i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE
Leishmania mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR
PERROS INFECTADOS NATURALMENTE UTILIZANDO
WESTERN BLOT.
Trabajo de Grado Presentado como requisito para obtener el
Título de Médico Veterinario Zootecnista
AUTORA:
DIANA GABRIELA JARAMILLO CHERRES
TUTOR:
Dr. Richar Ivan Rodriguez Hidalgo
Quito, Abril 2017
ii
DEDICATORIA
A quienes llenan de luz y amor mis días, mis amados padres y
hermanos, quienes son apoyo e inspiración en cada paso.
Diana Gabriela Jaramillo
AGRADECIMIENTO
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Agradezco a Dios por los regalos maravillosos de cada día, la vida, la
familia, la salud, el amor. Por iluminar mi camino con sus bendiciones y
darme fortaleza hasta cumplir mis anhelos.
A mis padres y hermanos por todo su amor, sabiduría y apoyo. Quienes
son mi inspiración, mi pilar, a ellos les debo quien soy.
Al Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis por permitir la
elaboración de este proyecto, y brindar el apoyo con sus instalaciones
para la realización del trabajo de laboratorio. A la Dra. Graciela Uzcanga
quien facilitó los procesos para la realización de esta investigación. A la
Lcda. Maritza Celi, por su grata amistad y la apertura a compartir su
conocimiento.
A mi querida facultad, a mis maestros por permitirme aprender de la
profesión y de la vida, por la amistad, porque cada persona con la que
he compartido, ha dejado valiosas lecciones y grandes experiencias.
Especialmente a mi estimado tutor, Dr. Richar Rodríguez, quien ha sido
ejemplo y apoyo desde el comienzo y en cada paso dado.
iv
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, DIANA GABRIELA JARAMILLO CHERRES, en mi calidad de una
de los autores del trabajo de investigación realizado sobre
“EVALUACIÓN LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania
mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR PERROS INFECTADOS
NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT”, por la presente
autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de
todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene
esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con
lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley
intelectual y su Reglamento.
Quito, 20 de marzo de 2017.
____________________________________
Diana Gabriela Jaramillo Cherres
C.I. 180328237-3
v
INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado presentado por la Srta.
DIANA GABRIELA JARAMILLO CHERRES para obtener el Título o
Grado de MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA, cuyo título es
“EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania
mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR PERROS INFECTADOS
NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT”, considero que dicho
trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la
presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que
se designe.
En la ciudad de Quito, a los 16 días del mes de marzo de 2017.
______________________________
Dr. Richar Rodríguez. Ph. D.
CI: 171205178-6
vi
CALIFICACIÓN DEL TRABAJO FINAL
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ix
INDICE GENERAL EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR PERROS INFECTADOS NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT...............................................i
DEDICATORIA.................................................................................................................ii
AGRADECIMIENTO.........................................................................................................ii
AUTORIZACIÓNDEAUTORÍAINTELECTUAL..................................................................iv
INFORMEDELTUTOR.....................................................................................................v
CALIFICACIÓNDELTRABAJOFINAL...............................................................................vi
INDICEGENERAL.............................................................................................................ix
LISTADEANEXOS...........................................................................................................xi
RESUMEN.....................................................................................................................xiii
CAPÍTULOI.....................................................................................................................1
INTRODUCCIÓN..........................................................................................................1
OBJETIVOS..................................................................................................................2
ObjetivoGeneral........................................................................................................2
ObjetivosEspecíficos..................................................................................................2
CAPITULOII....................................................................................................................3
MARCOTEÓRICO........................................................................................................3
2.1.Antecedentes..................................................................................................3
2.2.Etiología...........................................................................................................4
2.3.Transmisión.....................................................................................................5
2.4.SignosClínicos.................................................................................................7
2.5RespuestaInmunitaria.....................................................................................7
2.6.Diagnóstico......................................................................................................8
2.7.Medidaspreventivasydecontrol...................................................................9
CAPITULOIII.................................................................................................................10
METODOLOGÍA.........................................................................................................10
3.1.Ubicacióndezonasdeestudio......................................................................10
3.2.Diseñodelainvestigación.............................................................................10
3.3.PoblacióndeEstudioyUnidadesdeMuestreo.............................................10
3.4.Materiales.....................................................................................................11
3.5.Método..........................................................................................................12
3.5.1.Extractodeantígenos.................................................................................12
3.5.2.DeteccióndeanticuerposIgG1eIgG2porWesternBlot...........................12
x
3.5.3.DeteccióndeanticuerposIgG1eIgG2porELISAindirecto........................15
3.6.Análisismatemáticosyestadísticos..............................................................16
CAPITULOIV.................................................................................................................18
RESULTADOSYDISCUSIÓN.......................................................................................18
4.1.ExtractodeLeishmaniamexicana.....................................................................18
4.2.IdentificacióndelasbandasreveladasenWesternBlotconisotipoIgG1yevaluacióndelarespuestainmunemedianteELISAindirecto................................18
4.3.IdentificacióndelasbandasreveladasenWesternBlotconisotipoIgG2yevaluacióndelarespuestainmunemedianteELISAindirecto................................23
CAPITULOV..................................................................................................................29
CONCLUSIONES........................................................................................................29
ANEXOS........................................................................................................................30
Anexo1........................................................................................................................30
Anexo2........................................................................................................................32
Anexo3........................................................................................................................33
Anexo4........................................................................................................................35
Anexo5........................................................................................................................35
Anexo6........................................................................................................................36
Anexo7........................................................................................................................36
Anexo8........................................................................................................................37
Anexo9........................................................................................................................37
Anexo10......................................................................................................................37
Anexo11......................................................................................................................38
Anexo12......................................................................................................................38
Anexo14......................................................................................................................40
Anexo15......................................................................................................................41
Anexo16......................................................................................................................42
Anexo17......................................................................................................................43
Anexo18......................................................................................................................45
Anexo19......................................................................................................................46
Anexo20......................................................................................................................47
REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS....................................................................................48
xi
LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Lista de materiales utilizados en el ensayo
Anexo 2. Códigos Sueros Caninos utilizados en Western Blot para
detección de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2.
Anexo 3. Registro de los sueros utilizados para la evaluación
Anexo 4. Preparación de geles de acrilamida cámara para Western Blot
Anexo 5. Preparación de transferencia – Blotting
Anexo 6. Transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa
Anexo 7. Preparación de tiras de nitrocelulosa marcadas
Anexo 8. Sueros a evaluar
Anexo 9. Incubación de sueros
Anexo 10. Revelado de de bandas mediante sustrato
Anexo 11. Lectura de tiras de nitrocelulosa
Anexo 12. Cálculo del peso molecular de bandas reveladas por Western
Blot Anexo 13. Electroforesis – desplazamiento de proteínas
Anexo 14. Bandas observadas entre los grupos de sueros problema
Anexo 15. Bandas observadas entre los grupos de sueros problema
Anexo 16. Resultados de densidades ópticas en ELISA indirecto
Anexo 17. Correspondencia Kappa Resultados de IgG1 por (Western
Blot )
Anexo 18. Correspondencia Kappa Resultados de IgG2 por (Western
Blot )
xii
Anexo 19. Correspondencia Kappa (ELISA y Western Blot) Resultados
IgG1
xiii
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS DE Leishmania
mexicana (IgG1 e IgG2) PRODUCIDOS POR PERROS INFECTADOS
NATURALMENTE UTILIZANDO WESTERN BLOT.
AUTORA: Diana Gabriela Jaramillo Cherres
TUTOR: Dr. Richar Rodriguez Ph. D.
RESUMEN La Leishmaniasis es una enfermedad zoonósica de origen parasitario, causado por Leishmania spp., descrita en el ser humano y otros mamíferos como el canino. Es una enfermedad de amplia distribución reportada en 98 territorios y se transmite por medio de mosquitos vectores Phlebotomus y Lutzomia. El canino doméstico forma parte importante del ciclo de transmisión de la presentación visceral. El objetivo de esta investigación fue evaluar la presencia de anticuerpos de Leishmania mexicana IgG1 y IgG2 producidos por perros infectados naturalmente mediante la técnica de Western Blot. Para lo cual, se analizaron 42 muestras de suero canino: un grupo de 14 muestras positivas, otro de 14 muestras negativas procedentes del banco de sueros del Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis. También se considero un tercer grupo de 14 muestras de perros identificados como negativos y con antecedentes de no haber visitado zonas endémicas de la enfermedad, los cuales fueron recolectados en la clínica veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central. Las 42 muestras fueron evaluadas con la prueba de Western Blot y se revelaron varios polipéptidos con masas moleculares entre 113 kDa y 12 kDa reconocidos por los anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2. Donde se identificó una banda de 34 kDa con frecuencia significativa entre los sueros positivos evaluados. En el estudio, también se sometieron las muestras a un ELISA indirecto con el parásito completo como fuente de antígenos y se valoró el tipo de respuesta inmune que presentaban los animales (Th1 o Th2). Con lo cual, se observó mayor respuesta de tipo Th1 entre las muestras. Finalmente, la investigación reveló marcadores polipeptídicos de la presencia de la enfermedad en caninos y también se observó el estatus inmunológico de los perros en las zonas endémicas a la leishmaniasis en el Ecuador. Palabras clave: Leishmaniasis canina, respuesta inmune, IgG1/IgG2, Western Blot, perros.
xiv
EVALUATION OF THE PRESENCE OF Leishmania mexicana
ANTIBODIES (IgG1 and IgG2) PRODUCED BY NATURALLY INFECTED
DOGS USING WESTERN BLOT
AUTHOR: Diana Gabriela Jaramillo Cherres
TUTOR: Dr. Richar Rodriguez Ph. D.
SUMMARY
Leishmaniasis is a zoonotic disease of parasitic origin, caused by Leishmania spp., It has been described in humans and other mammals such as canines. It is a widespread disease reported in 98 territories and is transmitted by vectors Phlebotomus and Lutzomia. The domestic canine plays an important role in the transmission cycle of the visceral presentation. The objective of this research was to evaluate the presence of Leishmania mexicana antibodies IgG1 and IgG2 produced by naturally infected dogs using the Western Blot technique. For this, 42 samples of canine serum were analyzed: a group of 14 positive samples, another of 14 negative samples from the sera bank of the Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis. It was also considered a third group of 14 samples of dogs identified as negatives, with a history of not having visited endemic areas of the disease, these samples were collected in the veterinary clinic of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. The 42 samples were evaluated with the Western Blot test and several polypeptides with molecular masses between 113 kDa and 12 kDa were recognized by the antibodies isotypes IgG1 and IgG2. A band of 34 kDa was identified with significant frequency among the positive sera evaluated. The samples were also subjected to an indirect ELISA with the complete parasite as the source of antigens and the immune response (Th1 or Th2) was also evaluated. Thus, a higher Th1 response was observed among the samples. Finally, the research revealed polypeptide markers for the presence of the disease in canines and also the immunological status of dogs was observed in the endemic areas of leishmaniasis in Ecuador. Key words: Canine leishmaniasis, immune response, IgG1 / IgG2, Western Blot, dogs.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La Leishmaniasis es una enfermedad de origen parasitario, causado
Leishmania spp. (Desjeux et al., 2004). Tiene una amplia distribución, descrita
en 98 territorios (López-Céspedes et al., 2012) con más de doce millones de
personas infectadas por Leishmania spp. y con aproximadamente 350 millones
de personas en riesgo de contraer la enfermedad de acuerdo a datos de la
Organización Mundial de la Salud (Iowa State University/College of Veterinary
Medicine, 2009). Anualmente existen casos de leishmaniasis cutánea y
visceral en todos los continentes, entre los principales países afectados están:
India, Brasil, Bangladesh, Nepal y Sudán. También, se han identificado casos
en países de Sudamérica como Argentina, Bolivia, Colombia, Ecuador y
Venezuela (Dantas-Torres y Otranto, 2016).
La Leishmaniasis también afecta a otros mamíferos como los caninos, lo cual
ha sido descrito en varios poblados de países de Sudamérica como Brasil,
Venezuela, Colombia, México entre otros (Sacks y Perkins, 1984; Reguera et
al., 2016; Oliveira et al., 2016). A pesar de los reportes de infestación en perros
con diferentes especies de Leishmania en el continente americano (Esparta et
al., 2000; López-Céspedes et al., 2012; Oliveira et al., 2016), se desconoce
aún, cual es el papel epidemiológico que juegan estos animales en los ciclos
de transmisión de la leishmaniasis y los mecanismos de la respuesta inmune
que ocurren tras la infección. Del mismo modo, existe muy poca información
sobre la epidemiología y respuesta inmune de los perros infectados con
leishmania en el Ecuador, aunque, por estudios del instituto de Investigación
en Salud Pública y Zoonosis (CIZ) se ha determinado su presencia en áreas
endémicas del Ecuador (datos no publicados). Cruz-Chan y colaboradores
2
(2014) indicaron que la sintomatología de la infección no conduce a un
diagnóstico certero de la leishmaniasis americana en perros. Finalmente,
debido a la relación existente entre seres humanos y caninos, la leishmaniasis
americana, al igual que la leishmaniasis visceral causada por Leishmania
infantum representa una zoonosis importante. Por lo tanto, su estudio es de
gran importancia por los problemas que puede estar generando tanto para la
salud animal como para la salud pública de la población americana (Cruz-Chan
et al., 2014).
OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar la presencia de anticuerpos de Leishmania mexicana IgG1 y IgG2
producidos por perros infectados naturalmente mediante la técnica de Western
Blot.
Objetivos Específicos
• Evaluar el extracto de los antígenos de Leishmania mexicana a partir
del cultivo de promastigotes en la detección de anticuerpos (IgG1 e
IgG2) en perros naturalmente infectados con Leishmania spp. utilizando
Western Blot.
• Correlacionar los resultados del Western Blot y el ELISA indirecto en la
evaluación de la respuesta de anticuerpo anti leishmania (IgG1 e IgG2)
en perros infectados naturalmente.
3
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes
La Leishmaniasis es una enfermedad que afecta a seres humanos y a otros
mamíferos como el perro (Alvar et al., 2004; Dantas-Torres et al., 2010; Sacks
and Perkins, 1984). Varios casos de Leishmaniasis en caninos y equinos
fueron encontrados por Manoel Oliveira Neto y colaboradores (1988) mediante
un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, localizados en las zonas
periurbanas de la ciudad de Rio de Janeiro. Asimismo, se evidenció la
presencia de caninos positivos a Leishmania spp. mediante un ensayo
inmunológico ligado a enzimas (ELISA), en Bahía, Brasil entre los años 1971
y 1980 (López-Céspedes, 2012).
La Leishmaniasis canina es considerada como una enfermedad importante
puesto que afecta principalmente a caninos domésticos tanto en el continente
Europeo y Asiático como en el continente Americano, provocando que
animales infectados mueran por falta de tratamiento (Reguera, 2016).
En el Ecuador, se ha identificado casos de leishmaniasis en humanos, en
veinte provincias del país, distribuidos en las tres regiones continentales del
Ecuador (Calvopina et al., 2004; Kato et al., 2016, 2005; Olalla et al., 2015).
Entre las especies encontradas se mencionan: Leishmania mexicana,
Leishmania braziliensis, Leishmania major-like, Leishmania guyanensis, y
Leishmania panamensis. Aunque no existe reportes de Leishmaniasis en
caninos, Calvopiña et al., (2004) reportan la presencia de la enfermedad en el
oso hormiguero (Tamandua tetradactila) y el perro de monte (Potos flavus).
4
2.2. Etiología
La Leishmaniasis es causada un protozoario denominado Leishmania spp.
perteneciente a la familia Trypanosomatidae del orden Kinetoplastida, del cual
se han descrito cerca de treinta especies diferentes (Cabral et al., 1998;
Reguera et al., 2016).
La transmisión del parásito se produce por medio de insectos vectores de los
géneros Phlebotomus en el Viejo mundo y Lutzomyia en el Nuevo mundo
(Esparta et al., 2000; Reguera et al., 2016). Alrededor de treinta especies de
flebótomos han sido incriminados como vectores (Otranto and Dantas-Torres,
2013). Una vez que ingresa el parásito al vector, éste llega a ser infectivo entre
los ocho y veinte días posteriores a la ingesta. La multiplicación de la
Leishmania se da en el aparato bucal del vector (Desjeux et al., 2004). Por otro
lado, varios autores (Dantas-Torres and Otranto, 2016; Reguera et al., 2016)
han reportado que otros artrópodos como Dermacentor variailis y
Rhipicephalus sanguineus pueden ser también transmisores de la
enfermedad.
Las diferentes especies de Leishmania han sido divididas en dos subgéneros:
Leishmania leishmania y Leishmania viannia, (Alvar et al., 2004; Desjeux et
al., 2004).
De acuerdo al Centro de Control y Prevención de Enfermedades de los
Estados Unidos CDC (2015), este protozoario puede generar la enfermedad
con diferentes manifestaciones clínicas. El tipo de presentación clínica que se
observa está asociada a la especie de Leishmania que infectó al individuo
(Alvar et al., 2004). De esta manera se puede presentar: 1) Leishmaniasis
cutánea, observada en humanos y caninos, causada principalmente por las
especies: Leishmania amazonensis, L. tropica; también la presentación 2)
5
Leishmaniasis mucocutánea, observada en humanos y causada
principalmente por L. braziliensis (Alvar et al., 2004; Cabral et al., 1998; Iowa
State University/College of Veterinary Medicine, 2009; Kaszak et al., 2015;
Sasani et al., 2016); finalmente, 3) la Leishmaniasis visceral, observada en
humanos y caninos, es causada en la mayoría de los casos por L. donovani.
La Leishmaniasis visceral ha causado grandes pérdidas humanas y en la
actualidad genera los mayores problemas para su control (Desjeux et al.,
2004).
2.3. Transmisión
La Leishmaniasis es una enfermedad de mucha importancia en los seres
humanos aunque también afecta a los animales silvestres y domésticos (Alvar
et al., 2004; Desjeux, 2004; Oryan and Akbari, 2016; Reguera et al., 2016).
Epidemiológicamente, se han establecido dos formas de transmisión de la
enfermedad al ser humano; primero, la enfermedad es de tipo zoonósico, en
donde el canino es el origen de la parasitosis siendo considerado como un
hospedador accidental la ser humano (Esparta et al., 2000; Sasani et al.,
2016); y segundo, en donde se establece al ser humano como hospedador
directo de la enfermedad (Desjeux et al., 2004).
El ciclo de vida de Leishmania spp. inicia con la picadura del mosquito, cuando
absorbe los amastigotes de un individuo infectado; éstos migran hasta la
válvula estomodeal del mosquito madurando a promastigotes (estado
infectivo). Cuando el mosquito vuelve a picar al hospedador, inocula los
promastigotes que ingresan en el flujo sanguíneo del hospedador. En el
organismo del hospedador, el parásito es fagocitado principalmente por los
macrófagos; en su interior, los promastigotes se transforman a su estadio
intracelular aflagelado (fase amastigote), los cuales se multiplican
intracelularmente hasta romper la célula y liberar los amastigotes al torrente
6
sanguíneo (Esparta et al., 2000; Iowa State University/College of Veterinary
Medicine, 2009; Kaszak et al., 2015; Loría-Cervera and Andrade-Narváez,
2014); el ciclo finaliza y continua cuando el mosquito vuelva a picar y absorber
los amastigotes.
La Leishmaniasis ha sido ampliamente estudiada en los seres humanos
(Buxbaum, 2013; Chang and Dwyer, 1976; Oryan and Akbari, 2016; Torrecilha
et al., 2016) y muy poca importancia se le ha dado a la parasitosis en otras
especies como los caninos (Iowa State University/College of Veterinary
Medicine, 2009; Oliveira et al., 2016; Reguera et al., 2016). El perro es
considerado como uno de los principales animales de sangre caliente
afectados por este parásito (Cruz-Chan et al., 2014; Esparta et al., 2000;
López-Céspedes et al., 2012; Sasani et al., 2016); aunque, también han sido
reportadas otras especies animales como gatos, equinos, y algunas especies
de mamíferos silvestres; mientras que, en porcinos, ovinos y ganado se ha
detectado la presencia de anticuerpos contra Leishmania spp. (Dantas-Torres
et al., 2010).
Varios autores identifican a los caninos domésticos como una especie
importante dentro del ciclo de Leishmania spp. (Dantas-Torres et al., 2010;
Esparta et al., 2000), ya que es considerado como un reservorio adecuado
para Leishmaniasis (Trevisan et al., 2015), a pesar de esto, no ha sido
totalmente esclarecido el papel de los perros ya que su infestación podría ser
meramente accidental (Figueredo et al., 2012). De acuerdo a Otranto y
Dantas-Torres, (2013), el perro es un elemento importante en la epidemiologia
de la Leishmaniasis visceral por su estrecha relación con la naturaleza donde
habita el vector y el hombre.
7
2.4. Signos Clínicos
Los signos que se identifican en los animales con Leishmaniasis visceral no
son patognomónicos de la enfermedad, sin embargo, se puede observar
letargia, pérdida de peso, esplenomegalia, alteraciones en la coagulación
sanguínea con hematuria, epistaxis y melena (Iowa State University/College of
Veterinary Medicine, 2009). También se pueden presentar infestaciones
asintomáticas en periodos largos de tiempo (Cruz-Chan et al., 2014). En la
evaluación clínico patológica de perros infectados con L. infantum se ha
observado trombocitopenia, anemia, pancitopenia, leucopenia, azotemia,
hipoalbuminemia, hiperproteinemia y en algunos casos proteinuria (Silvestrini
et al., 2016).
En el caso de la Leishmaniasis americana, los caninos tienen una presentación
clínica de la enfermedad caracterizada principalmente por el aparecimiento
inicial de nódulos en la zona donde ocurrió la picadura con despigmentación y
áreas alopécicas; también se identifica eritema en las zonas de inoculación del
parásito y, el animal puede presentar cuadros de pirexia (Cruz-Chan et al.,
2014; Iowa State University/College of Veterinary Medicine, 2009)
2.5 Respuesta Inmunitaria
La respuesta inmunitaria que presentan los caninos ante la infestación del
parásito puede ser variable (Alvar et al., 2004). Leishmania spp. son parásitos
obligados, por lo cual infectan macrófagos, neutrófilos del individuo (Iowa State
University/College of Veterinary Medicine, 2009). Los niveles de las diferentes
inmunoglobulinas pueden ser valoradas en el canino para poder establecer la
respuesta inmune en base a su estado de salud (Cruz-Chan et al., 2014).
Estudios realizados en animales naturalmente infectados han demostrado que
la producción de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 es variable entre los individuos
enfermos (Alvar et al., 2004), también animales naturalmente infectados y
8
animales vacunados contra Leishmania spp. presentan diferentes niveles de
estas inmunoglobulinas (De Oliveira Mendes et al., 2003). Estos dos isotipos
podrían ser dos indicadores de estatus clínico del animal en presencia de
leishmaniasis canina (Cardoso et al., 2007). Varios ensayos experimentales
han demostrado la presencia de una respuesta Th2 (IgG2) ante la presencia
del parásito en el animal, presentándose en mayor cantidad durante el período
de incubación y presentación o no de signos clínicos (Alvar et al., 2004;
Fernández-Pérez et al., 2003). Del mismo modo, se ha reportado el
aparecimiento de la inmunoglobulina IgG2 anti-leishmania en mayor cantidad
en animales asintomáticos, mientras que la inmunoglobulina tipo IgG1 ha sido
relacionada con la respuesta protectiva ante la enfermedad (Alvar et al., 2004).
2.6. Diagnóstico
El diagnóstico de la leishmaniasis en animales se ejecuta a través de estudios
clínicos, inmunológicos y moleculares. Los diferentes métodos de laboratorio
incluyen procesos de inmunodiagnóstico como Western Blot, Ensayo
inmunológico ligado a enzimas (ELISA) de respuesta a antígenos o
anticuerpos, inmunofluorescencia directa, aglutinación indirecta,
hemaglutinación indirecta, inmunodifusión (Trevisan et al., 2015). También
existen métodos de diagnóstico clínico-patológicos, como la aspiración del
material en lesiones cutáneas, la observación directa del parásito por tinción
de Giemsa o con tinción Wrigth; la cual, es usada ampliamente para la
detección de los amastigotes observados en el núcleo de macrófagos (Iowa
State University/College of Veterinary Medicine, 2009). Se han desarrollado
varios tipos de diagnóstico moleculares como PCR en tiempo real, PCR-RFLP
y secuenciamiento de los espaciadores ribosomales (Dantas-Torres et al.,
2010; Esparta et al., 2000; Francino et al., 2006; Montalvo et al., 2010), para
la confirmación de la enfermedad y la identificación de la especie de
Leishmania spp. Este tipo de pruebas son consideradas como las más
9
sensibles y utilizan muestras de sangre, biopsias de piel o de linfonodos, pero
al ser procedimientos con alta sensibilidad y especificidad tienen costos altos
y requieren mayor tiempo para la obtención de resultados (Ferroglio et al.,
2007; Trevisan et al., 2015). Sin embargo, para la evaluación de la enfermedad
en zonas endémicas, la detección de anticuerpos de Leishmania por medio de
pruebas de serodiagnóstico han dado buenos resultados citando como
apropiadas las técnicas de Western Blot y ELISA (López-Céspedes et al.,
2012).
2.7. Medidas preventivas y de control
Existen diferentes medidas de control de la enfermedad en caninos, por
ejemplo, se pueden encontrar en el mercado vacunas que se han desarrollado
para la prevención de la enfermedad, como lo reportadas en zonas endémicas
de Brasil (De Oliveira Mendes et al., 2003; Reguera et al., 2016);
desafortunadamente, este tipo de prevención no evita que el animal sea picado
por los mosquitos vectores (Dantas-Torres and Otranto, 2016). Por otro lado,
también existen diferentes tipos de insecticidas como piretroides (Bray and
Hamilton, 2013; David et al., 2001; Oryan and Akbari, 2016), que se aplican a
los caninos para evitar la picadura de insectos, estos se los encuentra en
diferentes presentaciones como pipetas, collares o spray (Figueredo et al.,
2012). También en zonas endémicas a Leishmaniasis visceral como en Brasil,
se manejan políticas de eutanasias a aquellos animales que han dado como
positivos a la enfermedad (Trevisan et al., 2015; Dantas-Torres et al., 2010).
10
CAPITULO III
METODOLOGÍA
3.1. Ubicación de zonas de estudio
La investigación fue desarrollada en el Instituto de Investigación en Salud
Pública y Zoonosis (CIZ) en los laboratorios de Inmunodiagnóstico, ubicado
en el edificio del Hospital del Día de la Universidad Central del Ecuador.
3.2. Diseño de la investigación
La investigación es de tipo experimental, donde se evaluó la respuesta inmune
humoral de los caninos frente a los antígenos de Leishmania spp. Con este fin,
se emplearon sueros caninos en pruebas de ELISA indirecto y ensayo de
Western Blot para la evaluación de la presencia de anticuerpos anti-
Leishmania mexicana de los isotipos IgG1 e IgG2; en el cuál se determinó como
variable dependiente la presencia de las inmunoglobulinas y como variable
independiente la enfermedad en perros infectados naturalmente con
Leishmania spp.
3.3. Población de Estudio y Unidades de Muestreo
En total, se analizaron 42 sueros procedentes de caninos divididos en 3 grupos
(Tabla 1):
Grupo Positivo Endémico.- la población estudiada fueron 14 sueros
sanguíneos, procedentes de 14 caninos machos y hembras diagnosticados
positivos por frotis sanguíneo y confirmados mediante la técnica de PCR.
11
Grupo Negativo Endémico.- incluyeron 14 sueros caninos diagnosticados
como negativos mediante las técnicas de frotis sanguíneo y PCR. Estos dos
grupos de sueros proceden de las siguientes zonas endémicas: provincia de
Sucumbíos, parroquia de Aguas Negras (total 8 sueros); provincia de
Pichincha, parroquia Pedro Vicente Maldonado (total 7 sueros); provincia de
Orellana, parroquia García Moreno (total 9 sueros) y provincia de Napo,
parroquia de Gonzalo Díaz de Pineda (total 4 sueros). Los sueros fueron
analizados con la técnica de frotis sanguíneo donde se identificó la presencia
de amastigotes y todas las muestras identificadas como positivas fueron
sometidas a PCR-del espaciador interno del transcrito ribosómico (ITS) para
confirmar su positividad, información obtenida de los registros del CIZ (Anexos
2 y 3).
Grupo Negativo No Endémico.- un grupo de 14 sueros provenientes de perros
sin antecedentes de haber viajado a zonas endémicas, obtenidos en la ciudad
de Quito, área no endémica a la parasitosis. Las muestras fueron colectados
en la clínica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
Universidad Central del Ecuador (Anexos 2 y 3).
Tabla 1. Cantidad de sueros caninos totales y clasificación
PCR Total Muestras Observaciones
+ 14 Zona Endémica
- 14 Zona Endémica
- 14 Zona No Endémica
Total 42
Elaborado por: La Autora
3.4. Materiales
Los materiales utilizados son detallados en Anexo 1.
12
3.5. Método
3.5.1. Extracto de antígenos
Para la obtención del extracto de antígenos se empleó un cultivo de
Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel 21), proporcionado por La Fundación
Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), (Caracas-Venezuela). Una alícuota
conteniendo 107 parásitos/ml crio preservados a -70 ºC, fueron cultivados en
medio Schneider más 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor. Luego
de cuatro días se valoró la viabilidad del cultivo. Posteriormente, los parásitos
fueron colocados en tubos eppendorf, se centrifugaron a 15.000 r.p.m. por un
minuto con el fin de concentrar los parásitos.
Más tarde, se procedió a preparar el extracto de L. mexicana. Los parásitos
fueron lavados con una solución de NaCl, Na2PO4, NaH2PO4 y Glucosa; y se
retiró todo residuo del medio de cultivo. Los parásitos fueron lisados por
sonicación a 4 ºC en una solución 10 mM Tris-HCl pH 8 más 0.5M EDTA, SC-
29131 y agua ultra destilada. El SC-29131 es un compuesto de inhibidores de
proteasas; al estar presentes en la Leishmania por sonicación son liberadas y
podrían destruir las proteínas del extracto. Luego con la ayuda de Qubit® se
midió la cantidad de proteína. Posteriormente, éste material se lo llevó a una
concentración de 300 µg de proteína y se añadió dodecilsulfato sódico (SDS)
para desnaturalizar las proteínas y se lo calentó durante cinco minutos a 100
ºC obteniendo proteínas lineales.
3.5.2. Detección de anticuerpos IgG1 e IgG2 por Western Blot
Para el ensayo de Western Blot, se preparó un gel de poliacrilamida para
electroforesis (SDS-PAGE) descrita por Laemmli (1970).
En la preparación del gel para la electroforesis se utilizaron placas de 1.5 mm
de grosor. Se prepararon los geles con las siguientes especificaciones: se
13
realizó el gel de resolución al 10 % de acrilamida con 1 % de sodio dodecil
sulfato (SDS), en buffer 10 mM Tris-HCl pH 8.8 y polimerizado con 5 µg
UltraPureTM Temed (invitrogen Lote No. 031101360) en presencia de 5 µg
amonio per sulfato (APS) como catalizador. El gel de apilamiento fue
elaborado al 5 % de acrilamida con 0,5 % de SDS, en buffer 1 M Tris-HCl pH
6,8 y polimerizado con 5 µg UltraPureTM Temed (invitrogen Lote No.
031101360) en presencia de 5 µg APS como catalizador.
Se ensamblaron los geles en las placas de vidrio de la cámara de
electroforesis, vertiendo cuidadosamente, primero el gel de resolución por los
bordes de las placas de vidrio. Luego se procedió a ensamblar el gel de
apilamiento sobre el gel de resolución. Se colocó una peinilla con un pocillo de
10 µl. Se vertió la solución sobre el molde evitando la formación de burbujas.
Se dejó reposar hasta la polimerización del gel; más tarde, se retiró la peinilla,
y montó la placa en el equipo de electroforesis conjuntamente con buffer de
corrido preparado con 25 mM de Tris, 190 mM de glicina y 0,1 % SDS con pH
8,3 (Anexo 4). Posteriormente, se cargó el marcador de peso molecular en el
pocillo formado en el gel de apilamiento; se utilizó 5 µl del marcador SeeBlueR
Plus2 Prestained Estándar (invitrogen Lote No. 1024679) y se adicionó la
misma cantidad de buffer de muestra conformado por una solución de 250 mM
Tris-HCl pH 6,8 con 30 % de glicerol y 5x103 % de azul de bromofenol.
Luego se preparó el extracto de antígenos: se tomó 300 µg del extracto de
Leishmania mexicana en un tubo eppendorf de 1 ml. Se calentó la muestra
durante un minuto a 100 °C, y se lo vertió en el segundo pocillo del gel de
apilamiento. Se realizó el corrido de las proteínas a 50 V durante 5 min hasta
que las proteínas y el marcador se alineasen en el gel de apilamiento. Luego,
se incrementó el voltaje a 180 V hasta que las proteínas recorran el gel de
resolución. Para la visualización de las proteínas se utilizó Coomassie blue R-
250 o se transfirieron a papel de nitrocelulosa para la inmuno detección.
14
Transferencia: Se realizó la transferencia según el método descrito por Towbin
et al., (1979), las proteínas fueron transferidas desde el gel a papel de
nitrocelulosa (Invitrogen Lote No. 11373551), para lo cual se ensambló el gel
con el papel de nitrocelulosa a manera de sándwich. Primero, se colocó una
esponja, luego el papel filtro (Invitrogen Lote No. 11373551) sobre el cual se
colocó el papel de nitrocelulosa, después se colocó el gel con las proteínas y
sobre el gel un segundo papel filtro y otra esponja. Se retiró todas las burbujas
entre las diferentes capas para evitar problemas durante la transferencia. Las
proteínas fueron atrapadas en el papel de nitrocelulosa mediante cambios de
carga, el movimiento fue de zona positiva a zona negativa. Posteriormente, se
procedió a cortar tiras de 2 mm de espesor, del papel, cuidando de no
manipular la superficie donde se encontraban las proteínas. Cada tira con las
proteínas fue marcada con un número de referencia para la identificación de
la muestra (Anexo 5 y 6). Bloqueo: Se colocó cada tira en un tubo de vidrio
con tapa y se bloqueó cada una con la solución de buffer 20 mM Tris pH 7,5
con 150 mM de NaCl y 0,1 % Tween20 (TBS-T) adicionado con 5 % de leche
descremada. Incubación: se dejó en incubación cada tira, durante una hora en
agitación constante. Lavado: Se lavó cada tira de nitrocelulosa tres veces con
la solución de TBS-T previamente preparada, durante cinco minutos en
agitación constante para retirar los residuos de la solución de bloqueo (Anexo
7 y 8). Incubación primaria: Se incubó durante una hora en agitación constante
cada tira con cada uno de los 42 sueros a una concentración de 1:100 en buffer
TBS-T (Anexo 9). Lavado: Luego del proceso de incubación, las tiras fueron
lavadas tres veces con la solución de TBS-T durante cinco minutos en
agitación constate para retirar los residuos del suero. Incubación secundaria:
Finalmente, se incubó los anticuerpos caninos Antidog IgG1 (Bethyl
laboratorios inc. Lote No. A40-120P-20) disuelto 1:10,000 en buffer TBS-T ó
Antidog IgG2 (Bethyl laboratorios inc. Lote No. A40-121P-21) disuelto 1:10,000
en buffer TBS-T; cada isotipo fue evaluado por separado. Se realizó la
incubación toda la noche a temperatura ambiente. Lavado: Luego del proceso
15
de incubación, las tiras fueron lavadas tres veces con la solución de TBS-T
durante cinco minutos en agitación constate para retirar el exceso de
anticuerpo. Lectura de resultados: Para la observación de las bandas se
adicionó Tris-HCl, y el sustrato ClarityTM Western ECL Substrate (Lote
No.102030454) que permitió observar las bandas reveladas (Anexos 10 y 11).
Luego se procedió a determinar el peso molecular de cada una de las bandas
reconocidas mediante la técnica descrita por Garfin (2009) (Anexo 12) .
3.5.3. Detección de anticuerpos IgG1 e IgG2 por ELISA indirecto
Las 42 muestras de suero sanguíneo canino también fueron analizadas con la
técnica serológica ELISA indirecto descrito por Carson y colaboradores (2010)
y Solano-Gallego y colaboradores (2003) que se detalla a continuación:
Sensibilización de placas: Cada pocillo de las placas de ELISA fue
sensibilizado con una concentración de 2x107 parásitos/ml. Los parásitos
previamente fueron lavados con una solución de buffer fosfato salino (PBS
OXOID BR0014G), más glucosa al 2 % y formaldehído al 1 %. Posteriormente,
la solución fue centrifugada a 2500 r.p.m. durante 10 min y re-suspendidos en
un buffer de carbonato bicarbonato (Sigma C3041). Se colocó 2x106 parásitos
(100 µl) por pozo en los 96 pozos de la placa de polipropileno y, se incubó
durante una hora a 37 ºC en una cámara húmeda. Lavado: Se preparó la
solución de lavado (PBS + 0.05 % de Tween20) en concentración 1X; se lavó
tres veces por cinco minutos en agitación para retirar el exceso de antígeno.
Bloqueo: las placas fueron bloqueadas con 200 µl de PBS más Tween20
(PBS-T) con 5 % de leche descremada como agente de bloqueo. Se incubó
en cámara húmeda durante toda la noche a temperatura ambiente. Lavado:
Con la solución de lavado PBS-T 1X, se lavó tres veces por cinco minutos en
agitación para retirar el exceso de solución de bloqueo. Sueros: los sueros
contienen los anticuerpos contra leishmania. Los sueros fueron disueltos a una
16
concentración de 1:100 en solución de PBS-T más 150 mM de cloruro de sodio
para evitar uniones inespecíficas. Lavado: Se lavó tres veces cada uno por
cinco minutos en agitación constante para retirar el exceso de suero.
Conjugado: Se agregaron 100 µl de la solución conjugado, Antidog IgG1
(Bethyl laboratorios inc. Lote No. A40-120P-20) a concentración 1:40,000 o
Antidog IgG2 (Bethyl laboratorios inc. Lote No. A40-121P-21) a concentración
1:80,000, en solución de PBS-T de acuerdo a las especificaciones del
fabricante. En cada pocillo se colocó 100 µl de esta solución y se incubó en
cámara húmeda, durante 1 hora a 37 °C. Lavado: Se retiró el exceso de
conjugado mediante tres lavados de cinco minutos en agitación constante.
Revelado y Lectura: Se dispensó 200µl, de solución sustrato de peroxidasa, o-
fenilenidiamina dihidrocloro (OPD) (Lote No. 080M8204) más peróxido de
hidrógeno, a cada pocillo. Posteriormente, la placa se incubó durante 30 min
a temperatura ambiente. Se realizó la medición mediante el lector de ELISA a
450 nm.
Para analizar los resultados de la prueba ELISA se estableció el punto de corte
entre los valores positivos y negativos de los sueros de la zona endémica. Se
calculó el promedio y la desviación estándar (DS) entre las densidades ópticas
del grupo de sueros negativos no endémicos (De Savigny y Voller, 1980) como
se muestra en la siguiente formula:
!" = $%&'.)*+, + 3)/+,
PC: punto de corte, DO: densidad óptica, DS: desviación estándar, Sn: sueros negativos no endémicos.
3.6. Análisis matemáticos y estadísticos
Los resultados del ensayo de Western Blot permitieron el reconocimiento de
bandas que se revelaron en las tiras del papel de nitrocelulosa, mediante la
17
valoración de la frecuencia de repetición de estas bandas se identificaron los
antígenos relevantes característicos de la respuesta inmune Th1 y Th2.
Además, se analizaron los resultados obtenidos de los sueros positivos de
zona endémica (PE-PCR positivos) y negativos de zona endémica (NE-PCR
negativos), mediante pruebas de correspondencia Kappa, entre los valores de
absorbancia obtenidos en el ELISA indirecto y los sueros con bandas
reveladas en el Western Blot.
18
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Extracto de Leishmania mexicana
Para la valoración del extracto de Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel
21), se observó mediante el microscopio, motilidad de los parásitos a las 24
horas, 48 horas y 72 horas de crecimiento del cultivo. También, con una
cámara de Neubauer se calculó la concentración de los parásitos
obteniéndose 2,6 x 107 parásitos/ml. Posteriormente, los parásitos fueron
colocados en tubos eppendorf, se centrifugaron a 3.000 r.p.m. por un minuto
con el fin de concentrarlos.
Finalmente, los parásitos lisados por sonicación, llegaron a una concentración
de proteína de 3,1 mg/ml. Las proteínas desnaturalizadas se separaron
mediante la electroforesis en el gel de poliacrilamida (Anexo 13).
El extracto de parásitos y los parásitos formolizados fueron utilizados en los
ensayos de Western Blot y de ELISA indirecto, respectivamente.
4.2. Identificación de las bandas reveladas en Western Blot con isotipo
IgG1 y evaluación de la respuesta inmune mediante ELISA indirecto.
La evaluación de los niveles de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 en los estudios
de respuesta inmune de los caninos ante la leishmaniasis ha sido descrita
anteriormente en investigaciones realizadas por Ulrich y colaboradores,
(1995); Iniesta y colaboradores, (2007) y Neto y colaboradores, (2010), en los
cuales observaron una variación de la respuesta inmunológica entre IgG1
(Th1) e IgG2 (Th2) en grupos de caninos expuestos al parásito Leishmania sp.
de manera natural y experimental.
19
En la prueba de Western Blot realizada en este estudio, se lograron develar
bandas del isotipo IgG1 entre los sueros de la zona endémica. La inmuno-
tinción de la electro-transferencia de las proteínas del extracto (homogenato)
de Leishmania mexicana reveló varios polipéptidos con masas moleculares
calculadas entre los 113 kDa a 6 kDa. De las cuales se observó la frecuencia
de repetición; se obtuvieron veintiuno (21) de los veintiocho (28) sueros de la
zona endémica con polipéptidos inmuno-reconocidos de Leishmania
mexicana, lo cual correspondió al 75 %.
De los veintiuno sueros, 13 pertenecen al grupo positivos endémicos (PE-PCR
positivos) el 93 %; y 8 sueros pertenecen al grupo de negativos endémicos
(NE-PCR negativos) que corresponde al 57%.
Las bandas reveladas con mayor frecuencia tienen los siguientes pesos
moleculares: 58 kDa (6 sueros), 53 kDa (6 sueros), 43 kDa (10sueros), 10 kDa
(10 sueros), 7,3 kDa (8 sueros), 6 kDa (9 sueros), 5 kDa (10 sueros), 4,3 kDa
(7 sueros). También se pudieron identificar las otras bandas polipeptídicas con
los siguientes pesos moleculares: 113 kDa,104 kDa, 95 kDa, 83 kDa, 80 kDa,
73 kDa, 51 kDa, 47 kDa, 36 kDa, 33 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 17 kDa, 15,5 kDa,
14 kDa, 12 kDa, 11 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6,4 kDa, 4,5 kDa, 4,2 kDa como
se muestra en las Tabla 2 y Figura 1. Previamente, Fernández-Pérez (2003)
en su estudio sobre leishmaniasis visceral, reportó la presencia de
polipéptidos reconocidos identificando el antígeno de 67 kDa de peso
molecular, utilizando la inmunoglobulina anti-leishmania IgG1, como la banda
de mayor frecuencia de reconocimiento y mencionó el aparecimiento de
bandas con pesos moleculares entre 10 y 67 kDa (Anexo 14).
También, en este estudio se observó diferencia de reactividad entre las bandas
reconocidas. Se observó mayor reactividad entre los polipéptidos identificados
en las muestras positivas endémicas a diferencia de las bandas reveladas en
las muestras negativas endémicas. Esta variación de reactividad indica
diferencias de concentración de anticuerpos en los sueros de los animales, lo
cual puede estar asociado a la etapa de la infección en la que se encuentra el
20
animal, o a la reacción inmunológica de los animales expuestos al parásito
(Fernández-Pérez et al., 2003; Zaragoza et al., 2003).
De acuerdo a los resultados de correlación por la prueba Kappa entre los
polipéptidos de mayor frecuencia revelados y los verdaderos positivos
endémicos considerados en el estudio, se puede observar una correlación
discreta para las masas moleculares de 43 kDa, 10 kDa, 6 kDa y 5 kDa (Tabla
2). Mientras que para la banda de 7,3 kDa revelada no se presentó correlación
(Anexo 17).
Tabla 2. Frecuencia de inmunoreconocimiento de polipéptidos de Leishmania mexicana por anticuerpos de perros del isotipo IgG1
Ref PM(kDa)
Frecuencia
Ref. PM(kDa)
Frecuencia
Ref PM(kDa)
Frecuencia
PCR+ PCR- PCR+ PCR- PCR+ PCR-
1 113 4/14 1/14 12 36 5/14 0/14 23 8 1/14 0/14
2 104 2/14 0/14 13 33 2/14 3/14 24 7,3 5/14 3/14
3 95 2/14 1/14 14 30 2/14 0/14 25 7 2/14 0/14
4 83 4/14 1/14 15 20 3/14 0/14 26 6,4 1/14 1/14
5 80 5/14 0/14 16 17 1/14 0/14 27 6 6/14 3/14
6 73 0/14 3/14 17 15,5 3/14 0/14 28 5 7/14 3/14
7 58 6/14 0/14 18 14 2/14 0/14 29 4,5 5/14 0/14
8 53 6/14 0/14 19 12 2/14 0/14 30 4,3 4/14 3/14
9 51 1/14 0/14 20 11 3/14 0/14 31 4,2 5/14 1/14
10 47 1/14 0/14 21 10 7/14 3/14
11 43 7/14 3/14 22 9 1/14 0/14
Identificación de bandas: Ref. Referencia de banda en la fig. 1.; PM: peso molecular (kDa).
Elaborado por: La Autora
21
Figura 1. Identificación de los polipéptidos que generan respuesta del isotipo IgG1 en perros frente a antígenos de leishmania. Muestras: sueros positivos endémicos (1-14), sueros negativos endémica (15-28) y sueros negativos no endémica (29- 42).
Elaborado por: La Autora
22
En este estudio también se aplicó un ELISA indirecto como prueba adjunta a
la valoración de la respuesta inmune. En este ensayo el punto de corte (PC)
para el isotipo IgG1 fue calculado con el promedio de los sueros negativos de
zonas no endémicas y el valor obtenido fue 0,120 nm.
De los 28 sueros sometidos a ELISA indirecto, 14 sueros se localizaron con
valores de absorbancia superiores al punto de corte, correspondientes al 50
%. De estas 14 muestras, 8 pertenecen al grupo de sueros positivos
endémicos (67 % del grupo PE-PCR positivo) y 6 pertenecen al grupo de
sueros negativos endémicos (43 % del grupo NE-PCR negativo) (Anexo 16).
Esta variación de respuesta inmunológica para el isotipo IgG1, indica que el 50
% de caninos tienen valores de absorbancia >0,120 nm (PC) presentando así
la respuesta inmunológica humoral de tipo Th1. Esta clase de respuesta se
presenta ante una reacción de tipo protectiva del animal (Fernández-Pérez et
al., 2003; Cruz-Chan et al., 2014). También, De Oliveira Mendes y
colaboradores (2003), evidenció la presencia de inmunoglobulinas IgG1 en
animales naturalmente infectados y asintomáticos, e identificó la capacidad
para contener la enfermedad. También un estudio previo realizado por
Fernández-Pérez y colaboradores (2003), obtuvieron niveles superiores de la
inmunoglobulina IgG1 en perros infectados naturalmente con leishmaniasis sin
presencia de signos clínicos. Por otro lado, Iniesta (2003) reportó la presencia
de respuesta inmune de tipo Th1, en perros diagnosticados como negativos,
en donde mencionó la presencia de animales asintomáticos con mayor
cantidad de inmunoglobulinas del tipo IgG1, en animales diagnosticados como
negativos por pruebas de PCR.
Mientras tanto, se obtuvo 14 sueros con valores de absorbancia por debajo del
punto de corte correspondientes al 50 %, los cuales no presentan una
respuesta inmune aparente por la técnica de ELISA indirecto.
23
El valor de coeficiente Kappa calculado fue de 0,140 obtenido entre los
resultados del Western Blot y ELISA indirecto para la inmunoglobulina tipo IgG1
(anexo 19) Lo cual indica correlación insignificante entre ambos resultados.
Esto puede deberse a los diferentes antígenos utilizados para cada una de las
pruebas realizadas; en la prueba de Western Blot se realizó el análisis de las
bandas de polipéptidos utilizando como antígeno el extracto completo del
parásito, mientras que en la prueba de ELISA indirecto se utilizaron los
antígenos de superficie GP-63 (parásito completo formolizado). Por lo cual, no
se puede esperar una relación directa de los resultados de cada uno.
4.3. Identificación de las bandas reveladas en Western Blot con isotipo IgG2 y evaluación de la respuesta inmune mediante ELISA indirecto.
Los 28 sueros también fueron evaluados por Western Blot con el isotipo IgG2,
en donde se revelaron bandas de polipéptidos específicos para Leishmania
mexicana en 28 sueros y correspondió al 100 % de sueros de la zona
endémica (14 PE-PCR positivos y 14 NE-PCR negativos).
Como muestra en la Figura 2, se identifica menor reactividad en las bandas
reveladas pero mayor número de polipéptidos reconocidos. Las bandas
reveladas con mayor frecuencia tienen las siguientes masas moleculares: 91
kDa (8 sueros), 70 kDa (6 sueros), 51 kDa (6 sueros), 39 kDa (10 sueros), 38
kDa (9 sueros), 34 kDa (9 sueros), 21 kDa (6 sueros) y 11 kDa (6 sueros).
Entre las bandas reconocidas también se presentó mayor reactividad entre los
polipéptidos identificados en las muestras positivas endémicas a diferencia de
las bandas reveladas en las muestras negativas endémicas. Esta menor
reactividad puede sugerir que los animales mantienen niveles de respuesta
inmune bajos, pero constantes ante la presencia del parásito (Solano-Gallego
et al., 2003). En estudios anteriores, Fernández-Pérez (2003) analizó los
anticuerpos de tipo IgG en perros con Leishmaniasis visceral, y reportó la
24
presencia de polipéptidos entre las masas moleculares de 26, 29, 34, 42, 45,
50-57 kDa mayormente reconocidos con inmunoglobulina anti-leishmania
IgG2. En este trabajo también se identificó la banda de 34 kDa, la cual se
presentó solamente entre las muestras positivas de zona endémica. La
presencia de bandas de polipéptidos con repeticiones en la mayoría de
muestras evaluadas sugieren la presencia de polipéptidos específicos en el
extracto que podrían servir de referencia para el diagnóstico de la
Leishmaniasis canina.
En los resultados, también se lograron identificar bandas de: 83 kDa, 61 kDa,
53 kDa, 47 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 20 kDa, 19 kDa, 17
kDa, 16 kDa, 15 kDa, 14 kDa, 12 kDa, 10,4 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa,
6,7 kDa con menor frecuencia de repetición entre los sueros (Anexo 15).
De acuerdo a los resultados de correlación por la prueba Kappa entre los
polipéptidos de mayor frecuencia revelados y los verdaderos positivos
endémicos considerados en el estudio se puede observar una correlación
discreta para la masa molecular de 91 kDa, mientras que no existió correlación
con las masas moleculares de 39 kDa y 38 kDa (Tabla 3). Sin embargo, se
observó que la banda de polipéptido de 34 kDa tuvo correlación sustancial con
un valor de coeficiente kappa de 0,6429 (Anexo 18).
25
Tabla 3. Frecuencia de inmunoreconocimiento de polipéptidos de Leishmania
mexicana por anticuerpos de perros del isotipo IgG2
Ref. PM(kDa)Frecuencia
Ref. PM(kDa)Frecuencia
PCR+ PCR- PCR- PCR+
1 91 6/14 2/14 17 20 0/14 1/14
2 83 2/14 0/14 18 19 5/14 0/14
3 70 3/14 3/14 19 17 1/14 0/14
4 61 1/14 3/14 20 16 1/14 0/14
5 53 2/14 2/14 21 15 2/14 2/14
6 51 5/14 1/14 22 14 0/14 1/14
7 47 2/14 2/14 23 12 2/14 1/14
8 43 1/14 0/14 24 11 3/14 3/14
9 39 7/14 7/14 25 10,4 1/14 0/14
10 38 3/14 6/14 26 10 4/14 0/14
11** 34 9/14 0/14 27 9 2/14 0/14
12 30 1/14 2/14 28 8 1/14 0/14
13 29 4/14 0/14 29 7 3/14 0/14
14 24 2/14 2/14 30 6,7 1/14 1/14
15 23 4/14 0/14
16 21 4/14 2/14
Identificación de bandas: Ref. Referencia de banda en fig. 4.2.; PM: peso molecular (kDa).
Elaborado por: La Autora
26
Figura 2. Identificación de los polipéptidos que generan respuesta del isotipo IgG2 en perros frente a antígenos de leishmania Muestras: sueros positivos endémicos (1-14), sueros negativos endémica (15-28) y sueros negativos no
endémica (29-42) + banda de mayor frecuencia (34 kDa). Elaborado por: La Autora
27
Para el isotipo IgG2, también se aplicó a las 28 muestras una prueba ELISA
indirecto como complemento de estudio. Con lo cual permitió evaluar si se
presentó una respuesta inmune de tipo Th2. El valor calculado del punto de
corte fue de 0,935nm que fue calculado con el promedio de los valores de
absorbancia obtenidos de los sueros negativos de zona no endémica.
De los 28 sueros de zona endémica, se obtuvo como resultado un (1) suero,
del grupo de positivos endémicos (PE-PCR positivos), con valor de
absorbancia por encima del punto de corte (anexo 16). Este suero representó
el 5% y evidenció una reacción inmune de tipo Th2, evidenciando la presencia
de infección activa (Fernández-Pérez et al., 2003). De acuerdo a estudios
previos realizados por Reis y colaboradores (2006) y Cruz-Chan y
colaboradores (2014) la presencia de la respuesta Th2 ante la leishmaniasis
canina es un indicador de infección activa y esta relacionada con la mayor
susceptibilidad del animal a la enfermedad (Fernández-Pérez et al., 2003;
Solano-Gallego et al., 2001). También se ha observado este tipo de repuesta
Th2 en animales con altas cargas del parásito circulante (Reis et al., 2006).
Los sueros restantes (41) tuvieron valores de absorbancia menores al punto
de corte, lo cual muestra que no existió respuesta ante los antígenos. De
acuerdo al estudio realizado por Iniesta y colaboradores (2007) y Solano-
Gallego y colaboradores (2001) se menciona que el uso del extracto purificado
de los parásitos en el ensayo de ELISA indirecto presenta mejores resultados
para identificar las diferentes inmunoglobulinas IgG.
El coeficiente kappa calculado entre los resultados obtenidos de las pruebas
Western Blot y ELISA indirecto para la inmunoglobulina IgG2 fue insignificante.
Este resultado se debe a la diferencia entre los antígenos utilizados para cada
28
una de las pruebas, similar a los resultados obtenidos con la inmunoglobulina
IgG1 (Anexo 20).
Finalmente, en este trabajo de investigación, se logró identificar la presencia
de una banda polipeptídica de 34 kDa con la inmunoglobulina IgG2 mediante
la prueba de Western Blot con alto grado de correlación con el grupo de
muestras positivas endémicas. Este polipéptido ya fue descrito anteriormente
en un estudio en caninos infectados con Leishmania infantum utilizando el anti-
anticuerpo IgG2 (Fernández-Pérez et. al. 2003). Es así que, se podría llegar a
considerar a este polipéptido como un posible marcador de la presencia del
parásito en caninos, para lo cual se deberian plantear trabajos posteriores para
evaluar esta proteína y purificarla. También con la evaluación mediante la
prueba ELISA indirecto se observó principalmente una respuesta de tipo
protectiva IgG1 (Th1) en los caninos de zonas endémicas. Este tipo de
respuesta se presenta en animales sin presencia de sintomatología clínica y
procedentes de zonas endémicas a la leishmaniasis. Con lo cual, se sugiere
proponer que los caninos procedentes de estas zonas en el Ecuador están
logrando controlar la enfermedad o la superan en etapas tempranas de
infección evitando así el aparecimiento de signos clínicos.
Para poder establecer la Leishmaniasis canina como una potencial zoonosis
en el Ecuador se deben considerar varios factores referentes a la enfermedad,
como la preferencia alimentaria del vector; la capacidad de los caninos para
superar la enfermedad y valorar el estatus clínico e inmunológico de los
animales asintomáticos identificando si mantienen al parásito o si lo eliminan.
Se plantea como hipótesis: si los caninos de zonas endémicas en el Ecuador
tienen la capacidad de superar la infección con Leishmania sp., para lo cual se
debería evaluar también la presencia de citoquinas Th1 y realizar un estudio
de la evolución de los animales infectados.
29
CAPITULO V
CONCLUSIONES
• Se identificaron varias bandas polipeptídicas que generaron una
respuesta de anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2 mediante la
aplicación de la prueba de Western Blot. Entre las bandas reveladas
destaca el polipéptido de 34 kDa inmuno-reconocidos por anticuerpos
del isotipo IgG2 con alto grado de correlación con las muestras positivas
endémicas.
• Se evaluó los extractos del parásito Leishmania, con lo cual se detectó
la presencia de anticuerpos del isotipo IgG1 asociado a una respuesta
de tipo protectiva mediante la prueba de ELISA. Se requiere evaluar
otros compuestos como citoquinas Th1 para corroborar la presencia de
una respuesta inmune del tipo Th1 en los caninos evaluados.
• Los resultados de las pruebas de Western Blot y ELISA en la evaluación
de la Leishmaniasis en perros infectados naturalmente no generaron
correlación significante.
30
ANEXOS
Anexo 1.
Lista de materiales utilizados en el ensayo
MATERIALES FÍSICOS
− Acrilamida − Agua destilada − Artículos de escritorio − Azul de Coomassie R-250 − Bromofenol Azul Fisher Scietific Lote 100651 - Buffer Carbonato- Bicarbonato Laboratorio SIGMA Lote C3041-
100CAP − Butanol − Canaletas de plástico − ClarityTM Western ECL Substrato Lote102030454 − Cloruro de sodio − Esponjas para cámara de electroforesis − Glicina − Guantes de nitrilo − Laminas de nitrocelulosa Invitrogen Lote. 11373551 − Leche descremada − Medio Schneider de cultivo - Micro placas para ELISA marca gagner de 96 pocillos − Papel filtro Invitrogen Lote. 11373551 - Peróxido de Hidrogeno − Persulfato de amonio − Pipeta Eppendorf de 10 ul (serie 359711Z) − Pipeta Eppendorf de 100 ul (serie 2541907) − Pipeta Eppendorf multicanal 200 ul (Serie P36854C) − Puntas 10 ul para pipeta Eppendorf − Puntas 100 ul para pipeta Eppendorf − SeeBlueR Plus2 Prestained Estándar invitrogen Lote 1024679 - Solución de Conjugado IgG1 (Peróxido de rábano con conjugado
de anticuerpo monoclonal IgG1 anti-Dog) Lote No. A40-120P-20 de los Laboratorios Bethyl
- Solución de Conjugado IgG2 (Peróxido de rábano con conjugado de anticuerpo monoclonal IgG2 anti-Dog) Lote No. A40-121P-21 de los Laboratorios Bethyl
- Solución de Lavado PBS (OXOID P4809) - Solución de revelado-Sustrato O-Phenylenediamine
31
dihydrochloride Laboratorio SIGMA − Solución SDS 10 % − Suero Fetal Bovino SIGMA − Toallas desechables absorbentes − Tris-HCl Lote 0000121534 − Tubos de vidrio 10 ml − Tubos Eppendorf de 2 ml y 5 ml − Tubos Fálcon 10 ml y 50 ml - Tween al 20% − UltraPureTM Temed invitrogen Lote 031101360 MATERIALES BIOLÓGICOS
- Cultivo de parásitos Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel 21) - Extracto de proteínas de Leishmania mexicana (MHOM/BZ/82/Bel
21) - Muestras de suero sanguíneo canino conservadas a 4°C EQUIPOS
- Balanza - Cámara de electroforesis C.B.S. - Computador HP - Equipo para Blotting C.B.S. - Impresora HP - Incubadora Marca Memmert Serie I3267540 - Lector de luminiscencia - Lector de placa ELISA, Thermo Fisher Scientific Tipo 355 Serie
511181177 - Lector Multiparametros pH HACH Serie 8508850 Lot 12048 - QubitR2.0 Fluorometro invitrogen Seri Q32866 - Temporizador LabAlert, Serie C01Q
32
Anexo 2.
Códigos Sueros Caninos utilizados en Western Blot para detección de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2.
Positivos endémico Negativos endémico
Negativos no endémico
SC1 178 SC15 322 SC29 001
SC2 179 SC16 323 SC30 002
SC3 196 SC17 320 SC31 003
SC4 199 SC18 331 SC32 004
SC5 334 SC19 318 SC33 005
SC6 347 SC20 589 SC34 006
SC7 551 SC21 590 SC35 007
SC8 500 SC22 591 SC36 008
SC9 497 SC23 592 SC37 009
SC10 629 SC24 593 SC38 010
SC11 120 SC25 180 SC39 011
SC12 129 SC26 186 SC40 012
SC13 132 SC27 187 SC41 013
SC14 146 SC28 195 SC42 014
Elaborado por: Autora
33
Anexo 3.
Registro de los sueros utilizados para la evaluación
No. RAZA EDAD CLINIC
O FROTI
S
IgG1 ELIS
A
IgG2 ELIS
A
IgG1 WB
IgG2 WB PCR Provincia Cantón
1 Mestiza 1año Pos Pos Pos Neg Pos Neg Pos Pichincha Pedro Vicente
Maldonado
2 Mestiza NA Neg Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pichincha Pedro Vicente Maldonado
3 Mestiza 2 años Neg Pos Pos Neg Neg
Neg Pos Napo Gonzalo Díaz
de Pineda
4 Mestiza NA Neg Pos Neg Neg Neg
Neg Pos Pichincha Pedro Vicente
Maldonado
5 Mestizo 5 años Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Orellana García Moreno
6 Dálmata NA Neg Pos Pos Neg Neg Pos Pos Orellana García Moreno
7 Mestizo 8 meses Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Orellana García Moreno
8 Mestiza 8 años Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Napo Gonzalo Díaz de Pineda
9 Mestiza 1 año Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Napo Gonzalo Díaz de Pineda
10 Mestizo 6 meses Neg Pos Neg Neg Neg
Neg Pos Orellana García Moreno
11 Mestizo 1 Neg Pos Neg Neg Neg
Neg Pos Sucumbío
s Aguas Negras
12 Mestizo 10meses Neg Pos Pos Neg Neg
Neg Pos Sucumbío
s Aguas Negras
13 Mestiza 1 año Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Napo Gonzalo Díaz de Pineda
14 Mestiza NA Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Pichincha Pedro Vicente
Maldonado
15 Mestizo 3 Neg Neg Pos Neg Neg Pos Ne
g Sucumbio
s Aguas Negras
16 Mestizo 1 Neg Neg Pos Neg Neg Pos Ne
g Sucumbio
s Aguas Negras
17 Mestizo 2 Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ne
g Sucumbio
s Aguas Negras
18 Mestizo 2 Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ne
g Sucumbio
s Aguas Negras
19 Mestizo 6 meses Neg Neg Pos Neg Neg
Neg
Neg
Sucumbios Aguas Negras
20 Mestizo 5 Neg Neg Pos Neg Neg
Neg
Neg
Sucumbios Aguas Negras
21 Mestizo 1,5 Neg Neg Neg Neg Neg
Neg
Neg Orellana Garcia Moreno
22 Mestizo NA Neg Neg Neg Neg Neg
Neg
Neg Pichincha Pedro Vicente
Maldonado
23 Mestizo 6meses Neg Neg Neg Neg Neg
Neg
Neg Orellana Garcia Moreno
24 Mestizo 3 años Neg Neg Pos Neg Neg
Neg
Neg Orellana Garcia Moreno
25 Mestizo 2 años Neg Neg Pos Neg Neg
Neg
Neg Orellana Garcia Moreno
26 Mestizo 2 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg
Neg Orellana Garcia Moreno
27 Mestizo NA NA Neg Pos Neg Neg
Neg
Neg Pichincha Pedro Vicente
Maldonado
28 Mestizo NA NA Neg Pos Neg Neg Pos Ne
g Pichincha Pedro Vicente Maldonado
34
29 French P 2 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
30 Mestiza 1,5 año Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
31 French P 1 año Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
32 Bulldog 7 meses Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
33 Mestiza 3 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
34 Mestizo 1 año Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
35 French P 2 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
36 Mestiza 10 meses Neg Neg Neg Neg Ne
g Neg NA Pichincha Quito
37 Mestiza 3 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
38 Weimaraner 2 años Neg Neg Neg Neg Ne
g Neg NA Pichincha Quito
39 Mestiza 9 meses Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
40 Mestiza 3 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
41 Labrador 4 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
42 Labrador 2 años Neg Neg Neg Neg Neg
Neg NA Pichincha Quito
**Datos obtenidos del banco de sueros del Instituto de Investigación en Salud Publica y Zoonosis.
Elaborado por: La Autora
35
Anexo 4.
Preparación de geles de acrilamida cámara para Western Blot.
Elaborado por: La Autora Anexo 5.
Preparación de transferencia – Blotting
Elaborado por: La Autora
36
Anexo 6.
Transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa
Elaborado por: La Autora Anexo 7.
Preparación de tiras de nitrocelulosa marcadas
Elaborado por: La Autora
37
Anexo 8. Sueros a evaluar
Elaborado por: La Autora
Anexo 9. Incubación de sueros
Elaborado por: La Autora
Anexo 10. Revelado de de bandas mediante sustrato
Elaborado por: La Autora
38
Anexo 11.
Lectura de tiras de nitrocelulosa
Elaborado por: La Autora
Anexo 12. Cálculo del peso molecular de bandas reveladas por Western Blot
RF: distancia de migración; PM: peso molecular
PMmarcador LogPM RF RFMuestraProblema LogPMbandaproblema PM
198 5,288267031 0,133 0,36 3,75784 42,962 4,127134385 0,213 0,386666667 3,66948 39,249 3,891820298 0,307 0,16 4,42054 83,138 3,63758616 0,400 0,4 3,6253 37,528 3,33220451 0,507 0,333333333 3,8462 46,817 2,833213344 0,627 0,213333333 4,24382 69,714 2,63905733 0,787 0,306666667 3,93456 51,16 1,791759469 0,880 0,12 4,55308 94,9
Elaborado por: La Autora
y=-3,7996x+5,2728R²=0,92458
0123456
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000
LOGPM
RF
LogPM
39
Anexo 13.
Electroforesis – desplazamiento de proteínas
Elaborado por: La Autor
40
Anexo 14.
Bandas observadas entre los grupos de sueros problema
BANDASIDENTIFICADAS–IgG1 SUERO PCR 43kDa 10kDa 7,3kDa 6kDa 5kDa
1 P X 2 P 3 P 4 P 5 P X X X 6 P X X X7 P X X X X X8 P X X X9 P X X X X X10 P 11 P X X X X X12 P X X X X X13 P 14 P X X X15 N X X X X X16 N X X X X X17 N 18 N 19 N 20 N 21 N 22 N 23 N 24 N 25 N 26 N 27 N X X X X X28 N
Elaborado por: La Autora
41
Anexo 15.
Bandas observadas entre los grupos de sueros problema
BANDASIDENTIFICADAS–IgG2SUERO PCR 91kDa 39kDa 38kDa 34kDa
1 P X2 P X X3 P X X4 P X X5 P X6 P X X7 P X X8 P x X9 P X10 P x 11 P X x 12 P x 13 P X x 14 P x 15 N X x 16 N x 17 N x 18 N 19 N X x 20 N 21 N x 22 N x 23 N x 24 N x 25 N x 26 N x 27 N 28 N x
Elaboradopor:LaAutora
42
Anexo 16.
Resultados de densidades ópticas en ELISA indirecto
POSITIVOSENDEMICOS NEGATIVOSENDEMICOS NEGATIVOSNOENDEMICOS
No IgG1 IgG2 No IgG1 IgG2 No IgG1 IgG2
1 0,124 0,120 0,624 0,971 15 0,193 0,120 0,635 0,971 29 0,059 0,120 0,660 0,971
2 0,153 0,575 16 0,147 0,921 30 0,074 0,401
3 0,133 0,721 17 0,112 0,470 31 0,064 0,794
4 0,065 0,326 18 0,109 0,562 32 0,082 0,419
5 0,139 0,497 19 0,226 0,469 33 0,059 0,543
6 0,141 0,921 20 0,156 0,583 34 0,064 0,657
7 0,061 0,210 21 0,107 0,463 35 0,062 0,358
8 0,088 1,573 22 0,069 0,160 36 0,104 0,668
9 0,106 0,295 23 0,102 0,582 37 0,100 0,536
10 0,117 0,482 24 0,244 0,577 38 0,050 0,470
11 0,102 0,569 25 0,130 0,419 39 0,034 0,345
12 0,145 0,408 26 0,106 0,793 40 0,036 0,559
13 0,083 0,559 27 0,133 0,733 41 0,037 0,462
14 0,103 0,658 28 0,135 0,637 42 0,034 0,608
Elaboradopor:LaAutora
43
Anexo 17.
Tabla 4. Correspondencia Kappa Resultados de IgG1 por (Western Blot ) Bandas Reveladas con mayor frecuencia PM
43kDa 10kDa 7,3kDa 6kDa 5kDa
WESTERNBLOT
43kDa POS NEG Total
PCRPOS 7 7 14NEG 3 11 14Total 10 18 28
Po 0,642857143 Pe 0,5
Coeficientek 0,2857 DISCRETO
WESTERNBLOT
10kDa POS NEG Total
PCRPOS 8 6 14NEG 3 11 14Total 11 17 28
Po 0,678571429 Pe 0,5
Coeficientek 0,3571 DISCRETO
WESTERNBLOT
7,3kDa POS NEG Total
PCRPOS 5 9 14NEG 3 11 14Total 8 20 28
Po 0,571428571
Pe 0,5
Coeficientek 0,1429 INSIGNIFICANTE
44
WESTERNBLOT
6kDa POS NEG Total
PCRPOS 6 8 14NEG 3 11 14Total 9 19 28
Po 0,607142857
Pe 0,5
Coeficientek 0,2143 DISCRETO
WESTERNBLOT5kDa POS NEG Total
PCRPOS 7 7 14NEG 3 11 14Total 10 18 28
Po 0,642857143
Pe 0,5
Coeficientek 0,2857 DISCRETO
Elaborado por: La Autora
45
Anexo 18.
Tabla 5. Correspondencia Kappa Resultados de IgG2 por (Western Blot ) Bandas Reveladas con mayor frecuencia (PM)
91kDa 39kDa 38kDa 34kDa
WESTERNBLOT
91kDa POS NEG TotalPCR POS 6 8 14
NEG 2 12 14Total 8 20 28
Po 0,642857143
Pe 0,5
Coeficientek 0,2857 DISCRETO
WESTERNBLOT
39kDa POS NEG TotalPCR POS 3 11 14
NEG 7 7 14Total 10 18 28
Po 0,357142857
Pe 0,5
Coeficientek -0,2857 SINACUERDO
WESTERNBLOT
38kDa POS NEG TotalPCR POS 4 10 14
NEG 4 10 14Total 8 20 28
Po 0,5
Pe 0,5
Coeficientek 0 SINACUERDO
46
WESTERNBLOT
34kDa POS NEG TotalPCR POS 9 5 14
NEG 0 14 14Total 9 19 28
Po 0,821428571
Pe 0,5
Coeficientek 0,6429 SUSTANCIAL**
Elaborado por: La Autora
Anexo 19.
Tabla 6. Correspondencia Kappa (ELISA y Western Blot) Resultados IgG1
ELISA
POS NEG TOTALWB POS 11 11 22
NEG 3 3 6TOTAL 14 14 28
Po 0,5
Pe 0,418367347
Coeficientek 0,1401 INSIGNIFICANTE
Elaborado por: La Autora
47
Anexo 20
Tabla 7. Correspondencia Kappa (ELISA y Western Blot) Resultados IgG2
ELISA POS NEG TOTAL
WB POS 1 27 28NEG 0 0 0TOTAL 1 27 28
Po 0,035714286
Pe 0,035714286
Coeficientek 0 INSIGNIFICANTE
Elaborado por: La Autora
48
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