UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
TRABAJO FIN DE GRADO
MÉTODOS ANALÍTICOS EXISTENTES
PARA DETERMINAR EL ESTADO
NUTRICIONAL DE VITAMINA K EN LA
POBLACIÓN
Autor: Cristina Velasco Hernández
Tutor: Elena Rodríguez Rodríguez
Convocatoria: Junio
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Índice:
1. Resumen ………………………………………………………………………………………3
2. Introducción y antecedentes …………………………………………………………….........3
• Estructura de la vitamina K ……………………………………………………………….3
• Fuentes de la vitamina K ………………………………………………………………….4
• Ingestas adecuadas de la vitamina K …………………………………………………...…5
• Funciones de la vitamina K ……………………………………………………………….5
• Causas por déficit de vitamina K …………………………………………………………6
• Metabolismo de la vitamina K ……………………………………………………………6
• Toxicidad y recomendaciones …………………………………………………………….7
• Métodos analíticos para evaluar el estado nutricional de vitamina K en la población …..7
o Métodos indirectos ……………………………………………………………………8
− Tiempo de protrombina …………………………………………………………...8
− Osteocalcina (OC) o proteina Gla matriz (MGP) …………………………………8
− Descarboxiprotrombina (PIVKA-II) ……………………………………………...9
− Metabolitos urinarios de la vitamina K …………………………………………...9
o Métodos directos ……………………………………………………………………...9
3. Objetivo ……………………………………………………………………………………...10
4. Metodología …………………………………………………………………………… …...10
5. Resultados y discusión …………………………………………………………… ………...10
• Métodos de extracción de la vitamina K ………………………………………………...10
• Métodos directos de determinación de la vitamina K …………………………………...12
− Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta
visible (UV-Vis) ……………………………………………………………………...12
− HPLC con detección de fluorescencia ……………………………………………….13
− HPLC con detección electroquímica (EC) …………………………………………...14
− HPLC acoplado a espectrometría de masas (MS) …………………………………....16
• Características generales de los métodos directos ……………………………………….18
6. Conclusiones ……………………………………………………………………........……...19
7. Bibliografía …………………………………………………………………………………..19
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1. RESUMEN
La vitamina K es una vitamina liposoluble esencial para la salud, ya que tiene un papel principal
como cofactor de la síntesis de proteínas de la coagulación sanguínea, además de participar en la
regulación del metabolismo óseo y vascular.
Actualmente existen métodos analíticos directos e indirectos para poder determinar la concentración
de vitamina K en la población, pero sigue siendo un problema crítico por presencia de limitaciones e
interferencias en los métodos directos, debido a los bajos niveles circulantes de vitamina K, el
carácter no polar de la misma y la interferencia de los lípidos extraídos conjuntamente, y de baja
sensibilidad en los métodos indirectos. Sin embargo, los métodos directos se pueden considerar los
más informativos para determinar la vitamina K y sus homólogos.
A partir de la revisión realizada en el presente trabajo, se concluye que a pesar de que el método es
más rápido, sensible, preciso y selectivo para determinar la vitamina K es la cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masas en tandem (MS/MS), en los laboratorios
el método más usado actualmente es el HPLC con detector de fluorescencia, ya que es más
económico y el proceso de prepurificación de la muestra es más rápido.
2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES
• ESTRUCTURA DE LA VITAMINA K
La vitamina K, agrupa a un conjunto de estructuras que, de forma natural, presentan un anillo
metilado de naftoquinona y una cadena lateral alifática, y según sus características se dividen en dos
grupos: filoquinonas o vitamina K1, que contiene en su cadena lateral cuatro residuos de
isoprenoides y menaquinonas o vitamina K2 que tienen una cadena lateral compuesta de un número
variable de residuos isoprenoides insaturados, generalmente asignados como MK-n, donde “n”
especifica el número de isoprenoides. También existe la menadiona o vitamina K3, que es de origen
sintético, y en su cadena lateral posee un grupo H (figura 1). Está aceptado que la naftoquinona sea el
grupo funcional, así que el mecanismo de acción es similar para todas las formas de la vitamina K.1
Sin embargo, se podrían esperar diferencias por su estructura en la absorción intestinal, transporte,
distribución de tejidos y biodisponibilidad. Estas diferencias son causadas por las distintas afinidades
por los lípidos de las cadenas laterales y por las diversas matrices de los alimentos en las cuales
ocurren. Todas las formas de la vitamina K son liposolubles, aunque los derivados bisulfíticos de la
K3 son solubles en agua.2,3
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Figura 1. Estructuras de la vitamina K.3
• FUENTES
En la dieta se encuentran dos formas naturales de esta vitamina, la filoquinona y menaquinona. Las
filoquinonas (K1) están presentes en vegetales de hojas verdes, tales como la col rizada
(882μg/100g), la espinaca (493μg/100g), las coles de bruselas (192μg/100g), la lechuga cruda de
hoja verde (174μg/100g) y el brócoli tanto hervido (141μg/100g) como crudo (100μg/100g), en
algunos aceites vegetales como soja, algodón, canola y oliva (60μg/100g), y en menor cantidad en
atún (44μg/100g), carnes (1,6μg/100g), quesos (2,68μg/100g), frutas y pan (1,9μg/100g).1
En los vegetales verdes, la vitamina K1 está estrechamente unida a la membrana tilacoide de los
cloroplastos, por esta razón la filoquinona tiene una baja tasa de absorción (5-15%, dependiendo de
la ingesta de grasas de cada persona).4
Las menaquinonas (K2) son principalmente de origen animal y/o bacteriano (la produce la flora
intestinal). Está contenida en carnes (1-10μg/100g), aceites vegetales, quesos (3,6-10μg/100g), huevo
cocido (7μg/100g), leche entero y yogurt (1μg/100g), y en el producto de soja fermentada Natto
(1103μg/100g), consumido principalmente en Japón.1
Esta vitamina tiene una mejor absorción, aunque a menudo se subestima su importancia desde el
punto de vista nutricional.1,4
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• INGESTAS ADECUADAS
El nivel de ingesta adecuada (IA) de la vitamina K1 en base a los niveles de consumo de individuos
saludables son se recogen en la Tabla 1.
Edad Hombres (μg/día) Mujeres (μg/día)
0-6 meses 2
7-12 meses 2,5
1-3 años 30
4-8 años 55
9-13 años 60
14-18 años 60
19-50 años 120 90
>50 años 120 90
Embarazo 75-90
Lactancia 75-90
Tabla 1. Ingestas recomendadas de vitamina K en la población según edad y sexo.1,4
El consumo medio de vitamina K es de 1-2μg/Kg/día y con ello se consigue mantener la hemostasis
normal en el organismo y evitar cualquier problema por el déficit del mismo, como podría ser una
alteración hemorrágica.1
La biodisponibilidad de la vitamina K ingerida está influenciada por la ingesta de grasa alimentaria
en la dieta, por lo que es muy importante tomar una dieta equilibrada con bajo nivel de grasas y así
mejorar la absorción de la vitamina K llegando a los niveles adecuados de ingesta diaria.4
• FUNCIONES
Esta vitamina es requerida para los procesos de la coagulación de la sangre y generación de glóbulos
rojos, aunque se ha propuesto recientemente como un nutriente clave en la regulación de la
calcificación de tejidos blandos.4
· Coagulación sanguínea: la vitamina K en el hígado participa en la síntesis de algunos factores que
forman parte de la cascada de coagulación, cuyo fin es detener la hemorragia de los vasos sanguíneos
dañados a través de la formación del coágulo. Por ello también es llamada “vitamina
antihemorrágica”. Es decir, regula la actividad de la coagulación sanguínea.2
· Metabolismo óseo: la vitamina K también participa en el metabolismo del hueso ya que una
proteína ósea, llamada osteocalcina, requiere de la vitamina K para su maduración, es decir,
promueve la formación ósea en nuestro organismo. La vitamina K ayudaría a aumentar la densidad
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ósea y evitaría fracturas en personas con osteoporosis. Por lo tanto prevendría la osteoporosis y las
calcificaciones vasculares, y protegería la masa ósea de fracturas.2
• CAUSAS POR DÉFICIT DE VITAMINA K
· Coagulación: Algunos de los factores de la coagulación requieren de vitamina K para su síntesis
completa. Estas proteínas incluyen a los factores II, VII, IX y X, así como a las dos proteínas
reguladoras, proteína C y proteína S. En ausencia de vitamina K o en el caso de tratamiento con
anticoagulante con antagonistas de la vitamina K, estos factores son sintetizados pero están
incompletos, carecen de la unión de calcio al ácido carboxiglutámico y en el plasma se encuentran
como factores no funcionales, incapaces de unirse adecuadamente a los iones Ca.5
Cabe destacar que las alteraciones hemorrágicas muchas veces no pueden ser evitadas por la simple
ingesta de alimentos, esto se debe a que el déficit de esta vitamina viene dada por otros problemas
como la falta de reservas hepáticas en el recién nacido, insuficiencia hepática, absorción deficiente e
ingestión de ciertos antibióticos o antagonistas de la vitamina K.2
· Osteoporosis: La vitamina K protege de la osteoporosis a través de dos mecanismos, por un lado
protege del exceso de actividad de las células que destruyen hueso, los asteoclastos, porque
disminuye la cantidad de sustancias pro-inflamatorios que los activa. Y por otro lado, activa a las
células que generan hueso, los osteoblastos, porque carboxila la proteína que genera estas células, la
osteocalcina.2,5
·Aterosclerosis: Las investigaciones apuntan que una proteína sintetizada en el tejido arterial, la
proteína Gla de la matriz, requiere vitamina K (especialmente K2) para ser activada. Esta proteína
inhibe la calcificación de los vasos sanguíneos, con lo que se evita su pérdida de elasticidad, que es
uno de los principales contribuyentes a la aparición de problemas cardiovasculares.2
• METABOLISMO
La vitamina K pasa a linfa como componente de los quilomicrones y se transporta en sangre a través
de las lipoproteinas. El transporte de filoquinonas se realizan principalmente a través de las
lipoproteinas VLDL y en menor parte a través de las LDL y HDL. Las menaquinonas también se
transportan a través de las VLDL y con una mayor implicación de las lipoproteinas LDL y HDL. La
vitamina K se almacena principalmente en el hígado y otros tejidos como el corazón. La vitamina se
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cataboliza en el hígado y se excreta en su mayoría en forma de bilis, aunque una pequeña cantidad
(menos del 10%) se elimina por la orina en forma de glucurónidos y sulfoconjugados.2,3
Aunque la vitamina K es una vitamina liposoluble, el cuerpo almacena cantidades muy pequeñas que
son rápidamente agotadas sin una ingesta regular. Tal vez, debido a su limitada habilidad de
almacenar vitamina K, el cuerpo la recicla a través de un proceso llamado ciclo de la vitamina K-
epóxido.3
El hígado tiene preferencia por captar la vitamina K1 para mejorar la coagulación y es la forma de
elección para los bebés recién nacidos y los pacientes a los cuales se les desea revertir el efecto de
los anticoagulantes. La vitamina K2, sin embargo, se distribuye uniformemente en varios tejidos, lo
que indica que los tejidos extra-hepáticos se benefician más de la forma K2 que de la K1.6
• TOXICIDAD Y RECOMENDACIONES
La vitamina K resiste al calor y a la humedad pero es destruida ante un medio ácido, básico y agentes
oxidantes, siendo también inestable a la luz.3
Las personas que toman anticoagulantes deben tener una dieta equilibrada y monitorizada por su
médico, ya que los anticoagulantes disminuyen la formación de coágulos interfiriendo con la
vitamina K, por ello, una dieta rica en esta vitamina disminuiría la eficacia de los anticoagulantes.6
No se han encontrado efectos adversos asociados a una dosis excesiva de vitamina K1 o K2, pero no
ocurre lo mismo con la vitamina K3. Esta forma sintética puede interferir con la función del
glutation, un antioxidante que protege a las células de los radicales libres, lo cual genera daño
celular. En el recién nacido la vitamina K3 provoca daño hepático, ictericia y anemia hemolítica
(anemia dada por la ruptura de células sanguínea). Por ello se ha dejado de usar para el tratamiento
de la deficiencia de vitamina K.3,6
• MÉTODOS ANALITICOS PARA EVALUAR EL ESTADO NUTRICIONAL DE
VITAMINA K EN LA POBLACIÓN
Debido a que la vitamina K es muy liposoluble y poco abundante, existe una gran dificultad para
poder medir sus niveles en el organismo, habiendo limitado el desarrollo de técnicas existentes con
dicho objetivo. En general, los métodos para evaluar el estado en vitamina K pueden dividirse en
directos e indirectos.3,5
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Entre los métodos indirectos, se encuentra la medida del tiempo de protrombina, la determinación de
las proteinas subcarboxiladas (como la osteocalcina (OC) o proteína Gla matriz (MGP)), y de la
descarboxiprotrombina (PIVKA-II), así como el análisis de los metabolitos urinarios de la vitamina
K (7C-aglicona y 5C-aglicona).3,4
Entre los métodos directos se encuentran aquellos en los que se analiza la vitamina K o sus
metabolitos en plasma. Entre estos se encuentran la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
con detección ultravioleta visible (UV-Vis), HPLC con detección de fluorescencia, HPLC con
detección electroquímica (ECD), y HPLC acoplado a espectrometría de masas (MS).3,7
o MÉTODOS INDIRECTOS
- Tiempo de protrombina
Este método mide el tiempo que tarda la sangre en coagular. Se consideran valores normales de 11,1
a 13,1 segundos en adultos, de 2 a 3 segundos en neonatos, y de 3 a 5 segundos en neonatos
prematuros.
Es la técnica menos sensible para la determinación de vitamina K en el organismo y no se puede usar
como un indicador fiable del estado del mismo.3
- Osteocalcina (OC) o proteína Gla de la matriz (MGP)
La medida de estas proteínas son más sensibles en la detección de la deficiencia de la vitamina K que
el tiempo de protrombina. Sin embargo, la medida de MGP solo puede reflejar el estado de la
vitamina K a nivel vascular y no en otros órganos (en particular en hueso e hígado).3
La MGP es sintetizada predominantemente por los osteoblastos e incorporada en la matriz
extracelular del hueso, y actúa en las paredes de los vasos sanguíneos del organismo. Es el inhibidor
local más fuerte de la calcificación vascular en la pared del vaso y el inhibidor más potente de la
calcificación tisular actualmente conocido.8
La cantidad de osteocalcina parcialmente carboxilada (ucOC) podría representar un marcador
sensible del estado de vitamina K en plasma, sin embargo, aunque un alto porcentaje de ucOC indica
un estado pobre en vitamina K, esto refleja la ingesta reciente de la vitamina K y no el estado del
mismo a largo plazo. También hay que tener en cuenta que los niveles de osteocalcina están
influenciados por la vitamina D y por la paratohormona (PTH). Por ejemplo, aunque un paciente con
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hiperparatiroidismo presente los niveles de osteocalcina parcialmente carboxilada elevados en
sangre, no significa necesariamente que tenga un déficit en vitamina K.9,10
- Descarboxiprotrombina (PIVKA-II)
Esta proteína es un precursor inactivo de la protrombina y aumenta cuando existe deficiencia de
vitamina K. Por ello podría ser un marcador sensible para predecir la deficiencia de vitamina K,
especialmente en los recién nacidos.3
- Metabolitos urinarios de la vitamina K (7C-aglicona y 5C-aglicona)
Los metabolitos de la vitamina K, 7C-aglicona y 5C-aglicona, que son comunes para la filoquinona
como para la menaquinona, son excretadas por la orina, y dan una idea de la dieta que sigue el
paciente.
Uno de los inconvenientes es que el deterioro de la función renal podría interferir con la fiabilidad de
este marcador.3
o MÉTODOS DIRECTOS
Determinar la vitamina K en plasma es difícil por el hecho de sus bajos niveles circulantes en el
organismo, su carácter no polar, y a las interfierencias que presenta con los lípidos plasmáticos
extraídos conjuntamente.3
Además, hay varias interferencias con los componentes del plasma y los medicamentos
administrados, y la alta unión a lipoproteínas complica los procedimientos de extracción y confiere
resultados muy discrepantes (entre 1,6 ± 2,2 y 4,8 ± 2,9 nmol/L en estudios que utilizan diferentes
técnicas de extracción). Los procedimientos de preparación de muestras incluyen la extracción
líquido-líquido (LLE) o extracción en fase sólida (SPE). Cabe destacar que estos procedimientos
consumen mucho tiempo, mano de obra y grandes cantidades de disolventes orgánicos caros, tóxicos
y preligrosos para el medioambiente.11,12
Entre los métodos más usados actualmente para su detección y cuantificación se encuentran: la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta visible (UV-Vis),
fluorescente, electroquímica (EC) y por espectrometría de masas (MS). Se utilizan para el análisis
directo de K1, así como para el de MK-4 y MK-7.3,7
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3. OBJETIVO
Revisar los métodos analíticos directos existentes para la determinación de vitamina K en la
población.
4. METODOLOGÍA
Para llevar a cabo la realización de este trabajo, se realizó una búsqueda sobre la vitamina K y los
métodos analíticos para su determinación en Science Direct, Pubmed y Google-académico, así como
en la biboteca on-line de la Universidad Complutense de Madrid.
Para poder elegir cuales serían los mejores artículos para realizar este trabajo, hubo que poner límites
en la búsqueda. Primero se eligieron artículos publicados hace 20 años como máximo, que fueran
revisiones, ensayos clínicos y la especie elegida humanos (aunque para la introducción del trabajo
tuve que eliminar este criterio).
Se usaron las siguientes palabras claves: “vitamin K”, para la cual salieron 1991 resultados,
“determination of vitamin K”, para la cual salieron 611, “metabolism of vitamin K”, para la cual se
obtuvieron 695, “structure of vitamin K”, para la cual salieron 40, y “biochemistry of vitamin K”,
para la cual se obtuvieron 34 resultados.
Finalmente se usaron 26 artículos para llevar a cabo la realización de este trabajo y su revisión
bibliográfica.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
• MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE LA VITAMINA K
Para poder determinar la vitamina K por diversos métodos hay que preparar primero la muestra y
purificarla con diversas sustancias para que los resultados obtenidos sean lo más fiables posible. Para
ello, siempre hay que tener cuidado con la muestra, porque aunque sea muy estable al calor y las
pérdidas durante los distintos tratamientos térmicos sea casi imperceptible, es muy susceptible a la
degradación fotoquímica.3,11
Para poder preparar la muestra, primero se realiza una extracción líquido-líquido para separar la
vitamina K y los metabolitos del plasma, y posterioremente se procede a la extracción en fase sólida
para separar la vitamina K de los compuestos lipídicos de la muestra.12
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El procedimiento comienza con una toma de muestra de sangre, separando posterioremente el suero
por centrifugación. Las muestras deben ser protegidas de la luz para no producir una
desestabilización de las mismas. Se ha observado que la estabilidad de las muestras se consigue
utilizando viales de color ambar para evitar que le dé la luz, y almacenándolas con unas condiciones
estratégicas de tiempo y temperatura con diversos ciclos de congelación-descongelación de la
misma. Se consigue que sean estables hasta 7 días en plasma almacenándolas a 4ºC y hasta 14 días a
15ºC. A temperatura ambiente, se mantienen estables hasta 72 horas cuando se almacenan en
oscuridad y hasta 24 horas cuando se almacenan en tubos transparentes con luz. Son estables hasta
12 semanas a 20ºC, y no se encuentra ningún cambio significativo en las concentraciones de los
metabolitos de la vitamina K después de uno o tres ciclos de congelación-descongelación.12
Los metabolitos de vitamina K se extraen del suero por extracción líquido-líquido. Se parte de unas
alícuotas de suero y se transfieren a un tubo de centrífuga de vidrio desechable que contiene agua
destilada. Una apropiada cantidad de suero estándar se añade por inyección. Se agregan unos
mililitros de etanol para precipitar así las proteínas con una breve agitación. A continuación, se
agregan unos mililitros de n-hexano y se mezclan vigorosamente a través de una centrifugación de
1500g (aproximadamente 3000rpm) unos 10 minutos a temperatura ambiente hasta la separación de
la capa superior de hexano de la capa inferior acuosa-etanólica y las proteínas precipitadas. La capa
superior de hexano se tranfiere cuantitativamente a un tubo de vidrio desechable, y de la capa más
baja se vuelven a extraer otros mililitros de hexano. Las capas orgánicas superiores se agrupan y
luego se someten a una evaporización para proceder al secado bajo una corriente suave de nitrógeno
a 50ºC.12
Una vez extraídos los metabolitos, se procede al aislamiento de la fracción de vitamina K de los
extractos lipídicos llevado a cabo mediante el uso de un sistema de extracción en fase sólida (SPE).
En primer lugar se acondicionan unos cartuchos de sílice con hexano para eliminar así los materiales
del cartucho que puedan interferir con el ensayo de la vitamina K. El extracto lipídico seco se
disuelve en n-hexano y se empuja a través del cartucho, y posteriormente el tubo se enjuaga con
hexano. El hexano se extrae a través de cada cartucho aplicando vacío para separar la fracción de
lípidos de los hidrocarburos. Los compuestos de vitamina K retenidos se eluyen con éter dietílico en
hexano y se recolectan en tubos de vidrio desechables. A continuación se procede al secado por
evaporización bajo una coriente de nitrógeno a 50ºC.
La fracción de vitamina K seca se disuelve en 2-propanol y se tranfiere a viales de vidrio para
realizar el análisis por HPLC.12
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• MÉTODOS DIRECTOS DE DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA K
- HPLC con detección ultravioleta visible
La vitamina K1 puede ser detectada en el plasma humano a través del método de HPLC con detector
de ultravioleta visible. La determinación por ultravioleta visible fue uno de los primeros métodos
utilizados para la detección de la vitamina K1 y se basa en la capacidad de esta vitamina en absorber
radiación ultravioleta. Se basa en un método de cromatografía líquida, generalmente en fase inversa,
usando una mezcla de acetonitrilo/diclorometano/metanol como eluyente a 20ºC. La detección del
metabolito se lleva a cabo mediante una longitud de onda de 248nm y normalmente la velocidad de
flujo es de 1ml/min.13
Para proceder a cuantificar la vitamina K, se deben preparar curvas estándar. Para su cuantificación
se comparan de manera directa la relación de las áreas y los picos obtenidos en el cromatograma.
Para ello, se prepara una solución madre del estándar disolviendo 100mg de vitamina K en 100ml de
hexano con una corriente de nitrogeno, y se almacena en un matraz ámbar a 18ºC. El día que se va a
realizar el ensayo, las soluciones estándar del trabajo se deben preparar diluyendo las cantidades
apropiadas en 90:10 de metanol/diclorometano. Las concentraciones de las soluciones se deben
confirmar mediante el análisis espectrométrico a 248nm con un espectrofotómetro con detector
ultravioleta visible.13
La integración del cromatograma y la regresión lineal de la curva de calibración se realiza utilizando
un programa de software especial para este tipo de métodos (HP Chemstation 3365).
Para poder estudiar la recuperación de la vitamina K se analizan por triplicado mediante el uso de
1ng de 20,30-dihidrofloiloquinona como patrón interno en las muestras. La recuperación de la misma
se calcula de la siguiente manera:
(Rt - Re) / Ra x 100
Donde Rt es la cantidad total de vitamina K1, Re es la cantidad de vitamina K1 endógena, y Ra es la
cantidad de vitamina K1 adicional.13
Este método de determinación es fácil de usar, rápido y capaz de medir la filoquinona en plasma
humano, y los datos que se obtienen a través de este método son similares a los reales, además es uno
de los más utilizados. Sin embargo, debido a su baja sensibilidad y selectividad, se recomienda que
se acompañe con determinaciones adicionales.13
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Figura 2. Detector de ultravioleta visible (UV-Vis).13
- HPLC con detección de fluorescencia
Este método permite determinar la vitamina K y sus derivados (K1, MK-4 y MK-7), sin embargo,
requiere una purificación de la muestra exhaustiva para reducir la interferencia cromatográfica
inducida por los lípidos.14
El sistema consiste en HPLC, un inyector, columna termostatizada a 35ºC y un detector de
fluorescencia configurado a una longitud de onda de 320nm para MK-4 y 240nm para K1 y MK-7.
Entre la columna de HPLC y detector de fluorescencia se encuentra la columna de reducción de
platino o zinc para purificar la muestra.15
Para la determinación de MK-4 se usa generalmente una fase móvil de 95:5 de metanol y agua,
mientras que para la determinación de K1 y MK-7 la fase móvil suele estar compuesta de metanol y
etanol (95:5). Una velocidad de flujo de 1ml/min en ambos sistemas suele ser adecuada para una
correcta determinación.16
La concentración de MK-4, K1 y MK-7 en plasma se calcula usando la fórmula de:
[MK-4], [K1] o [MK-7] = R·S / V
Donde R es la relación cuantitativa de vitamina K en la curva de calibración, S es la cantidad de
estándar interno (1ng), y V es el volumen de la muestra tomada para el ensayo.17
Para determinar la linealidad del método se realiza una curva de calibrado de MK-4, K1 y MK-7.
Los límites de detección de MK-4 y MK-7, basados en una relación señal-ruido de 3:1, son de
0.001 - 0.004ng por inyección, y el de K1 son de 0.01 - 0.002ng por inyección, respectivamente. Las
recuperaciones de MK-4, K1 y MK-7 calculadas por mediciones de la vitamina K en suero
enriquecido a baja, media y alta concentración de la misma son aproximadamente del 92-105%. Los
valores calculados de precisión intra e interensayo por mediciones del suero control y del plasma de
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los sujetos sanos son del 5.73 - 9.21% para MK-4, 4.86 - 9.64% para K1 y 6.32 - 19.31% para MK-7.
La sensibilidad y recuperación general combinada con una buena reproducibilidad para la medición
de tres tipos de vitamina K (MK-4, K1, MK-7) con solo 0,2ml de plasma, hace que sea un método
muy factible.18
En este método presenta una mayor sensibilidad y selectividad de reproducibilidad y precisión que la
detección ultravioleta visible, por lo que se considera un método adecuado para determinar el estado
de salud así como para realizar estudios nutricionales.14
- HPLC con detector electroquímico (EC)
Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse. Se mide la corriente
que pasa entre el electrodo de trabajo y un electro auxiliar, en función del tiempo. Con este detector
se debe trabajar en rigurosa ausencia de oxígeno y con disoluciones acuosas, o de disolventes
polares, que contengan electrolitos. Presentan una gran sensibilidad, con un límite de detección entre
el 0,01 y 1ng. Sin embargo, no pueden ser empleados en elución con gradiente, y dependen de la
temperatura y del caudal.19
Figura 3. Detector electroquímico.19
En este proceso se realiza la reducción de la estructura de quinona de la vitamina K a su
hidroquinona correspondiente, es decir, consiste en una reducción de dos electrones para producir la
hidroquinona correspondiente en la exploración catódica y la reoxidación a la quinona en la
exploración anódica. La separación entre los picos catódicos y anódicos es muy notable, y esto
quiere decir que la reacción es casi reversible. La naturaleza casi reversible del proceso de reducción
también se observa por el cambio de potencial máximo catódico con la tasa de exploración y por la
magnitud de los valores de α·na, los cuales se calculan a partir de la ecuación:
α·na = 0,048 / (Ep – Ep/2)
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donde α es el coeficiente de tranferencia, na es la cantidad de electrones implicados en el paso de
determinación de la velocidad, Ep es el potencial máximo, y Ep/2 es el potencial máximo a la mitad de
la corriente máxima.20
La función disminuye ligeramente con la velocidad de exploración de las corrientes catódicas pero
aumentó con las corrientes anódicas; esto sugiere que solo la forma reducida de la filoquinona se
adsorbe en la superficie del electrodo de carbono vítreo. Esto está en contraste con el
comportamiento que se puede observar en un electrodo de mercurio donde, en condiciones similares,
tanto la forma oxidada como la reducida de la vitamina se adsorben y el proceso de reducción es
reversible.20
El HPLC-EC se realiza con una bomba recíproca de flujo constante y un detector electroquímico,
también llamado amperométrico. Este dispone de un sistema de celda de tres electrodos, que
incorpora un electrodo indicador de carbono vítreo, un electrodo de referencia (calomelano saturado
o Ag-AgCl) y un contraelectrodo de platino. Las inyecciones de muestra se realizan a través de una
válvula de inyección de carga con una jeringa.
Es importante elegir los solventes y reactivos más adecuados para su determinación. Las soluciones
madre de filoquinona se preparan con etanol o metanol, diluyendolas posteriormente con el tampón
de acetato para llegar a la concentración adecuada. El tampón de acetato metanólico se desgasifica
con nitrogeno libre de oxígeno que habían pasado anteriormente de manera continua a través de
cloruro de vanadio (II) y metanol. Para mantener el vanadio en estado reducido, se añade una
amalgama de zinc a la solución de cloruro de vanadio (II), de esta manera se puede reducir el tiempo
requerido para la eliminación de oxígeno mediante la desgasificación previa al vacío.21
Las condiciones voltamperométricas que debe tener para poder llevar a cabo una buena detección
son: el potencial inical +1V mantenido durante 1 minuto antes del escaneo, la velocidad de
exploración de 10, 20, 50 y 100mVs-1, y el rango de 0,02mA. Entre las sucesivas ejecuciones, el
electrodo indicador se debe limpiar con agua destilada seguido de acetona y por último secarlo bien
con papel.
La voltametría hidrodinámica se realiza inyectando volúmenes fijos de una solución estándar de
filoquinona con un flujo de 1ml/min, y variando el potencial aplicado entre -0,5 y -0,8V. Entre cada
inyección se aplica un potencial de limpieza de +0,7V durante 3 minutos. Los voltamogramas
hidrodinámicos se construyen trazando la corriente máxima registrada contra el potencial aplicado.19
El gráfico de calibración de la altura del pico frente a la masa de filoquinona inyectada es lineal, en
el rango de 1-10ng. Los cromatogramas obtenidos para las muestras de plasma con filoquinona
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tienen unos picos bien definidos. La recuperación de la filoquinona con un rango del 0 - 0,8ng/ml es
lineal, siendo del 86 - 91%; y la precisión para las muestras es del 8,9%.
La sensibilidad de HPLC-EC para determinar filoquinona es aproximadamente tres veces mayor que
en HPLC-UV.19
El método es capaz de reducir el porcentaje de mala resolución que a menudo se caracteriza por el
aumento de las concentraciones totales de colesterol y triglicéridos en los pacientes, ya que se
elimina el exceso de lípidos e interferencias mediante el proceso de purificación de la muestra.20,21
- HPLC acoplado a espectrometría de masas (HPLC-MS)
El principal problema que surge al acoplar un espectómetro de masas (MS) al HPLC es la enorme
cantidad de disolvente que acompaña al analito procedente del HPLC. Para ello, se han desarrollado
técnicas para introducir y analizar muestras líquidas por MS. Una de ellas es la interfase de
ionización química a presión atmosférica (APCI), que además consigue la ionización de la muestra.
Con esta técnica se forma un spray a partir de la muestra y mediante una descarga eléctrica el analito
se convierte en iones que son conducidos hacia el espectrómetro de masas.22
Debido a que la vitamina K1 es un compuesto neutro y de baja polaridad, se utiliza una fuente de
APCI de iones positivo con una corriente de nebulizador de 3μA y una temperatura de sonda de
400ºC. Se usa nitrógeno de pureza ultra alta como gas de cortina y gas de colisión, y se usa aire cero
como gas nebulizador.22
De todos los analizadores de masas existentes, se han obtenido muy buenos resultados con
analizadores de triple duadruplo (MS/MS). Para entender su fundamento, primero se debe
comprender el funcionamiento de un duadruplo, consta de cuatro barras cilíndricas paralelas que
actúan como electrodos. Las barras opuestas se conectan eléctricamente, un par está unido al polo
positivo de una fuente variable de corriente contínua y el otro par se une al terminal negativo.
Además, se aplican a cada par de barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia,
que están desfasados 180 grados. Los iones son acelerados a través del cuadrupolo. Las tensiones de
corriente contínua y alterna se incrementa simultáneamente manteniendo constante su relación, sólo
aquellos iones que tienen una adecuada relación m/z consiguen tener una trayectoria estable y pasan
al detector, el resto termina colisionando con las barras. (Figura, 4).23
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Figura 4. Partes de un duadruplo.23
El analizador MS/MS se trata de una configuración de tres cuadrupolos situados de forma secuencial,
de forma que el primero y último (Q1 y Q3) actúan como un cuadrupolo normal, mientras que el
segundo tiene unas características especiales y se denomina celda de colisión. En esta celda se
introduce una pequeña cantidad de gas (He, Ar), de forma que los iones que entran, colisionan con
los mismos fragmentándose. Los iones formados pasan al Q3 para finalmente ser analizados. (Figura
5).23
Figura 5. Tiempo de residencia (dwell). Energía de colisiones.23
Las soluciones madres se preparan disolviendo los analitos en etanol para formar los patrones de
calibración y obtener así muestras de control enriquecidas posteriormente con K1, MK-4 y MK-7. Se
deben usar viales de color tupido, como el ámbar, para evitar la fotodegradación de la vitamina K y
guardarlas a -20ºC.24
La extracción de la muestra se consigue con una mayor recuperación de analitos si, seguido de la
extracción líquido-líquido, procedemos a la precipitación de proteínas. Se usa etanol y ciclohexano
como precipitante y extractante respectivamente para dar una mayor recuperación y menor
interferencia en la preparación de la muestra. Para alcanzar la respuesta máxima de la señal en un
tiempo de análisis más corto, se mantiene tan alto como sea posible el porcentaje de fase orgánica, al
mismo tiempo que se evita el primer pico que contiene la mayoría de interferencias endógenas que
suprimirían la respuesta.25
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LC-APCI-MS/MS es un método simple y rápido para la determinación cuantitativa de K1, MK-4 y
MK-7 en plasma humano. El procedimiento simple de preparación de las muestras evita métodos de
prepurificación intensivos, mientras que el corto tiempo de ejecución total permite un mayor
rendimiento. Aunque el método más comunmente utilizado es el HPLC con detector de
fluorescencia, este requiere una prepurificación muy extensa de la muestra para disminuir la
interferencia cromatográfica de los lípidos extraídos conjuntamente. Sin embargo, LC-APCI-MS/MS
para la medición de K1, MK-4 y MK-7 en plasma ofrece una mayor sensibilidad y selectividad en
comparación con otras técnicas, y muestra una excelente linealidad, recuperaciones consistentes
(92% para K1, 103% para MK-4 y 99% para MK-7) y un mayor rendimiento. Permite la
cuantificación reproducible de K1 en plasma a través de un amplio rango de concentraciones, con
una variación intra e inter-análisis de K1 y MK-4 de <10% y <12% para MK-7 a altas
concentraciones, y un límite de detección del 0,1 - 0,044ng/mL para K1 y MK-4 y 1 - 1,38ng/mL
para MK-7.26
Por lo tanto, este método es adecuado para la medición de K1 y podría serlo para medir MK-4 y
MK-7 en poblaciones que consumen mayores cantidades de las mismas, o para controlar el
tratamiento con estos metabolitos de la vitamina K.
• CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS DIRECTOS
HPLC-UV-Vis
(248nm)
HPLC-
fluorescencia
HPLC-EC HPLC-APCI-
MS/MS
Tiempo análisis Rápido Rápido Lento Lento
Sensibilidad Baja Alta Alta Muy alta
Límite de
detección
0,1 – 1ng 0,001 – 0,01ng 0,01 - 1ng 0,04 – 1,4ng
Precisión
(CV%)
2,2-5,6% K1=4,86-9,64%
MK-4=5,73-9,21%
MK-7=6,32-19,31%
8.9%
K1 y MK-4 = <10%
MK-7 = <12%
Recuperación 88% ± 3,6 92 - 105% 86 - 91% 92 - 103%
Temperatura
de trabajo
18-20ºC 35ºC 20ºC Automuestrador=15ºC
Columna=50ºC
Sonda=400ºC
Eliminación
interferencias
No Sí Sí No
Gradiente Sí Sí No Sí
Selectividad Baja Alta Alta Muy alta
Índice de flujo 1ml/min 1ml/min 1ml/min 1ml/min
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6. CONCLUSIONES
Después de comprobar varios métodos analíticos de determinación de vitamina K y sus análagos, se
ha determinado que aunque el más rápido, sensible, preciso y selectivo es el método HPLC-APCI-
MS/MS, en los laboratorios el más usado actualmente es el HPLC con detector de fluorescencia, ya
que es más económico y el proceso de prepurificación de la muestra es más rápido.
7. BIBLIOGRAFÍA
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