ANLISIS Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOSReaccin de la ninhidrina (espectrofotomtrica)Reaccin con o-ftalaldehdo (Fluorimtrica) Cromatografa deintercambio catinicoActualmente: HPLC
Cromatografa en capa fina (aminocidos)
PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE PROTENAShttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
CENTRIFUGACIN ISOPCNICAhttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENASSe basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad
Afinidad por otras molculas
SEPARACIN DE PROTENASCROMATOGRAFA EN COLUMNALas diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a grupos qumicoshttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
A: CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO(Ej: intercambio catinico)Las protenas se separan segn su carga a un pH determinado
B: CROMATOGRAFA DE FILTRACIN O EXCLUSIN MOLECULARLas protenas se separan segn su tamao
C: CROMATOGRAFA DE AFINIDADLas protenas se separan en funcin de la especificidad de unin a un ligando. En este ejemplo el ligando es la glucosa y se separan aquellas protenas que se unen a ella. Las protenas de inters se eluyen aadiendo un exceso de ligando libre.
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
ELECTROFORESIS EN GEL ELECTROFORESIS EN GEL:Tras aplicar un campo elctrico las protenas migran en funcin del tamao y de la carga(solubiliza protenas)Electroforesis en SDS-PAGEhttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Ejemplo de anlisis de protenas por SDS-PAGE en cada paso de una purificacin. En el ltimo paso hay una nica banda, lo que indica que tenemos la protena de inters completamente purificada
ISOELECTROENFOQUEEs un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un gradiente de pH. Cada protena migra hasta su punto isoelctrico.http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Ejemplo de SDS-PAGE teido con azul de CoomassieMarcador de PMMarcador de PM
GELES BIDIMENSIONALES (2D)Primero isoelectroenfoque y luego SDS-PAGE
Ejemplo de gel bidimensional
SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENASSe basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad (centrifugacin)
Afinidad por otras molculas
FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIN DE LA SOLUBILIDAD(Voet)(p.e. sulfato de amonio)
(Voet)