Universidad Central “Martha Abreu” de Las Villas.
Facultad de Química-Farmacia.
Departamento de Farmacia.
Tesis para optar por el título de
Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
“Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos
de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
Autora: Yileimys Cárdenas Expósito.
Tutores: MSc. Edisleidy Águila Jiménez.
MSc. Nancy Bernal Pérez.
Santa Clara.
2009.
Dedicatoria
Yileimys Cárdenas Expósito _ _ ____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
A mi mamá, por estar siempre a mi lado y enseñarme el camino correcto,
por su paciencia, comprensión y dedicación. Por su infinito amor, por ser mi
más valioso tesoro, mi luz y mí guía y porque sin ella no hubiese sido posible
realizar este sueño.
A mi esposo, por ser el hombre más maravilloso que he conocido, por ser
mi amigo, mi esposo y amante, por toda su dedicación y paciencia para
conmigo, por estar siempre a mi lado y compartir mis alegrías y tristezas, por
respetarme, amarme y cuidarme, a ti amor mío dedico parte de este trabajo.
A mis queridos abuelitos, por ser muy importantes para mi felicidad y
por su inmensa colaboración.
Agradecimientos
Yileimys Cárdenas Expósito _ _ ____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
A mis tutoras Nancy y Edisleidys, por su ayuda desinteresada, dedicación,
comprensión, por brindarme su amistad y sobre todo por tenerme mucha
paciencia, se que sin ellas no hubiera sido posible la realización de este trabajo
por todo esto y mucho más les estaré eternamente agradecida.
A mi familia, que a lo largo de este camino nunca me abandonaron.
- A mis primos Oelvis y Laraine por ser un verdadero ejemplo a seguir, por
todos los consejos que a lo largo de mi carrera me dieron, por brindarme su
mano y guiarme por el camino correcto y por todo lo que para mí representan.
- A mi madre, porque gracias a su sacrificio me he convertido en la persona que
hoy soy.
- A mi padre, por poder contar con el para todo lo que he necesitado.
- A mi abuela y abuelo por su amor, cariño y todos sus esfuerzos para que hoy
se cumpliera este sueño.
- A mi tía Milagro y Miao, por su gran preocupación a lo largo de toda mi
carrera, por su infinita colaboración y su gran cariño.
- A Vicentino y Magda, por su apoyo, cariño y amor.
Y quiero agradecer en especial a una persona que aunque no lleva mi sangre
siempre formará parte de mi familia.
- A Wayny, por su inmenso amor y cariño, por su preocupación, por brindarme
su apoyo y amistad en todo momento y por lo mucho que para mí significa.
Agradecimientos
Yileimys Cárdenas Expósito _ _ ____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
A mis amistades, Annileidys, Dianne, Yainy, Yeilin, Dayana, Tamara, por estar
siempre pendientes de mis estudios, a Cabeza, Odalys, Guallito y Evelin, por
preocuparse por mí y aportar su granito de arena para la realización de este
trabajo.
A todos mis compañeros que de una forma u otra me ayudaron a realizar este
sueño, a Grey, Anita, Urbano, Onelys, Yusmilany, Yadira.
A mis profesores, Elisa, Luis Torres, Daimi y en especial a Mirtha Mayra, por
toda su ayuda, dedicación, confianza y comprensión, por estrecharme su mano
siempre que la necesite, por todos los consejos que me dió y ser para mi como una
madre más.
A todos, muchas gracias.
Yileimys.
Resumen
Yileimys Cárdenas Expósito _ _ ____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
Se ha demostrado que la evaluación de la contaminación mediante la utilización de
bioensayos de toxicidad es una herramienta imprescindible en la valoración de los
potenciales efectos sobre los organismos en diversos ecosistemas, lo que ha
llevado a la incorporación de estos en el biomonitoreo de los residuos de sustancias
químicas de origen natural o sintético que son vertidas al medio sin tratamiento. En
el presente trabajo se aborda la evaluación del efecto de los extractos acuosos de
Nicotiana acuminata, piper y Crotalaria juncea producidos a mediana y gran escala
en el laboratorio de formulación de la Facultad de Química- Farmacia de la
Universidad Central Martha Abreu de las Villas utilizando el ensayo de inhibición de
la germinación y la elongación de las raíces de semillas de Raphanus sativus
(rábano), Lactuca sativa L (lechuga) y Lycopersicon esculentum ( tomate). Se
demostró al concluir el trabajo que la lechuga resultó la especie más sensible para
este tipo de estudio. Los extractos pueden ser vertidos al medio a concentraciones
menores que 0.01 % con un margen de seguridad que no van a afectar los procesos
de germinación y elongación de las raíces. Se determinó que se puede emplear el
ensayo solo utilizando las semillas de lechuga como especie de ensayo.
Índice.
Yileimys Cárdenas Expósito __ _____________________________________ “Estudios de estabilidad del aceite obtenido de las semillas de Cucurbita moschata Duch.”
INDICE.
Introducción. 1
CAPÍTULO I. Revisión bibliográfica. 4
1.1. Ecotoxicología. Generalidades. 5
1.1.1. Estudios acuáticos y terrestres. 5
1.1.2. Evaluación del riesgo ambiental. 5
1.2. Evaluación ecotoxicológica de Cuba. 6
1.3. Características de los compuestos ecotóxicos. 7
1.3.1. Actuación de los compuestos ecotóxicos en el medio ambiente. 7
1.4. Influencia de residuales naturales en el medio ambiente. 9
1.5. Ensayos de toxicidad. 11
1.5.1. Bioensayos de toxicidad. 12
1.5.2. Ensayos ecotoxicológicos en medio terrestre. 13
1.6. Consideraciones generales sobre el uso de las plantas medicinales. 16
CAPÍTULO II. Materiales y métodos. 18
2.1. Preparación de los extractos vegetales. 18
2.2. Materiales y reactivos. 18
2.3. Obtención, control y conservación de las semillas. 19
2.4. Procedimiento experimental. 19
2.4.1. Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad 20
2.5 Expresión de los resultados 21
2.5.1. Interpretación de los resultados. 21
CAPÍTULO III. Resultados y discusión. 23
3.1 Efecto de los extractos sobre la inhibición de la germinación. 23
3.2 Resultados del efecto de los extractos sobre la inhibición de la elongación de las raíces.
25
Conclusiones. 33
Recomendaciones. 34
Bibliografía. 35
Introducción 1
Yileimys Cárdenas Expósito __ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
INTRODUCCIÓN
La ecotoxicología, disciplina científica relativamente joven, desarrollada a partir de
la toxicología y la química medioambiental comprende el estudio del destino y
efecto de agentes tóxicos en los ecosistemas incluyendo además el estudio de los
efectos tóxicos a nivel celular, individual, poblacional y comunitario. Integra varias
disciplinas, dentro de las más importantes se encuentran: la biogeoquímica
ambiental, toxicología y ecología, tratando de dilucidar los mecanismos, procesos
y respuestas, versando sobre las interacciones entre los organismos, los agentes
tóxicos y el medio ambiente.
Durante las últimas décadas la comunidad científica y reguladora se ha dado
cuenta gradualmente que se deben considerar metodologías biológicas que
incluyan una batería de ensayos con especies de los diferentes niveles tróficos en
las cuales se encuentran varias especies de: bacterias; algas azul verdosas;
levaduras; hongos; protistas flagelados y ciliados; algas microscópicas; plantas;
celenterados; nemátodos; rotíferos; lombrices de tierra; moluscos; crustáceos;
insectos; erizos de mar; peces; ranas y; mamíferos (ratones, ratas, cobayos,
conejos y otros).
Actualmente en esta rama de la toxicología son empleados los bioensayos
ecotoxicológicos que proporcionan información para la evaluación del riesgo e
investigan los efectos y mecanismos de acción de nuevas sustancias químicas.
Las alternativas más prometedoras en ecotoxicología abarcan la utilización de
unos pocos organismos con sensibilidad limitada y/o que no están protegidos por
la legislación. Estos incluyen bacterias, hongos, algas, plantas y animales
invertebrados. Sin embargo, hay autores que indican la necesidad de combinar
estos ensayos ecotoxicológicos con los químicos para evaluar dicha toxicidad
potencial y establecer su naturaleza (Repetto y col., 2001), (Bellas y col., 2005).
Lo cual nos pone ante la necesidad de establecer un balance entre los análisis
químicos, biológicos, toxicológicos y microbiológicos los cuales constituyen la
mejor estrategia para generar una base de información más amplia sobre los
peligros ambientales de estos contaminantes. La necesidad de la introducción de
Introducción 2
Yileimys Cárdenas Expósito __ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
estas pruebas biológicas ha sido frenada por el problema de los costos asociados
con las pruebas ecotoxicológicas, especialmente las empleadas para el control
rutinario y monitoreo de los niveles de contaminantes. Uno de los aspectos que
han contribuido a este freno es el número restringido de laboratorios
especializados y los altos costos de cultivo y mantenimiento continuo de “stocks”
de organismos vivos para los ensayos. Intensas investigaciones se han llevado a
cabo en las últimas dos décadas en numerosos laboratorios para desarrollar
microbioensayos alternativos para permitir el empleo de pruebas rutinarias de
bajo costo, y con equipo y materiales básicos de laboratorio.
Entre las determinaciones que se pueden efectuar con los bioensayos se pueden
mencionar las siguientes: evaluación de reducción de toxicidad (p.ej., en plantas
de tratamiento), dosis/concentración letal/efectiva/inhibitoria media (p.ej., DL50,
CE50, CI50; en toxicidad aguda y crónica), dosis/concentración mínima inhibitoria,
concentración sin efecto observado, riesgo ecotoxicológico de aguas naturales,
efluentes y otras matrices , potencial de eutroficación de aguas naturales o de
efluentes líquidos.
La diversidad de organismos que se encuentran en la naturaleza se refleja en la
variedad de procesos metabólicos y compuestos químicos de los cuales depende
la vida en sus diferentes niveles de expresión, desde bacterias a plantas y
animales superiores. Una sustancia con propiedades tóxicas puede serlo para un
tipo de organismo pero no para otro, dependiendo con que compuestos de la
célula interactúa. Por ello, se considera que tres es el mínimo de especies con las
cuales se debe evaluar la toxicidad de una muestra, incluyendo representantes de
organismos fotosintéticos (microalgas) y animales de dos niveles de complejidad,
un invertebrado como el crustáceo (pulga de agua) Daphnia y un vertebrado como
alguna especie de pez.
En términos de toxicidad deberá evaluarse la toxicidad aguda y la toxicidad
crónica. De la misma manera, se puede evaluar la toxicidad de muestras de
efluentes líquidos antes de su descarga, en términos de toxicidad crónica. Estos
bioensayos intentan obtener información, a partir de la determinación de variables
que se vean afectadas por una exposición prolongada a concentraciones o
Introducción 3
Yileimys Cárdenas Expósito __ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
diluciones (volumen/volumen) relativamente bajas, de manera que produzcan
efectos sub-letales.
En nuestro marco y aprovechando la experiencia adquirida en la rama de la
toxicología preclínica en la evaluación de nuevos principios activos y productos de
origen natural o sintético y ahora como miembros de la Red Nacional de
Ecotoxicología nos hemos dado a la tarea de incorporar paulatinamente una serie
de ensayos para la evaluación de nuevos productos con fines de registro y de las
aguas residuales de los laboratorios de producción existentes en el recinto
universitario como un indicador de seguridad ecotoxicológica de estos al ser
vertidos, para contribuir en gran medida al desarrollo de una política medio
ambiental consecuente con el cuidado y protección del medio ambiente nos
hemos propuesto abordar la realización del monitoreo de las producciones del
laboratorio de Tecnologia Farmaceutica perteneciente al Departamento de
Farmacia de la Facultad de Química- Farmacia de la Universidad Central Martha
Abreu de las Villas, para lo cual se ha diseñado el siguiente sistema de objetivos:
Objetivo general:
Evaluar ecotoxicológicamente tres extractos acuosos producidos en la
Facultad de Química – Farmacia de la Universidad Central Marta Abreu de
las Villas utilizando los ensayos de inhibición de la germinación y
elongación de la raíz en plantas de rábano, lechuga y tomate.
Objetivos específicos:
Determinar la Concentración letal media (CI 50) de los extractos sobre la
germinación de las raíces de semillas de plantas.
Determinar la Concentración efectiva media (CI 50) de los extractos sobre
la elongación de las raíces de semillas de plantas.
Determinar la especie más sensible en estos ensayos.
Revisión Bibliográfica 4
Yileimys Cárdenas Expósito _ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
CAPÍTULO I. REVISION BIBLIOGRÁFICA.
1.1 Ecotoxicología. Generalidades.
La Ecotoxicología es la ciencia que se encarga del estudio de los efectos de las
sustancias químicas xenobióticas sobre la estructura y función de los ecosistemas
considerados de forma integrada, para lo que resulta indispensable el análisis de los
efectos a nivel individual y poblacional. Existen dos tipos de ecotoxicología, la
prospectiva que evalúa la toxicidad de las sustancias antes de su producción y uso y
la retrospectiva que se ocupa de confirmar si la sustancia produce daños en el
ecosistema.El principal objetivo de la aplicación de las investigaciones
ecotoxicológicas es la elucidación de indicadores de toxicidad que serán utilizadas
para la evaluación de los riesgos que pueda implicar la liberación al ambiente de
productos químicos potencialmente peligrosos (Burger J., 2000).
En la actualidad se han diseñados modelos de ecosistemas para todos los
ambientes (acuático, terrestre, aéreo y sus combinaciones) y el éxito de las
evaluaciones de Seguridad Ambiental de un producto o vertido estriba en escoger el
modelo adecuado, crear condiciones similares a las naturales, y utilizar especies
naturalmente afectadas o de alta sensibilidad. El principio fundamental de la
ecotoxicología es que los organismos vivos son herramientas esenciales para la
evaluación de la calidad ambiental, puesto que ellos son los que están expuestos a
los efectos combinados de la ecotoxicidad (Ronco A., 2002)
Pero hoy, en la etapa más rigurosamente contemporánea, se ha desarrollado un
nuevo aspecto. El paso de cantidades importantes, de tóxicos en el medio. Hay tres
factores que complican y confieren gravedad a este tema. De un lado la gran
cantidad de sustancias: todos los productos utilizados en la industria. De otro las
cantidades masivas de algunos productos, miles de toneladas en la extensión de la
tierra, por ejemplo el plomo, el mercurio o los plaguicidas. En tercer lugar que los
posibles afectados somos todos. La totalidad de la población está expuesta a los
efectos de los contaminantes, tanto las personas en correcto estado de salud como
quienes, por su patología previa, son mucho más vulnerables a la acción de un
tóxico. Y además de una manera involuntaria, pasiva y sin conocimiento concreto
del riesgo. Así se valoran ya los incrementos claros de la mortalidad por la patología
Revisión Bibliográfica 5
Yileimys Cárdenas Expósito _ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”
respiratoria coincidiendo con episodios puntuales de aumento de gases de origen
doméstico o industrial en la atmósfera (Kooi BW., 2008).
El fenómeno de la contaminación ha pasado a tener una importancia sanitaria de
primer orden. La defensa o protección del medio ambiente se ha convertido en un
problema político y está fijada claramente en las leyes fundamentales de algunos
países, entre ellos España.
1.1.1 Estudios acuáticos y terrestres.
Sirven para evaluar, en las especies analizadas, los efectos tóxicos tanto de
determinados compuestos y productos para su clasificación (de acuerdo con la
legislación de régimen hidráulico, para hojas de datos de seguridad, autorizaciones
de transporte, para el registro de sustancias químicas, productos fitosanitarios y
biocidas), como también de tomas de muestras ambientales (por ejemplo, en el
sector de antiguos vertederos o para la evaluación de aguas residuales).
Los tests de toxicidad, en función de los requisitos de las autoridades, se requieren
como estudios:
Agudos.
Subagudos.
De reproducción (Dutka BJ., 1989)
1.1.2 Evaluación del riesgo ambiental.
La ecotoxicología la podemos definir como la ciencia que se encarga de estudiar los
efectos de las sustancias químicas sobre las estructuras y función de los
ecosistemas. De hecho, valorar y predecir efectos sobre estructuras altamente
complejas es sin duda una tarea difícil de desarrollar y es por ello, que se han
diseñado modelos de valoración de riesgos que nos permiten predecir situaciones
adversas sobre el medio ambiente producto de la liberación de sustancias químicas,
en este caso de plaguicidas (Burger J., 2000)
La Evaluación de Riesgo Ambiental, ERA, es un buen mecanismo para la toma de
decisiones en este campo, los procedimientos de la misma , se basan en los
criterios de no efecto, en donde se considera que la utilización de los plaguicidas
debe regularse, a modo que se evite la aparición de efectos adversos sobre el
Revisión Bibliográfica 6
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medio ambiente, el planteamiento ecotoxicológico extrapola al campo ambiental un
axioma que establece que la mayoría de las curvas que relacionan la dosis o
concentración del tóxico a que se ve sometido un individuo, con la respuesta que en
el se produce tienen forma sigmoidea, la extrapolación se basa en utilizar la
información existente para determinar las dosis o concentraciones para la cual no
hay efectos, considerando la calidad y cantidad de la información disponible, la
Evaluación de Riesgo Ambiental ERA, permite establecer los límites de
aceptabilidad mediante procedimientos científicos basados en la información
disponible (APHA-AEEA-WPCF, 1992)
1.2 Evolución ecotoxicológica de Cuba.
En nuestro país se tienen referencias de manifestaciones tóxicas en el hombre,
ocurridas en el siglo XV, ocasionadas por la inhalación de gran cantidad de tabaco,
lo cual producía embriaguez, manifestando alucinaciones, en las que decían que
habían hablado con el SEMI, nombre que en la Isla los indígenas le daban a sus
ídolos moldeados en barro de madera grosera y tosca. Un hecho trascendental en la
historia de la Toxicología Cubana, se produce en esta época, cuando el Dr. en
Medicina y Cirugía, farmacéutico de la escuela de París, Catedrático en Fisiología,
Patología General e Higiene Privada de la Universidad de la Habana, Dr. Julio Le
Riverend y Languor (1793-1864) publicó en esta ciudad, (en la imprenta del
Gobierno), su diccionario de Reactivos Químicos Toxicológicos y Medicina Legal
con una extensión de 400 páginas; primer libro escrito en nuestro país sobre
Toxicología.
Fueron múltiples los médicos cubanos que se dedicaron a resaltar el papel que
jugaba el estudio de la Química de modo científico y su papel en el desarrollo
detallado del análisis cualitativo y cuantitativo.
En esta época los farmacéuticos eran los encargados por los tribunales de
investigar la existencia de venenos, de ahí la necesidad de estos conocimientos.
En nuestro país, las publicaciones sobre esta temática eran esporádicas y a medida
que transcurre el tiempo surgen diferentes personalidades que enriquecen sus
conocimientos y los ofrecen a favor de las investigaciones sobre las causas y
desenlace de los envenenamientos.
Revisión Bibliográfica 7
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Con el triunfo de la Revolución, se le da un impulso a los estudios universitarios en
el país y como parte de ello, la Toxicología se inserta en la enseñanza de los
estudios de Medicina y de Farmacia en los diferentes planes de estudio, los cuales
tratan de perfeccionarse.
1.3 Características de los compuestos ecotóxicos.
Un ecotóxico es un producto químico peligroso con capacidad para ser absorbido
por cualquiera de los elementos de un ecosistema y para, por pequeña que sea la
cantidad presente, alterar los equilibrios biológicos del mismo. Muchos de ellos
tienden a persistir en el ambiente. El ser humano es un elemento más de los
ecosistemas. Con el fin de poder actuar eficazmente sobre los problemas de
ecotoxicidad, resulta muy importante establecer la relación existente entre los
productos y la contaminación ambiental. Se dice que un ambiente está contaminado
cuando en él aparecen sustancias o productos que no debieran estar, o cuando su
concentración es distinta a la que debería haber de forma natural. En ambos casos
los ciclos naturales no pueden desarrollarse adecuadamente y se rompen los
equilibrios naturales (agua, carbono, azufre o nitrógeno). Podemos afirmar, por
tanto, que todos los tóxicos son contaminantes, pero no todos los contaminantes
son tóxicos. Por ejemplo, el CO2 es un compuesto natural presente en el aire que
en las concentraciones en que aparece en la naturaleza resulta inocuo para los
animales, plantas y personas, sin embargo, el aumento de su concentración en la
atmósfera como consecuencia de la combustión de combustibles fósiles es una de
las causas fundamentales del cambio climático (Betton C., 1993)
Independientemente de su forma física (gases, disoluciones, partículas, aerosoles o
residuos sólidos) y de los focos de emisión, hay dos tipos básicos de contaminantes:
primarios, que se vierten como tales desde los focos de emisión al ambiente y
secundarios, que se forman en el ambiente por las distintas reacciones químicas en
que participan los anteriores (oxidación, síntesis, hidrólisis o fotólisis).
1.3.1 Actuación de los tóxicos en el medio ambiente.
La acción de un tóxico en un ecosistema se divide en dos etapas, la primera
denominada toxicocinética en la que el tóxico entra en el ecosistema, se acumula y
Revisión Bibliográfica 8
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se transforma, y la segunda etapa, o toxicodinámica, que integra la acción del tóxico
y la respuesta del ecosistema:
PRIMERA ETAPA: El compuesto entra por el aire en forma de vapor o de gas,
arrastrado o diluido por el agua de lluvia, de riego, etc.. o, a veces, difundiéndose
por materiales permeables. Incluye tres fases:
a-Transporte. Introduciéndose en las cadenas alimenticias y en los ciclos
biogeológicos, alterándolos. Los principales ciclos son el del agua, el del carbono, el
del azufre y el del nitrógeno y revisten gran interés por su enorme impacto, los del
ozono, fósforo, arsénico, mercurio, cadmio, plomo, selenio, el de las nitrosaminas y
el de los productos organoclorados (plaguicidas, bifenilos, PCB, PCT,..).
b- Acumulación en el medio y en los organismos (Bioacumulación). El tóxico se
integra en la cadena trófica y va incrementando su concentración en las distintas
especies pudiendo llegar hasta el ser humano. Se mide habitualmente por medio del
Factor de Bioconcentración (FCB).
c-Transformaciones de los compuestos como resultado de reacciones
químicas o de procesos biológicos. Estos cambios pueden representar unas
veces un incremento y otras una reducción de la toxicidad. El conocimiento de los
factores de bioconcentración es útil para la evaluación del riesgo de exposición y
estimar las consecuencias a largo plazo, así como para establecer los niveles
legales en agua y alimentos.
SEGUNDA ETAPA: La acción del tóxico desencadena efectos en el medio, la
respuesta de los elementos y comunidades vivas y la reacción global del
ecosistema. Las acciones tóxicas, al igual que ocurre en relación a la salud laboral,
pueden ser de carácter agudo o crónico, sin embargo, hay una gran diferencia pues
la ecotoxicología no considera las acciones sobre individuos aislados sino sobre las
poblaciones y sobre el equilibrio del sistema. Es importante establecer esta
diferencia porque los efectos producidos y los indicadores que informan de los
mismos son distintos.
Para medir la acción ecotóxica se utilizan los siguientes conceptos:
Efectos agudos: “dosis letal media” (DL50, CE50 o CL50), parámetro que indica la
dosis o concentración que produce la muerte al 50% de los individuos de la especie
experimental.
Revisión Bibliográfica 9
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Efectos crónicos: “ concentración de inhibición del crecimiento” o, en el caso de
pequeños invertebrados, “concentración de inmovilización” (CI50) parámetro que
indica la concentración de un tóxico en el aire, agua o tierra, que inhibe el
crecimiento o la movilidad del 50% de la población expuesta.
En función de estos conceptos se establece la clasificación general de productos
ecotóxicos.
Además, los efectos que produce una acción tóxica pueden ser directos o indirectos
y reversibles o irreversibles. Los efectos directos son consecuencia de la acción del
compuesto sobre las poblaciones de las distintas especies presentes. Los efectos
indirectos aparecen como consecuencia de las modificaciones que se producen en
las condiciones ambientales (temperatura, humedad, lluvias ácidas, incremento de
CO2).
Habitualmente, a un ecosistema pueden llegar numerosos contaminantes, unos
persistirán un largo tiempo, otros serán transformados o destruidos por el medio;
también varía el tiempo que permanecen en los organismos vivos. Como
consecuencia se produce una interacción de los distintos tóxicos que se conoce con
el nombre de toxicidad múltiple. La gran diversidad de sustancias que se liberan al
medio ambiente con las múltiples reacciones posibles que pueden tener lugar entre
ellas, hace que resulte muy complejo determinar con rigurosidad los efectos que
resultan de la toxicidad múltiple. Sin embargo, a modo de ejemplo, describimos un
fenómeno que sí es conocido, como es el caso de la “potenciación gas-polvo”, en
que las partículas, por simple adsorción potencian la concentración de gases y
vapores facilitando el transporte y la incidencia del tóxico en el órgano humano u
organismos expuestos. Así, en los seres humanos, para reducir a la mitad la
capacidad respiratoria se precisan 60 ppm de SO2, pero si se añaden 4 mg/m3 de
partículas de cloruro sódico éste efecto se consigue con sólo 18 ppm de SO2 y, si
incorporamos 10 mg/m3 de partículas de cloruro sódico la respuesta se multiplica 15
veces, pues la concentración de SO2 precisa se reduce a 4 ppm (Hursthouse
2009).
1.4 Influencia de residuales naturales sobre el medio ambiente.
Revisión Bibliográfica 10
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La acción del hombre sobre el planeta ha sido tan notable, especialmente en el
último siglo, que se puede afirmar que no existe ecosistema que no esté afectado
por su actividad. Desde hace milenios el hombre ha explotado y modificado la
naturaleza para subsistir, pero en los últimos decenios además ha producido miles
de sustancias nuevas que se han difundido por toda la atmósfera, la hidrosfera, los
suelos y la biosfera (Dutka BJ., 1989)
Todos los organismos consumidores viven de la explotación del ecosistema y la
especie humana también necesita explotarlo para asegurar su supervivencia. De la
naturaleza se obtienen los alimentos y a la naturaleza se devuelven los residuos que
generamos con nuestra actividad. La energía que empleamos la obtenemos, en su
mayoría, de la combustión de reservas de compuestos de carbono (petróleo,
carbón, gas) almacenados por el trabajo de los productores del ecosistema a lo
largo de muchos millones de años.
Entre las acciones humanas que más influyen en el funcionamiento de los
ecosistemas tenemos:
Agricultura y ganadería
Obtención de energía y materias primas
Reciclado de residuos
Destrucción de ecosistemas naturales
Introducción de organismos ajenos al ecosistema.
La actividad humana mueve muchas especies de unos lugares a otros. A veces
conscientemente y otras sin querer, al transportar mercancías o viajar de unos sitios
a otros.
Muchas de estas especies son beneficiosas por su aprovechamiento agrícola o
ganadero, como la patata y el maíz que fueron introducidas en Europa y son un
importantísimo recurso alimenticio. Otras sirven para controlar plagas. Pero algunas
son muy perjudiciales, porque no tienen depredadores que las controlen y se
convierten en plagas. Siempre hay que tener en cuenta que la alteración del
ecosistema es muy difícil de prever y sus efectos secundarios difíciles de controlar
(Fairbrother 2001).
Revisión Bibliográfica 11
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1.5 Ensayos de toxicidad
Los ensayos de toxicidad son los bio ensayos empleados para reconocer y evaluar
los efectos de los contaminantes sobre la biota. En los bioensayos se usa un tejido
vivo, organismo, o grupo de organismos, como reactivo para evaluar los efectos de
cualquier sustancia fisiológicamente activa.
Estos ensayos, básicamente, consisten en la exposición de grupos de organismos,
a determinadas concentraciones del tóxico por un tiempo determinado. Los
organismos deben estar en buenas condiciones de salud, previamente aclimatados
a las condiciones del ensayo, y se mantienen en condiciones ambientales
constantes. Además se dispone de grupos de control (que no se exponen al tóxico).
Luego se miden y registran los efectos biológicos observados en cada uno de los
grupos control y tratados y, posteriormente, se efectúa un análisis estadístico de los
datos obtenidos .
Los efectos tóxicos a evaluar pueden ser: mortalidad, inmovilidad, inhibición del
crecimiento de la población, alteración del comportamiento, etc. Se determinan
distintas variables como, por ejemplo, la concentración letal 50 (CL 50), que es la
concentración letal para el 50 % de los individuos expuestos. Las condiciones de los
cultivos y los ensayos deben estar altamente estandarizadas para permitir la
comparación de los resultados.
Los ensayos de toxicidad permiten establecer los límites permitidos para los
distintos contaminantes, evaluar el impacto de mezclas sobre las comunidades de
los ambientes que las reciben y comparar la sensitividad de una o más especies a
distintos tóxicos o a diferentes condiciones para el mismo tóxico. Es útil para la
investigación básica del fenómeno de toxicidad, establecer criterios o patrones de
calidad de aguas superficiales o efluentes, la evaluación del impacto ambiental y del
riesgo ecológico y el monitoreo de las condiciones de un cuerpo de agua.
Generalmente, no es suficiente para proteger la biota registrar en un ecosistema
dado las concentraciones de las sustancias químicas; los programas para
monitorear tales sustancias suelen ser muy caros, y aquellas de alta toxicidad
generalmente deben detectarse en concentraciones muy bajas, usando equipos
costosos y personal muy entrenado; y en un solo ambiente puede haber cientos de
contaminantes con efectos muchas veces no aditivos. Por lo tanto, se necesitan los
Revisión Bibliográfica 12
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ensayos biológicos que son relativamente simples, rápidos y económicos, y pueden
brindar información adicional sobre el riesgo potencial, incluyendo efectos tóxicos
como generación de cáncer, malformaciones, desórdenes de conducta, efectos
acumulativos, antagonismos y sinergismos.
Los ensayos pueden ser de laboratorio (con un número reducido de especies, y en
condiciones estandarizadas que reproducen sólo en forma muy parcial las
condiciones naturales en el ambiente), o de campo (con “encierros” sometidos a las
condiciones del medio).
Mediante los ensayos de toxicidad se estudian las relaciones dosis o concentración,
efecto y dosis o concentración - respuesta (efecto: cambio biológico evaluable por
una escala de intensidad o severidad; respuesta: proporción de la población
expuesta que manifiesta un efecto definido).
Los organismos empleados para los ensayos deben tener alta sensibilidad a los
tóxicos, ya que al establecer las concentraciones seguras para ellos se espera
proteger a todo el ecosistema, pero hay que tener en cuenta que distintas especies
tienen diferente sensitividad a distintas sustancias químicas. Más de 150 especies
desde bacterias hasta mamíferos se usaron como organismos para test, pero sólo
unas 40 tuvieron cierta aprobación oficial.
De todos modos, ninguna especie aislada podría representar adecuadamente un
ecosistema entero en sensitividad toxicológica, por lo que hay organizaciones que
recomiendan una serie de ensayos crónicos incluyendo, por ej: algas, dáfnidos y
peces . Se utilizan métodos integrados (secuencial, para evaluar la toxicidad de
sustancias químicas puras, y simultáneo, para deshechos que contienen varias
sustancias diferentes). Los ensayos deberían complementarse con monitoreos
biológicos y el uso de indicadores ecológicos (EPA/600/3-88/029, 1989).
1.5.1 Bioensayos de toxicidad
Los bioensayos de toxicidad son procedimientos de laboratorio empleados para
evaluar los efectos tóxicos potenciales de contaminantes químicos, efluentes
industriales, o muestras de agua de un cuerpo receptor sobre biomodelos sensibles.
Los efectos se evalúan a través de respuestas letales (mortalidad) en estudios de
toxicidad aguda o respuestas subletales (crecimiento, comportamiento,
Revisión Bibliográfica 13
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reproducción) a través de estudios de toxicidad crónica.
Entre las especies mas utilizadas se encuentran:
· Fitoplancton (Chlorella vulgaris)
· Zooplancton: microcrustáceos de agua dulce (Daphnia spp)
microcrustáceos marinos (Artemia salina)
especies de hidrozoos y rotíferos
· Peces de agua dulce (Brachidario rerio, Poecilia reticulata)
· Plantas terrestres (Lactuca sativa) (OECD, 1984).
1.5.2 Ensayos ecotoxicológicos en medio terrestres.
a) Ensayos de Toxicidad aguda en Lombriz de Tierra Eisenia foetida. Se evalúa la
toxicidad de los productos en el suelo a través del Ensayo de toxicidad por contacto
sobre papel de filtro según los métodos descritos en OCDE 1984, Prueba nº207 y
del Ensayo de toxicidad sobre suelo artificial (14 días) según métodos descritos en
OECD-207,1984.
b) Ensayo de germinación de semillas con Lactuca sativa (5 días).
El parámetro a evaluar son los efectos sobre la germinación según el método EPA
600/3-88/029 (Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites.
A.8.7. Lettuce root elongation (Lactuca sativa) (1988)), determinando el NOEC,
LOEC y CEX.
c) Ensayo de emergencia y crecimiento en plantas terrestres (14 días).
Determinar la inhibición de la germinación de semillas y la inhibición del crecimiento
de las plantas (Lactuca sativa), se sigue la Línea directriz OCDE nº 208 (2006).
-Ventajas del uso de las plantas Como parte integral del ecosistema, las plantas superiores son ampliamente
utilizadas por ser organismos eucarióticos, y por lo tanto más comparables a la
mayoría de las especies de la flora y la fauna superiores, y constituyen una eficiente
herramienta de trabajo para medir alarma de peligro ambiental, además de poseer
las siguientes ventajas:
Las plantas son más sensibles a estrés ambiental que otros sistemas de
ensayos disponibles.
Revisión Bibliográfica 14
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Fácil manipulación y almacenaje.
Bajo costo.
Buena correlación con otros sistemas de pruebas (Clarkson DT., 1965).
Entre las pruebas a corto plazo con plantas que más se han utilizado para la
evaluación toxicológica ambiental se encuentran:
1. Prueba de toxicidad a corto plazo de la prolongación de la raíz de un vegetal.
La justificación para realizar este bioensayo radica en la importancia de eventos de
desarrollo temprano en el crecimiento y supervivencia de las plantas. La
prolongación de la raíz es inhibida a concentraciones más bajas de las sustancias
tóxicas que para el caso de la germinación de las semillas; por lo tanto, puede ser
un indicador más sensible de efectos biológicos. Este bioensayo puede ser
ejecutado con cualquier número de especies, las cuales resulten económicamente
importantes, sean fácilmente disponibles, germinen y crezcan rápidamente. Una de
las semillas más comúnmente utilizadas en esta prueba son las semillas de Lactuca
sativa L(Dutka BJ., 1989).
El bioensayo con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) es un ensayo estático de
toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se evalúan los efectos
fitotóxicos de un compuesto puro o de una mezcla compleja en el proceso de
germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros
días del crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los efectos
fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la
prolongación de la radícula y del hipocotilo. A diferencia del bioensayo tradicional de
germinación de semillas, la evaluación del efecto en la prolongación de la radícula y
del hipocotilo de las plántulas permite la evaluación del efecto tóxico de compuestos
solubles presentes en concentraciones tan bajas que no son suficientes para inhibir
la germinación, pero que sí pueden retardar o inhibir completamente los procesos
de prolongación de la raíz o del hipocotilo, lo que depende del modo y sitio de
acción de los contaminantes(Dutka BJ., 1989)
Este ensayo evalúa los constituyentes solubles del agua (aguas superficiales, aguas
subterráneas, suelos o eluatos de sedimentos y lixiviados), teniendo en cuenta para
el resultado la cantidad de semillas germinadas y la media del crecimiento de la raíz.
Se calcula la EC50 que no es más que la concentración que reduce la longitud de la
Revisión Bibliográfica 15
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raíz en un 50 % en relación con el control. Dutka BJ y colaboradores evaluaron la
calidad de sedimentos y agua mediante el empleo de diferentes bioensayos, y
reportaron similitud entre los resultados con esta prueba y el resto de los bioensayos
probados(Dutka BJ., 1989).
Otros autores también han utilizado esta prueba en la evaluación ecotoxicológica de
muestras de agua y sedimentos, bioensayo para la estimación de la toxicidad por la
medición de la media del crecimiento de la raíz de cebollas (Allium cepa L). Este
método es una herramienta fácil y sensible para la medición de la toxicidad total
causada por tratamientos de sustancias químicas. Los resultados de este ensayo se
ajustan bien a una batería de pruebas compuesta por organismos procariontes y/o
eucariontes. Es aplicable a los siguientes tipos de muestras:
Aguas naturales (lagos, ríos y pozos).
Agua potable (agua de grifo diferentes tuberías.
Aguas residuales domésticas e industriales, incluyendo lodos y lixiviados.
Sustancias químicas solubles en agua y con sustancias químicas insolubles
en agua y solventes.
El ensayo con bulbos de cebolla (Allium cepa L.) es un bioensayo de toxicidad
aguda (72 horas) semiestático (con renovación diaria de la solución de ensayo).
Como punto final de evaluación de efectos fitotóxicos se cuantifica la inhibición
promedio en la prolongación de las raíces del bulbo.10
El grado de toxicidad de las sustancias químicas de prueba es estimado por la
medición de la longitud de cada uno de los bultos de las raíces (10 cebollas son
empleadas para cada concentración o menos en dependencia de si sólo están
disponibles pequeñas cantidades de muestra). Para el reporte de la prueba, se toma
un valor medio del crecimiento para cada una de las series. También se calcula la
EC50 (Fiskejö G., 1983).
Con el empleo de esta prueba en el monitoreo de aguas residuales por Fiskesjö G
se demuestra también su alta correlación con otros sistemas de ensayo,
involucrando la toxicidad general (crecimiento de las raíces) y la genotoxicidad
(aberraciones cromosómicas). Por otra parte, se sugiere el empleo de la prueba
como un bioensayo normado para el monitoreo ambiental.
Revisión Bibliográfica 16
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Fiskesjö G resumió algunas de estas ventajas, entre las que se encuentran la
toxicidad (EC50 para la media del crecimiento de la raíz), que puede ser obtenida
dentro de la prueba; buena correlación con otros sistemas de prueba, y además del
equipamiento normal del laboratorio, sólo se necesita de un microscopio con una
cámara, si se quiere realizar la prueba citológica con las puntas de las raíces
(Fiskesio G., 1993)
1.6 Consideraciones generales sobre el uso de las plantas medicinales.
Desde la época de los aborígenes, las plantas medicinales han sido a través de los
tiempos el recurso más utilizado por el hombre y los animales para aliviar o curar
sus dolencias. Los primeros herbolarios datan de la época de los asirios, los
babilonios y los fenicios y son una recopilación de los conocimientos de la época
sobre las propiedades curativas de las plantas. Así comenzó la Historia de la
Fitoterapia (Navarro C., 2002).
Así, los nuevos fitofármacos cápsulas, tabletas y líquidos de complejos productos
vegetales extraídos con sofisticados métodos y valorados en modelos biológicos
novedosos y prometedores. Las plantas volvieron vestidas de alta tecnología y de
una novedosa mercadotecnia (Cañigueral S., 2000).
Esto ha significado el nacimiento de la nueva fitoterapia, en que la preparación y
validación de las formulaciones a base de diversas especies vegetales se realiza
por profesionales especializados, capaces de satisfacer las necesidades que el
paciente reclama en aspectos importantes como la prevención y la salud. El 25 por
ciento de los medicamentos tradicionales contiene sustancias de origen vegetal, y
los fitofármacos son medicamentos elaborados exclusivamente con principios
activos de origen vegetal (Cañigueral S., 1998).
La utilización tradicional de plantas medicinales, sumada a los avances en
tecnología, influyó en los cambios que la industria farmacéutica, los centros de
investigación y la agranoindustria experimentaron los procesos de estudios,
desarrollo y producción. Su notable avance permitió generar diversos productos de
calidad uniforme, eficaz y seguro. Estos aspectos hacen que el enfoque para definir
la calidad en plantas medicinales y aromáticas varíe de acuerdo al uso y destino
(Peris JB., 1996).
Revisión Bibliográfica 17
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La toxicidad de los preparados fitoterapéuticos suele ser baja y los efectos
secundarios son reducidos, lo que no quiere decir que no haya interferencias o
efectos secundarios. Pero bien es cierto que no alcanzan el nivel de las
especialidades farmacéuticas habituales (Stübing G. y col., 2004).
No obstante es necesario verificar los posibles efectos tóxicos que estos pudieran
tener así como su influencia al interactuar con el medio ambiente.
El Piper aduncum L. es una planta cuyos nombres más conocidos son “Condorcillo”,
“Matico”, hierba del soldado entre otros. Se ha observado que en esta especie
existe bastante confusión respecto de los nombres “Condorcillo”, “Matico”, pues en
varias zonas del Perú se conocen con este nombre a 3 ó 4 especies diferentes del
Género Piper y a la especie Jungia Paniculada (DC.) Gray. Perteneciente a la
familia ASTERACEA todas estas especies se las denominan igual y se le atribuye
propiedades similares. Su uso es múltiple y variado, como en dolencias
gastrointestinales (diarrea aguda o crónica), enfermedades del tracto respiratorio
(antiinflamatorio, antitusígeno), en infecciones del aparato genital, cicatrizante de
úlceras internas y externas (Torres-Santos EC y col, 1999).
La Nicotiana Acuminata Hook pertenece a la familia Solanaceae y se conoce
vulgarmete con el nombre de Tabaco del cerro o tabaco silvestre, es una planta
anual erecta de rápido crecimiento, 0.5 a 2 m de altura. Tallo viscoso en toda su
extensión con pelos inconspicuos, apretados, muy cortos, dorados o parduscos,
ramas inferiores largas ascendentes a menudo numerosas, las superiores
progresivamente mas cortas. Su uso tradicional es fundamentalmente ornamental
(www. es.wikipedia.org/wiki/Nicotiana).
La Crotalaria juncea pertenece a la Familia Leguminosas, es una variedada no
comestible de boniato, es de crecimiento rápido que se utiliza para la producción de
fibra en el Indo-Pakistán. También es bueno para su uso como abono verde en
muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo y como una fuente de nitrógeno
orgánico. Se suprime las malezas, frena la erosión del suelo, la raíz y reduce la
población de nematodos-nudo (Charchar JM. Y col., 1981)
Materiales y métodos
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18
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Preparación de los extractos
Los extractos acuosos utilizados de Piper aduncum L., Crotalaria juncea y
Nicotiana acuminata proceden del Laboratorio de Tecnología Farmacéutica
perteneciente al Departamento de Farmacia de la Facultad de Química- Farmacia
de la Universidad Central Martha Abreu de las Villas.
2.1.1 Preparación de las diluciones
Para realizar la curva dosis-respuesta se preparan 6 diluciones seriadas en escala
logarítmicas 100; 10; 1; 0,1; 0,01% respectivamente lo que nos que permite
establecer el intervalo de concentración conveniente para obtener valores de
efecto entre 100 y 0% necesarios para calcular la CE50 siempre partiendo de los
extractos puros y tomando como control agua destilada.
2.2 Reactivos y materiales
• Material biológico: semillas de Raphanus sativus (rábano), Lactuca sativa L (lechuga) y Lycopersicon esculentum ( tomate).
• Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparación se recomienda utilizar reactivos Grado ACS y agua destilada
• Cápsulas de Petri de 100 mm de diámetro.
• Papel de filtro Whatman núm. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro. El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes características:
— Trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de líquido.
— Resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las plántulas sin dañarlas.
— Ausencia de residuos tóxicos (ej. blanqueadores).
Materiales y métodos
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19
— Que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las semillas).
• Matraces aforados de 50 mL.
• Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL.
• Regla u otro elemento de medición.
• Pinzas.
• Toallas de papel.
• Bolsas plásticas.
• Cámara oscura termostatizada (22± 2 °C).
2.3 Obtención, control y conservación de las semillas.
Las semillas de rábano, lechuga y tomate fueron suministradas por la Empresa
Provincial de Semillas Varias, MINAGRI- Villa Clara con certificado de calidad
otorgado por especialistas del Centro Provincial de Sanidad Vegetal. Estas son
semillas sin tratamiento con fungicidas o plaguicidas, con buen poder germinativo
y baja variabilidad en la elongación de la radícula.
Las semillas seleccionadas se almacenan a 4 °C, en oscuridad y en ambiente
seco. Conservadas en estas condiciones mantienen su vigor al menos durante
dos años. Un indicador de la reducción de la vitalidad y envejecimiento de las
semillas es la reducción en el poder germinativo y el aumento en la variabilidad de
las medidas de elongación de radícula en el control negativo. En este caso se
recomienda realizar las pruebas de toxicidad utilizando un nuevo lote de semillas.
2.4 Procedimiento experimental.
• Después de preparadas las diluciones a utilizar.
• Colocar en cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro.
• Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la
fecha y hora de inicio y término del bioensayo.
Materiales y métodos
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• Saturar el papel de filtro con 2 ml de la dilución evitando que se formen bolsas
de aire.
• Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente treinta semillas, dejando
espacio suficiente entre ellas para permitir la elongación de las raíces.
• Colocar las placas en un mueble tapados con bolsa plástica (para evitar la
evaporación de la sustancia de prueba) en total oscuridad a una temperatura de
22 +/- 2 º C.
• Incubar durante 120 horas.
• Determinar el número de semillas que germinan.
• Determinar la longitud de las raíces de las plantas que germinan (OECD-208,
1984).
2.4.1 Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad
Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos
expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control
negativo sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de
muestra.
Terminado el periodo de exposición (120 h), se procede a cuantificar el efecto en
la germinación y en la elongación de la radícula.
Efecto en la germinación
Se registra el número de semillas que germinaron normalmente, considerando
como criterio de germinación la aparición visible de la radícula.
Efecto en la elongación de la radícula.
Se utilizó una regla para medir cuidadosamente la longitud de la radícula de cada
una de las plántulas correspondientes a cada concentración de tóxico o dilución
de muestra y a los controles. La medida de elongación de la radícula se considera
desde el nudo (región más engrosada de transición entre la radícula) hasta el
ápice radicular.
El procesamiento estadístico de toda la información se realizó en Microsoft Excel
2003, y con el paquete de programas STATISTICA, versión 5 para Windows
(US EPA, 1989).
Materiales y métodos
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21
Control de calidad de la prueba
El ensayo deberá repetirse en caso de que los controles presenten:
En el control negativo:
• Porcentaje de germinación inferior al 90%.
• Alta variabilidad en la elongación de la radícula (CV>30%).
• Exposición a la luz durante el proceso de imbibición: inmediatamente después de
colocar las semillas sobre el papel de filtro, se recomienda tapar y envolver las
cápsulas de Petri cubriéndolas de la luz (para el caso de semillas fotoblásticas
negativas).
• Temperatura de ensayo: las semillas expuestas a una temperatura superior
(apenas unos grados) a la óptima para la germinación, no germinarán aunque se
les coloque posteriormente a temperaturas inferiores (termodormancia o
dormancia inducida por la temperatura).
2.5 Expresión de los resultados.
Se realizan los siguientes cálculos:
• Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula de las plántulas
de cada repetición.
• Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula, con el promedio de
elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación del control
negativo.
• Porcentaje de inhibición en la germinación.
Con estos datos se elabora la gráfica dosis-respuesta colocando en la ordenada el
porcentaje de inhibición y en la abscisa, la concentración. Mediante un método
gráfico o el uso de programas estadísticos, se calcula la concentración que
produce el 50% de inhibición (CI50/CE50) para cada punto final evaluado. Para el
caso de muestras en donde la inhibición es inferior al 50%, o para determinar el
valor correspondiente al NOEC o LOEC, se realiza el análisis de comparación de
medias (t Student, Dunnett) para verificar la significación estadística en el
porcentaje de efecto
Materiales y métodos
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2. 5.1 Interpretación de los resultados
Los efectos cuantificados sobre la elongación de la radícula son efectos
subletales. La inhibición en la germinación podría considerarse como un efecto
letal, siempre y cuando podamos corroborar que finalizada la exposición a una
muestra las semillas no germinaron por muerte del embrión, y que no existe
simplemente un retraso en el proceso de germinación, manteniéndose la
viabilidad de la semilla.
Resultados y discusión.
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CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
3.1 Efecto de los extractos sobre la inhibición de la germinación.
Al analizar los efectos letales de los extractos estudiados, medidos a través de la
inhibición de la germinación de las semillas de las especies de plantas utilizadas en
el ensayo mostrados en la tabla # I podemos observar el comportamiento de los
tres extractos en las especies estudiadas de forma general en cuanto a los que
daños agudos se refiere en este indicador la especie más sensible es la lechuga
pues los valores del % de inhibición de la germinación en los tres extractos es
menor lo cual indica que es la más afectada por los tóxicos disueltos en el agua del
medio donde ella se desarrolla. Haciendo una análisis mas detallado del efecto de
los extractos en la tres especies ensayadas podemos observar que el rábano es la
especie menos afectada por los componentes de dicho extracto ya que el valor de
su concentración letal media es mayor respecto al tomate y la lechuga que
disminuyen respectivamente lo que nos indica la mayor sensibilidad en la
germinación de las semillas de lechuga, de forma general el comportamiento de la
inhibición de la germinación de los demás extractos es rábano< tomate< lechuga.
Resultados estos que de alguna manera son coincidentes con estudios realizados
por Wang y col. Donde solo realizan los ensayos para la evaluación de productos y
muestras ambientales de diferentes orígenes solo en esta especie, lo cual reafirma
nuestra tesis acerca de la sensibilidad de la misma ante la exposición a tóxicos
ambientales y nos pone en condiciones de abordar en evaluaciones futuras, este
ensayo en esta especie en los ensayos de rutina de nuestro laboratorio (Wang W.,
1987).
La inhibición de la germinación en el estudio de toxicidad de muestras ambientales
complejas o con compuestos volátiles reportadas en la literatura transcurrido el
tiempo del estudio, en algunos casos han observado que al finalizar el periodo de
exposición, la inhibición en la germinación es elevada, pero si se extiende el periodo
de ensayo, sin renovar la exposición a la muestra, las semillas comienzan a
germinar. La vitalidad de las semillas que no han germinado es posible verificarla
mediante la prueba de tetrazolium para viabilidad, pudiendo de esta manera
Resultados y discusión.
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asignarle con certeza a la inhibición de la germinación, el valor e importancia de un
efecto letal. No obstante esto, la inhibición en la germinación registrada al finalizar la
prueba, se considera fitotoxicidad, aunque el efecto en la germinación sea
reversible, aspecto este que no fue contemplado en nuestro estudio pero que nos
pone ante una variante a tener en cuenta en próximos ensayos siempre y cuando la
composición de la muestra a evaluar sea compleja en cuanto a componentes (Ellis
y col., 1985).
Al analizar los datos de los extractos podemos decir que de forma general el orden
de toxicidad para rábano es extracto 1 = extracto 3 >extracto 2, para el tomate el
comportamiento de la toxicidad fue extracto 3 >extracto 2 > extracto 1 y para el
caso de la lechuga que a nuestra consideración ha sido la especie mas sensible el
orden resultó extracto 2 < extracto 3 < extracto 1 pues al desconocer la
composición de los extractos no podemos compararlos entre si pero si tomando
como variable una misma especie de planta.
Tabla I: Resultados de la inhibición de la germinación de los extractos
estudiados.
Extracto Especie % inhibición de la
germinación (CI50)
Extracto 1 Rábano 52.3
Lechuga 7.8
Tomate 38.0
Extracto 2 Rábano 64.0
Lechuga 1.4
Tomate 12.0
Extracto 3 Rábano 52.8
Lechuga 1.7
Tomate 5.2
Resultados y discusión.
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Leyenda:
Extracto 1: Extracto acuoso de Nicotiana acuminata
Extracto 2: Extracto acuoso de piper
Extracto 3: Extracto acuoso de Crotalaria juncea
3.2 Resultados del efecto de los extractos sobre la inhibición de la elongación
de las raíces.
Otro aspecto importante en este ensayo son los efectos provocados por los
extractos estudiados sobre la elongación o crecimiento de la raíz, los cuales son
analizados como efectos subletales ya que una sustancia o muestra en cuestión
puede no afectar en principio la germinación pero si el crecimiento y desarrollo de la
raíces . Estos resultados son mostrados en la tabla # II donde analizamos el efecto
del extracto 1 sobre el crecimiento promedio de las plantas de cada grupo de
tratamiento y su desviación estándar utilizados para calcular la inhibición de la
elongación la raíz del extracto 1, si analizamos los valores de % de inhibición
notaremos las diferencias con respecto a la inhibición de la germinación como se
comentó anteriormente ya que la inhibición del crecimiento ocurre a diluciones
mayores es decir que los daños tóxicos se observan en las diluciones mayores
respecto al control.
Tabla II: Resultados del efecto del extracto 1 sobre el crecimiento de las
raíces y desviación estándar
Media DE
rábano Lechuga Tomate rábano Lechuga Tomate
Control (-) 4.9 2.9 3.21 1.04 0.84 1.17
100 0.1 0.1 0.51 0.11 0.17 1.05
10 1.3 0.2 2.80 0.87 0.25 1.82
1 3.6 0.7 3.93 1.33 0.97 1.48
0.1 4.4 0.9 4.04 1.41 0.95 1.27
0.01 4.8 1.6 4.73 1.38 1.34 1.21
Resultados y discusión.
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Al analizar el gráfico 1 donde se muestra el efecto del extracto 1 sobre la elongación
de las raíces de las especies estudiadas podemos observar que el rábano y el
tomate tuvieron un crecimiento similar, diferenciándose significativamente con lo
ocurrido con la lechuga donde se observa claramente la magnitud de la inhibición de
la elongación las raíces, pero si analizamos más detalladamente cada extracto
podemos ver en el gráfico 2 el comportamiento de las tres especies en los
diferentes diluciones observamos que el extracto puro produjo una inhibición de la
elongación muy marcada respecto al control y se observa que a medida que
diluimos el extracto el efecto disminuye, pero siempre en la lechuga el efecto toxico
es mayor lo que nos reafirma la sensibilidad de esta especie ya que en todas las
diluciones hay diferencias significativas con respecto al control lo cual no ocurre con
las demás especies que a partir de la dilución del 0.01 % no se observan diferencias
significativas para un p<0.05.
Planta; LS Means
Current effect: F(2, 522)=212.32, p=0.0000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Rábano lechuga tomate
Planta
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
L r
aíz
(1
)
Gráfico 1: Efecto del extracto 1 sobre la elongación de las raíces de rábano,
lechuga y tomate.
Resultados y discusión.
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-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
Control (-) 100 10 1 0.1 0.01
Concentración (%)
Larg
o r
aíz
(m
m)
rábano
Lechuga
Tomate
Gráfico 2: Efecto del extracto 1 sobre la elongación de las raíces de rábano,
lechuga y tomate en las diluciones de estudio.
Los resultados del efecto del extracto 2 sobre la media del crecimiento de las raíces
de las plantas y la desviación estándar son mostrados en la tabla III los cuales nos
permiten graficar el efecto de las diluciones del extracto sobre el crecimiento de las
raíces
Tabla III: Resultados del crecimiento y desviación estándar del extracto 2
Rábano Lechuga Tomate
Conc Media DE Media DE Media DE
Control
(-) 6.1 1.0 4.25 1.82 4.68 0.65
100 0.1 0.1 0.00 0.00 0.00 0.00
10 2.0 1.0 0.18 0.43 1.68 1.23
1 2.4 1.1 0.80 0.96 2.73 1.06
0.1 4.6 1.5 1.12 0.90 3.04 0.99
0.01 6.1 1.6 4.02 1.41 3.84 0.93
Resultados y discusión.
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En el gráfico 3 se muestra el efecto del extracto 2 sobre la elongación de las raíces
de rábano, lechuga y tomate donde se denota que hay diferencias entre las
especies utilizadas pues el crecimiento es menor significativamente en la lechuga,
comportándose de forma similar al extracto 1 en cuanto a sensibilidad rábano<
tomate<lechuga, reafirmando la observación de la futura utilización de la lechuga
como especie a utilizar en este tipo de ensayo siempre y cuando el producto no sea
para ser utilizado sobre esta especie.
Planta; LS Means
Current effect: F(2, 522)=212.32, p=0.0000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Rábano lechuga tomate
Planta
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
L r
aíz
(1)
Gráfico 3: Efecto del extracto 2 sobre la elongación de las raíces de rábano,
lechuga y tomate.
Si analizamos el comportamiento de las tres especies en las diferentes diluciones,
mostrados en el gráfico 4, observamos que el extracto puro provocó una inhibición
de casi la totalidad de la germinación de las semillas de lechuga y tomate, solo en el
caso del rábano hubo un ligero brote de las raíces y a medida que se aumentó la
dilución el efecto fue disminuyendo hasta la dilución de 0.01 % donde las diferencias
fueron no significativas respecto al control para un p<0.05.
Resultados y discusión.
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-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Control 100 10 1 0.1 0.01
Concentración (%)
Larg
o d
e l
a r
aíz
(m
m)
rábano
Lechuga
Tomate
Gráfico 4: Efecto del extracto 2 sobre la elongación de las raíces de rábano,
lechuga y tomate en las diluciones estudiadas.
Los resultados del efecto del extracto 3 sobre la inhibición de la elongación de las
raíces de las tres especies son mostrados en la tabla IV, resultados que al graficar
nos permite obtener el gráfico 4 donde observamos que la lechuga resultó ser la
especie más afectada en cuanto al crecimiento de las raíces
Tabla IV: Resultados del crecimiento y desviación estándar del extracto 3
Media DE
Rábano Lechuga Tomate Rábano Lechuga Tomate
Control (-) 7.2 2.8 4.90 1.61 0.61 1.19
100 0.2 0.0 0.02 0.18 0.00 0.07
10 1.7 0.3 1.06 1.10 0.38 1.19
1 2.8 0.8 2.29 1.15 0.81 1.41
0.1 4.3 1.3 3.25 1.44 1.00 1.23
0.01 5.2 2.0 4.06 1.12 0.92 1.18
Resultados y discusión.
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Realizando un análisis más detallado de la influencia del extracto 3 sobre la
inhibición de la elongación de las raíces de las tres especies utilizadas obtenemos el
gráfico 5 donde podemos denotar que el extracto puro provocó ua inhibicion
marcada en lechuga y tomate, aumentando el largo de las raíces a medida que
aumentó la dilución del extracto.
Planta; LS Means
Current effect: F(2, 522)=240.51, p=0.0000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Rábano lechuga tomate
Planta
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
L r
aíz
(3)
Gráfico 4: Efecto del extracto 3 sobre la elongación de las raíces de rábano,
lechuga y tomate.
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
Control (-) 100 10 1 0.1 0.01
Concentración (%)
Larg
o d
e la r
aíz
(m
m)
rábano
Lechuga
Tomate
Resultados y discusión.
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Gráfico 5: Efecto del extracto 3 sobre la elongación de las raíces de rábano,
lechuga y tomate en las diluciones estudiadas.
A modo de resumen acerca de los resultados obtenidos en la inhibición de la
germinación y la elongación de las raíces de los extractos estudiados en las
especies de plantas utilizadas confeccionamos la tabla V con el objetivo de poder
comparar los efectos de los extractos sobre ambos proceso los cuales son
afectados por la toxicidad de los compuestos disueltos en el agua, como podemos
observar en la tabla y a nuestro juicio el efecto sobre el crecimiento de las raíces es
un indicador más fino ya que a concentraciones menores hay signos de daños
tóxicos pues modifican los mecanismos por los cuales se produce el crecimiento.
Tabla V: Comparación del efecto de los extractos sobre la germinación y el
crecimiento.
Extracto Especie % inhibición de la
germinación (CI50)
% Inhibición de la
elongación de la raíz
(CI50)
Extracto 1 Rábano 52.3 3.11
Lechuga 7.8 0.016
Tomate 38.0 28.0
Extracto 2 Rábano 64.0 0.61
Lechuga 1.4 0.053
Tomate 12.0 1.0
Extracto 3 Rábano 52.8 0.24
Lechuga 1.7 0.087
Tomate 5.2 0.51
Otro aspecto a considerar es el mayor desarrollo en la elongación de la radícula en
algunas muestras con respecto al control. La exaltación en un punto final no debe
ser interpretada como un efecto favorable o estimulante. En la aplicación de la
prueba con semillas a muestras ambientales, conjuntamente con otros organismos
Resultados y discusión.
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como parte de una batería, se ha detectado en diferentes ocasiones que la
exaltación en la respuesta en la radícula se corresponde con toxicidad frente a otros
ensayos de la batería.
Conclusiones 33
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CONCLUSIONES.
En los extractos acuosos de Nicotiana acuminata Hook, Piper aduncum
L. y Crotalaria juncea a diluciones mayores o iguales a 0.01 % no se
muestran signos de toxicidad sobre las especies estudiadas.
En el ensayo de inhibición de la germinación para la especie rábano los
extractos de mayor toxicidad fueron el de Nicotiana acuminata Hook y
Crotalaria juncea, con una concentración letal de 52.3% y 52.8%
respectivamente, mientras que para el tomate el extracto mas tóxico fue el
de Crotalaria juncea con una concentración letal de 5.2% y para la
especie lechuga el de mayor toxicidad fue el de Piper aduncum L con una
concentración letal de 1.4%.
En el ensayo de inhibición de la elongación de la raíz para la especie
rábano el extracto de mayor toxicidad fue el de Crotalaria juncea, con una
concentración letal de 0.24%, mientras que para el tomate el extracto mas
tóxico fue el de Crotalaria juncea con una concentración letal de 0.51% y
para la especie lechuga el de mayor toxicidad fue el de Nicotiana
acuminata Hook con una concentración letal de 0.016%.
La especie más sensible en los ensayos realizados fue la lechuga.
Recomendaciones 34
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RECOMENDACIONES
Emplear este ensayo solo utilizando la lechuga para la evaluación de la
toxicidad de muestras ambientales.
Realizar el ensayo en otras especies recomendadas en las Guías para
ensayos ecotoxicológicos en plantas, con sensibilidad similar a la lechuga y
que se puedan utilizar indistintamente en nuestras condiciones.
Incorporar otros ensayos ecotoxicológicos para la evaluación de muestras
ambientales.
Realizar el monitoreo de aguas residuales de otros laboratorios del recinto
universitario para conocer la toxicidad de las mismas.
Bibliografía
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