados en este trabajo.
2.1 Materiales y métodos
2.1.1 Absortividad molar
Se preparó una serie de diluciones de cada FV en dimetilsulfóxido (DMSO, grado
analítico, Merck) en el rango de 10-4000μM. La absorbancia de cada una de las
soluciones se midió a 355 nm, en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2401C de doble
canal. Se emplearon celdas de cuarzo de 10mm de camino óptico. Se usó DMSO en la
celda de referencia como blanco.
La determinación del coeficiente de absortividad molar se realizó partiendo de la ley de
Beer-Lambert, construyendo la curva de absorbancia en función de la concentración en
un rango entre 0.01 y 0.8 unidades de absorbancia donde se cumple la linealidad de
dicha ley permitiendo a partir de la pendiente de la recta de regresión, determinar el
coeficiente de absortividad molar a una longitud de onda determinada.
2.1.2 Rendimientos cuánticos de fluorescencia
Se prepararon soluciones diluidas de las moléculas en dimetilsulfóxido (DMSO, grado
analítico, Merck) entre 2–20 μM. Como fluoróforo de referencia se usó sulfato de quinina
debido a que se realiza la determinación empleando un método comparativo.32 Las
30 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
soluciones de antraceno se prepararon en etanol (grado analítico, Merck), a su vez, las
soluciones de sulfato de quinina se prepararon en H2SO4 0.1M (agua desionizada, tipo I,
18.2 Ωcm).
Los rendimientos cuánticos de fluorescencia o radiativos para los sistemas FV
sintetizados fueron estimados por el método descrito por Williams y col.32 usando la
siguiente ecuación.
Donde es el rendimiento cuántico radiativo, es la pendiente de la curva construida al
graficar el área bajo la curva del espectro de emisión en función de la absorbancia a la
longitud de onda de excitación para el sistema FV así como la sustancia de referencia.
es el valor de rendimiento cuántico de la referencia. Los valores para construir la
curva se obtienen a partir de la medición de soluciones del FV en un rango de
concentración determinado, así como para la sustancia de referencia. El término es el
índice de refracción del disolvente en el que se hace la medida para los sistemas y la
sustancia de referencia. La eficiencia cuántica no radiativa es asumida como:
Donde representa la eficiencia cuántica radiativa, obtenida por el método de
Williams, como se describió anteriormente.
2.2 Resultados de propiedades optoelectrónicas
Como se describió en la introducción de este trabajo, aunque no se ha encontrado una
estructura ideal definida para la matriz a emplear en MALDI, se tiene conocimiento de
que debe contar con ciertas propiedades optoelectrónicas,2 entre las que se destaca
poseer altos coeficientes de absortividad molar a la longitud de onda del láser empleado
en el equipo (en el caso presente láser NdYAG de 355 nm) para así poder realizar de
forma eficiente el proceso de fotoionización, para luego a través de las reacciones
secundarias, ionizar el analito a evaluar.
Capitulo 2 31
Aunque los altos coeficientes de absortividad molar son comunes en sistemas
conjugados similares a los FV,11 es importante corroborarlo para poder establecer con
certeza su potencialidad como matrices MALDI.
Figura 2-1: Espectro de absorción de los sistemas FV sintetizados en el presente trabajo
Los espectros de absorción en el UV-Vis (Figura 2-1) permitieron apreciar que los tres
sistemas presentaban máximos de absorción en zonas cercanas a la longitud de onda
del láser empleado en los experimentos MALDI (línea punteada en la Figura 2-1). El
compuesto FVCl presentó un máximo de absorción a 398 nm, el compuesto FVCOOH a
378 nm y el compuesto FVCOOH-CH3 a 362 nm. Debe destacarse que aunque el
máximo de las moléculas sintetizadas en este trabajo no se situó exactamente en los 355
nm, todas ellas presentan absorciones altas a esta longitud de onda.
Los coeficientes de absortividad a 355 nm determinados para los compuestos FV son
presentados en la Tabla 2-1 junto con los valores de los coeficientes de absortividad
molar para tres de las matrices MALDI más comunes. Se aprecia que las moléculas
sintetizadas en esta investigación presentan valores de absortividad molar similares
(caso FVCl y FVCOOH) o superior por casi el doble del valor del DCTB para el caso del
32 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
FVCOOH-CH3; Proponiéndolas como candidatas interesantes para su uso como
matrices MALDI.
Tabla 2-1: Coeficientes de absortividad molar ( ) a 355nm para los sistemas FV
sintetizados y los reportados para las tres matrices MALDI más comunes.
Compuesto [M-1cm-1]
FVCOOH-CH3 4,25X104
FVCOOH 2,80x104
FVCl 2,27x104
Antraceno33 4,98x103
DCTB 2.63x104
CHCA34 1.78x104
La eficiencia cuántica de fluorescencia es una medida directa de la relación entre
los fotones absorbidos por la molécula respecto a la cantidad de fotones que emite la
molécula al relajarse en procesos de corto tiempo y pasar del estado excitado al basal.
Los valores de eficiencia cuántica son igualmente importantes a los coeficientes de
absortividad molar para una matriz MALDI de transferencia electrónica, puesto que
dependiendo de lo que suceda con la matriz MALDI en estado excitado, se evaluará su
correcto desempeño. Si la matriz tiene un alto valor de se tiene que la mayoría de
fotones absorbidos son emitidos como fotones de longitud de onda mayor. Este caso es
el ideal para un dispositivo electrónico como un LED,35 puesto que asegura buenas
propiedades para su función como emisor. En el evento MALDI al tenerse un proceso de
fotoionización se desea que la molécula que funciona como matriz no emita la energía
que absorbió, sino que pueda emplearla para realizar la reacción bimolecular de
Capitulo 2 33
ionización del analito;6 es decir si la molécula presenta una alta eficiencia cuántica
radiativa, es una candidata pobre como matriz MALDI, mientras que sí su rendimiento
cuántico radiativo es bajo; se espera que la mayor parte de la energía absorbida se
emplee en el proceso de ionización.
Figura 2-2: Espectro de emisión de los sistemas FV sintetizados en el presente trabajo
Los espectros de emisión de los sistemas FV que se aprecian en la Figura 2-2 muestran
emisiones centradas en el azul (cerca de 450nm). Los rendimientos cuánticos radiativos
y no radiativos, obtenidos son presentados en la Tabla 2-2 y se aprecia que los valores
para las eficiencias cuánticas no radiativas son altos y superiores a los radiativos;
además son similares a los reportados para el antraceno que es una matriz de
transferencia electrónica muy empleada. El valor de eficiencia cuántica radiativa para el
trans-2-[3-(4-tert-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno] malononitrilo (DCTB, por sus siglas en
inglés) que es otra de las matrices más comúnmente empleadas; es significativamente
más bajo que los valores para los FV, pero es consistente con la naturaleza de la
molécula que es menos conjugada que los sistemas FV empleados en el presente
trabajo. Adicionalmente la presencia de un grupo sustituyente nitrilo como se ha
mostrado en literatura reciente sirve para disminuir el rendimiento cuántico radiativo.36
34 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Los valores experimentales de los parámetros optoelectrónicos establecidos para los FV
en este capítulo, permiten establecer el potencial de los mismos para ser empleados en
experimentos como matrices MALDI.
Tabla 2-2: Eficiencias cuánticas radiativas y no radiativas para los sistemas FV
sintetizados y los reportados para dos matrices MALDI comunes.
Compuesto
FVCOOH 0.29 0.71
FVCOOH-CH3 0.38 0.62
FVCl 0.52 0.48
Antraceno33 0.28 0.72
DCTB 0.01 0.99
Capítulo 3 37
3. Análisis de espectrometría de masas MALDI usando los sistemas FV como matrices.
En el presente capítulo se presentan los resultados obtenidos en experimentos de
espectrometría de masas MALDI en los que se emplearon los sistemas FV sintetizados
como matrices.
3.1 Análisis de proteínas empleando sistemas FV como matrices MALDI
3.1.1 Materiales y Métodos
Se prepararon soluciones de 1000ppm de los FV en acetonitrilo:agua (2:1) con adición de
ácido trifluoroacético (0.1% vol). Dried droplet fue la técnica usada para la preparación de
las muestras. Se aplicaron cinco spots (lugar en el equipo donde la muestra es aplicada)
de cada muestra, para cada técnica de preparación de muestra. Fue desarrollado un
método de autoejecución en el software FlexControl para la adquisición automática de los
espectros de masas. La fluencia de láser fue constante a 30% y movimiento aleatorio
(random walk) en el área del spot. Se tomaron los espectros de masas en el rango de
100 a 4000Da. El programa de autoejecución diseñado realiza la adquisición de las
señales con relación señal-ruido mayor a 100 y resolución mayor a 1000. Cada
evaluación exitosa corresponde a 500 espectros individuales y requirió 2000 espectros
individuales para guardar el espectro acumulado final. Si al cabo de 30 intentos no se
adquieren 2000 espectros con la mínima calidad, el programa aborta la adquisición en
ese spot. Fue empleada como analitos de referencia una mezcla de cuatro péptidos
disueltos en solución buffer de pH: 7.0; leu-encefalina m/z: 556.27, bombensina m/z:
38 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
1619.82, bradiquidina m/z: 1060.57 y renina sustrato m/z: 1758.93. Los experimentos se
realizaron con relaciones molares matriz:analito de 100:1. Se empleó como matriz de
referencia el CHCA.
3.1.2 Resultados y discusión
Después de establecer las propiedades optoelectrónicas como óptimas para implementar
los FV como matrices MALDI; se decidió realizar una primera serie de experimentos
empleando los FVCOOH y FVCOOH-CH3 como matrices de transferencia protónica,
debido a la presencia de los grupos carboxilo en su estructura. Siguiendo lo establecido
por evidencia experimental reportada por los grupos de Zenobi37 y Kinsel.38 Se esperaba
que al estar en medio ácido se diera la protonación del FV en el estado fotoexcitado,
para sí formar una especie protonada altamente reactiva que realizará el proceso de
donación de protón al analito, y así formar la especie del analito protonado. Este proceso
se ilustra en la Figura 3-1, en la que se muestra como un FV ácido en estado
fotoexcitado produce la protonación de la proteína en los sitios básicos.
Figura 3-1: Fotoionización y protonación del FVCOOH y la posterior transferencia del
protón al péptido.
H+
hv
Transferencia protón
H
+
39
Los experimentos realizados con los cuatro péptidos y la matriz de referencia el CHCA
mostraron que esta matriz permitió ionizar todos los péptidos, pero algunos de ellos con
intensidades relativamente bajas para el pico correspondiente a la molécula protonada,
como se aprecia en la Figura 3-2.
Figura 3-2: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz
CHCA
Los resultados de los experimentos empleando los FVCOOH y FVCOOH-CH3 como
matrices de transferencia protónica con los cuatro péptidos, mostraron la ausencia de
ionización de los péptidos; es decir, a pesar de las excelentes propiedades
optoelectrónicas encontradas para estos sistemas, no se pudo encontrar la generación
de señales correspondientes a los péptidos protonados, y menos aún la señal
correspondiente a la matriz protonada que comúnmente se puede encontrar en este tipo
de experimentos.
Debe destacarse que los espectros obtenidos durante estos análisis permitieron observar
principalmente la señal correspondiente al catión radical de los FV empleados en los
experimentos, como se evidencia en la Figura 3-3 y la Figura 3-4.
1758.932
379.090
578.253
335.094
1060.568
1583.361
1945.961
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z
Leu-Encefalina 556.27
Bombensina 1619.82
Bradiquidina 1060.57
Renina Sustrato 1758.93
40 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 3-3: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz
FVCOOH
Figura 3-4: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz
FVCOOH-CH3
370.129
397.150
607.515
500.401
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Inte
ns.
[a.u
.]
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z
398.194
381.189
632.255
0
1
2
3
4
5
4x10
Inte
ns. [a
.u.]
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z
Catión radical
Catión radical
No hay señales de péptidos en esta zona
No hay señales de péptidos en esta zona
41
Para evaluar sí era posible o no, la formación del ion molecular protonado de los FV, se
decidió realizar una serie de experimentos sin analito, empleando como matriz y muestra
cada uno de los FV ácidos, (método LDI, porque no hay asistencia de una matriz distinta
a la misma molécula durante la ionización); se realizaron distintas adiciones de ácido
trifluoroacético (5, 7 y 10% vol.) buscando acidificar en exceso el medio para así poder
favorecer la aparición del pico correspondiente a la molécula de FV protonada (señal
M+H+), sin embargo no se pudo verificar la presencia de la misma, sólo se evidenció la
presencia del catión radical; como se puede observar en la Figura 3-5 y en la Figura 3-6.
Figura 3-5: Espectro de masas LDI del FVCOOH con adición de ácido trifluoroacético
(10% vol).
Las señales en las zonas de (M+1) m/z para cada FV (señales 371 y 372 m/z para
FVCOOH y señal 399 y 400 m/z para FVCOOH-CH3, Figura 3-6) que se encontraron en
los experimentos y que erróneamente se podrían asignar al ion M+H+ de cada molécula
analizada, corresponden al patrón isotópico esperado para cada una de ellas como se
detalla en la Figura 3-7 (26% intensidad para FVCOOH y 28% intensidad para FVCOOH-
CH3), y por tanto se puede sugerir a partir de los datos experimentales encontrados, que
la formación del ion correspondiente a la molécula de FV protonada es poco probable, y
de allí que se puedan explicar los pobres resultados de los FV como matrices de
transferencia protónica.
370.156
353.158
0
2000
4000
6000
Inte
ns. [
a.u.
]
175 200 225 250 275 300 325 350 375m/z
42 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 3-6: Espectro de masas LDI del FVCOOH-CH3 con adición de ácido
trifluoroacético (10% vol.)
Figura 3-7: Acercamiento a las señales correspondientes a los experimentos de LDI,
donde se aprecia que las intensidades encontradas, son las esperadas para la
distribución isotópica.
Entonces, se decidió usar herramientas computacionales para entender por qué no se
había evidenciado la protonación de los FV ácidos estudiados aquí durante la serie de
experimentos y por tanto no se había podido apreciar el catión protonado de estos FV
ácidos en los experimentos de MALDI. Se partió del reporte de Bourcier y col.39 en el que
398.165
381.174
354.201276.162252.158 371.441298.419219.206
0
2
4
6
4x10In
ten
s. [
a.u
.]
200 225 250 275 300 325 350 375 400m/z
Esperado: 26% Intensidad
Esperado: 28% Intensidad
399 m/z
400 m/z
371 m/z
372 m/z
43
se detallan cálculos de afinidad protónica (AP) para posibles matrices MALDI. Se usó la
metodología DFT con el funcional B3LYP, y usando como base 6-311++(2d,2p) para
optimizar la estructura del FVCOOH y del FVCOOH-H+, se calcularon las energías
electrónicas (Eelec) y las termoquímicas (Eterm) para ambas moléculas, a partir de:
AP= E(FVCOOH)−E(FVCOOH-H+)
E(FVCOOH)=Eelec +Eterm
A partir de los cálculos se determinó que la AP del FVCOOH es de 213 Kcal/mol, mucho
mayor a la del CHCA que es de 198 Kcal/mol, por lo que se puede sugerir que la especie
protonada del es poco probable bajo condiciones MALDI.40
Figura 3-8: Estructuras optimizadas para el FVCOOH y el ion quasimolecular
FVCOOHH+
Debe tenerse en cuenta que este tipo de cálculos se asemeja al proceso MALDI, porque
la ionización ocurre en el vacío y las correcciones térmicas aseguran una temperatura
similar.
Los resultados para esta primera serie de experimentos no fueron considerados como
malos, puesto que permitieron comprobar un interesante fenómeno para los FV al
emplearse en experimentos MALDI, en las que se determinó bajo distintas condiciones,
la prevalencia en la formación del catión radical, es decir que los experimentos tratando
213 Kcal/mol
44 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
de realizar la fotoionización por medio de la protonación, permitieron encontrar que este
no es el camino que usan los FV estudiados, sino que sí hay un proceso de
fotoionización y corresponde a la pérdida de un electrón, como se detalla en la Figura 3-
8.
Los cationes radicales son especies altamente reactivas y de amplio interés para la
espectrometría de masas MALDI, y al haberlos evidenciado en alta proporción durante el
trabajo, además del conocimiento previo de las propiedades óptimas de las moléculas
sintetizadas; permitió replantear el tipo de analitos a ionizar durante los experimentos de
espectrometría de masas con estos FV, cambiándolos de analitos susceptibles a
transferencia protónica, por analitos de gran interés y muy poco investigados como lo son
los hidrocarburos policíclicos aromáticos que son susceptibles a ser ionizados a través de
transferencia electrónica.
Figura 3-9: Dos posibles caminos de fotoionización del FVCOOH. El primero es el de
protonación y el segundo corresponde a la formación del catión radical.
+H+
-e-
e-
45
3.2 Análisis de hidrocarburos policíclicos aromáticos
Como se mencionó con anterioridad, la evidencia experimental demostró la generación
de cationes radicales en las condiciones MALDI por parte de los FV sintetizados durante
este trabajo. Grozema y col.15 ya habían evaluado la aparición de cationes radicales en
estilbenos (FV de una unidad y media de conjugación) al ser impactados con un láser a
temperatura ambiente. Así que tratando de aprovechar este comportamiento y partiendo
de los múltiples estudios que reportan la transferencia electrónica como método de
ionización,4 se decidió realizar un análisis computacional para determinar los potenciales
de ionización de los FV sintetizados, y evaluar la posibilidad de usarlos como matrices de
transferencia electrónica.
Los cálculos fueron realizados por el grupo de fisicoquímica teórica y experimental de la
Universidad Industrial de Santander, empleando la metodología Hartree-Fock, usando la
base 6-311G++. Las condiciones del cálculo que representan el vacío y a la molécula en
fase gaseosa son muy próximas a las condiciones MALDI, por lo que el cálculo
representa una muy buena aproximación. Se espera que una buena matriz MALDI tenga
un potencial de ionización cercano a los 8 eV para así asegurar una amplia ventana de
potencial y por tanto poder reaccionar con el analito. En la Tabla 3-1 se muestran los
resultados para dichos cálculos, con los que se encontró que los tres FV presentan
potenciales de ionización altos y prometedores para ser empleados en los experimentos
MALDI.
Tabla 3-1: Potenciales de ionización calculados para los tres FV y valor experimental
reportado para el antraceno, matriz MALDI común, así como para los analitos a usar.
Molécula Potencial Ionización (eV)
FVCOOH 7.61
FVCOOH-CH3 7.59
FVCl 7.39
Antraceno 7.43*
Naftopireno 6.82
46 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Continuación tabla 3-1
Rubreno 6.71
Tiofeno-pireno 7.26
Hexafenilbenceno 6.91
* Reporte experimental41
Los resultados permiten sugerir que una vez fotoionizados los FV, forman el catión
radical y debido a su alto potencial de ionización, este podría realizar la transferencia
electrónica durante las reacciones secundarias con el analito debido a que todos
presentan menores potenciales de ionización respecto a los FV.
Con base en todos los argumentos encontrados, se realizaron pruebas empleando 4
analitos modelo de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA) que simulan algunos de
los compuestos más característicos presentes en los crudos pesados y que representan
un gran potencial investigativo y económico para nuestro país.
3.2.1 Materiales y métodos
Se prepararon soluciones de los FVs en cloroformo. Fueron empleados analitos modelo,
provistos por el profesor Gray Murray de la Universidad de Alberta, Canadá. Las técnicas
thin layer y dried droplet fueron empleadas para la preparación de muestras. Fueron
usados cinco spots de cada muestra, para cada técnica de preparación. Un método de
autoejecución fue desarrollado en el FlexControl para la adquisición automática de los
espectros de masas. Se empleó distintas fluencias de láser entre 5 y 40%, y movimiento
aleatorio (random walk) en el área del spot. Se tomaron los espectros de masas en el
rango de 100 a 2000Da. El programa de autoejecución diseñado realiza la adquisición de
las señales con relación señal-ruido mayor a 100 y resolución mayor a 1000. Cada
evaluación exitosa corresponde a 500 espectros individuales y se requirieron 2000
espectros individuales para guardar el espectro acumulado final. Si al cabo de 30 intentos
no se adquieren 2000 espectros con la mínima calidad, el programa aborta la adquisición
en ese spot.
En esta serie de experimentos fueron empleadas altas relaciones matriz:analito. Se
preparó inicialmente una solución 2.5mM de cada uno de los FVs en cloroformo, que son
aproximadamente 1000ppm y fueron puestos en contacto con soluciones 0,25 mM;
47
0,025mM; 2,5 y 0,25 M de los HPA, para así obtener relaciones molares de 10:1, 100:1,
1.000:1, 10.000:1, respectivamente. En cada caso fue usada una solución 2.5mM de la
matriz que corresponde a la máxima solubilidad posible para las moléculas FVCl, FV-
COOH y FV-COOH-CH3, y fue modificándose la cantidad de analito agregado en las
concentraciones enumeradas anteriormente.
3.2.2 Resultados y discusión de análisis de HPA
3.2.2.1 Naftopireno
Se realizaron experimentos con naftopireno como analito modelo, empleando cuatro
relaciones distintas de matriz/analito o analito/solvente para el caso del LDI (1:10, 1:100,
1:1000 y 1:10000). Y así poder evaluar la evolución de la señal del ión molecular del
naftopireno (302 m/z) al ser ionizado por metodología LDI (sin matriz) o cuando la
ionización era asistida por los FV como matrices (MALDI) y encontrar posibles efectos
positivos al emplear como matriz MALDI los FV sintetizados en este trabajo de
investigación.
Los resultados muestran que los FV tienen alto potencial como matrices de transferencia
electrónica, puesto que los análisis realizados revelaron que la señal del ion molecular
del naftopireno aumentaba significativamente al emplear los FV como matrices, en
condiciones experimentales suaves, pues se empleaban bajas fluencias o potencias de
láser respecto a otro tipo de matrices. En la Figura 3-9 se puede apreciar mejor el
aumento en la señal conseguido por los FV, esa figura corresponde a un espectro LDI
del naftopireno en una solución 0.025 mM y la señal al emplear el FVCOOH-CH3 como
matriz en una relación 1:100.
48 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 3-9: Espectro de masas MALDI de naftopireno empleando a) LDI y b) usando FV-
COOH-CH3 como matriz MALDI en una proporción molar 1:100.
Se evidenció claramente que el uso del FV como matriz aumentó la señal del ión
molecular del naftopireno desde una intensidad de 8000 (LDI) hasta 1x105 (MALDI)
mostrando un efecto positivo de aumento en la señal de casi el 1000%. Teniendo en
cuenta que este resultado es para una relación molar en la que se evidencia una alta
presencia de analito. Al disminuir en uno o dos órdenes de magnitud las relaciones
analito:matriz (experimentos con relaciones molares 1:1000 y 1:10000) se encontró que
el aumento en la relación señal/ruido para el naftopireno llegó a ser de hasta 2500 veces
al emplear FVCOOH-CH3 como matriz y de casi 1000 veces al emplear FVCl como
matriz. En la Figura 3-10 se presenta el aumento de la señal al emplear distintas
concentraciones de naftopireno, en experimentos con ionización LDI o MALDI con FV
como matrices en cuatro relaciones molares distintas.
Figura 3-10: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando naftopireno y
diferentes FV como matrices en cuatro distintas proporciones analito:matriz.
302.112 NP_100_01 0:F2 MS Raw
0
2000
4000
6000
8000
Inte
ns. [
a.u.
]
398.133
302.090
NPM5_100_02 0:O14 MS Raw
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.505x10
Inte
ns. [
a.u.
]
200 400 600 800 1000 1200 1400m/z
49
Los resultados obtenidos permiten demostrar que los FV sintetizados se comportaron
como matrices de transferencia electrónica de alta fiabilidad con incrementos
significativos en la relación seña/ruido para el pico correspondiente al ión molecular y por
tanto establecerse como potenciales matrices para el análisis de HPA.
3.2.2.2 Hexafenilbenceno
Con los resultados positivos obtenidos en los análisis de naftopireno se decidió probar un
nuevo analito modelo. El hexafenilbenceno (HFB) es otro excelente modelo para todas
aquellas moléculas conjugadas poliaromáticas presentes en el crudo pesado. Los
experimentos de LDI mostraron que el HFB no presenta señales correspondientes al ión
molecular a potencias de láser entre 5 y 30%. Sólo se pudo evidenciar distintas señales
correspondientes a las fragmentos de la molécula. El ión molecular (534 m/z) sólo pudo
ser visualizado cuando se empleó una potencia de láser del 60%, pero con una
intensidad pobre (cerca de las 25 a.u.) como se presenta en la Figura 3-11. El hecho de
50 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
encontrar una pobre presencia del ión molecular se debe a la naturaleza misma del HFB,
que a pesar de estar compuesto por múltiples anillos aromáticos, su estructura no es
planar, y por tanto los estados fotoexcitados son menos estables,42 llevando a la
fragmentación. Además, el uso de altas potencias de láser lleva intrínsecamente a una
excesiva fragmentación, puesto que el exceso de energía del láser que sobrepasa la
capacidad de absorción del conjunto matriz-analito, termina siendo empleada en
procesos de desintegración de la molécula. 42
Figura 3-11: Espectro LDI del HFB usando el 60% de la potencia del láser.
Teniendo en cuenta estos resultados de transferencia electrónica con el HFB se buscó
evaluar si los FV estudiados al ser usados como matrices podían generar efectos de
protección durante la ionización, evitando la fragmentación del ión molecular.del HFB Por
lo tanto, se realizaron experimentos, en los que se determinó como óptimo, usar una
fluencia de láser del 30%. En la Figura 3-12 y en la Figura 3-13 se realiza una
comparación entre un espectro LDI tomado para el HFB, en la que se empleó una
fluencia de láser del 30%. No se ve la presencia de la señal del ión molecular del HFB
(ubicado arriba en cada figura), mientras que para los espectros MALDI en los que se
usó como matrices el FVCOOH y el FVCOOH-CH3 (abajo en cada figura) se aprecia
como los FV permiten preservar la señal correspondiente al ión molecular (534 m/z), es
decir que se pudo observar la presencia de la señal de ión molecular, en proporciones
muy altas y también se aprecia para ambos experimentos que la intensidad de la señal
está en el orden de magnitud de 104. Además se pudo apreciar la disminución en el
número de señales correspondientes a rupturas producto del proceso de fragmentación
del analito.
H1_1 0:L1 MS Raw
0
5
10
15
20
25
30
Inte
ns. [
a.u.
]
268.212
211.138
586.171331.232 449.367183.103 380.332 534.241
H1(60)_10_04 0:K10 MS Raw
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
200 300 400 500 600 700m/z
534.22m/z
51
Figura 3-12: Comparación del espectro LDI del HFB usando el 30% de la potencia del
láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH como matriz en proporción
1:100 con la misma potencia de láser.
Figura 3-13: Comparación del espectro LDI del HFB usando el 30% de la potencia del
láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH-CH3 como matriz en
proporción 1:100 con la misma potencia de láser.
Los dos FV ácidos, presentaron efectos muy positivos en el aumento de la relación
señal/ruido para la señal 534 m/z, algunos de hasta 1500 veces, como se muestra en la
H2_1 0:N1 MS Raw
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
Inte
ns.
[a
.u.]
398.208
381.204
534.315350.057 426.251 487.256 706.416 751.430617.357 791.345576.168
HM2_10_05 0:D15 MS Raw
0
1
2
3
4
5x10
Inte
ns.
[a
.u.]
400 500 600 700 800m/z
534.315
533.472
0
1
2
3
4
4x10
Inte
ns.
[a
.u.]
534 536 538 540 542m/z
534m/z
FVCOOH 1:100
LDI
H2_1 0:N1 MS Raw
0
1
2
3
4
5
6
Inte
ns. [
a.u.
]
534.315
528.300 576.168
HM2_10_05 0:D15 MS Raw
0
1
2
3
4
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
530 540 550 560 570 580m/z
LDI
FVCOOHCH3
52 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 3-14, en la que se puede apreciar dicho aumento usando dos relaciones molares
distintas analito:matriz.
Figura 3-14: Relación señal/ruido para experimentos MALDI de HFB usando FV como
matriz y potencia de láser del 30% en dos distintas relaciones molares.
3.2.2.3 Rubreno
Posteriormente se realizó una serie de análisis empleando al rubreno como analito
modelo de HPA. Se realizaron experimentos empleando ionización LDI, en los que se
encontró a fluencias de láser entre el 30 y 40% y concentraciones relativamente altas
(0.25 mM) una buena señal correspondiente al ion molecular del rubreno (532 m/z) pero
también se pudo evidenciar una señal significativa a 459 m/z correspondiente al proceso
de fragmentación del ion molecular del rubreno, probablemente debido a la pérdida de
un fenilo. En la Figura 3-15 se aprecia como la relación señal ruido para el ión molecular
disminuyó drásticamente en los experimentos de LDI para el rubreno, al disminuir la
concentración de la muestra.
53
Figura 3-15: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando rubreno, el
primero a la derecha es LDI, mientras que los otros corresponden a diferentes FV como
matrices en tres distintas proporciones analito:matriz.
Con los resultados superiores que se encontraron con el uso de nuestros FV como
matrices de transferencia, permitía aumentar la relación señal ruido para el ion molecular
(532 m/z) aún a bajas concentraciones. Adicionalmente se evidenció en los
experimentos en los que se empleó el Rubreno como analito, y FV como matrices, que la
fragmentación se veía disminuida, así como se vio el aumento de la señal del ión
molecular en algunos casos hasta en casi 3000 veces la relación señal/ruido. En la
Figura 3-16 se aprecia la intensidad de la señal del ión molecular al emplear los FV
ácidos como matrices, así mismo la baja presencia de la señal derivada de la
fragmentación que aparece en 459 m/z.
54 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 3-16: Espectros de análisis por masas MALDI con fluencia de láser del 30% para
el Rubreno usando como matriz MALDI el FVCOOH (arriba) y el FVCOOH-CH3 (abajo).
3.2.2.4 Porfirina de Níquel-Pireno (PNP)
Numerosos reportes de espectrometría de masas de porfirinas metálicas individuales y
conectadas a otros sistemas aromáticos,43 muestran que este tipo de compuestos tienen
una significativa tendencia a la fragmentación durante los análisis por espectrometría de
masas, evitando la visualización de su ión molecular con buena intensidad, pudiendo
llegar hasta la supresión completa de la señal. El principal interés en el análisis de este
tipo de compuestos, radica en que son análogos de las petroporfirinas encontradas en la
mayoría de crudos pesados del mundo,43 y que representan una fracción compleja y de
difícil tratamiento, puesto que no se conoce bien la naturaleza de su estructura, ni su
masa molecular. Por lo tanto se empleó una porfirina de níquel conectada por dos
carbonos tetraédricos a una molécula de pireno (Porfirina de Níquel-Pireno, PNP), de la
que se había determinado, usando una potencia de láser de 20%, que presentaba en su
532.095
370.008
470.252
RM1_10_01 0:I6 MS Raw
0
1
2
3
5x10
Inte
ns.
[a.
u.]
532.189
398.114
470.332
378.093
361.041
RM2_10_02 0:L7 MS Raw
0
2
4
6
8
5x10
Inte
ns.
[a.
u.]
100 200 300 400 500 600 700 800 900m/z
55
espectro de masas LDI una señal del ión molecular con baja intensidad en 898 m/z; y
como ión base presentaba una señal con alta intensidad a 683 m/z, correspondiente a la
metaloporfirina después de perder el fragmento de 215 m/z propio del pireno. En la
Figura 3-17 se ilustra la estructura molecular de PNP y las rupturas características
encontradas durante su análisis.
Figura 3-17: Porfirina de Níquel y sus rupturas más relevantes.
El uso de FV como matrices MALDI para el análisis de este tipo de analitos permitió
encontrar un efecto positivo en la ionización. Ya que se apreció un efecto de protección al
ión molecular donde su señal del ion molecular a 898 m/z aumentó en casi dos órdenes
de magnitud, así como se disminuyó la señal del fragmento que aparecía en 683 m/z,
como se puede observar en la Figura 3-18.
56 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 3-18: Espectro de masas LDI de la porfirina de níquel (arriba) y espectro de
masas MALDI de la porfirina de níquel empleando como matriz FVCl (abajo).
Diferentes análisis en los que se emplearon distintas fluencias de láser, además en los
que se usó DCTB como matriz de referencia, permitieron determinar que los FV
representan una matriz potencial para este tipo de análisis. Como se observa en la
Figura 3-19, el DCTB presenta altas relaciones señal/ruido para el pico en 898 m/z sólo
cuando se emplean fluencias de láser relativamente altas (más de 40%), que pueden
significar un aumento inmediato en la fragmentación del analito, además en ningún caso
superan los valores de la relación señal/ruido obtenidas para los FVCl y FVCOOH-CH3.
Los FV muestran un comportamiento óptimo en los análisis, pues permitieron obtener
buenas relaciones señal/ruido para el analito a fluencias de láser bajas, siendo la fluencia
óptima del 20%.
683.169
215.091 607.147
898.125
1134.942 1793.804
PN_200_01 0:A7 MS Raw
0
1
2
3
4
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
410.090
898.138
683.163277.126 512.145 1131.973 1308.523
PNM1_200_01 0:E7 MS Raw
0
1
2
3
4
5
5x10
Inte
ns. [
a.u.
]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z
Fragmento
metaloporfirina
PNP
Fragmento
pireno
PNP
Fragmento
metaloporfirina
FVCl
57
Figura 3-19: Relación/señal ruido, para la señal 898 m/z resultante de los análisis en los
que se empleó distintas fluencias de láser y como matrices los tres FV más DCTB como
matriz de referencia.
3.2.2.5 Efectos positivos de los FV como matrices en MALDI de analitos HPA
Los sistemas FV sintetizados durante esta investigación, mostraron resultados bastante
prometedores al ser empleados como matrices de transferencia electrónica en los
análisis por espectrometría de masas MALDI de los cuatro distintos analitos modelo de
hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA). Es importante examinar las posibles
características y propiedades que permitieron que se consiguieran estos resultados
experimentales.
58 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
El proceso MALDI como se ha mostrado en la introducción de este documento, es un
proceso muy complejo en el que se cree que interviene más de un mecanismo de
ionización, además de los procesos de desorción y de dinámica molecular inherentes a
este tipo de ionización asistida. A pesar de esto, es importante evaluar las posibles
propiedades que permiten que una matriz MALDI ofrezca buenas propiedades de
absortividad molar, eficiencia cuántica no radiativa, supresión de señales secundarias y
aumento en la señal del ión molecular, entre otras, para su futura implementación en el
análisis de otros analitos, así como el futuro mejoramiento de sus estructuras
moleculares a través de diseño racional.
Sabiendo que el impacto del haz de fotones provenientes del láser a la muestra genera
una alta descomposición de matriz y de analito,5 y teniendo en cuenta también que entre
mayor sea la fluencia del láser mayor será la energía disponible para que el analito tenga
una absorción directa llegando a estados fotoexcitados, en los que la formación de
especies radicalarias del analito que podrán sufrir de procesos de desintegración o
reacciones de recombinación entre los radicales para obtener moléculas de mayor
tamaño, haciendo que la observación del ion molecular del analito sea más difícil o poco
probable.4,6 Bajo estas condiciones la absortividad molar cumple un papel importante, es
más, ésta propiedad ha sido descrita extensivamente por Knochenmuss y col.37 como
una de las más relevantes; puesto que si una matriz tiene una alta absorción de energía
podrá ser más efectiva en la ionización y en la preservación del ión molecular, debido a
que la mayor parte de la energía del láser será absorbida por la matriz, primero por una
razón estadística, puesto que la población de la matriz es mayor que la del analito
(relaciones molares usadas en las muestras son mayoritarias para la matriz respecto el
analito), además la matriz al presentar una alta absortividad molar asegura que sea ésta
y no el analito quien absorba la mayor parte de la energía. Por lo tanto no haya
necesidad de trabajar con altas fluencias de láser como fue evidenciado con los distintos
analitos que se emplearon en los análisis de esta investigación, principalmente en el caso
de la porfirina de níquel-pireno (PNP) en la que se pudo comprobar la fragmentación en
los análisis LDI y como el uso de matrices con altos coeficientes de absortividad molar
como los FV evitaban significativamente la fragmentación del ion molecular, asegurando
a bajas fluencias de láser relaciones señal/ruido más altas respecto a la matriz
convencional DCTB y a los experimentos LDI. Finalmente los mejores resultados fueron
59
obtenidos con FVCOOH-CH3 para la mayoría de analitos, siendo éste el FV sintetizado
en este trabajo que presentó mayor absortividad molar.
Figura 3-20: Se ilustra primero a la izquierda la co-cristalización del analito con el FV
como matriz y la irradiación con el láser. Segundo en el centro, se muestran los cationes
radicales formados después de la irradiación y su reacción con el analito. Tercero a la
derecha, la reacción entre el analito y la matriz ionizada produce el respectivo analito
ionizadio.
Otro parámetro importante en la ionización del analito es el potencial de ionización de la
matriz, puesto que una vez se ha formado el catión radical de la matriz, está será una
especie altamente reactiva8 e intentará estabilizarse a través de la recepción de un
electrón proveniente del analito. Este proceso hace parte de las reacciones secundarias y
puede observarse como una reacción bimolecular, que sucede en la escala de los
nanosegundos.6 Si el potencial de ionización es alto (para matrices MALDI es ideal, igual
o superior a 7.5 eV) el proceso de transferencia electrónica se verá beneficiado. Como se
mostró al inicio de este capítulo los FV sintetizados presentan potenciales de ionización
altos (entre 7.4 y 7.7 eV) que aseguran una mayor ventana de potencial, y por tanto una
mayor posible reactividad frente a los analitos. Los FV con grupos sustituyentes tipo
ácido carboxílico en sus extremos presentaron en la mayoría de los experimentos los
mejores resultados no sólo debido a sus mayores absortividades molares, sino también
en parte porque presentan un mayor potencial de ionización respecto al FVCl (7.59 y
7.61 eV respecto a 7.39eV para FVCl ).
PI matriz> PI analito
hv
60 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
El último parámetro que nos permite relacionar el éxito de los FV como matrices de
transferencia electrónica y que los postula como matrices de interés para el análisis de
HPA; es la estructura molecular de los sistemas FV y su capacidad comprobada de
generación de agregados por apilamiento .12 Esta propiedad resulta sumamente
importante y ventajosa respecto a otras matrices, puesto el proceso MALDI inicia en
estado sólido, pues la muestra se deja secar lentamente empleando solventes volátiles,
buscando asegurar la co-cristalización de la matriz con el analito, para asegurar que el
proceso de desorción sea óptimo, además buscando que haya formación de clústeres
que permanecerán en la nube después de la desorción, con lo cual se facilitan las
reacciones bimoleculares.4 La posibilidad de formar una fase en la que haya
interacciones en estado sólido producto de la co-cristalización entre los FV y los HPA
hace que sea probable el proceso de ionización del analito por parte del FV. Debe
tenerse en cuenta que a excepción del naftopireno, ninguno de los otros analitos tenía
estructura completamente planar, como sucede con la mayoría de HPA presentes en los
crudos pesado; pero todos presentan zonas de la molécula con planaridad en las que se
pueden establecer interacciones tipo y por tanto la formación de los clústeres esperada
en el proceso MALDI.
Los sistemas FV demostraron buenas propiedades que permiten por medio de la
presente investigación postularlos como potenciales matrices de transferencia electrónica
que pueden usarse para analizar HPA en crudos, y que posiblemente permitirían
identificar a muchos otros compuestos policíclicos aromáticos que están presentes en
bajas proporciones en el crudo, pues los experimentos que se realizaron con bajas
relaciones de analito respecto a la matriz mostraron relaciones señal/ruido
significativamente altas para las moléculas analizadas.
62 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
4. Síntesis y caracterización de derivados de Ácido acrílico
Parte de los propósitos de este trabajo era poder sintetizar matrices de transferencia
protónica y los primeros sistemas sintetizados resultaron ser exitosas matrices de
transferencia electrónica. Debido a esto, se decidió realizar un análisis de promisorios
derivados de ácido acrílico como matrices de transferencia protónica. Se espera que la
información obtenida con estos experimentos, sirva como base para sintetizar en trabajos
posteriores moléculas objetivo y que quizás puedan presentar unidades FV en su
estructura. Se espera que dichas moléculas presenten las características ideales
obtenidas de la información conseguida.
Los ácidos acrílicos y cianoacrílicos fueron sintetizados empleando la reacción de
Knoevenagel, en el presente capítulo se detallan los procedimientos experimentales de
síntesis y purificación de dichos compuestos, así como la caracterización de su
absortividad molar.
4.1 Materiales y Reactivos
Todos los reactivos eran grado analítico y se usaron como se recibieron. Tiofeno 2-
carboxaldehido, furfural, ácido malónico y ácido cianoacetico fueron comprados a Sigma-
Aldrich (Nueva Jersey, EEUU). Metanol, etanol, yodo, piperidina, acetato de amonio y
tolueno fueron adquiridos de Merck (Darmstadt, Alemania).
El único precursor sintetizado para la obtención de compuestos mencionados en el
presente capítulo fue el 5-yodotiofeno-2-carboxaldehido, y su síntesis fue adaptada de un
reporte previo44 y es descrita a continuación con su respectiva caracterización:
63
4.1.1 5-Yodotiofeno-2-carboxaldehido
A una solución en reflujo de peryodato de sodio (1 equivalente) en metanol, mientras se
agitaba se agregó por goteo a través de un embudo de adición una mezcla de yodo (1
equivalente) y tiofeno-2-carboxaldehido (1 equivalente) durante una hora. Cuando
terminó la adición, se dejó la mezcla en reflujo por 45 minutos más; luego se adicionó
una solución de bisulfito de sodio (10%) y se dejó enfriar. La mezcla resultante fue
extraída con diclorometano. La fase orgánica se lavó tres veces con bicarbonato de sodio
(10%), tres veces con salmuera y tres veces con agua. Posteriormente se secó con
sulfato de sodio anhidro. El solvente se retiró por destilación a presión reducida dejando
un sólido café. La recristalización en ciclohexano, permitió obtener un sólido con forma
de agujas de color amarillo pálido. Rendimiento 82%. P.f. 52-54°C. Lit. 57-58°C.44 RMN
1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 7.41 (m, 2H), 9.79 (s, 1H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz, :
ppm): 87.79, 137.0, 138.3, 149.7, 181.1.
4.1.2 Equipos
Los puntos de fusión fueron medidos en un fusiómetro Stuart SMP10. Los espectros de
resonancia magnética nuclear fueron tomados en un espectrómetro Bruker Avance 400
usando (TMS) como estándar interno. Para las pruebas de espectrometría de masas
MALDI se empleó un espectrómetro de masas Bruker UltraFlex con analizador de tiempo
de vuelo. Se realizó un barrido entre 180-2000Da, usando el analizador en modo
reflectrón y el detector en modo positivo. La intensidad del láser se usó 5% por encima
del umbral de ionización para cada muestra, con el fin de reducir la fragmentación y
aumentar la resolución.
4.1.3 Absortividad molar
Se preparó para cada derivado de ácido acrílico una serie de soluciones en metanol
(grado analítico, Merck) en el rango de 1–5μM, La absorbancia de cada una de las
soluciones se midió a 355 nm, en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2401C de doble
canal. Se emplearon celdas de cuarzo de 10 mm de camino óptico. Se usó metanol en la
celda de referencia como blanco.
64 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
4.2 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos
acrílicos
Figura 4-1: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico.
Procedimiento general:
En un balón de fondo redondo de 10 mL equipado con un condensador, una mezcla del
respectivo aldehído (1 equivalente), ácido malónico (1 equivalente) y piperidina (0.1
equivalentes); fue puesta en reflujo en 5 mL de piridina durante 5 horas. Posteriormente
se permitió a la reacción alcanzar temperatura ambiente y se agregó por goteo una
solución de HCl (5% vol.), formándose un precipitado. El precipitado fue colectado por
filtración. La recristalización del producto en metanol, dio el respectivo ácido acrílico con
rendimientos entre 71 y 88%.
4.2.1 Ácido acrílico de furano (AFu): (ácido 3-(furan-2-il)-2-
propenóico)
Se partió de furfural y ácido malónico. Tiempo de reacción 5 h. Sólido amarillo pálido.
Recristalizado en metanol. Rendimiento: 85%. P.f. 140-142°C. Lit. 138-139°C.45 RMN 1H
(DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.17 (d, 1H J=15.8 Hz), 6.63 (d, 1H), 6.93 (dd, 1H), 7,40
(d, 1H J=15.8 Hz), 7.84 (d, 1H), 12.40 (s, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :
ppm):113.1, 115.7, 116.5, 131.3, 146.2, 150.9, 167.8. Peso Molecular: Calculado:
138.032. Encontrado: 138.033 (MALDI-TOF).
65
4.2.2 Ácido acrílico de tiofeno (ATio): (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-
propenóico)
Se partió de tiofeno-2-carboxaldehido y ácido malónico Tiempo de reacción 5 h. Sólido
blanco crema. Recristalizado en metanol. Rendimiento: 71%. P.f. 147-149. Lit. 145-
147ºC.46 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.27 (d, 1H J= 14.2 Hz), 7,10 (dd, 1H),
7,33 (d, 1H), 7,45 (d, 1H), 7.91 (d, 1H J=14.2 Hz). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :
ppm):115.9, 128.2, 129.3, 131.7, 139.2, 139.4, 172.32. Peso Molecular: Calculado:
154.009. Encontrado: 154.018 (MALDI-TOF).
4.2.3 Ácido acrílico de yodotiofeno (AItio): (ácido 3-(5-yodotiofen-
2-il)-2-propenóico)
Se partió de tiofeno-5-yodo-2-carboxaldehido y ácido malónico Tiempo de reacción 5 h.
Sólido polvoroso blanco. Recristalizado en metanol. Rendimiento 84%. P.f. 180-182°C.
Lit. 181-183°C.47 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.13 (d, 1H J= 15.3 Hz), 7,20 (d,
1H, J: 16,1Hz), 7,38 (d, 1H), 7,69 (d, 1H J= 15.3 Hz). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz,
ppm): 81.7, 118.7, 133.7, 136.0, 138.6, 145.2, 167.3. Peso Molecular: Calculado:
279.905. Encontrado: 279.912 (MALDI-TOF).
4.3 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos
cianoacrílicos:
Figura 4-2: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico.
66 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Procedimiento general:
En un balón de fondo redondo de 10 mL equipado con un condensador una mezcla del
respectivo aldehído (1 equivalente), ácido cianoacetico (1 equivalente) y acetato de
amonio (0.15 equivalentes); en 5 mL de tolueno, fue puesta en reflujo durante 8 horas. La
reacción fue enfriada en un baño de hielo y se formó lentamente un precipitado. El
precipitado se colectó por filtración, y su recristalización en etanol permitió aislar el
respectivo ácido cianoacrílico puro. Los rendimientos de las reacciones estuvieron entre
69 y 83%.
4.3.1 Ácido cianoacrílico de furano (AFuCN): (ácido 3-(furan-2-il)-
2-cianopropenóico)
Se partió de furfural y ácido cianoacético. Tiempo de reacción de 8 h. Sólido café pálido.
Recristalizado en metanol. Rendimiento: 83%. P.f. 210-212°C. Lit. 215ºC.48 RMN 1H
(DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.86 (dd, 1H), 7,47 (d, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.20 (s, 1H),
13.39 (s, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 56.5, 98.8, 114.6, 116.2, 124.1,
139.2, 148.7, 150.1, 164.0. Peso Molecular: Calculado: 163.027. Encontrado: 163.031
(MALDI-TOF).
4.3.2 Ácido cianoacrílico de tiofeno (ATioCN): (ácido 3-(Tiofen-2-
il)-2-cianopropenóico)
Se partió de tiofeno-2-carboxaldehido y ácido cianoacético. Tiempo de reacción 8 h.
Sólido amarillo oscuro. Recristalizado en etanol. Rendimiento: 80%. P.f. 230-231°C. Lit.
232-234.5ºC49 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 7.25 (dd, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,85
(d, 1H), 8.36 (s, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 99.3, 115.6, 128.6, 135.1,
136.1, 137.1, 146.6, 162.8.
67
4.3.3 Ácido cianoacrílico de yodotiofeno (AITioCN): (ácido 3-(5-
yodotiofen-2-il)-2-cianopropenóico)
Se partió de 5-yodo-2-tiofenocarboxaldehido y ácido cianoacético. Tiempo de reacción 8
h. Sólido amarillo. Recristalizado en etanol. Rendimiento: 69%. P.f. 267-269°C. RMN 1H
(DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 7.42 (d, 1H), 7.61 (d, 1H), 8.45 (s, 1H) RMN 13C (DMSO-
d6, 100 MHz, : ppm): 99.3, 115.6, 128.6, 135.1, 136.1, 137.1, 146.6, 162.8.
68 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
4.4 Resultados y discusión
4.4.1 Síntesis
Se sintetizaron y caracterizaron con éxito los 6 derivados de ácido acrílico con
rendimientos entre el 70 y el 85%, comparable a los encontrados en la literatura45-49
acorde a las condiciones experimentales empleadas.
En la Figura 4-3 se aprecian las estructuras de cada uno de los derivados de ácido
acrílico y cianoacrílico sintetizados. A continuación sólo se realizará la discusión del
análisis estructural del AFu (ácido-3-(furan-2-il)-2-propenóico), debido a la similitud de los
otros compuestos no se entrará en detalles para cada uno. Para los otros derivados de
ácido acrílico y cianoacrílico, sus correspondientes análisis estructurales pueden ser
encontrados en el anexo 1 de este trabajo de investigación.
Figura 4-3: Estructuras de los derivados de ácido acrílico sintetizados.
69
El ácido acrílico de furano (Afu), presenta un espectro de resonancia magnética nuclear
protónica característico de este tipo de compuestos. Primero se analiza la presencia de
las señales acrílicas (notadas en la Figura 4-4 como A y D) que aparecen a 6.63 y 7.40
ppm (espectro protónico, Figura 4-5), en forma de doblete como se esperaban. Algo que
resulta muy interesante de este resultado es que la constante de acoplamiento es de
15.8 Hz, mostrando que el compuesto presenta mayoritariamente una conformación
entgegen, por lo que se puede indicar que la reacción de Knoevenagel presenta
estereoselectividad hacia el isómero E, bajo las condiciones empleadas, conocidas como
modificación de Doebner por la presencia de la piridina para generar la descarboxilación
para el tipo de compuestos sintetizados en este trabajo. Este resultado no es nuevo para
este tipo de reacción, pues en la síntesis de distintos tipos de sistemas insaturados ya se
ha indicado este tipo de estereoselectividad;50 pero incluso así es destacable, pues se
presentó para los tres ácidos acrílicos, como lo indica las constantes de acoplamiento
que presentaron las señales acrílicas entre 14 y 16 Hz, como se puede observar en la
Tabla 4-1.
Figura 4-4: Estructura de AFu y las señales esperadas para los experimentos de
resonancia protónica.
Para el caso de los derivados de ácido cianoacrílico, la sustitución de uno de los
hidrógenos acrílicos en posición al carbonilo, por el grupo ciano, hace que el hidrógeno
no sustituido (en posición ) se presente como una señal tipo singlete, bastante corrida a
campo bajo como se muestra en la Tabla 4-2; para cada uno de los tres ácidos
cianoacrílicos sintetizados en esta investigación. Dicho corrimiento es debido a la
70 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
presencia del grupo ciano que por ser electroatractor, atrae la nube electrónica de la
insaturación, aumentando la desprotección del hidrógeno beta.
Figura 4-5: Espectro de resonancia protónica para AFu.
Tabla 4-1: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido acrílico.
Molécula Señales acrílicas (ppm) Constante (Hz)
AFu 6.17 y 7.40 15.8
ATio 6.27 y 7.91 14.2
AITio 6.13 y 7.69 15.3
Continuando con la asignación de señales para la estructura del AFu, tenemos las
señales propias de los hidrógenos del anillo furánico. Primero se asignó como 7.84 ppm
la señal correspondiente a la posición 5 del anillo (señal E) puesto que el efecto de la
71
sustitución del anillo recae en esta posición, haciendo que esté más desprotegida. La
señal del hidrógeno de la posición 4 (señal C) aparece como un doble doblete en 6.93,
pues en este tipo de anillos experimentalmente se observa en distintas moléculas que
ese hidrógeno acopla individualmente con cada uno de los otros dos hidrógenos del
anillo. El hidrógeno restante (Hidrógeno B) aparece en 6.63 ppm como un doblete con un
corrimiento típico para un hidrógeno furánico.51 El hidrógeno ácido se aprecia en este
compuesto como una señal ancha centrada en 12.40 ppm. En la mayoría de ácidos
sintetizados en este trabajo, dicho hidrógeno no pudo ser observado plenamente.
Tabla 4-2: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido cianoacrílico.
Molécula Señal acrílica
(ppm)
AFuCN 8.08
ATioCN 8.36
AITioCN 8.45
El espectro de resonancia magnética nuclear de carbono permitió corroborar la
información obtenida para la estructura a través de la resonancia magnética de 1H. El
carbono de ácido carboxílico se evidencia (carbono A de la Figura 4-6) en 167.95 ppm
como se aprecia en la Figura 4-7. El carbono B del anillo furánico al estar sustituido se
asignó como la señal a 150.88 ppm. El carbono C correspondiente a la posición 5 del
anillo de furano, por estar enlazado al heteroátomo aparece como la señal a 146.18 ppm.
Figura 4-6: Estructura de AFu y asignaciones para los carbonos.
72 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 4-7: Espectro de resonancia magnética de carbono para AFu.
El carbono D corresponde al carbono alfa al carbonilo del derivado de ácido acrílico y
aparece en 131.27 ppm. Para los derivados de ácido cianoacrílico este carbono por la
presencia del grupo ciano aparece entre 98 y 99 ppm. El carbono de la posición beta
(carbono E) y los de las posiciones 3 y 4 del anillo aromático presentan corrimientos
similares entre 113 y 116 ppm y fueron asignados como se aprecia en la Figura 4-7.
Con la caracterización estructural por RMN terminada, se realizaron los espectros de
masas LDI para las moléculas en las que se pudo encontrar señales con intensidades
relativamente bajas, correspondientes al ión molecular de cada una de ellas. El espectro
de masas de AFu se aprecia en la Figura 4-8. Debe tenerse en cuenta que el mismo
fenómeno de baja intensidad del ión molecular se evidencia para el ácido CHCA52
impidiendo ver claramente su ión molecular, puesto que hay una alta generación de
aductos y de especies, de las que se hablará en el capítulo 5 de este documento.
73
Figura 4-8: Espectro de masas LDI para AFu.
Una vez verificada la identidad de las moléculas sintetizadas se procedió a establecer
sus propiedades de absortividad molar para evaluar su posible aplicación como matrices
de transferencia protónica para espectrometría de masas MALDI. Aunque para los FV se
realizó todo un capítulo sobre las determinaciones de las propiedades optoelectrónicas,
para los derivados de ácido acrílico se presenta como una sección de este capítulo,
debido a que sólo se realizó evaluación de las propiedades de absortividad; puesto que
la determinación de las propiedades de eficiencia cuántica no es importante en procesos
de transferencia protónica debido a que las propiedades de la molécula excitada no son
necesariamente las mismas del estado fotoexcitado de la molécula protonada.
138.0330.00
0
2
4
6
Inte
ns. [a
.u.]
130 132 134 136 138 140 142 144m/z
74 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
4.4.2 Caracterización de absortividad molar
La mayoría de ácidos acrílicos ya han sido reportados en literatura como se observó en
la sección anterior, pero ninguno ha sido empleado antes como matriz en experimentos
MALDI. Para evaluar el potencial uso en espectrometría de masas MALDI de los
compuestos sintetizados se realizó la respectiva caracterización de las propiedades de
absortividad molar. Para el CHCA se ha encontrado que las propiedades de emisión por
fluorescencia son bastante bajas y por tanto se decidió no determinar esta propiedad
para los ácidos acrílicos sintetizados.29
Se realizaron barridos del espectro UV-Vis y se determinaron los coeficientes de
absortividad molar a 355 nm, puesto que esta es la longitud de onda de trabajo del láser
de NdYAG que se emplea en el equipo en el que se realizaron los análisis de
espectrometría de masas. Los espectros de absorción resultantes se observan en la
Figura 4-9.
Figura 4-9: Espectros de absorción para los seis derivados de ácido acrílico.
355 nm
75
Los espectros de absorción permitieron notar algunos comportamientos interesantes en
los compuestos sintetizados, como por ejemplo que la sustitución en el carbono del
hidrógeno por el grupo nitrilo genera un efecto batocrómico, puesto que todos los ácidos
derivados de acrílico presentaron un aumento en la ubicación de su máximo de absorción
de cerca de 30 nm, como se aprecia en la Figura 4-9, para la pareja Furano-Furanociano
(espectro rojo y fucsia, respectivamente) el máximo cambió de 302 a 331nm. Este efecto
es conocido para este tipo de grupos y ha sido previamente reportado, teniendo en
cuenta que el grupo ciano es un cromóforo por su triple enlace (por sus enlaces )
además por su efecto electroatractor modificando la densidad electrónica de los otros
enlaces. Los ácidos derivados de ácido acrílico demostraron que sus máximos de
absorción se encontraban lejanos de 355 nm.
Tabla 4-3: Coeficientes de absortividad molar a 355 nm para cada uno de los derivados
de ácido acrílico
Molécula
Coeficiente
absortividad molar
ε[M-1cm-1]
AFu 1.3x102
ATio 3.6x102
AITio 6.9x103
AFuCN 3.0x104
ATioCN 4.0x104
AITioCN 4.1x104
CHCA34 1.78x104
Los valores de absortividad molar se presentan en la Tabla 4-3 y se puede notar que
todos los ácidos acrílicos sin grupo ciano tienen una menor absortividad que la matriz de
referencia el CHCA, debido a que sus máximos de absorción están muy corridos hacia el
76 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
azul. Por otro lado se evidencia que el grupo ciano que generó el corrimiento de los
máximos de absorción hacia el rojo, hizo posible que las moléculas presenten un máximo
de absorción más cercano a 355 nm. Adicionalmente, se encontró que todos los
derivados de ácido cianoacrílico presentan un coeficiente de absortividad molar más alto
que el CHCA, en casi el doble de su valor y por tanto representan moléculas con alto
potencial como matrices de transferencia protónica MALDI.
El conocimiento obtenido a partir de estos resultados permite sugerir que el desarrollo de
nuevas moléculas basadas en derivados de ácido acrílico que sean potencialmente
aplicables como matrices en espectrometría de masas MALD,I deben tener en su
estructura el grupo nitrilo, puesto que éste permite tener mejores propiedades de
absortividad molar.
Capítulo 5 79
5. Derivados de ácido acrílico como matrices MALDI para procesos de transferencia protónica
En este capítulo se detallan los resultados de las pruebas realizadas, en las que se
emplearon los derivados de ácido acrílico y ácido cianoacrílico como matrices de
transferencia protónica. Se describe el alcance y el potencial de dichas moléculas en su
uso en espectrometría de masas MALDI.
5.1 Materiales y métodos
5.1.1 Experimentos de espectrometría de masas MALDI
Se preparó una solución saturada de las 6 matrices y del CHCA como matriz de
referencia en ACN:H2O (2:1, v/v, 0.1% TFA). Como analito se usó una mezcla equimolar
de tres péptidos sintéticos, en concentraciones de 63μmol/L en H2O adicionando 0.1%
de ácido fórmico para ayudar en el proceso de protonación. Los péptidos usados
corresponden a los siguientes (se específica la masa).
Bombensina 1618.8Da
Bradiquinina 1059.5Da
Renina sustrato 1759.9Da
Se aplicó 1.0μL de mezcla de matriz y analitos en el target y se dejó secar en la cabina
de extracción. Fue empleado un espectrómetro de masas Bruker UltraFlex con
analizador de tiempo de vuelo. El barrido fue hecho entre 180-2000Da, usando el
analizador en modo reflectrón y el detector en modo positivo. La intensidad del láser se
usó 5% por encima del umbral de ionización para cada muestra, con el fin de reducir la
fragmentación y aumentar la resolución. Fue empleada una relación Analito:Matriz de
80 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
1:100. Cada evaluación exitosa corresponde a 500 espectros individuales y se
requirieron 2000 espectros individuales para guardar el espectro acumulado final.
5.1.2 Cálculos computacionales
Se emplearon herramientas computacionales para explicar y analizar la protonación de
las distintas moléculas usadas durante la serie de experimentos de espectrometría de
masas MALDI. Partiendo del reporte de Bourcier y col.39 en el que se detallan cálculos de
afinidad protónica para potenciales matrices MALDI. Se usó la metodología DFT, como
funcional B3LYP, y como base 6-311++(2d,2p) para optimizar la estructura de los
distintos ácidos acrílicos y cianoacrílicos; también se calcularon las energías y las
propiedades termoquímicas para el ácido antes de la protonación y para el ácido con un
protón adicional en su grupo ácido. Para los ácidos acrílicos AITio y AITioCN, no se
pudieron realizar este tipo de cálculos puesto que esta metodología presenta
restricciones para átomos de número atómico muy grande.39 Todos los cálculos se
implementaron en el programa Gaussian 09W.
El cálculo se realizó a partir de:
AP= E(M)−E(M-H+)
E(M)=Eelec M +Eterm M
E(M-H+)=Eelec M-H+ +Eterm M-H+
Donde AP es la afinidad protónica, Eelec es la energía electrónica de la matriz y de la
matriz en estado fotoexcitado, Eterm es la energía térmica que se obtiene al calcular las
propiedades termodinámicas de la matriz y la matriz en estado fotoexcitado.
5.2 Resultados y discusión
Para establecer el potencial uso de los derivados de ácido acrílico y de ácido
cianoacrílico, se realizaron experimentos comparativos con el CHCA que es la matriz
más común y más empleada en el análisis de proteínas. La tres proteínas que se
emplearon están en el rango de 1000 y 2000 Da. En la Figura 5-1, que corresponde al
Capítulo 5 81
espectro de masas MALDI de la mezcla de las tres proteínas al ser ionizadas con CHCA,
se aprecia como el CHCA permite la ionización de los tres péptidos con intensidades
distintas, la bombesina presenta una intensidad de 6.8x104 mientras que los otros dos
péptidos presentan intensidades similares cercanas a 4.0x104 u.a.
Este resultado para el CHCA es bastante bueno, puesto que se empleó una relación
molar de 1:100, teniéndose en cuenta que en el análisis de proteínas y péptidos se busca
siempre emplear la menor cantidad de muestra, ya que como es muy bien conocido la
obtención de muchas de estas muestras es difícil y dispendiosa, y en muchos casos no
permite la consecución de cantidades altas de proteína para analizar y caracterizar
completamente. Debido a esto, una excelente matriz MALDI será aquella que genere las
más altas intensidades de señal para el ión molecular empleando las menores relaciones
analito:matriz.
Figura 5-1: Espectro MALDI de tres péptidos evaluados usando CHCA como matriz
En la zona entre 100 y 600 Da, se aprecia una cantidad significativa de señales
correspondientes al uso de CHCA, las cuales ya han sido ampliamente estudiadas52 y
que representan aductos de molécula con metales alcalinos distintos y también algunos
productos de reacciones de entrecruzamiento que se pueden dar en el CHCA debido a la
generación de estados altamente energéticos durante el fenómeno MALDI.4
379.094
1619.823
228.012
1060.565 1758.937
568.136
484.995
304.301
934.980666.021
0
2
4
6
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z
Bombensina
Bradiquinina
Renina sustrato
82 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Los ensayos realizados empleando el ATio como matriz MALDI fueron los primeros que
en ser realizados y permitieron encontrar el primer gran resultado, puesto que a pesar de
que se había observado una muy baja absortividad para esta molécula (cercana a 360 M-
1cm-1) se pudo observar la ionización de los péptidos en intensidades cercanas a 3.0x104
como se ve en la Figura 5-2, en la que se puede apreciar el espectro LDI del ATio y el
resultado al usarlo como matriz.
Figura 5-2: Espectro LDI de ATio (arriba) y espectro de masas MALDI de tres péptidos
evaluados usando ácido ATio como matriz (abajo).
Figura 5-3: Acercamiento al Espectro LDI de ATio.
398.091
476.135
274.137
629.218193.056
130730_M3_02 0:C12 MS Raw
2
4
6
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
1060.592
398.040
1619.859476.085
1758.985594.235
192.988
724.095
258.127
205.028
130730_M4_03 0:C13 MS, BaselineSubtracted
1
2
3
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z
398.040274.086
346.999
331.023
309.045
382.088
368.979
291.038352.994
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
280 300 320 340 360 380 400m/z
[2M+H]+
[2M+Na]+
[2M+K]+
Bombensina
Bradiquinina
Renina
sustrato
Capítulo 5 83
Resulta muy interesante considerar el hecho de que el ATio debió presentar alguna
afinidad ligeramente mayor por la bradiquinina respecto a los otros péptidos, puesto que
ésta es la que exhibe las mayores intensidades en los experimentos realizados. Para
tratar de entender por qué ATio había generado estos buenos resultados lo primero que
se realizó fue el análisis de la zona entre 250 y 400 m/z (Figura 5-3) para encontrar la
posible formación de aductos con iones, encontrados siempre en las moléculas que
presentan buenos resultados como matrices MALDI.29 Se pudo apreciar una señal a
309.045 m/z que fue asociada la presencia de un aducto de dos moléculas de ATio y un
protón, también se encontró una señal a 331.023 m/z correspondiente a un aducto entre
un ión sodio y dos moléculas de ATio y una señal a 346.999 m/z que fue asignada como
el aducto formado por el ión potasio y dos moléculas de ATio. Este tipo de aductos son
comunes cuando se usa CHCA y se asocian con una buena capacidad de realizar
interacciones con el péptido.7 Cabe anotar que los iones metálicos provienen de las
soluciones origen de las proteínas, pues es normal que estas estén guardadas en
soluciones amortiguadoras de pH en las que hay presencia de estos elementos.
También se recurrió al uso de herramientas computacionales para intentar explicar los
resultados obtenidos, el cálculo de energías de afinidad protónica es muy común para las
matrices nuevas que se han desarrollado.39 Se espera que la energía de afinidad
protónica no sea demasiado alta pues esto indica que la formación de la especie matriz-
protón está desfavorecida termodinámicamente. El valor de afinidad protónica para el
CHCA calculado experimentalmente es 199 Kcal/mol, así que se espera que una buena
matriz tenga un valor cercano a este.
Se modelaron estructuras con distintas conformaciones para el ATio y la optimización
permitió encontrar que las 4 estructuras presentaban menor energía (Figura 5-5).
Partiendo de éstas; se modelaron las respectivas estructuras protonadas en el carbonilo
del ácido carboxílico y se hallaron las energías de afinidad protónica. Se encontró para el
caso del ATio que las moléculas de conformación Z presentaban mayores energías de
afinidad protónica, con valores de 209 Kcal/mol que son ligeramente altos. Para la
estructura de conformación E se obtuvo 205 Kcal/mol, que es mucho más bajo y que se
puede relacionar con el fenómeno de transferencia protónica que se evidenció. Aunque
realmente los resultados del uso de ATio como matriz MALDI son mejores de lo esperado
de acuerdo a los parámetros estudiados. Adicionalmente se tiene que funcionó mejor
con la bradiquinina, y esto se puede asociar a su estructura, a razón de que este péptido
84 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
presenta zonas ligeramente hidrofóbicas pertenecientes a los fenilos de la fenilalanina,
que podrían haber presentado fenómenos sinérgicos con la insaturación y el anillo
tiofénico, a diferencia del CHCA que es de mayor carácter hidrofílico a lo largo de su
estructura.
Figura 5-4: Estructura del péptido bradiquinina.
Capítulo 5 85
Figura 5-5: Estructuras más estables encontradas para ATio, arriba de cada una se
muestran los valores correspondientes de la energía de la molécula y se puede apreciar
el valor de energía de afinidad protónica.
En los experimentos en los que se usó AFu, también se pudo realizar completamente la
ionización de los tres péptidos analizados, siendo la bombesina la que presentó mayor
intensidad en su señal, probablemente debido a que éste péptido presenta bastantes
sustituyentes polares. Lastimosamente ésta matriz presentó un problema significativo de
205 Kcal/mol
209 Kcal/mol
209 Kcal/mol
209 Kcal/mol
E: -819.145 Ha E: -819.484 Ha
E: -819.144 Ha E: -819.491 Ha
E: -819.152 Ha E: -819.500 Ha
E: -819.154 Ha E: -819.494 Ha
86 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
señales no deseadas; tanto en el espectro LDI como en el MALDI con los péptidos
(Figura 5-5) se aprecia una cantidad significativa de señales en la zona entre 100 y 700
Da. Se pudo determinar que algunas señales pertenecían a aductos de moléculas de la
matriz asociadas a protones o iones metálicos, pero la mayoría de estas no tiene una
asignación clara y una posible explicación es que se deba a la recombinación de la
matriz en productos de mayor peso molecular no deseables durante el análisis, asi
mismo de presentar una intensidad mayor para dichas señales a la que se presenta en el
CHCA.
Figura 5-6: Espectro LDI de AFu (arriba) y espectro de masas MALDI de tres péptidos
evaluados usando ácido AFu como matriz (abajo).
Para AFu se había determinado un coeficiente de absortividad molar cercano a 130 M-
1cm-1 que es considerablemente bajo, además la energía de afinidad protónica para las
estructuras de menor energía (Figura 5-7) dieron como mínimo un valor de afinidad
protónica de 206 Kcal/mol, que no es muy bueno en comparación con la matriz de
referencia. Debe tenerse en cuenta que a pesar de las limitaciones encontradas para el
uso de esta molécula como matriz MALDI se pudo comprobar la ionización de los
617.139
248.307
M2_60 0:A8 MS Raw
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
5x10
Inte
ns. [
a.u.
]
1667.873
1060.609
1619.87
M2P_60 0:I8 MS, BaselineSubtracted, Smoothed
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
500 1000 1500 2000 2500 3000m/z
Bombensina
Bradiquinina
Renina
sustrato
Capítulo 5 87
péptidos, y la señal fue relativamente alta, así que este tipo de molécula puede servir
como base para el diseño de otras en las que se puedan mejorar estas propiedades.
Figura 5-7: Estructuras más estables encontradas para AFu (arriba) y AFuCN (abajo),
arriba de cada una se muestran los valores correspondientes de la energía de la
molécula y se puede apreciar el valor de energía de afinidad protónica
207 Kcal/mol
206 Kcal/mol
197 Kcal/mol
E: -496.060 Ha E: -496.513 Ha
E: -496.156 Ha E: -496.502 Ha
197 Kcal/mol
E: -588.432 Ha E: -588.756 Ha
E: -588.421 Ha E: -588.747 Ha
88 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Los experimentos en los que se usó AFuCN como matriz MALDI de transferencia
protónica fueron sumamente satisfactorios (Figura 5-8), pues los resultados conseguidos
mostraron que AFuCN presentó para la señal de la bombesina una intensidad de 8.9x104
y por tanto tuvo un mejor desempeño que el CHCA al ionizar este péptido. Para el caso
de los otros dos péptidos se tuvieron intensidades de señal entre 3.0 y 4.0x104,
haciéndolas comparables con las obtenidas en los experimentos en los que se usó como
matriz CHCA. Los magníficos resultados son atribuidos a dos factores importantes, el
primero es que el coeficiente de absortividad molar de esta molécula fue determinado
como 3.0x104 M-1cm-1 representando casi el doble del CHCA, además los cálculos
computacionales de las estructuras con conformaciones de menor energía (Figura 5-7),
permitieron estimar el valor de la energía de afinidad protónica en 197 Kcal/mol, muy
similar al reportado para el CHCA, permitiendo establecer a AFuCN como una potencial
matriz de transferencia protónica. Se considera que el alto incremento en la señal para la
bombesina puede estar relacionado con la presencia de distintos grupos polares a lo
largo de la estructura de AFuCN, y por ello puede realizar más interacciones
intermoleculares de la matriz con los sustituyentes polares de los aminoácidos que
componen la bombesina.
Figura 5-8: Espectro LDI de AFuCN (arriba) y espectro de masas MALDI de tres
péptidos evaluados usando ácido AFuCN como matriz (abajo).
269.104
721.087
514.105
1744.147
M5_25 0:D8 MS Raw
0
1
2
3
4
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
1620.090
412.430
578.382
269.176
1060.767
M5P_25 0:D11 MS Raw
0
2
4
6
8
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
500 1000 1500 2000 2500 3000m/z
Bombensina
Bradiquinina
Renina
sustrato
Capítulo 5 89
El hecho de que se presente una alta intensidad en el péptido que presenta mayor
cantidad de grupos polares, también permite establecer la potencialidad para emplear
AFuCN en el análisis de distintos péptidos de este tipo; que podrían presentar resultados
alentadores.
Para el caso en el que se usó ATioCN como matriz MALDI de transferencia protónica se
encontró que los resultados no fueron tan satisfactorios como se esperaban. Aunque, el
coeficiente de absortividad molar fue determinado como 4.0x104 M-1cm-1 siendo superior
al doble del coeficiente del CHCA, y la energía de afinidad protónica fue estimada con
base en las estructuras de menor energía como 199 Kcal/mol, un valor bastante similar al
que posee el CHCA; pero esto no significó que se encontraran buenos resultados (Figura
5-10) ya que la intensidad máxima observada fue de 1.5x104 para la bombesina que a
pesar de no ser baja, en comparación con el CHCA y con AFuCN es bastante discreta.
Para el caso de la bradiquinina la intensidad de la señal es del orden de 102, siendo muy
inferior respecto a todas las otras moléculas.
La disminución en la intensidad en la señal de bradiquinina; que en los experimentos
para ATio había sido la más alta, permite darle fundamento a la teoría de la interacción
intermolecular de la insaturación de ATio con los sustituyentes aromáticos de los
aminoácidos de la bombesina, pues sabiendo que al introducir el grupo ciano cambia la
polaridad de esta zona de la molécula, así como la disponibilidad de la insaturación para
interaccionar, se espera una disminución en la posibilidad de interaccionar con el péptido
y por tanto la disminución en la capacidad de ionizarlo.
Figura 5-9: Estructura del péptido bombesina.
90 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
Otra de las razones a las que se atribuye el bajo desempeño de ATioCN, a pesar de sus
buenas propiedades, se relaciona con la estabilidad del derivado de ácido acrílico, pues
la muestra presentó un ligero cambio en la coloración después de su proceso de síntesis
hasta su posterior uso como matriz. La presencia de señales en el espectro LDI (Figura
5-10) en zonas superiores a 1800 Da, también pueden sugerir algún proceso de
polimerización de la muestra antes de ser usada como matriz y debido a esto la molécula
no estuvo integra al ser empleada en los experimentos y debido a limitaciones de tiempo,
estos experimentos no pudieron ser repetidos con la muestra purificada.
Figura 5-10: Espectro LDI de ATioCN (arriba) y espectro de masas MALDI de tres
péptidos evaluados usando ácido ATioCN como matriz (abajo).
317.026
1164.955
466.085 1887.9021365.947784.960 2227.923
M8_25 0:G8 MS, BaselineSubtracted, Smoothed
0
1
2
3
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
315.041
1619.931
578.284
538.058
1164.9811887.936
M8P_25 0:G11 MS, BaselineSubtracted, Smoothed
0.0
0.5
1.0
1.5
2.04x10
Inte
ns. [
a.u.
]
500 1000 1500 2000 2500 3000m/z
Bombensina
Bradiquinina
Renina
sustrato
Capítulo 5 91
Figura 5-11: Estructuras más estables encontradas para ATioCN, arriba de cada una se
muestran los valores correspondientes de la energía de la molécula y se puede apreciar
el valor de energía de afinidad protónica.
Los experimentos realizados con las moléculas AITio y AITioCN no produjeron resultados
positivos o apreciables al ser empleados como matrices de transferencia protónica, a
pesar de que exhibieran propiedades estimables como óptimas para su potencial uso
como matrices de transferencia protónica. Principalmente se atribuyen estos malos
resultados a la presencia del sustituyente yodo, pues como ha sido ampliamente
documentado en espectrometría de masas, este elemento tiende a ser retirado de la
estructura molecular, generando especies o subproductos indeseables que no fueron
percibidos debido a la ausencia de la relación masa/carga o a tener cargas negativas. El
uso de estas matrices con yodo se hizo para tener un sitio susceptible a posteriores
transformaciones sintéticas; y probar que estas matrices servían como base para el
desarrollo de posteriores moléculas con otro tipo de sustituyentes que permitieran
mejorar las propiedades de las matrices obtenidas durante esta investigación. A pesar de
estos resultados, se considera que estas moléculas pueden servir de base para la
198 Kcal/mol
203 Kcal/mol
E: -911.416 Ha E: -911.742 Ha
E: -588.421 Ha E: -588.747 Ha
92 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
síntesis de nuevas matrices, pues se parte de los resultados obtenidos con las otras
moléculas, que fueron bastante satisfactorios y prometedores.
Figura 5-12: Estructura más estable encontrada para CHCA, arriba de cada una se
muestran los valores correspondientes de la energía de la molécula y se puede apreciar
el valor de energía de afinidad protónica.
Para establecer que tan buena aproximación representaban los valores de afinidad
protónica de los ácidos acrílicos, se realizó el modelamiento del CHCA (Figura 5-12) para
determinar su energía de afinidad protónica y compararla respecto al valor experimental
de 199 Kcal/mol. El resultado del modelamiento dio una estructura de baja energía que al
emplear la metodología descrita permitió determinar un valor de energía de afinidad
protónica de 199 Kcal/mol, como ya lo había demostrado Bourcier.39
Este resultado permite pensar que las energías de afinidad protónica calculadas en este
trabajo para los derivados de ácido acrílico y cianoacrílico, están bastante cercanas a las
experimentales y por tanto sirven para la argumentación del presente trabajo
experimental. En la Tabla 5-1 se muestran las energías de afinidad protónica
determinadas para las estructuras de menor energía del CHCA y de los derivados
acrílicos.
199 Kcal/mol
E: -665.902 Ha E: -666.232 Ha
Capítulo 5 93
Tabla 5-1: Energías de afinidad protónica calculadas para las matrices empleadas en los
experimentos MALDI.
Estructura más
estable
Afinidad
protónica
(Kcal/mol)
ATio 205
ATioCN 198
AFu 206
AFuCN 197
CHCA calculado 199
Todos los resultados encontrados nos permiten sugerir que AFuCN puede tener una
aplicación posterior como matriz de transferencia protónica, y se hace necesario
someterla a pruebas adicionales para establecer una posible explotación comercial
futura.
94 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Se sintetizaron tres sistemas FV con altos rendimientos empleando la reacción de
acoplamiento carbono-carbono de Mizoroki-Heck. Dichos sistemas presentaron
excelentes propiedades optoelectrónicas; altos coeficientes de absortividad molar y bajas
eficiencias cuánticas radiativas. Su implementación como matrices de transferencia
protónica fue infructuosa debido a la imposibilidad de formar el ión molecular protonado
del FV ácido Se encontró que los FV se ionizaban empleando un camino de transferencia
electrónica y no protónica y por ello al ser probados como matrices de transferencia
electrónica, usando como analitos hidrocarburos policíclicos aromáticos dieron
excelentes resultados. Los mejores resultados en la mayoría de los experimentos fueron
obtenidos con el FVCOOH-CH3.
Los derivados de ácido acrílico fueron sintetizados exitosamente por medio de la
reacción de Knoevenagel. Se encontró que poseían propiedades de absortividad molar
interesantes, sobre todo aquellos con el grupo ciano en posición al carbonilo. La
implementación de estos ácidos como matrices de transferencia protónica permitió
encontrar que aquellos que no poseían yodo en su estructura podían hacer trasferencia
protónica. El derivado de furano y ácido cianoacrílico mostró mejores resultados que la
matriz de referencia CHCA. Se calcularon las energías de afinidad protónica y se pudo
establecer que algunas de las moléculas sintetizadas son candidatas para su
implementación como matrices MALDI y que también pueden servir como base para el
diseño de matrices nuevas. Los mejores resultados de transferencia protónica se
consiguieron con el ácido cianoacrílico de furano.
Capítulo 5 95
6.2 Recomendaciones
Se recomienda para una futura implementación de matrices MALDI basadas en FV
realizar antes de la síntesis un estudio computacional de las estructuras, para evaluar la
posible formación de cationes radicales. Además sería bueno que para las próximas
potenciales estructuras a sintetizar se tuvieran en cuenta las posibles interacciones que
habrá entre el analito y la matriz, pues esto puede determinar el tipo de analito a ionizar.
Se recomienda partir de la estructuras con anillo de furano y preferiblemente con la
presencia del grupo ciano, debido a la importancia demostrada para estos en este
trabajo, al desarrollar posibles matrices con potencial uso como matrices de transferencia
protónica.
98 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
13C RMN
Divinilbenceno
1H RMN
Anexo A. Nombrar el anexo A de acuerdo con su contenido 99
13C RMN
1,4-Diyodo-2,5-dimetoxibenceno
1H RMN
100 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
13C RMN
1,4-Diyodo-2,5-dimetilbenceno
1H RMN
102 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
13C RMN
E,E-1,4-Bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH)
1H RMN
Anexo A. Nombrar el anexo A de acuerdo con su contenido 103
13C RMN
E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH CH3)
1H RMN
104 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
13C RMN
5-yodotiofeno-2-carboxaldehido
1H RMN
Anexo A. Nombrar el anexo A de acuerdo con su contenido 105
13C RMN
Ácido acrílico de furano (ácido 3-(furan-2-il)-2-propenóico)
1H RMN
106 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
13C RMN
Ácido acrílico de tiofeno: (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-propenóico)
1H RMN
Anexo A. Nombrar el anexo A de acuerdo con su contenido 107
13C RMN
Ácido acrílico de yodotiofeno: (ácido 3-(5-yodotiofen-2-il)-2-propenóico)
1H RMN
108 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
13C RMN
Ácido cianoacrílico de furano: (ácido 3-(furan-2-il)-2-cianopropenóico)
1H RMN
Anexo A. Nombrar el anexo A de acuerdo con su contenido 109
13C RMN
Ácido cianoacrílico de tiofeno: (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-cianopropenóico)
1H RMN
13C RMN
110 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
112 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o
aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI
Título de la tesis o trabajo de investigación
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