TEMA 13
Métodos manuales y automatizadospara la identificación microbiana
Tema 13. Métodos manuales y automatizados para la identificación microbiana
1. Esquema general de identificación microbiana2. Métodos convencionales
2.1. Pruebas bioquímicas3. Métodos rápidos
3.1. Sistemas manuales3.1.1. Enterotubo
3.1.1.1. Lectura e interpretación de los resultados3.1.2. API
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API3.1.2.3. Sistema ATB (API automatizado)
3.2. Sistemas automatizados3.2.1. Abac-Abactor II
3.2.1.1. Procedimiento 3.2.2. Vitek
3.2.2.1. Procedimiento
Microscopio (fresco/tinciones)
Identificación
1. Esquema general de identificación microbiana
Microscopio (fresco/tinciones)
Pruebas genéticasPruebas inmunológicas Muestra
Cultivo puro
Aislamiento(medios selectivos)
Pruebas genéticas
Pruebas inmunológicas
Pruebas bioquímicas
2. Métodos convencionales
2.1. Pruebas bioquímicas
Rápidas (algunas) catalasa, oxidasa
- enzimas preformadas
- inmediatas
Lentas (la mayoría)
- cultivo del microorganismo (18 a 24 horas)
- medios con sustrato a metabolizar
- reacción positiva cambios de color (pH, reactivos)
Cambios de color por pH
+−
Cambios de color por reactivos
3. Métodos rápidos
Pruebas bioquímicas convencionales
• Ayuda inestimable en identificación de bacterias
Sistemas comerciales de identificación
• Manuales
• Automatizados
Ventajas:
• Rapidez de manipulación
• Homogeneidad de resultados (comparación entre laboratorios)
• Disposición de bases de datos (interpretar resultados)
3.1. Sistemas manuales
1880: primeros cultivos de microorganismos en medio sólido (Robert Koch)
1914: comercialización de un medio deshidratado (Difco)
1960-1970: sistemas comerciales (Enterotubo y API 20E)
Primeros sistemas diseñados para enterobacterias
• Frecuencia en muestras clínicas
• Rápido crecimiento
• Buen conocimiento de identificación (pruebas bioquímicas)
3.1. Sistemas manuales
Comercialización de pruebas metabólicas en paneles o galerías miniaturizados
• Gran adelanto en identificación de bacterias (principalmente)
Características:
• Pocillos de plástico
• Mínima cantidad de medio o de sustrato (liofilizado o desecado)
• Inoculación directa del medio (rehidratación del sustrato)
• Entre 10 y 50 pruebas
• Manipulación y lectura siguiendo instrucciones del fabricante
• Posibilidad de identificar enterobacterias, bacilos Gram negativos nofermentadores, estafilococos, estreptococos, neiserias, corineformes,bacterias anaerobias y levaduras
3.1. Sistemas manuales
Ventajas
• Fiabilidad semejante a pruebas convencionales
• Iguales entre sí
• Ocupan poco espacio (incubación y almacenamiento)
• Larga duración (caducidad: 6-12 meses)
• Manejo sencillo
• Fácil inoculación
• Fácil interpretación de resultados
• Pruebas y medios uniformes
Becton Dickinson Diagnostics
Tubo de polipropileno (forma de lápiz)
12 compartimentos
12 medios de cultivo diferentes (pruebas bioquímicas)
15 resultados posibles
3.1.1. Enterotubo
Alambre para inoculación
Compartimentos
Centro del tuboatravesado por alambre
Alambre sobresale por losextremos (tapones de rosca)
No se necesita suspensiónbacteriana
Inoculación directa desdecolonias aisladas (alambre)
3.1.1. Enterotubo
Insertar alambre en los 4 primeros compartimentos (condiciones anaerobias)
Romper el resto (colocar tapones de rosca)
Agujerear 8 compartimentos restantes (condiciones aerobias)
Incubar horizontalmente 18 a 24 horas a 37ºC
Reactivos inyectados con aguja hipodérmica (a través del tubo de propileno)
3.1.1. Enterotubo
3.1.1.1. Lectura e interpretación de los resultados
Lectura de las pruebas: positivas (1), negativas (0)
Obtención de un número binario (100100111001010)
Agrupar las pruebas de tres en tres
- negativas (todas valen 0)
- positivas
primera del triplete vale 4
segunda vale 2
tercera vale 1
Obtención del número de biotipo (5 dígitos)
Comprobar identificación con ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding and Identification System) (registro de perfiles)
3.1.2. API
Suministradas en sobres de aluminio sellados
Bandeja de plástico y tapa transparentes
Biomerieux
3.1.2. API
Tiras de plástico con 20 minitubos
Orificio en parte superior (inoculación)
Contienen sustratos deshidratados de 20 pruebas bioquímicas
Los pocillos de la bandeja se llenan con agua de grifo (mantener la humedad)
Necesaria suspensión bacteriana
• A partir de colonias aisladas
• Agua destilada o solución salina estéril (NaCl al 0,85%)
3.1.2. API
Llenado de los tubos enla galería API 20E
Aceite de parafina
Nivel de llenado
estándarSuspensión bacteriana
Para evitar la formación de burbujas de aire al llenar los tubos, dejar resbalar la suspensión por la pared del tubo
Cúpula
Tubo
Aceite de parafina
Pruebas negativas
Pruebas positivas
API 20E
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados
Pruebas de lectura directa e indirecta (necesitan adición de reactivos)
Identificación de pruebas positivas y negativas por el color
API STAPH
API 20 STREP
Interpretación de resultados en función de tabla
Asignar el valor + ó – a cada prueba (positiva o negativa)
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados
Agrupar las pruebas de tres en tres
• Negativas (todas valen 0)
• Positivas
Primera del triplete vale 1
Segunda vale 2
Tercera vale 4
Conversión del código binario (+ – +) en código octal (de 0 a 7)
… etc. Pruebas no incluidas en la galería
Klebsiella pneumoniaeo Serratia liquefaciensCódigo de la muestra: 5215773
Transformación de las 20 pruebas en código de 7 dígitos (número de biotipo)
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados
Anotar resultados en tarjeta
Comprobar identificación en manual o en base de datos (ordenador)
3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados
3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API
API 20 NE (No fermentadores)
API 20 A (Anaerobios)
API NH
API LISTERIA
3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API
API CORYNE
API CANDIDA
API 50 CH
3.1.2.3. Sistema ATB (API automatizado)
3.2. Sistemas automatizados
3.2.1. Abac – Abactor II
Menarini Diagnostics
Conjunto de rotores (Abac)
Instrumento paradistribución del inóculo ylectura de las pruebas(Abactor)
3.2. Sistemas automatizados
3.2.1. Abac – Abactor II
Ssistema semi-automatizado e informatizado
Permite:
1. Identificación de bacterias Gram negativas
• Determinación simultánea de sensibilidad a 15 antibióticos
• Basado en técnicas de dilución en medio líquido
2. Determinación de sensibilidad bacteriana frente a 16 antibióticos
• Bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias, estafilococosy estreptococos
3. Determinación de la CMI
3.2.1. Abac – Abactor II
Abac
Rotores con medio de cultivo deshidratado
Identificación bacteriana
Estudio automatizado de la sensibilidad antimicrobiana
• Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebas bioquímicas y 15antibióticos a una concentración única o doble
• Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a dobleconcentración
• Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucósidos y beta-lactámicos
Suministrados en bolsas de aluminio al vacío
Conservación hasta 18 meses (temperatura ambiente)
3.2.1. Abac – Abactor II
Abactor II
Distribución automática del inóculo
• Inoculación: 8 mL de suspensión en cavidad central de rotor
Lectura de los rotores de forma automática
Interpretación de resultados e impresión en tarjeta
• Resultados de identificación bacteriana
o Interpretación
- Exacta
- Probable
- Imposible
• Pruebas de sensibilidad
Descripción de Abactor II
Sector destinado a la distribución automática del inóculo y la homogeneización del cultivo después de
la incubación (mediante breve centrifugación)
Sector que realiza la lectura de los rotores (fuente de luz enfocada por
una lente al centro del pocillo)
Teclado para introducción del número de identificación de las
muestras y teclas de función
1. Realizar suspensión bacterianaa partir de colonias aisladas
2. Verter 8 mL del inóculo enla cavidad central del Abac
3. Colocar el rotor en Abactor paraque la rotación del aparato durante
unos segundos transfiera 0,1 mLde inóculo a cada célula 4. Incubar el Abac en recipiente adecuado
en la estufa a 37ºC de 18 a 20 horas
5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperary retirar la tarjeta con los resultados impresos
3.2.1.1. Procedimiento
Tarjeta de lectura
Mismo color que etiqueta colocada en los rotores
Formada por tres hojas autocopiables diferentes
Primera hoja para microbiólogo
• Resultados de pruebas bioquímicas
• Nombre (probable o exacto) de bacteria
• Posibles pruebas adicionales (confirmar identificaciones probables)
• Perfil de sensibilidad a antimicrobianos (resistente, intermedio, sensible)
Otras copias para médico
• Identificación definitiva
• Perfil de sensibilidad
Tarjeta de lectura
3.2.2. Vitek
Sistema automatizado e informatizado
Permite identificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendopatógenos de orina, patógenos entéricos, levaduras, anaerobios, Neisseria yHaemophilus
Módulo de llenado y selladoIncubador y lector
Tarjetas
Programa
Disco duroImpresora
Indica susceptibilidada antimicrobianos
Biomerieux
3.2.2. Vitek
Módulo de lectura admite 30, 60, 120ó 240 tarjetas
Solicitud de resultados en cualquiermomento del proceso
Identificación disponible en 4-6 horasde media (2 horas para bacterias de crecimiento rápido)
Tarjetas de plástico transparente
Llenado por succión al vacío (hasta 10a la vez)
Transferencia automática del inóculo
Pocillo consustrato
1. Marcar la tarjeta con número quesistema pueda leer directamente
2. Añadir diluyente al tubo quecontiene la muestra y colocar tarjetas
en soporte con el tubo de transferenciadentro del tubo de muestra
3. Colocar tarjetas en el módulo dellenado y sellado; la muestra se
introduce por succión al vacío en lospocillos, sellando después la tarjeta
3.2.2.1. Procedimiento
4. Colocar tarjetas en bandejae introducir en módulode incubación y lectura
5. Posibilidad de solicitar informepreliminar una hora después
de cargar la muestra
6. Para cada tarjeta se imprimeautomáticamente al final del
ciclo un informe final
3.2.2.1. Procedimiento