“AÑO DEL DEBER CIUDADANO”
UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” DE ICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICO E HIDROALCOHÓLICO DE LAS SEMILLAS DE Carica papaya L. “PAPAYA”
Para obtener el título profesional de:
QUÍMICO FARMACÉUTICO
Presentado por:
Bach. PALOMINO MENDOZA, Maryori Ysabel
Bach. URIBE CANALES, Cinthia Pamela
Asesores: Q.F. CHANG CANALES, Artemio Q.F. KLINAR BARBUZA, Silvia Q.F. VARGAS PONCES, Hugo
ICA – PERÚ
2007
Pamela Uribe Canales
A Dios y mi ángel por guiarme cuando lo necesite y cuidarme siempre. A mis padres Miguel y Rosa que siempre me brindaron su apoyo en mi formación hasta llegar a ser una profesional; y a mis hermanas Regina y Marie que me apoyaron incondicionalmente en todo momento de mi vida.
Pamela Uribe Canales
- Al Padre Eterno y Altísimo que me
enseñó a caminar bajo su dirección fortaleciéndome para la culminación de este trabajo.
- A mis padres, hermano y cada miembro
de mi familia como primeros partícipes de mi formación profesional por el apoyo desmedido que me brindaron para alcanzar mi meta trazada.
Maryori Palomino Mendoza
AGRADECIMIENTO
− A los asesores: Q.F. Artemio Chang Canales, Q.F. Silvia Klinar Barbuza, Q.F.
Hugo Vargas Ponce; por su guía y colaboración en el desarrollo de la tesis.
− Un agradecimiento muy especial a quienes desinteresadamente no midieron su
tiempo ni las circunstancias para brindarnos gran ayuda en la realización de este
trabajo: Blgo. Cartagena Siguas, Q.F. Rocío Córdova, Blgo. Andrés Herrera.
− A Laboratorios Fitofarma E.I.R.L. por permitirnos sus instalaciones, equipos y
materiales para el desarrollo de la parte Fitoquímica de nuestra investigación.
− Al Laboratorio de Microbiología de la facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional de San Luis Gonzaga de Ica y al personal técnico por permitirnos la
investigación de la parte Antimicrobiana de nuestra tesis.
− A cada uno de nuestros amigos por ayudarnos amablemente en diferentes
necesidades que hallamos, desde el inicio hasta la culminación de esta
experiencia investigadora.
ÍNDICE
RESUMEN
SUMARY
INTRODUCCIÓN 1
1. GENERALIDADES 3
1.1 Aspectos botánicos de Carica papaya L. “papaya” 3
1.1.1 Historia 3
1.1.2 División taxonómica 4
1.1.3 Hábitat 6
1.1.4 Descripción 6
1.1.5 Cultivo 11
1.1.6 Usos medicinales 13
1.1.7 Otros usos 15
1.1.8 Composición química 17
1.1.9 Referencias Farmacológicas 18
1.1.10 Referencias Toxicológicas 22
1.2 Actividad antimicrobiana 24
1.2.1 Definición 24
1.2.2 Determinación de la actividad antimicrobiana 24
1.2.3 Antibiograma 24
2. MATERIALES Y MÉTODOS 25
2.1 Materiales 25
2.1.1 Del estudio fitoquímico 25
2.1.2 Del estudio antimicrobiano 27
2.2 Métodos 29
2.2.1 Del estudio fitoquímico 29
2.2.1.1 Preparación del material vegetal 29
2.2.1.2 “Screening” fitoquímico 34
2.2.1.2 Obtención de los extractos etanólico e hidroalcohólico 40
2.2.2 Del Estudio de la actividad antimicrobiana 46
2.2.2.1 Material microbiológico 46
2.2.2.2 Medios de cultivo 46
2.2.2.3 Controles 47
2.2.2.4 Interpretación de resultados 47
2.2.2.5 Método de difusión mediante excavación en placa 48
2.2.2.6 Preparación de medios de cultivo líquido 52
2.2.2.7 Determinación de la concentración mínima bactericida
y bacteriostática (CMB) 54
3. RESULTADOS 59
4. DISCUSIÓN 66
CONCLUSIONES 68
RECOMENDACIONES 69
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70
ANEXOS 77
SUMARY
The research was developed to determine the antimicrobial activity of Carica
papaya L, “papaya” seeds. These were obtained through the percolation of ethanolic
and hydroalcoholic (2:3) extracts of dry and fat-free dry seeds, and their
antimicrobial activity was determined through diffusion by an excavation method in
presence of the following microorganisms: Candida albicans ATCC 10231,
Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923. Furthermore, a
phytochemical screening of the samples was made.
Tanines, triterpenoids and/or steroids and flavonoids were detected in both
dry and fat-free dry seeds.
The hydroalcoholic extracts of the dry and fat-free dry seeds displayed
antimicrobial activity in presence of the 5 confronted microorganisms, whereas the
ethanolic extracts of dry and fat-free dry seeds showed activity in presence of
Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus.
RESUMEN
Se realizó el presente trabajo de investigación para determinar la actividad
antimicrobiana de las semillas de Carica papaya L. “papaya”. Se obtuvieron por
percolación los extractos etanólico e hidroalcohólico (2:3) de semillas secas y
semillas secas desengrasadas, y se determinó su actividad antimicrobiana mediante el
método de difusión por excavación frente a los siguientes microorganismos: Candida
albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC
29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC
25923. Así mismo se realizó un “screening” fitoquímico de las muestras.
Tanto en las semillas secas y semillas secas desengrasadas, se detectaron:
taninos, triterpenoides y/o esteroides y flavonoides.
Los extractos hidroalcohólicos de las semillas secas y semillas secas
desengrasadas evidenciaron actividad antimicrobiana frente a los 5 microorganismos
confrontados, mientras que los etanólicos de las semillas secas y semillas secas
desengrasadas mostraron actividad frente a Enterococcus faecalis y Staphylococcus
aureus.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la resistencia a los antimicrobianos se ha convertido en
un problema mundial y se ha analizado con mayor interés en muchos países,
reconociéndose oficialmente que el incremento de la resistencia bacteriana a los
antibióticos amenaza la salud pública.1
Se sabe que las plantas han sido usadas por muchos cientos de años con una
amplia variedad de propósitos. Así mismo se puede afirmar que presentan una
complejidad de propiedades medicinales, entre ellas la acción antimicrobiana. Por tal
motivo algunas plantas medicinales se pueden considerar como una posible
alternativa de tratamiento efectivo de las enfermedades infecciosas.
La especie vegetal Carica papaya L. “papaya”, considerada como una planta
cosmopolita de amplio cultivo en nuestro país, presenta diferentes constituyentes
químicos distribuidos en toda su estructura: raíces, tallo, hojas, flores, frutos y
semillas, lo que le confiere un indudable efecto medicinal.4
La investigación científica, basada en el uso popular medicinal de esta
especie, demuestra la relación que existe entre su composición química y su
propiedad terapéutica, encontrándose antecedentes de la actividad antimicrobiana de
las semillas, además de su buena acción ya conocida contra los parásitos intestinales.
De lo antes mencionado se planteó la presente investigación teniendo como
objetivo determinar la actividad antimicrobiana in vitro de los extractos etanólico e
hidroalcohólico de las semillas de Carica papaya L., para llegar a probar su eficacia
en modelos in vitro frente a cepas de microorganismos patógenos, con el propósito
de ampliar el conocimiento sobre su acción antimicrobiana. Así mismo, se consideró
adicionalmente la realización del “screening” fitoquímico de las muestras en estudio.
1. GENERALIDADES
1.1 Carica papaya L.
1.1.1 Historia 2,3,7,8,9,10
Es una planta originaria de América tropical; sin embargo el
centro de origen botánico de la especie cultivada no puede ser establecido
con exactitud. Algunos autores consideran a las Antillas como su centro
de origen y otros a México, América Central y aún al Perú como los
lugares de donde proviene esta especie.
Según Linneo, Fernández había llamado a esta fruta “Higo de
Mastuerzo”, y tuvo la idea de clasificarla como un higo (carica en griego)
y además se dice que las muestras que le llevaron provenían de la India, y
especialmente de una región del Asia que se llamaba en ese tiempo
Carica, bautizó este genero con el vocablo Carica y lo apellidó con la
denominación ya universal Papaya.
Los españoles se encargaron de llevarla a todo el trópico del orbe,
la introdujeron en la Republica Dominicana (1525), la presentaron a los
reyes de España (1535) y a las Filipinas (1550) diseminándola luego por
el África, Malasia y por todas las Islas del Pacífico.
Desde fines del siglo XVIII, se sabía que algunos grupos
indígenas sudamericanos usaban las hojas del papayo para envolver la
carne de los animales que se cazaban con el objeto de hacerla mas suave y
sabrosa; otros acostumbraban frotar la carne dura con una tajada de
papaya verde para que se ablande o añadían un pedazo de papaya verde al
agua donde se hierve la carne. Edlicher y Vanquelin reportaron en 1756,
la acción vermicida y digestiva del látex. Posteriormente Wurtyz en 1880,
comunicó al mundo científico el descubrimiento de la Papaína una
sustancia que Chittenden calificó como fermento vegetal en 1883.
Hubo después una serie de investigaciones y descubrimientos
complementarios que progresivamente fueron atrayendo la atención de
empresarios industriales.
Actualmente la industria de la papaína es muy importante en la
economía agrícola de muchos países.
1.1.2 División taxonómica
De acuerdo al Sistema de Clasificación de Cronquist (1988)
evaluado por el Herbario San Marcos del Museo de Historia Natural, de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, se determinó como:
Reino: Plantae.
División: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Orden: Violales.
Familia: Caricaceae.
Género: Carica.
Especie: Carica papaya L.
• Sinónimos 2,3,8,9
Vasconcellea cestriflora, Vasconsellea pubescens, Carica
cundinamarcensis, Carica candamarcensis Hook, Carica
cestiflora, Carica pubescens, Papaya cestiflora, Papaya
cundinamarcensis, Papaya pubescens, Carica chiriquensis
Woodson, Carica monoica, Carica pantagona, Carica glandulosa,
Carica candicans, Carica gouditiana, Carica peltat, Carica
gondotiana, Carica quinqueloba, Carica comunis Noroña,
Papaya carica, Papaya cubensis.
• Nombres vulgares 2,8, 11,12,13,14
Chilhualcán, Chiblocán, Chamburo, Siglolón, Siglalón, Sigloalón
(Ecuador); Papayuela, Lechosa (Puerto Rico y Colombia); Mamao
(Brasil); Fruta bomba (Cuba); Melón-zapote (México); Mamón
(Argentina, Paraguay, Tahití y Hawai); Papaya de tierra fría,
Chihualcan, Papaya (Chile); Olocotón (Nicaragua); Mountain
papaya (Estados Unidos); Papaya (Guatemala, Nicaragua y Italia);
Papai (Haití); Pawpaw (Dominica, Inglés); Papaya, Pucha
(Shipibo, Conibo); Capucha (Pano); He-i, Kupaoyo,
Noompucha(Cashibo); Pampucho (Coshibo); Chamburú, Milikane
(Tahití y Hawai); Ababaya; Ababi (Caribe); Papayabaum
(Alemania); Papaya, Papayer (Francia); y otros como: Papayero;
Mamona; Mapaña; Higo de mastuerza; Put.
1.1.3 Hábitat 2,9,10,15
Nativa de laderas bajas de los Andes orientales, la cuenca
amazónica y Centro América en clima tropical húmedo en alturas hasta
1600 msnm. Introducida en los trópicos del viejo mundo, donde se
produce comercial y artesanalmente.
El cultivo del papayo se extiende en la faja del planeta
comprendido entre los 22° latitud norte y 32° latitud sur. En condiciones
de ambiente ecológico favorable, calor y humedad apropiados,
aproximadamente, a partir de los 10 meses de su plantada, crece
satisfactoriamente en un rango de temperatura entre 22°C y 32°C. Las
plantaciones con este frutal se efectúan en áreas protegidas de los vientos,
con un rango de humedad relativa de 70% y 80%.
1.1.4 Descripción 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16
Planta de naturaleza herbácea, de porte variado de 3 a 10 m. de
altura. Es una planta frutal perennifolia, dioica con tallo único raras veces
ramificado, frondosa en la parte superior y productora de látex. Es una
especie polígama, diferenciando plantas femeninas, masculinas y
hermafroditas.
• Tallo.- Es cilíndrico, hueco, desnudo, erecto y tiene un diámetro
hasta de 30 cm.; en la base adelgazándose hacia arriba; es carnoso,
poroso, y jugoso. Las cicatrices foliares grandes que presenta en la
superficie del eje de la planta, marca la ubicación de hojas y frutos
que se han desprendido.
• Hojas.- Ubicadas en el extremo superior del tallo, en una especie de
roseta espiral formando una corona o sombrilla; son alternas,
simples y palmeadas sin estipulas; tienen largos pecíolos entre 50 a
90 cm. de diámetro, presenta entre 5 a 13 lóbulos; de matiz verde
oscuro en el haz y verde claro en el envés, con pocas vellosidades de
70 cm. con un diseño redondo pero con profundas escotaduras y sus
nervaduras son muy prominentes en el envés.
• Raíces.- Consta de pocas ramificaciones, relativamente gruesas, las
mismas que en su extremo distal están provistas de numerosas
raicillas.
• Flores.- Las flores emergen de las axilas de las hojas, son solitarias,
pentámeras; nacen agrupadas en una inflorescencia cimosa hay
masculinas, femeninas y hermafroditas.
Flor Femenina.- Es de forma redondeada y el estigma en forma
de abanico. Son muy numerosas, pedunculadas, de color blanco,
solitarias en las axilas foliares, cáliz pequeño, sésiles de 8 cm. de
largo; corola con 5 pétalos angostos separados entre sí,
triangulares de 5 a 7 cm. de largo; gineceo con ovario supero y
ovoide, tri o penta carpelar; unilocular; y 5 placentas con
numerosos óvulos. Tienen un pistilo formado por la fusión de 5
estigmas de color amarillo.
Flor Masculina.- Aparecen en ramilletes que están en el
extremo del pecíolo (15 - 20 cm.) de 4 cm. de largo, de color
blanco cremoso a veces verdosas o amarillentas; se compone de
un tubo corto, en que abre 2/3 partes de su longitud formando 5
pétalos, ubicándose a su alrededor 10 estambres con anteras
amarillas. La corola es tubular (2 - 3 cm.) con 5 lóbulos cortos y
un pistilo rudimentario y muy delgado, careciendo de estigma.
Son flores fragantes muy atractivas para los insectos diurnos y
nocturnos; éstas raras veces forman frutos o si los forma son
deformes y carecen de valor comercial.
Flor Hermafrodita.- Puede ser flor pentandría, intermedia y
alargada; son escasas y mas anchas que las masculinas. Poseen 5
pétalos gruesos de color verde claro, de ápice pubescente,
agudo; posee de 5 a 10 estambres. Los filamentos son largos, de
dorso algo hendido, blancos adheridos al pétalo. Las anteras
poseen un conectivo verde y encorvado; el ovario con 5
estigmas desiguales papilosos y gruesos. Los frutos pueden ser
globulosos, alargados y deformes.
• Fruto.- Tiene forma variada: esférica, periforme, ovalado, alargado
y otras. Es una baya grande de hasta 40cm. de diámetro y 15 a más
cm. de largo; tiene una piel delgada, savia lechosa, posee una pulpa
dulce, suave. El fruto consta de 5 carpelos que se unen para formar
una cavidad y el fruto con menos de 5 carpelos forman frutos
alargados.
El peso varia desde 0.2 a 7.0 Kg.; el color de la pulpa puede ser de
amarillo anaranjado pálido, anaranjado rojo hasta rosado oscuro. La
cavidad está casi vacía con las abundantes semillas cubriendo las
paredes.
• Semillas.- Un fruto normal contiene hasta mil semillas ovoides de 5
a 7 mm. de diámetro; negras y recubiertas por un arilo o envoltura
mucilaginosa, gelatinosa que le da a la semilla una falsa cubierta lisa
y brillante; con la superficie rugosa. Es de sabor picante; el embrión
es pequeño y los cotiledones están bien desarrollados.
Ramas y hojas de Carica papaya L.
Fruto maduro de Carica papaya L.
Semillas de Carica papaya L.
1.1.5 Cultivo 7,9,10,15,17,18,19
Debido a su gran importancia actual en el comercio frutero y en la
industria, el cultivo ha sido perfeccionado hasta llegar a ser una verdadera
especialidad gastronómica.
A nivel mundial se encuentra ampliamente distribuido
principalmente en Brasil seguidamente por México, Tailandia, Indonesia,
India, Colombia y Cuba; en el año 1990; notándose un incremento en la
producción. Los principales países importadores de papaya son Reino
Unido, Alemania, Francia e Italia y en menor cantidad Estados Unidos,
Canadá, Suiza.
A nivel nacional había 2893 hectáreas plantadas con papaya en
1984 (Ministerio Agricultura. Estadística Agraria 1984).
A continuación mostramos en un cuadro los 5 principales
departamentos del Perú en la producción, superficie cosechada y
rendimiento de papaya.
Departamento Producción (t)
Superficie (ha)
Rendimiento (kg/ha)
Huánuco 50 706 2 653 19 113
Junín 34 046 3 402 10 008
Ucayali 23 619 2 791 8 463
San Martín 17 447 1 456 11 983
Cajamarca 14 208 1 009 14 081
Fuente: Ministerio de agricultura
En los países donde se cultiva la papaya, las variaciones
encontradas entre los numerosos tipos son muy amplias dependiendo del
tamaño, calidad y otras características que le dan los diferentes cultivares
como: “Solo”, “Sunrise”, Subset”, “Cariflora”, “Vista Solo”, “Criolla”,
“Waimando”, “Higgis”, “Wilder”, “Gold”, “Petersen”, y otros híbridos.
La papaya crece fácilmente en cualquier clima tropical o
subtropical. No es tolerante al frío, y muere fácilmente con temperatura
cercana a 0°C. Necesita buena lluvia o buen riego, pero bien drenada no
tolera el encharcamiento por más de 24 horas. Tolera la brisa marina, pero
no el terreno salado o salitroso; es de suelo franco, ligero, poroso, rico en
materia orgánica y con un buen abono; pH 5,5 - 6,7. Se propaga bien con
semillas a las que se les lava el arilo y se secan. Tardan 30 - 45 días en
germinar y pueden transplantarse a los 3 - 6 meses. Comienza a producir
en un año y puede vivir produciendo hasta los 20 años pero su producción
ideal es entre los 3 - 5 años, para algunas variedades que rinden 20 a 40
frutos por año. Deben ser plantados a una distancia de 2 x 2 metros. Se
cosechan cuando el 80% tiene color amarillo o anaranjado.
La producción del látex no esta siempre relacionado al buen sabor
de la fruta, este puede tenerse por fisuras en el fruto verde, que luego se
torna amarillo al endurecerse y su recolección no hace daño a la calidad
del fruto.
1.1.6 Usos medicinales 2,3,7,12,13,14,20,21,22,23,24,25,26,27
Es conocida su buena acción contra los parásitos intestinales,
especialmente contra los ascárides se usa el polvo de las semillas secas
25-30g.; una infusión de raíz (2-3 cucharadas al día); semilla fresca
licuada con miel o el látex disuelto en agua (una cuchara grande para un
adulto) puede seguir usándose con aceite de ricino u otro purgante.
Las hojas de papaya en infusión se usa para controlar la disentería
amebiana; las hojas secas se fuman contra el asma, en infusión o
decocción se usan para afecciones cardiacas, infusión de hojas tiernas se
aconseja como tónico cardiaco.
El látex es utilizado para el tratamiento tónico de diversos
procesos de la piel; se usa el látex (o un trozo de papaya verde, o una
porción de hojas mojadas) para extirpar verruga, suavizar un callo, hacer
desaparecer una peca o atacar el nido de una nigua. En preparación con
glicerina se usa para aliviar la soriasis, controlar la hiperhidrosis de las
manos o axilas. Puro o diluido se usa para limpiar heridas o llagas
infectadas y necróticas. Una pincelación de la faringe con una mezcla de
látex y glicerina ayuda a controlar la presencia de costras, secreciones en
la difteria y otras faringitis graves. Se usa tópicamente para tratar
afecciones dérmicas (eczemas, erisipela, tinea), induraciones, cáncer y
tumores. Por vía oral se usa para tratar esplenomegalia, catarro intestinal
y parásitos intestinales (oxiuros, tricocéfalos, tenias). También se puede
usar para el mismo fin el látex diluido en alcohol.
El cocimiento de cogollos se usa para sacar las lombrices y tratar
paludismo y dispepsia.
Se alega también que el fruto verde molido con sus semillas y
disuelto en cerveza para quitarle el mal sabor, es un buen emenagogo y
puede provocar el aborto; en otros empleos menos generalizados se
prepara jarabes para la tos a partir de la fruta madura o de una infusión de
las flores, el jarabe también se usa por vía oral contra afecciones
digestivas (constipado, diarrea, disentería, dispepsia, enteritis, parásitos
intestinales) y respiratorias (asma, catarro, difteria, tos, tuberculosis),
enfermedades venéreas, fiebre, hipertensión, locura, oliguria; se dice que
el fruto mejora la digestión y previene el reumatismo.
Además la maceración o infusión de raíz se usa para uretritis,
sífilis y contener hemorragias, se dice que en infusión concentrada puede
ser abortivo. En Loreto las mujeres consumen media papaya madura en
ayuna en los días de la menstruación con fines anticonceptivos y con el
mismo fin también usan las flores masculinas en infusión (1 taza de flores
en 3 tazas de agua), tomar 1 taza 3 veces al día 3 días antes de la
menstruación. Así mismo se usa el jarabe de flores para tratar ictericia,
bronquitis y otras afecciones respiratorias.
En otros usos medicinales se indica como sedante, el cocimiento
de raíces gruesas y añejas (20g/L de agua) tomar un vaso 3 veces al día;
como carminativo el cocimiento de semillas secas y molidas (20g/L de
agua) tomar un vaso 3-4 veces al día y como galactogogo el cocimiento
de las hojas verdes de la planta madura (3-4 hojas en 2L de agua) tomar 2
vasos 3 veces al día.
Se le atribuye propiedad amebicida, anodina, antibiótica,
antiflogística, bactericida, cardiotónica, carminativa, colagoga, digestiva,
diurética, emenagogo, estomáquica, expectorante, fungicida, insecticida,
laxante, pectoral, pediculicida, proteolítica, tónica y vermífuga.
1.1.7 Otros usos 2,7,10,13,14,15
La pulpa del fruto es jugosa, blando y dulce, es muy apetecida y se
come fresca, en jugo o mermelada; el fruto tierno puede comerse cocido o
en “pie”; las hojas tiernas se comen cocidas. Industrialmente se prepara
fruta confitada a partir de la fruta verde; y néctar de papaya, papaya en
almíbar y mermelada a partir de la fruta madura.
Del látex se obtiene la papaína de amplio uso industrial,
alimenticio y medicinal; las cáscaras y hojas se usan para ablandar la
carne. Las hojas usadas como substituto del jabón son muy útiles para
remover manchas.
La papaína la usan también en el laboratorio de bacteriología para
preparar determinados tipos de cultivos. Otros afirman su uso en la
preparación industrial de cerveza para la clarificación de la bebida; en la
industria del caucho natural, para acelerar la maduración del producto. En
la industria textil se usa para evitar el encogimiento de la lana y dar mas
brillo a la seda; en las curtiembres, para facilitar el batimiento del cuero y
mejorar la calidad del producto.
Así mismo también es usado en la industria del queso
reemplazando a la renina para obtener calidades específicas; en
Norteamérica es indispensable las enzimas de la papaya en la industria de
la goma de mascar. Y a la vez se menciona su uso en cosmética,
dentífrico y otros productos de tocador.
1.1.8 Composición química 2,7,11,12,14,15,17
El fruto contiene:
Agua 90%Azúcares (levulosa, sacarosa, glucosa) 8 - 10%Proteínas 0,5%Grasas 0,1%
Vit. A en carotenos activos (criptoxantina, violaxantina, licapeno, zeaxantina, fitoeno, etc)
2000 - 3000UI
Vit. C 75mg%Ac. no volátiles (cítrico, málico, acetogluterico)
Vit. B1 (Tiamina) 0.02 - 0.04mg
Vit. B2 (Riboflavina) 0.02 - 0.06mgVit. B3 (Niocina) 0.22 - 0.55mgSales 0.50gCalorías 23 - 25Ac. ascórbico 35.5 - 71.3mgFibra cruda 0.5 - 1.3gCeniza 0.31 - 0.66gCalcio 12.9 - 40.8mgFósforo 5.3 - 22mgHierro 0.25 - 0.78mgTriptófano 4 - 5mgMetionina 1mgLisina 15 - 16mg
Fuente: 2,7,11,12,14,15,17
Las semillas contienen:
Aceite 25%Proteínas 24%Ac. grasos (oleico, miristico, palmítico, esteárico)
Glucosido (caricina, carposenina)Mirosina
Derivados de isotiocianato de bencilo (tropaeolina)
Fuente: 2,7,11,12,14,15,17
Las hojas contienen:
Humedad 83.3gProteína 5.6gGrasa 0.4gCarbohidratos 8 - 11gFibra cruda 1gCeniza 1.4gCalcio 0.406gHierro 0.0063gCaroteno 28.9000UIAc. Ascórbico 38,6%Magnesio 0.035gAc. fosfórico 0.225gCarpaína 0,25%Taninos 0.5 - 0.6%Pseudocarpaína, isocarpaína, dihidrocarpaína I y IIGlicosidos cianogéneticos
Fuente: 2,7,11,12,14,15,17
La corteza contiene: pentaalcohol, xilitol, saponósidos.
La raíz contiene: alcaloides (isocarpaína, dihidrocarpaína), taninos.
El látex contiene: papaína, quimopapaína, carpósido.
1.1.9 Referencias Farmacológicas
La papaína es una enzima proteolítica que actúa sobre las
proteínas rompiendo los enlaces peptídicos para dar lugar a compuestos
más simples que son los aminoácidos los cuales están unidos entre sí por
enlaces peptídicos. Cuando estos enlaces son destruidos por un fermento
o enzima proteolítica como la papaína, la proteína se desintegra, rota en
pedazos como un collar de perlas destruido o como una cadena
desarticulada.7
Los helmintos que parasitan en el intestino humano tiene su
cuerpo protegido para que no sea digerido por jugos digestivos normales,
todo el cuerpo esta recubierto por una sustancia proteica que se llama
quitina con una capa de células epidérmicas muertas. Los fermentos
proteolíticos vegetales como la papaína son capaces de destruir las
proteínas muertas y la quitina; son así como los gusanos desnudos son
fácilmente eliminados y por esta razón se dice que son sustancias
antihelmínticas.7
Se han obtenido buenos resultados con la tenia, los oxiuros, el
ancylostoma, los trichuris, etc. pero la acción más específica parece ser
sobre los ascarides. Algunos afirman que puede usarse 10g de papaína
pura para un niño de 1 – 2 años, 10 – 15g entre 2 – 6 años y 15 – 20g
después de los 6 años siguiendo media hora después con una dosis de
aceite de ricino.7
También se reporta que el alcaloide carpaína tiene un interesante
efecto sobre el músculo cardiaco, parecido al de la digital; se dice que en
su marcha farmacológica deprime primero la actividad auricular, después
la concentración ventricular y puede producir la detención del corazón a
altas dosis. Se indica que a dosis de 5mg/Kg./vía oral mata a un conejo
pero no perjudica a un gato. Es relajante de la musculatura lisa de los
bronquios, del intestino y del útero, lo que explicaría la acción del humo
de las hojas sobre los síntomas del asma.7 En la Universidad Nacional San
Luis Gonzaga de Ica – Perú, a través de una investigación se comprobó la
actividad cardiotónoca e hipotensora de la papaya utilizando el extracto
etanólico de las hojas sobre corazón “in situ” de sapos y una aurícula
aislada de cobayo respectivamente.36
El xilitol es un diurético reconocido, antihelmíntico y productor de
los niveles de bilirrubina en ratas experimentalmente intoxicadas por
inyecciones saponósicas.11
En Alemania y Checoslovaquia usan especialidades farmacéuticas
como TROMALYT y UROGAN para el tratamiento de infecciones
urinarias resistentes.11
En África se demostró la actividad antihipertensiva de la papaya a
dosis de 0.01mg por el principio activo carpaína, la misma que inhibe in
vitro cepas de Mycobacterium tuberculosis.11
Estudios antibacterianos demuestran que el extracto de semillas y
fruto tierno y maduro son activos contra bacterias Gramnegativas; los
extractos etanólicos de hojas son activos contra Escherichia coli y
Staphylococcus aureus. Se tienen reportes sobre los extractos acuosos de
varias partes del fruto que no tienen actividad antimicrobiana.5
Estudios de Nigeria mostraron que el extracto etanólico de la hoja
seca administrado por vía intraperitoneal en ratas tiene efecto analgésico a
la dosis de 20mg/Kg., anticonvulsivante en dosis de 20mg/Kg. y
100mg/Kg., relajante del músculo esquelético a la dosis de 50mg/Kg.,
cronotropo positivo a 20mg/Kg. y tranquilizante a la dosis de 10mg/kg. 11
Por otro lado se ha demostrado que el extracto metanólico no tiene
actividad antiinflamatoria en el edema de la oreja del ratón inducido por
acetato de tetradecanoilforbol.5
El extracto acetónico del látex pulverizado contiene un factor que
acelera la coagulación sanguínea y otro que la previene.5 También
presenta actividad antifúngica in vitro especialmente frente a Candida
albicans (CL100=138µg/mL).11
En Londres se curaron las heridas de una operación de transplante
de riñón con tiras del fruto, se dejaron durante 48 horas, después que los
medicamentos modernos habían fracasado.5
Los extractos butánolico y en alcohol isopentílico respectivamente
ejercen una actividad espasmolítica sobre el ileon aislado de cobayo a la
concentración de 0.2mg/mL.11
El fruto y la semilla por vía intraperitoneal en la rata tienen efecto
anticonceptivo por impedir la implantación del huevo o cigote en el
útero.11
Así mismo se reporta que en estudios con animales, la ictericia
provocada por la administración de saponósidos desapareció rápidamente
al administrar el extracto de Carica papaya.11
De las semillas frescas machacadas se ha aislado la aglicona de
glucotropaeolin bencil isotiocianato (BITC) que tiene actividad
bacteriostática, bactericida y fungicida; la dosis efectiva única es de 4 –
5g. (25 – 30mg. BITC). La tropoeolina también ha sido usada como
agente bactericida en infecciones intestinales y urinarias en dosis de 6µg.5
Estudios en Alemania afirman que el extracto etanólico de las
semillas de Carica papaya no presenta actividad antibacteriana contra
microorganismos Grampositivos o Gramnegativos.28
En una investigación realizada en Japón, se indica que las
semillas y frutos de la papaya presentan actividad antibacteriana y
antioxidante.30 Mientas que en Camerum demostraron la actividad
antimicrobiana frente a especies de Salmonella.34
Por otro lado en Jamaica, mediante un estudio realizado sobre el
efecto antibacteriano de los frutos y semillas de Carica papaya, se
demostró que éstas últimas son portadoras de una actividad antibacteriana
que inhibe el crecimiento de los microorganismos Grampositivos y
Gramnegativos. Así mismo no se produjo zona de inhibición alguna por
parte de los extractos de epicarpio y endocarpio.31
También se ha comprobado la acción antiparasitaria de las
semillas frente al parásito nematodo Haemonchus contortus en una
investigación realizada al Oeste de África,32 y en Perú frente a Ascaris
lumbricoides. 37,38 Así mismo se relaciona la actividad antihelmíntica con
el contenido de bencilisotiocianatos.33 A su vez se considera a la papaya
como una buena alternativa para las quemaduras en pacientes pediátricos
en el caso de infecciones, tejidos necrosados y rupturas de implantes en la
piel.35
1.1.10 Referencias Toxicológicas
La carpaina actúa a nivel del corazón como los digitálicos y es
susceptible de provocar a fuertes dosis parálisis y depresión cardiaca.11
La quimopapaína tiene un efecto inmunogénico marcado en el
hombre, por lo que se ha limitado su utilización clínica en instilación in
situ (tratamiento de hernias discales), produce choque anafiláctico en el
1% de los pacientes sometidos a dicho procedimiento. En el perro la vía
intradiscal fue bien tolerada a dosis de hasta 25mg/Kg., no se observó
ninguna toxicidad después de varios meses. Se ha establecido la DL50 por
vía intravenosa en el ratón: 79mg/Kg.; en la rata: 120mg/Kg.; en el
conejo: 15mg/Kg. y en el perro: 17mg/Kg. Además la papaína provoca
enfisema pulmonar por inhalación en el perro, en el hámster y en la rata.11
La DL50 del extracto acuoso de semilla, en el ratón, es superior a
10mL/Kg.11
Los extractos acuosos y etanólicos de hoja y corteza (500 ppm)
son tóxicos a peces del género Mollinesia.5
El fruto verde y el exceso de semillas pueden ser abortivos; la raíz
en enema se usa como abortivo; el látex fresco es irritante y vesicante
sobre todo a la mucosa ocular y su ingestión puede causar gastritis,
también puede producir dermatitis y otras formas de alergia, el polen
puede causar severas alergias respiratorias.5
El extracto acuoso de semilla produjo esterilidad irreversible a
ratas albinas machos (se dio una disminución en la motilidad de los
espermatozoides por interferencia motora de los vasos deferentes),
probablemente se debe a una acción antiandrogénica.11
1.2 Actividad antimicrobiana
1.2.1 Definición
Sustancia química, producida por un microorganismo o por
síntesis, que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de los
microorganismos.
La actividad antimicrobiana se mide in vitro para determinar: la
potencia de un agente antibacteriano en solución, su concentración en
los líquidos del cuerpo o en los tejidos, y la sensibilidad de un
microorganismo dado a concentraciones conocidas del medicamento.
1.2.2 Determinación de la actividad antimicrobiana
Para evaluar la actividad es preciso conocer el modelo
microbiano perfectamente y tenerlo controlado en las condiciones de
laboratorio, ya sea por procedimientos in vitro o in vivo.
Utilizando un microorganismo estándar apropiado de prueba y
una muestra conocida de medicamento para la comparación, pueden
emplearse dos métodos principales: dilución o difusión para estimar
tanto la potencia del antibiótico en la muestra como la “sensibilidad”
del microorganismo.
1.2.3 Antibiograma
Esquema o patrón de sensibilidad de un microorganismo a una
batería de agentes antimicrobianos.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Materiales
2.1.1 Del estudio fitoquímico
Material botánico: La muestra corresponde a las semillas secas de la
especie Carica papaya L. “papaya”.
Material de laboratorio:
- Agitadores
- Alcoholímetro
- Aros
- Balones
- Embudos
- Espátulas
- Fiolas
- Gotero
- Gradillas
- Matraces
- Nueces
- Papel de filtro
- Papel tornasol
- Peras de bromo
- Pipetas
- Pinzas
- Probetas
- Soporte universal
- Tubos de ensayo
- Vaso de precipitación
Reactivos y solventes:
- Ácido sulfúrico c.c.
- Ácido clorhídrico
- Agua destilada
- Alcohol amílico
- Alcohol rectificado
- Anhídrido acético
- Cloruro de sodio
- Diclorometano
- Reactivo Dragendorff
- Éter de petróleo 60º - 90º C
- Reactivo Hager
- Hidróxido de sodio
- Limadura de magnesio
- Reactivo Mayer
- Solución de gelatina
- Sulfato de sodio anhidro
- Tricloruro de fierro
Equipos de laboratorio:
- Balanza analítica
- Balanza de humedad
- Baño Maria
- Cocinilla eléctrica
- Equipo de agitación
- Equipo de destilación (Obtención del solvente)
- Equipo de percolación
- Equipo de reflujo (Screening fitoquímico)
- Estufa
- Molino manual
2.1.2 Del estudio antimicrobiano
Material biológico: Se usaron cepas proporcionadas por el INS Instituto
Nacional de Salud.
- Candida albicans ATCC 10231
- Escherichia coli ATCC 25922
- Enterococcus faecalis ATCC 29212
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
- Staphylococcus aureus ATCC 25923
Material de laboratorio:
- Algodón
- Asa de platino
- Baguetas
- Cinta de control de esterilidad
- Espátulas
- Gradillas
- Matraces
- Papel aluminio
- Papel kraff
- Pabilo
- Pinza para tubo de ensayo
- Pipetas
- Placas petri
- Probeta
- Sacabocado
- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.
- Tubos de ensayo de 8 x 60 mm.
- Tubos de ensayo 16 x 160 mm.
- Viales
Equipos:
- Autoclave
- Balanza analítica
- Baño María
- Cocina eléctrica
- Estufa
- Horno de esterilización
- Mechero de Bunsen
- Refrigeradora
Reactivos y solventes:
- Agua destilada
- Antibiótico de referencia (control positivo): Gentamicina
80mg/2mL
- EtOH-Agua (3:2)
Medios de cultivo:
- Agar Müeller Hinton (MH)
- Agar Tripticasa Soya (TSA)
- Caldo Nutritivo (CN)
2.2 Métodos
2.2.1 Del estudio fitoquímico
2.2.1.1 Preparación del material vegetal
Recolección.- Para obtener las semillas de Carica papaya L., se
recolectaron los frutos en el distrito de Juan Guerra, provincia de
Tarapoto, departamento de San Martín en el mes de agosto del
2006 posteriormente se empacaron con protección adecuada para
ser trasladados a la ciudad de Lima donde fueron cortados para
obtener las semillas, las mismas que se limpiaron con un paño
retirando los restos de pulpa del fruto.
Ubicación geográfica del distrito de Juan Guerra, provincia de Tarapoto
Secado.- Inicialmente se realizó el secado al natural bajo sombra
por un tiempo de tres semanas en un ambiente adecuado con
buena ventilación y finalmente secado en estufa a temperatura de
38oC por un tiempo de dos semanas, debido a la elevada humedad
que presentan las semillas, controlando la pérdida de peso
diariamente hasta llegar a peso constante, asimismo se determinó
la humedad de la muestra.
Secado en estufa de las semillas de Carica papaya L.
Fragmentación.- Esta etapa la se realizó utilizando un molino
manual en buenas condiciones de limpieza obteniendo una
muestra finamente triturada.
Fragmentación de las semillas de Carica papaya L.
Almacenaje.- Las semillas trituradas se almacenaron en frascos
de vidrio color ámbar herméticamente cerrados y se conservaron
en un ambiente fresco y seco.
Fluxograma 1. Recolección y preparación de las semillas secas.
Droga Semillas de Carica papaya L.
“papaya”
Recolección (*)
Secado (*)
Fragmentación (*)
Almacenamiento (*)
Inicialmente a sombra. Luego a 38ºC en estufa.
Ambiente freso y seco
Molino manual
(*) En cada uno de estos pasos se realizó una selección del material vegetal en base a las características organolépticas.
Fluxograma 2. Recolección y preparación de las semillas secas
desengrasadas.
(*) En cada uno de estos pasos se realizó una selección del material vegetal en base a las características organolépticas.
Droga Semillas de Carica papaya L.
“papaya”
Recolección (*)
Secado (*)
Secado (*)
Almacenamiento (*)
En sombra
Ambiente freso y seco
Molino manual
Fragmentación (*)
Lavado (*) Con éter petróleo
60º-90º
En estufa a 38ºC
2.2.1.2 “Screening” fitoquímico
Es una de las etapas iniciales de la investigación
fitoquímica, que permite luego orientar las extracciones y/o el
fraccionamiento de los extractos eligiendo los grupos de mayor
interés para el investigador.
Se realizó una marcha fitoquímica como se indica en el
Fluxograma Nº 3, para una determinación preliminar cualitativa
de los principales grupos de constituyentes químicos de la planta,
llamados metabolitos secundarios. Haciendo uso de solventes
apropiados para la extracción se obtuvo 6 fracciones denominadas
A, B, C, D, E y F. Para realizar un estudio comparativo se hizo el
screening fitoquímico con muestras de semillas lavadas y sin
lavar.
Obtención del Extracto
Se pesan 20 gramos del material vegetal seco y molido ya
seleccionado, y se maceran con cantidad suficiente de etanol
durante 48 horas.
Se somete a reflujo por 8 horas, luego se prosigue con la
obtención de las fracciones.
Obtención de Fracciones:
1. El extracto obtenido por reflujo, se filtra en caliente y
lleva a volumen final de 50 mL. Se separan 10 mL del
extracto etanólico, lo que constituye la fracción A.
2. Los 40 mL restantes se secan a temperatura reducida
3. Extraer el extracto seco con 15 mL de HCl 2 % a
50ºC. Si es necesario agregar más solución del ácido,
evitando que el volumen final exceda de 15 mL. El
insoluble se lava con agua destilada y se disuelve con
diclorometano en caliente, se filtra y lleva a un
volumen final de 10 mL; esto constituye la fracción B.
4. La solución ácida se neutraliza con NaOH o KOH,
controlando con papel tornasol. Se extrae con 2
porciones de 15 mL de diclorometano, se juntan las
dos fases orgánicas, se filtran sobre sulfato de sodio
anhidro y llevan a volumen final de 10 mL; esto
constituye la fracción C.
5. A la solución acuosa se le agregan 2 g de NaCl y se
extraen con 2 porciones de 15 mL de diclorometano-
etanol (3:2), se juntan las 2 fases orgánicas, se filtran
sobre sulfato de sodio anhidro y llevan a volumen final
de 10 mL; esto constituye la fracción D.
6. La solución acuosa restante se lleva a un volumen final
de 10 mL, esto constituye la fracción E.
7. 1 g de la muestra seca y molida se extrae con agua por
ebullición durante 10 minutos, se filtra y se lleva a
volumen final de 10 mL, esto constituye la fracción F.
Fluxograma 3. “Screening” fitoquímico
Neutralizar con NaOH ó KOH. Extraer con CH2Cl2 (2 x 15 mL)
Macerar con Etanol por 48 horas, reflujar por 6 horas y filtrar en caliente. Llevar a volumen final de 50 mL.
Separar 10 mL
Muestra seca y molida 20g.
Fracción A
40mL de extracto etanólico
Solución ácida
Fase orgánica Fase acuosa
Fase acuosa Fase orgánica
Insoluble
Fracción B
Fracción C
Fracción D Fracción E
Muestra seca y molida 1g.
Fracción F
Llevar a sequedad. y extraer con 15 mL de HCl 2% a 50°C.
Lavar con agua destilada. Disolver en CH2Cl2 en caliente. Filtrar y concentrar a 10 mL
Extraer con 20 mL de agua por 10 minutos (ebullición). Filtrar y concentrar a 10 mL.
Filtrar sobre Na2SO4 anh. Concentrar a 10 mL.
Filtrar sobre Na2SO4 anh. Concentrar a 10 mL
cc 10 mL
Agregar 2 g de NaCl. Extraer con CH2Cl2 –EtOH 3: 2 (2 x 15mL)
Insoluble
Identificación de metabolitos secundarios:
FRACCIÓN A
2 mL de Muestra
Solución de Ensayo (S.E)
A sequedad y disuelto con 2 mL de agua destilada. Filtrar
0.5 mL S.E. + 0.5 mL S.E. + 0.5 mL de sol. acuosa Cloruro férrico 0.5% de Gelatina
Turbidez o precipitado
Coloración intensa azul, negro o verde
DETERMINACIÓN DE TANINOS
DETERMINACIÓN DE GRUPOS
FENÓLICOS LIBRES
FRACCIÓN B
1. Reacción de Lieberman – Bourchard para determinar Triterpenoides y/o Esteroides:
0,5 mL de Muestra + 0,5 mL de Anhídrido acético + 1 gt de Acido sulfúrico cc.
Coloración azul, verde o naranja 2. Reacción de Bornträger para determinar Antraquinonas:
0.5 mL de Muestra + 5 mL de NaOH 5 % (agitación)
Coloración roja
FRACCIÓN C
1. Reacción de Lieberman – Bourchard (Descrita anteriormente): 2. Reacción para Alcaloides:
2 mL de Muestra
A sequedad y disuelto con HCl 1 % a 50 ºC
Solución de Ensayo (S.E)
0.5 mL de S.E. + 0.5 mL de S.E. + 0.5 mL de S.E.+ gts de R. Mayer gts de R. Hager gts de R. Dragendorff
Precipitado Precipitado Precipitado color blanco color amarillo color anaranjado
FRACCIÓN D
1. Reacción de Lieberman – Bourchard:
0.5 mL de Muestra
A sequedad y disuelto con 1 mL. diclorometano
Se procede igual que los casos anteriores.
2. Reacción para Alcaloides: ( Descrita anteriormente )
3. Reacción de Rosenhein para Leucoantocianidinas y Catequinas; y Reacción de Shinoda para Flavonoides.
2 mL de Muestra
Solución de Ensayo (S.E)
0.5 mL de S.E. + 0.5 mL de S.E. + 0.2 mL de HCl cc 0.2 mL de HCl cc + Limadura de Magnesio + 2 mL de Agua destilada + 2 mL de Alcohol amílico Aparece coloración
A sequedad y disuelto con 5 mL de etanol a 50 ºC
Calentar por 10 minutos a 100 ºC y enfriar. Reposar 5
minutos
Agitación Coloración rojo intenso a rojo débil (Leucoantocianidinas) o marrón (Catequinas).
FRACCIÓN E.- Sobre esta fracción se realiza directamente los ensayos de
Rosenhein y Shinoda (descritos en la Fracción D)
FRACCIÓN F.- Colocar 1 mL en un tubo de ensayo, tapar y agitar
fuertemente durante 15 minutos, luego de este tiempo se mide la altura de la
espuma. La reacción es negativa si la altura de la espuma es menor de 5 mm.
2.2.1.3 Obtención de los extractos etanólico e hidroalcohólico
Obtención de los extractos:
Se obtuvieron los extractos empleando EtOH-Agua (3:2) y
EtOH con la finalidad de comparar resultados en las diferentes
etapas de la investigación, obteniéndose al final del proceso el
extracto etanólico y el extracto hidroalcohólico seco.
De lo observado en los resultados de las primeras
percolaciones, debido a la presencia de abundante grasa en los
extractos se hizo un desengrasado de nuevas semillas secas
(segundo grupo de recolección), posteriormente se hizo las
percolaciones respectivas para cada tipo de extracto.
Muestra.- Para las semillas secas y fragmentadas se pesaron
100g. para cada equipo de percolación (4 equipos) separando
dos percolaciones por cada tipo de extracto. En el caso de las
semillas desengrasada y fragmentada se tomó 210g. para cada
equipo de percolación y por cada tipo de extracto.
Proceso de extracción por percolación.- se realizó a través
de las siguientes etapas:
- Primera Etapa
a. Estabilización: Comprende el Secado y la
fragmentación (descrito anteriormente).
b. Humectación: Para las semillas sin lavar se
dejó humectar la muestra por 4 horas y en las
semillas lavadas realizamos una humectación por
17 horas.
- Segunda Etapa
a. Llenado o carga: Posteriormente a la
instalación del equipo se procedió con el llenado.
La cantidad de solvente que se añadió al material
vegetal fue calculado tomando en cuenta la
siguiente fórmula:
Cantidad de solvente
complementaria=
Volumen final
del extracto+
Coeficiente de absorción
de agua de la drogax Proporción
de la droga
Se tomó como coeficiente de absorción de agua de
la droga 3.0 correspondiente a las semillas y la
cantidad de solvente complementaria empleada
para macerar las semillas sin lavar y lavadas fue de
400 y 840mL respectivamente.
b. Maceración: Se procedió a macerar la muestra
por un tiempo de 48 horas.
c. Lixiviación propiamente dicha: La extracción
se dio a una velocidad de flujo de 20 gotas por
minuto (lixiviación lenta) cuidando
minuciosamente el proceso, obteniendo de esta
manera el extracto líquido.
d. Extracto: Finalmente el volumen obtenido en el
extracto líquido fue llevado a concentración hasta
terminar en extracto seco para el caso del
hidroalcohólico y extracto líquido concentrado para
el etanólico.
Inicio del proceso de percolación
Obtención de los extractos
Fluxograma 4. Proceso de Lixiviación de semillas secas
4 horas
Droga Semillas de Carica papaya L.
“papaya”
Etapas de Lixiviación
Primera Etapa
Segunda Etapa
Estabilización
Humectación
Lixiviación propiamente dicha
Maceración
Llenado
100g
Extracto seco Hidroalcohólico
Obtención del extracto líquido
Concentración
Extracto Etanólico
48 horas. EtOH y EtOH-Agua (3:2)
Fluxograma 5. Proceso de Lixiviación semillas desengrasadas
Droga Semillas de Carica papaya L.
“papaya”
Etapas de Lixiviación
Primera Etapa
Segunda Etapa
Estabilización
Humectación
Lixiviación propiamente dicha
Maceración
Llenado
210g
17 horas
Extracto Hidroalcohólico
Obtención del extracto líquido
Extracto Etanólico
Concentración
48 horas. EtOH y EtOH-Agua (3:2)
2.2.2 Estudio de la actividad antimicrobiana
2.2.2.1 Material microbiológico
Las cepas fueron proporcionadas por el Instituto
Nacional de Salud (INS):
Candida albicans ATCC 10231
Escherichia coli ATCC 25922
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Cepas replicadas en incubación
2.2.2.2 Medios de cultivo
Los medios de cultivo que se utilizaron fueron: Agar
Müeller-Hinton (MH), Agar Tripticasa Soya (TSA), Caldo
Nutritivo (CN); para microorganismos en estudio.
2.2.2.3 Controles
Como control positivo se utilizó la Gentamicina para las
bacterias y como control negativo Etanol-Agua (3:2) para los
extractos etanólico e hidroalcohólico.
Extractos y Controles
2.2.2.4 Interpretación de resultados
Porcentaje de Inhibición Relativa (PIR)
Para la interpretación de los resultados se utilizó el
Porcentaje de Inhibición Relativa (PIR) la cual tiene por
finalidad comparar la actividad antimicrobiana de los extractos
frente al control positivo del antibiótico, obteniéndose un
porcentaje de inhibición.
a x 100 PIR =
b
Donde:
PIR = Porcentaje de Inhibición Relativa
a = Promedio del diámetro del halo de inhibición
del extracto.
B = Promedio del diámetro del halo de inhibición
del antibiótico estándar.
2.2.2.5 Método de difusión mediante excavación en placa
Preparación de medios de cultivo sólido
Todos los materiales de laboratorio (material de vidrio,
material de fierro, torundas, etc.) fueron previamente esterilizados
para realizar los ensayos microbiológicos; estos ensayos fueron
realizados por dos oportunidades por duplicado.
Se usó Agar Müeller-Hinton como medio. 25 mL del agar
fundido fueron asépticamente mezclados con una suspensión
bacteriana de 1 mL a la cual se hizo la comparación con el
nefelómetro de Mac Farland Nº 0.5 (1.5 x 108 UFC/mL) y vertido
en una placa petri esterilizada de 150mm. Al endurecerse el agar
se retiró 8 mm de diámetro usando un sacabocado estéril,
agregándose el extracto etanólico e hidroalcohólico de Carica
papaya L., en las excavaciones en el agar, también se tomó EtOH-
Agua (3:2) como control negativo y Gentamicina como control
positivo para bacterias grampositivas y gramnegativas. Los
ensayos se realizaron por duplicado.
Se midió la actividad antimicrobiana tomando en cuenta el
diámetro (mm) de la zona clara del halo de inhibición.
Proceso de llenado de excavaciones
Determinación de la Actividad antimicrobiana mediante difusión por excavación
de los extractos hidroalcohólicos y etanólicos.
Determinación de la Actividad antimicrobiana mediante difusión por excavación
de los extractos hidroalcohólicos.
METODO DE EXCAVACIÓN EN PLACA
Cepa del microorganismo Cultivo microbiano 0.5 Mc Farland
Con pipeta estéril 1mL de Cultivo microbiano
Incorporación del Agar Müeller-Hinton
Agregando extractos Excavación con
sacabocado
Incubar a 37ºC x 24 h.
Lectura y Medición del halo de inhibición
2.2.2.6 Preparación del medio de cultivo líquido
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Los cultivos microbianos fueron ajustados al estándar 0.5
de Mac Farland. Para hallar el MIC se prepararon baterías de 10
tubos previamente esterilizados y rotulados del número 1 al
número 10, la cual se utilizó para cada microorganismo.
Técnica de la Concentración Mínima Inhibitoria
- A partir del cultivo puro se tomó una asada cargada con el
inóculo, realizando la siembra por agitación en el medio
líquido (CN) contenido en el tubo de ensayo.
- Se flameó la boca del tubo y se tapó dejándolo en la gradilla
previamente rotulada según la bacteria replicada.
- Se incubó a 37ºC por 24 horas, cumplido el tiempo se ajustó al
estándar 0.5 de Mac Farland.
- Las baterías de tubos previamente estériles fueron enumerados
y rotulados por microorganismo y tipo de extracto.
- A partir del tubo Nº 2 hasta el tubo Nº 10 se agregó 0.5 mL del
Caldo Nutritivo.
- Seguidamente se coloca 0.5 mL del extracto al tubo Nº 1 y
tubo Nº 2, a partir del tubo Nº 2 se traspasa 0.5 mL al tubo Nº
3 mezclando, y así sucesivamente hasta el tubo Nº 9; del tubo
Nº 9 se cogió 0.5 mL y se descartó. El tubo de ensayo Nº 10
no recibió extracto.
- Posteriormente se agregó 0.5 mL del inóculo microbiano a
todos los tubos y se llevó a incubación a 37ºC por 24 horas.
Proceso de incubación de la Concentración Mínima Inhibitoria
Lectura
La lectura se realizó observándose la turbidez de cada una
de las baterías de tubos, el tubo con la menor concentración del
extracto que no presentó turbidez contuvo la concentración
mínima inhibitoria.
2.2.2.7 Determinación de la Concentración Mínima Bactericida y
Bacteriostática (CMB)
La concentración mínima bactericida se define como la
menor concentración del antimicrobiano que mata totalmente la
bacteria en estudio; y la concentración mínima bacteriostática,
como la concentración que no logra matar todos los
microorganismos.
Determinación de la Concentración Mínima Bactericida y
Bacteriostática (CMB).
Para determinar la Concentración Mínima Bactericida
(CMB) y Concentración Mínima Bacteriostática (CMB) se
procedió a partir de la concentración mínima inhibitoria.
- En una placa petri estéril previamente rotulada se dividió en
diez porciones en forma equitativa y enumerada del Nº 1 al 10.
- Se preparó agar Müeller-Hinton, para cada microorganismo.
- Con la ayuda del asa bacteriológica se cogió un inóculo del
tubo Nº 1 y se sembró por estrías en la división Nº 1 de la
respectiva placa, el asa se flamea al rojo vivo; y de la misma
manera se cogió una asada del tubo Nº 2, sembrándose en el
sector correspondiente de la placa petri, se sigue así
sucesivamente hasta la división Nº 10.
Proceso de Siembra Concentración Mínima Bactericida y Bacteriostática
- Concluida la siembra en la placa petri, se lleva a incubación a
37ºC por 24 horas.
Proceso de Incubación de Concentración Mínima Bactericida y Bacteriostática
Lectura
Se observa en cada una de las 10 divisiones de la placa
petri si hubo crecimiento microbiano, la fracción con la menor
concentración del extracto que no mostró ningún crecimiento, fue
la concentración mínima bactericida y la concentración que no
inhibió totalmente el crecimiento del microorganismo constituyó
la concentración mínima bacteriostática.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) Y CONCENTRACIÓN
MÍNIMA BACTERICIDA – BACTERIOSTÁTICA (CMB)
0.5 mL de Caldo del tubo Nº 2 al 10 Extracto
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 Desechar
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10(CN
0.5 mL del inoculo
Cultivo microbiano
Estandarizar
0.5 Mc Farland
Incubar a 37ºC x 24 h. Lectura de resultados
10
9
8
7
6 5 4
3
2
1
Siembra en placa con Agar Müeller-Hinton
Incubar a 37ºC x 24 h.
Lectura de resultados
1
2
3
4
56
7
8
9
1
3. RESULTADOS Estudio Fitoquímico (Cuadros elaborados por los Autores)
Cuadro 1
Resultados del secado de las semillas de Carica papaya L.
Grupos
Secado en sombra
Secado en estufa
Peso inicial
Peso final
Humedad inicial
Humedad final
Grupo Nº 1 25 días 15 días 2096g 361.0035g 76.58% 0.88%
Grupo Nº 2 20 días 10 días 3519g 626.5767g 78.27% 1.29%
Cuadro 2
Rendimiento de los Extractos Etanólico e Hidroalcohólico de las semillas de
Carica papaya L.
Extracto Peso semillas Rendimiento
Extracto EtOH-Agua (3:2) 100g 7,48%
Extracto Etanólico 100g 16,11%
Cuadro 3
Rendimientos de los Extractos Etanólico e Hidroalcohólico de las semillas
desengrasadas de Carica papaya L.
Extracto Peso inicial Rendimiento
Extracto EtOH-Agua (3:2) 210g 6.17%
Extracto Etanólico 210g 14.15%
Cuadro 4
Características organolépticas de los menstruos de la percolación etanólica de
semillas secas y semillas desengrasadas de Carica papaya L.
Aspecto: Translúcido
Color: Amarillo oscuro
Olor: Desagradable
Extractos etanólicos
Cuadro 5
Características organolépticas de los menstruos de la percolación
hidroalcohólica de semillas secas y semillas desengrasadas de Carica papaya L.
Aspecto: Ligeramente opaco
Color: Marrón claro
Olor: Desagradable
Extractos hidroalcoholicos
Cuadro 6
Características organolépticas de los extractos de etanólico e hidroalcohólico de
las semillas secas y desengrasadas de Carica papaya L.
Extracto Hidroalcohólico Extracto Etanólico
Aspecto: Opaco Opaco
Color: Marrón oscuro Marrón oscuro
Olor: Desagradable Desagradable
Cuadro 7
Resultados del “Screening” fitoquímico de las semillas de Carica papaya L.
Fracción Metabolitos Reacciones Resultado
Taninos Solución de gelatina +Grupos fenólicos libres Solución de cloruro férrico +
Triterpenoides y esteroides Lieberman-Bouchard +Antraquinonas Borntrager -
Triterpenoides y esteroides Lieberman-Bouchard -Alcaloides Mayer, Hager, Dragendorff -
Triterpenoides y esteroides Lieberman-Bouchard -Alcaloides Mayer, Hager, Dragendorff -
Leucoantocianidinas y catequinas Rosenheim -oda -
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4. DISCUSIÓN
Las semillas de Carica papaya L. presentan en su composición gran cantidad
de grasa por lo que para evitar interferencias durante el proceso de “screening” se
procedió a desengrasarlas con éter de petróleo. Tanto a las muestras secas como a las
muestras desengrasadas se les realizó un “screening” fitoquímico, encontrándose en
ambos casos la presencia de taninos, triterpenoides y/o esteroides y flavonoides
(cuadro Nº 7).
En la extracción por percolación o lixiviación se presentan diferencias
marcadas en las características organolépticas de los menstruos etanólico e
hidroalcohólico (cuadros Nº 4 y 5). También en los rendimientos de cada extracto
obtenido (cuadros Nº 2 y 3), notándose mayor porcentaje en los etanólicos, esto
posiblemente se deba al mayor grado alcohólico; sin embargo no representa la mejor
actividad antimicrobiana. La lixiviación para la obtención de los principios activos
se realizó bajo las mismas condiciones para ambos extractos (extracto etanólico y
extracto hidroalcohólico).
En la determinación de la actividad antimicrobiana de las semillas de la
especie Carica papaya L. por el método de difusión mediante excavación en agar, se
observó que los extractos hidroalcohólicos evidenciaron actividad antimicrobiana
contra los 5 microorganismos confrontados, determinándose mayor actividad con los
extractos hidroalcohólicos de semillas desengrasadas frente a Enterococcus faecalis
y Pseudomona aeruginosa registrándose valores menores para los otros
microorganismos, siendo estos similares a los observados con los extractos
hidroalcohólicos de semillas secas; mientras que los extractos etanólicos mostraron
actividad frente a Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus (cuadro Nº 8). Al
parecer en los extractos etanólicos no se logra extraer a los metabolitos responsables
de la actividad contra bacterias gramnegativas, según lo observado en los resultados
donde si evidenció actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas; mientras
que los extractos hidroalcohólicos mostraron actividad antimicrobiana tanto frente a
microorganismos grampositivos y gramnegativos.
En la determinación de la concentración mínima bactericida y bacteriostática
(CMB) los extractos hidroalcohólicos, a la concentración de 250mg/mL, inhibieron
el crecimiento tanto de las bacterias grampositivas como gramnegativas. El extracto
hidroalcohólico de las semillas sin desengrasar presenta mayor actividad que el
extracto hidroalcohólico de semillas desengrasadas, frente a Candida albicans
ATCC 10231, con MIC de 3.91mg/mL y 31.25mg/mL respectivamente. Estas
concentraciones observadas menores para la Candida albicans ATCC 10231 y
mayores para las bacterias se deben a las diferencias estructurales constitutivas entre
microorganismos donde las bacterias presentan pared celular como estructura celular
más externa componente que no presenta la levadura Candida albicans ATCC
10231; siendo la parte vital mas periférica la membrana plasmática, así también estas
presentan un núcleo definido y diferentes organelas a comparación de las bacterias
que no presentan un núcleo verdadero (con envoltura celular) y solo ribosoma como
organela.
CONCLUSIONES
1. En el “screening” fitoquímico realizado a las semillas secas y semillas
desengrasadas se detectaron la presencia de los siguientes metabolitos
secundarios: taninos, triterpenoides y/o esteroides y flavonoides.
2. Los extractos etanólicos (de semillas secas y semillas desengrasadas) mostraron
actividad frente a Enterococcus faecalis ATCC 29212 y Staphylococcus aureus
ATCC 25923.
3. Los extractos hidroalcohólico (de semillas secas y semillas desengrasadas)
evidenciaron actividad antimicrobiana contra los 5 microorganismos
confrontados: Candida albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 25922,
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
4. Se determinó mayor actividad con el extracto hidroalcohólico de semillas secas
desengrasadas frente a Enterococcus faecalis y Pseudomona aeruginosa.
5. El extracto hidroalcohólico de las semillas sin desengrasar dio los siguientes
valores de MIC = 3,91mg/mL para Candida albicans ATCC 10231, con el
extracto hidroalcohólico total fue de 31,25mg/mL;
6. Ambos extractos hidroalcohólicos presentan MIC = 125 mg/mL. Para
Escherichia coli ATCC 25922.
7. Ambos extractos hidroalcohólicos presentan MIC = 250mg/mL. para
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y
Enterococcus faecalis ATCC 29212.
RECOMENDACIONES
1. Profundizar la investigación de la actividad antimicrobiana hallada en las
semillas de Carica papaya L. “papaya” con diferentes tipos de extractos y/o
cepas de microorganismos patógenos.
2. Realizar evaluaciones IN VIVO en animales de experimentación para comprobar
la actividad antimicrobiana y otras propiedades.
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