UNIVERSIDAD DE COLIMA
DOCTORADO EN CIENCIAS: REA BIOTECNOLOGA
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.) CON EL GEN QUE CODIFICA PARA EL INHIBIDOR DE CISTEN PROTEINASAS
DE ORIGEN HUMANO; CISTATINA C.
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS, REA: BIOTECNOLOGA
PRESENTA
M EN C JOS FRANCISCO MORALES DOMNGUEZ
ASESORES DR. RAFAEL GUTIERREZ CAMPOS DR. OSCAR REBOLLEDO DOMNGUEZ
Tecomn, Colima, Mxico Enero del 2006
A: A: A: A:
A mis hijmis hijmis hijmis hijos:os:os:os:
FFFFrancisco Emiliano y Lus Hernn.rancisco Emiliano y Lus Hernn.rancisco Emiliano y Lus Hernn.rancisco Emiliano y Lus Hernn.
A mi domadora:A mi domadora:A mi domadora:A mi domadora:
CristY.CristY.CristY.CristY.
A mi papA mi papA mi papA mi pap
Y a JuanitaY a JuanitaY a JuanitaY a Juanita y Rogey Rogey Rogey Roge....
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Autnoma de Aguascalientes por el apoyo institucional brindado en mi superacin profesional.
Al Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) por su apoyo con la beca PROMEP/ 103.5/02/2037 para la realizacin de mi Doctorado en Ciencias. Al M en C. Rafael Urza Macias Rector de la Universidad Autnoma de Aguascalientes por su confianza y apoyo incondicional. Al Dr. Rafael Gutirrez Campos, por la direccin de esta tesis, asesora, invaluables consejos y su gran amistad, mi agradecimiento sincero. Al Dr. Eugenio Prez Molphe-Balch, por la asesora, revisin del escrito, apoyo y su gran amistad, mil gracias. Al Dr. Oscar Rebolledo Domnguez, por la asesora, brindada durante todo este proceso y por su gran amistad. Al Dr. Jaime Molina Ochoa, por la asesora brindada y acertadas sugerencias. Al Dr. Juan Alberto Osuna Castro y el Dr. Elpidio Pea Beltrn, por las sugerencias en la parte experimental, en la revisin del escrito y por la confianza brindada. Al Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. Roberto Lezama Gutirrez, Dr. Alfonso Pescador Rubio, por su valiosa revisin y sugerencias en durante todo este proceso. Al M en C Carlos Dvila Figueroa y a la TLQ Martha Prez Reyes, por su gran apoyo tcnico. A M en C. Cristina Garcidueas Pia, por el apoyo, amistad y su gran amor, mil gracias. A Elizabeth Lizardi Juregui, Mariana Muoz Vega, Mireya Delgado Gutirrez, Sandra Camacho, Bernardo Velsquez, por su amistad y apoyo. A todos mis compaeros del posgrado en Ciencias por compartir esta aventura y superacin.
Y sin olvidar a mis hermanos y hermanas y a la familia Morales Ruiz, gracias por todo. Y otra vez, a todos los mencionados y los que me faltaron, mil gracias.
ndice
ndice de figuras---------------------------------------------------------------------------------------I
ndice de tablas----------------------------------------------------------------------------------------II
Abreviaturas--------------------------------------------------------------------------------------------III
Resumen------------------------------------------------------------------------------------------------IV
Abstract---------------------------------------------------------------------------------------------------V
I INTRODUCCIN -----------------------------------------------------------------------------------1
II ANTECEDENTES-----------------------------------------------------------------------------------5
2.1 Origen e historia de la papa.---------------------------------------------------------------5
2.2 Taxonmia y cultivo de la papa.----------------------------------------------------------5
2.3 Produccin de papa.-------------------------------------------------------------------------6
2.4 Importancia de la papa----------------------------------------------------------------------8
2.5 Daos en papa. ---------------------------------------------------------------------------9
2.6 Proteasas.-------------------------------------------------------------------------------------12
2.7 Inhibidores de Cisten proteinasas.-----------------------------------------------------13
2.8 Estudio molecular del gen de la cch.---------------------------------------------------16
2.9 Cultivo de tejidos en papa.----------------------------------------------------------------17
2.10 Microtuberizacin.--------------------------------------------------------------------------20
2.11 Factores que inducen la microtuberizacin.-----------------------------------------21
2.12 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por
Agrobacterium tumefaciens. --------------------------------------------------------------23
III MATERIALES Y METODOS --------------------------------------------------------------------25
3.1 Materiales--------------------------------------------------------------------------------------25
3.2 Mtodos----------------------------------------------------------------------------------------25
3.2.1 Construccin del plsmido Pcambia:cch.-------------------------------------------25
3.2.2 Aislamiento de DNA plasmdico mediante mini preparaciones por
el mtodo de Birboin.------------------------------------------------------------------------28
3.2.3 Micropropagacin de plntulas axnicas de papa mediante cultivo
de tejidos vegetales.-------------------------------------------------------------------------29
3.2.4 Regeneracin de papa va organognesis.-----------------------------------------29
3.2.5 Microtuberizacin.-------------------------------------------------------------------------30
3.2.6 Registro y anlisis de datos.------------------------------------------------------------31
3.2.7 Germinacin de los microtubrculos y aclimatacin.-----------------------------32
3.2.8 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por
Agrobacterium tumefaciens.---------------------------------------------------------------32
3.2.9 Anlisis histoqumico del gen uidA (gus).-------------------------------------------35
3.2.10 Anlisis molecular de las plantas transformadas mediante la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).-----------------------------------------35
IV RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------------------37
4.1 Construccin y anlisis molecular del vector Pcambia:cch.----------------------37
4.2 Produccin de brotes a partir de tubrculos de la papa.--------------------------40
4.3 Propagacin de plntulas de papa. ----------------------------------------------------40
4.4 Regeneracin.--------------------------------------------------------------------------------41
4.5 Produccin de microtubrculos.---------------------------------------------------------45
4.6 Germinacin de microtubrculos.-------------------------------------------------------48
4.7 Transformacin de plantas.---------------------------------------------------------------50
V DISCUSIN ------------------------------------------------------------------------------------55
VI CONCLUSIONES----------------------------------------------------------------------------68
VII LITERATURA CITADA---------------------------------------------------------------------69
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Produccin mundial de papa -----------------------------------------------------7
Figura 2. Produccin nacional de papa ----------------------------------------------------8
Figura 3. Diagrama del uso integral de la papa.-----------------------------------------10
Figura 4. Mecanismo propuesto para la inhibicin de cisten proteasas ---------16
Figura 5. Proceso de tuberizacin en papa. ---------------------------------------------21
Figura 6. Mapa del vector pKYLX80 -------------------------------------------------------26
Figura 7. Mapa del vector pCAMBIA:2301 -----------------------------------------------27
Figura 8. Anlisis de restriccin de pUC18:cch -----------------------------------------38
Figura 9. Anlisis de restriccin de pBSK-:cch. -----------------------------------------38
Figura 10 Anlisis de restriccin de pCAMBIA:cch -------------------------------------39
Figura 11. Mapa de la construccin pCAMBIA:cch.-------------------------------------39
Figura 12. Micropropagacin in vitro de plntulas de papa.--------------------------40
Figura 13. Regeneracin de papa a partir de tallos.------------------------------------42
Figura 14. Produccin de tejido calloso en explantes de hoja y tallo --------------43
Figura 15. Formacin de brotes a partir de tejido calloso.-----------------------------43
Figura 16. Regeneracin de papa a partir de callos ------------------------------------44
Figura 17. Enraizamiento de plntulas de papa.-----------------------------------------44
Figura 18. Efectos de la luz contina en la produccin de tubrculos.-------------47
Figura 19. Efectos de la oscuridad en la microtuberizacin -------------------------47
Figura 20. Efecto de la sacarosa y cinetina sobre la microtuberizacin.----------48
Figura 21. Germinacin de microtubrculos.----------------------------------------------49
Figura 22. Adaptacin en suelo de plantas de papa ------------------------------------49
Figura 23. Comparacin entre plntulas transformadas y no transformadas. ----52
Figura 24. Verificacin de plantas transformadas mediante PCR.-------------------53
Figura 25. Anlisis de gus papa transformadas. -----------------------------------------53
Figura 26. Plantas regeneradas de papa con el gen de la cch.-----------------------54
Figura 27. Verificacin de plantas transgnicas por PCR y GUS.--------------------54
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tratamientos analizados para la regeneracin de papa.----------------30
Tabla 2. Tratamientos analizados para la microtuberizacin.---------------------31
Tabla 3. Primera transformacin gentica de plantas de papa.------------------34
Tabla 4. Segunda Transformacin gentica de plantas de papa.----------------34
Tabla 5. Efecto de varias combinaciones de los reguladores de
crecimiento en la regeneracin de papa.-------------------------------------------41
Tabla 6. Tratamientos in vitro utilizados para la microtuberizacin.-------------45
Tabla 7. Anlisis de la expresin de GUS en explantes de hoja
y tallo de papa.----------------------------------------------------------------------------51
ABREVIATURAS
Krpm Kilo (mil) revoluciones por minuto.
L Litros
ml Mililitros
l Microlitros
Kg. Kilogramos
g Gramos
mg Miligramos
g Microgramos
ng Nanogramos
M Molar
mM Milimolar
M Micromolar
hr Hora
min. Minuto
cm Centmetro
pb Pares de bases
RNAasa Ribonucleasa
DNAasa Desoxirribonucleasa
Micro
U/l Unidades por microlitro
PCR Reaccin en cadena de la polimerasa
Npt II Neomicina fosfotransferasa II.
cch Gen de la cistatina C humana
oc-I Gen de oryzacistatina ( cistatina del arroz)
MS Medio de cultivo de Murashige y Skoog
BA Bencil adenina
AIA cido indol actico.
Cb Carbenicilina
Km Kanamicina
C Grados centgrados
RESUMEN
TRANSFORMACION GENTICA DE PLANTAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.) CON EL GEN QUE CODIFICA PARA EL INHIBIDOR DE CISTEN PROTEINASAS DE ORIGEN
HUMANO; CISTATINA C.
Se optimiz un sistema de regeneracin in vitro por organognesis en Solanum tuberosum cv. Alfa sin el uso de zeatina. Se utilizaron explantes de hojas y tallos provenientes de plntulas de 4-5 semanas cultivadas in vitro. La formacin de callo ocurri despus de 4-5 semanas y los brotes aparecieron de 8-10 semanas despus de la formacin de los callos en medio MS conteniendo 0.05 mgL-1 TDZ, 0.1 mgL-1 BA, 1 mgL-1 GA3 y 1 mgL
-1 AIA. Alrededor del 97% de los explantes cultivados formaron callo, y la regeneracin de brotes ocurri con una frecuencia del 85.7% relativa al total de callos formados. Por otro lado, se analizaron algunos procesos para la microtuberizacin en este mismo material gentico de papa. El cultivo de segmentos nodales con un brote en MS 100% ms 2.5 mgL-1 de cinetina result en un incremento en la formacin de microtubrculos bajo condiciones de un pretratamiento de incubacin de 14 das en la oscuridad seguido por un fotoperiodo de das cortos. Los segmentos nodales produjeron en promedio 7.30.3 microtubrculos por explante. Los sistemas de regeneracin y microtuberizacin optimizados en este trabajo permitirn reducir el tiempo y costos para la propagacin de plantas de papa con caractersticas deseables.
Asimismo, se llev a cabo la transformacin de Solanum tuberosum cv. Alfa con el gen de la cistatina C humana, el cual codifica una protena pequea que es un potente inhibidor de proteasas y a la cual se le ha asignado potencial para proteccin de cultivos de inters econmico. El transgen estuvo regulado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor potenciado (35S2). La transformacin fue realizada mediante cocultivo con las cepas EHA 105, PVG 2260 y AGL 1226 de A. tumefaciens. Los anlisis moleculares de expresin y presencia del transgen en las plantas presuntamente transformadas consistieron en anlisis histoqumicos de actividad de GUS y la tcnica de PCR con oligos especficos dirigidos a los genes cch, nptII, uidA y virD1. El transgen pareci mostrar una sobre expresin temprana ya que las plantas generadas presentaron efectos pleitrpicos fisiolgicos tales como enanismo, decremento en la dominancia apical, hojas pequeas delgadas y etioladas, as como una necrosis en el sitio de corte del tallo posiblemente debida a una apoptosis lenta. La optimizacin de este sistema de expresin permitir analizar el potencial de la cistatina C como agente de proteccin contra fitopatgenos de cultivos importantes. Palabras clave: Solanum tuberosum, cv. alfa, callo, microtubrculo, cinetina.
ABSTRACT
TRANSFORMATION OF Solanum tuberosum, CV. ALPHA, WITH GENE ENCODING TO CYSTEINE PROTEASE INHIBITORS FROM HUMAN; CYSTATIN
C. An in vitro organogenesis-based regeneration system was optimized for Solanum
tuberosum cv. Alfa without using zeatin. Leaves and stems from 4-5 week-old in vitro grown plantlets were used as explant source. Callus formation occurred after 4-5 weeks and shoots appeared 8-10 weeks after callus formation in Murashige & Skoog (MS) medium containing 0.05 mgL-1 TDZ, 0.1 mgL-1 BA, 1 mgL-1 GA3 and 1 mgL
-1
AIA. About 97% of the cultivated explants formed calli, and shoot regeneration occurred at a frequency of 85.7% relative to the total of calli formed. On the other hand, several processes for the microtuberization of this potato genetic material were analyzed. Cultivation of nodal segments containing one shoot on 100% MS amended with 2.5 mgL-1 of kinetin resulted in increased microtuber formation under conditions involving an incubation pre-treatment of 14 days in darkness followed by a short-day photoperiod. Nodal segments produced an average of 7.30.3 microtubers per explant. The regeneration and microtuberization systems optimized in the present work will permit reductions in time and costs for the propagation of potato plants with desirable characteristics.
In addition, Solanum tuberosum cv. Alfa was transformed with the human cystatin C gene, encoding a small protein with a potent protease-inhibiting activity and potential for protection of crops of economic interest. The transgene was regulated by a potentiated form of the cauliflower mosaic virus promoter (35S2). Transformation was carried out by co-culture with A. tumefaciens EHA 105, PVG 2260 and AGL 1226 strains. Molecular analyses for transgene expression and presence in putatively transformed plants consisted in histochemical analyses for GUS activity and PCR with specific oligos targeted at the cch, nptII, uidA and virD1 genes. The transgene seemed to show early overexpression in view that transformed plants presented physiologic pleiotropic effects such as dwarfism, decreased apical dominance and small, thin etiolated leaves, as well as necrosis at the stem cut site possibly due to slow apoptosis. Optimization of this expression system will allow for the analysis of the potential of cystatin C as a protection agent against phytopathogens of important crops. Keywords: Solanum tuberosum, cv. alfa, calli, microtuber, kinetin.
1
I INTRODUCCIN
Por su gran inters agrcola y econmico la papa (Solanum tuberosum L.) es uno
de los principales cultivos de cosecha a nivel mundial, sin embargo, existen grandes
prdidas debido tanto a factores biticos como abiticos. Entre los factores biticos
que ms daan a la papa se encuentran, las plagas y los patgenos (Atkinson et al.,
2001).
La Biologa Molecular de plantas, ofrece nuevas alternativas para el control de
plagas y patgenos, as como para la generacin de materiales con caractersticas
agronmicas ventajosas al lograr transferir material gentico exgeno (transgen) que
le confiera alguna de las caracterstica deseadas (Lawrence, 2002).
Existen varios mtodos de transformacin en plantas, sin embargo una de las vas
posibles para aumentar la eficacia de estos mtodos es la optimizacin de la
capacidad de regeneracin in vitro de las plntulasespecies a trabajar (Powell et al.,
1990; Le, 1991; Ly et al., 1996; MHamdi et al., 1998). En plantas de papa, es posible
la transformacin de diferentes cultivares comerciales, a partir de segmentos de tallo
y hojas desarrolladas in vitro, anteras y de discos de microtubrculos (Gmez et al.,
1997; Rodrguez et al., 2000; Trujillo et al., 2001).
Entre los genes ms estudiados como de defensa en plantas estn los que
codifican para inhibidores de proteasas (Boulter, 1993; Urwin et al., 1995; Atkinson et
al., 2001). Los inhibidores de proteasas, son pequeas protenas, que generalmente
se encuentran en altas concentraciones (10% del contenido proteco) en tejidos de
almacenamiento de la planta, pero tambin se han detectado en las hojas como
respuesta al ataque de insectos y microorganismos patgenos. Tales inhibidores se
unen con alta afinidad pero reversiblemente a enzimas proteolticas en un sitio
especfico de tal modo que inhiben su actividad (Urwin et al., 1997; Koiwa et al.,
2000; De Leo et al., 2002).
Con formato: Fuente: Cursiva
2
Los inhibidores de proteasas ms estudiados son del tipo cisten proteinasas o
cistatinas y entre estos se encuentran el oc-I (oryzacistatina de arroz) aislado de
semillas de arroz (Arai et al, 2002), y cch (cistatina c Humano) aislado de suero de
pacientes con enfermedades autoinmunes y esta presente en altas concentraciones
en mucho fluidos biolgicos como: el plasma seminal, fluido cerebroespinal y en bajas
concentraciones en otros fluidos como saliva y orina humana (Abrahamson et al.,
1990). En plantas transformadas genticamente con cistatinas exgenas
principalmente con el oc-I, indican que este tipo de inhibidores juega un papel clave
en la defensa contra diferentes plagas y patgenos (Valueva y Mosolov, 2004). Sin
embargo, no existen estudios reportados donde el gen de la cch se haya expresado
en plantas pero, los estudios ms sobresalientes de este gen son en sistemas de
expresin bacterianos donde se obtienen grandes cantidades de esta protena sin
perder sus propiedades fisicoqumicas (Abrahamson, 1988). Otro punto importante
de esta protena, se refiere a los efectos que tiene en el auto procesamiento del virus
del ciruelo, ya que este tipo de inhibidor interviene en la protelisis de la poliprotena
viral producida por el propio virus impidiendo su procesamiento infectivo (Garca et
al., 1993; Gutirrez-Campos et al., 1999). La propuesta hecha por Irie et al. (1996)
sobre la funcin de las cistatinas como inhibidores del auto procesamiento de los
potivirus ha sugerido que la cch puede jugar un papel clave en el reconocimiento e
inhibicin de proteasas exgenos o actuar en las enzimas digestivas de los intestinos
de los insectos.
Sin embargo, en plantas de papa de la variedad alfa transformadas genticamente
con el del gen de la cch podran mostrar resistencia o tolerancia a plagas y
patgenos.
Pero para que la transformacin sea eficiente se requiere de un sistema ptimo de
regeneracin. Existen diversos trabajos sobre regeneracin en papa donde se
demuestra que hay una gran dependencia del genotipo en la capacidad y eficiencia
de regeneracin (Park et al. 1995). Sin embargo, el factor ms importante para que la
3
regeneracin sea posible es el balance adecuado de reguladores del crecimiento
(Yadav y Sticklen, 1995).
La mayora de los protocolos de regeneracin en papa, se basan en colocar los
explantes en tres diferentes medios en composicin: 1) para la induccin de tejido
calloso, 2) para la induccin de brotes y 3) Enraizamiento, provocando que este
sistema sea ms laborioso y consuma tiempos ms largos (Park, 1995; Hulme et al,
1992; Curry y Cassells, 1999). Sin embargo, tambin existen protocolos de
regeneracin en un slo paso, que consisten en colocar explantes en el mismo
medio de cultivo con una adecuada combinacin de reguladores del crecimiento
hasta la obtencin de plntulas (Trujillo et, al. 2001; Rodrguez et al. 2001).
En el caso del cultivo de papa, particularmente en la variedad alfa (la de mayor
produccin y consumo en nuestro pas), es posible la produccin de plantas y
tubrculos libres de enfermedades, germoplasma, conservacin y sistemas de
transformacin gentica, sin embargo estos mtodos son lentos, costosos e
ineficientes.
Debido a lo anterior, en el presente trabajo realizamos estudios in vitro con la
planta de papa de la variedad alfa con el fin de establecer metodologas de
propagacin, microtuberizacin, aclimatacin de plntulas y microtubrculos, as
como un sistema eficaz de regeneracin va organognesis en un slo paso. De la
misma forma se generaron plantas transformadas genticamente a travs del
sistema Agrobacterium tumefaciens con el cDNA del gen de la cistatina C humana
(cch). Dicha protena fue seleccionada debido a su alta capacidad inhibitoria de
cisten proteinasas cuando es evaluada in vitro (contra la actividad enzimtica de
papana), demostrando que es mayor que en el caso de la oc-I.
4
hiptesis:
El sistema de regeneracin in vitro en un slo paso es adecuado para la
transformacin de plantas de papa mediante Agrobacterium tumefaciens con el gen
de la cch, y las plantas transformadas que se generen tendrn dicho gen.
Objetivo general.
Desarrollar un sistema in vitro de regeneracin va organognesis de plantas de papa
y transformar explantes de hoja y tallo mediante Agrobacterium tumefaciens con el
gen de la cistatina C humana.
Objetivos especficos
1. Optimizar un sistema de propagacin y microtuberizacin a partir de
segmentos nodales de plntulas de papa crecidas in vitro.
2. Optimizar un sistema de regeneracin va organognesis a partir de explantes
de hoja y tallo de plntulas crecidas in vitro.
3. Transformar genticamente plantas de papa a partir de explantes de hoja y
tallo de plntulas crecidas in vitro con el gen de la cistatina C humana (cch)
mediada por Agrobacterium tumefaciens.
4. Verificar la transformacin gentica mediante tincin histoqumica de GUS y
por PCR para los genes nptII, virD, gus y cch de lneas de papa como posibles
transformantes.
5
II ANTECEDENTES
2.1 Origen e historia de la papa
La palabra papa proviene del vocablo quechua que significa tubrculo, es una
planta tuberfera originaria de Amrica (Hawkes y Lester, 1977). Existen dos centros
de biodiversidad de papa silvestre: uno que est localizado en la regin central de
Mxico, y el segundo entre la regin central del Per y el noroeste Argentino.
Algunasde Argentina. Algunas variedades silvestres son originarias de Mxico. Los
incas del Per han cultivado esta hortaliza desde hace dos mil aos, lo que habla de
la tradicin de este producto en las culturas indgenas del continente. Fue introducida
a Europa despus de la conquista de los espaoles, apareciendo gradualmente en
varios pases europeos durante los siglos XVII y XVIII. Durante el periodo de 1600 a
1845, la papa se constituy como la principal fuente de alimentos de Irlanda, siendo
los inmigrantes de este pas los que la trajeron a Norteamrica en el ao de 1719. Por
sus altos rendimientos por hectrea y sus caractersticas alimenticias, diversas
naciones del viejo mundo incorporaron su cultivo con el fin de evitar los rigores de las
hambrunas entre sus pueblos (Hawkes, 1977; Alonso, 1991).
2.2 Taxonmia y cultivo de la papa
El cultivo de la papa se ha extendido por todo el mundo a excepcin de los pases
tropicales. La papa (Solanum tuberosum L.) pertenece a la familia Solanaceaefamilia
Solanaceae; es una planta dicotilednea herbcea anual, sus races son muy
ramificadas, finas y largas, el tallo se origina en las yemas del tubrculo y es grueso,
fuerte y anguloso con una altura que vara entre los 0.5 y 1 metros; por lo general
consta de nueve o mas foliolos cuyo tamao es mayor cuanto ms alejados se
encuentren del nudo de insercin (Hawkes, 1977).
Con formato: Color de fuente:Automtico
6
El fruto es una baya redonda de color verde, que al madurar se vuelve amarilla. A
la vez que tallos areos, la planta tiene tallos subterrneos; los primeros son de color
verde y contienen un alcaloide txico llamado solanina, que pueden formarse
tambin en los tubrculos cuando estos se exponen prolongadamente a luz. Los
tallos subterrneos o estolones, relativamente cortos, en sus extremidades se
convierten en tubrculos. En la superficie de los tubrculos se forman yemas
distribuidos en forma helicoidal, abundando sobre todo en la parte opuesta al punto
de insercin sobre el estoln. Aunque la papa puede multiplicarse por semillas y por
esquejes, en la prctica, la multiplicacin es siempre vegetativa, hacindose por
medio de los tubrculos que producen brotes en las yemas (Alonso, 1991).
En Mxico, la papa se produce tanto en el ciclo otoo-invierno como en el de
primavera-verano, aunque el ms importante es este ltimo ya que durante el mismo
se obtienen alrededor del 60 por ciento de la produccin. Se cultiva tanto en
condiciones de temporal como de riego destinndose para la primer modalidad
aproximadamente el 50 por ciento del total y el restante para riego (Sagarpa, 2004).
2.3 Produccin de papa
La produccin mundial de papa se increment rpidamente en las ltimas tres
dcadas, en una mayor proporcin que cualquier otro cultivo, exceptuando al trigo,
arroz y maz. Actualmente se cultiva en todo el mundo y en muchos pases es el
alimento bsico (Alonso, 2000; Sagarpa; 2004). En Alemania, Rusia y Polonia se
consumen alrededor de 180 kg de papa percpita por ao. Por su parte, el promedio
de consumo nacional percpita promedio en Mxico durante el periodo 1992-2001 fue
de 16.5 kilogramos por persona (Sagarpa, 2004). Pese a que la papa es un producto
originario de Amrica, la principal zona productora no est en el continente
americano, si no que est conformada por pases asiticos y europeos. Segn datos
de la FAO en el periodo comprendido entre 1992-200, la produccin mundial de papa
registr un incremento del 11 por ciento, al pasar de 277 millones de toneladas en
7
1992 a 308 millones en 2001. Casi el 60 por ciento de la produccin mundial de papa
se concentra en China, Rusia, Polonia, Estados Unidos, India y Ucrania (Fig. 1)
(Sagarpa, 2004).
Figura 1. Produccin mundial de papa en el periodo comprendido entre 1992-2001. En la figura se muestra grficamente la produccin mundial de papa en millones de toneladas (Y), por pas (X) (FAO, 2004).
En nuestro pas, la papa ocupa el quinto lugar en importancia, superado
nicamente por los granos bsicos (maz, frjol, arroz y trigo), entre las hortalizas solo
los cultivos de jitomate y chile verde ocupan una mayor superficie, en cuanto
produccin slo es superado por el jitomate (Sagarpa, 2004). En estos ltimos diez
(1992-2002) aos, los principales estados productores han sido: Sinaloa, Estado de
Mxico, Nuevo Len, Chihuahua, Sonora y Guanajuato (Fig. 2), quienes en conjunto
aportaron el 60 por ciento del total de la produccin nacional durante el periodo
analizado (Sagarpa, 2004).
0
100
200
300
400
500
600
China Rusia Polonia EstadosUnidos
India Ucrania Alemania Belosrusia Holanda Reino Unido Mxico
Pas
Mill
on
es d
e to
nel
adas
8
Figura 2. Produccin nacional de papa en el periodo comprendido entre 1992- 2001. En la figura se muestra grficamente el porcentaje de produccin nacional de papa por estado (Sagarpa, 2004).
2.4 Importancia de la papa
El destino de la produccin de papa en Mxico, est distribuido de la siguiente
manera: el 80% es consumida como alimento fresco, 7% para uso industrial y
alimentos procesados (papas fritas, almidn, alcohol, industria farmacutica) y el
13% restante, se utiliza como semilla. El 60% de las reas de cultivo de papa en
Mxico es ocupada por la variedad alfa, seguida por la variedad Lpez con un
25% y el resto lo componen entre las variedades Atlantic, White Rose, Bintje,
Nortea, Rosita, Mexiquense, entre otras.
En trminos de nutricin, 100 g de papa suplen cerca del 10% de la dosis diaria
de protena recomendada para nios, una consideracin importante para pases
que buscan mejorar la dieta de sus pobladores. Estos 100 g tambin proporcionan
el equivalente al 10% de los requerimientos de un adulto de tiamina, niacina,
Sinaloa17%
Mexico10%
Nuevo Len 9%
Chihuahua9%Sonora
8%
Guanajuato8%
Michoacan7%
Puebla7%
Coahuila5%
Jalisco4%
Veracruz4%
Otros12%
9
vitamina B6 y cido flico y cerca del 50% de vitamina C (Dilmer, 2000). Adems
de su consumo como producto fresco la papa tiene un gran potencial econmico
cuando es procesado para la industria alimentara, qumica, agroindustrial,
farmacolgica y en otras ramas industriales (Fig. 3).
Adems de que, la papa sufre varios procesos para diferentes usos, en la
actualidad se ha emprendido el mejoramiento en su produccin mediante
Biotecnologa , ya que en el pasado se enfoc en incrementar la produccin por
hectreas sembrada y en desarrollar variedades resistentes a plagas y
enfermedades (Van der Meer, 1994; Wu et al., 1995; Atkinson et al., 1997; Urwin
et al., 1997; Veramendi et al., 1999; Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Atkinson et
al., 2001; Zeh et al., 2001; Vsquez, 2001; Urwin, 2001; Lauterslager et al., 2001).
2.5 Daos en papa
El cultivo de la papa y su produccin, se ve afectado tanto por factores biticos y
abiticos. Entre los factores biticos, se encuentran principalmente los patgenos y
plagas, entre los patgenos ms importantes se encuentran Los patgenos mayor
considerados estn: las bacterias, destacando ; entre las que han causado severos
daos en la produccin y sanidad de la papa se incluyen a 2 subespecies
estrechamente relacionadaos de Erwinia carotovora (E. c, Subs. carotora y
astroseptica) que causa la pudricin blanda y es conocida comnmente como piedra
negra, Ralstonia solanacearum (Pseudomas solanacearum) que causa marchitez y
daa a nivel vascular en los tubrculos, dao conocido como vaquita de la papa y
Clavibacter michiganenesis sspSubs.. sepedinicum que causa la enfermedad como
pudricin anillada de la papa y marchitez.,
10
Figura 3. Diagrama del uso integral de la papa.
11
En lo que respecta a los en virus, existe una gran lista de los que se han
identificado en el cultivo de la papa a nivel mundial y su distribucin geogrfica esta
limitada a ciertas regiones lo que puede ser determinado por las condiciones
ambientales, el tipo del suelo, la presencia del vector y transmisin mecnica,. eEntre
los principales virus se encuentran: el virus X de la papa (potexvirus), los virus Y y A
de la papa (potivirus), el virus S de la papa (carla virus) y el virus del enrollamiento de
la hoja (luteovirus) y entre estos, los ms importantes son los del tipo potivirus
(Lozoya-Saldaa et al., 2002; Bakker et al., 2003).
Entre los , en hongos patgenos de papa, uno de los ms importantes es
Phyphthora infestans que causa la enfermedad conocida como tizn tardo (Lawrence
et al., 2002), fitoplasmas causantes de la punta morada, mientras que en los
nematodos fitoparsitos estn los del genero Globodera rostochiensis y Globodera
palliada; nematodos formadores del quiste de la raz (Urwin et al., 2000) y
Meloidogyne incgnita; nematodo formador de ndulos de la raz (Hussey y Jenssen,
2002; y en plagas algunos insectos como: colepteros y hempteros principalmente
(Ashok et al.,1998; Atkinson et al., 2001; Lawrence et al., 2002).
Tradicionalmente, el control de estas plagas y patgenos requiere de la rotacin
de la tierra, resistencia del husped y de plaguicidas qumicos. Las dos primeras
estrategias proveen un control incompleto y los plaguicidas son demasiados txicos y
provocan contaminacin ambiental (Urwin et al., 1998).
Una alternativa para controlar este tipo de plagas y patgenos, consiste en proveer a
la planta de defensas transfiriendo genes que codifican para inhibidores de proteasas
(Boulter, 1993; Urwin et al., 1998; Atkinson et al., 2001), estas protenas se unen a
enzimas proteolticas (proteasas), de tal modo que inhiben su actividad (Ryan, 1990;
Abe et al., 1991; Richardson, 1991).
12
2.6 Proteasas
Las proteasas son un grupo de enzimas que tienen la capacidad de degradar total
o parcialmente las protenas. El termino proteasa incluye a tanto a endopeptidasas
como a exopeptidasas, mientras que proteinasa es usado para describir solo a
endopeptidasas (Ryan, 1990).
Las primeras funciones asignadas a este tipo de enzimas derivaron de la
implicacin en la digestin de las protenas de la dieta (Turk, 1991). Actualmente, en
animales, su significado biolgico se ha ampliado notablemente y se ha reconocido
su papel central y especfico en mltiples procesos como la coagulacin sangunea,
la cicatrizacin de heridas, la ejecucin de los programas de apoptosis (Rodrguez-
Fragoso, 2000). Recientemente, se ha estudiado la actividad metablica de proteasas
principalmente de cisten proteinasas en los intestinos de diferentes plagas y en
diversos procesos celulares de patgenos que atacan a plantas de inters
agroalimentarios (Arai, 1996; Lilley et al., 1996).
En plantas, las proteasas juegan un papel importante en la degradacin de
protenas, como un proceso esencial para el crecimiento, desarrollo y respuestas a
diferentes factores ambientales. Aunque las plantas pueden sintetizar todos los
aminocidos de novo, una gran cantidad de nuevas protenas son derivadas del
reciclado de aminocidos. Los aminocidos pueden ser generados de la degradacin
de protenas de reserva en semillas o tejidos vegetativos. Bajo condiciones de estrs,
la degradacin de protenas es acelerada para mantener el suministro adecuado de
aminocidos. Por lo que la protelisis en plantas es un proceso muy complejo que
involucra muchas proteasas (Ho et al., 2000).
Las proteasas, se clasifican en base a su mecanismo de accin y son: sern,
aspartil, cisten y metalo proteasas (Barret, 1987; Chauhan, 1991; Grant, 1996;
Chinni, 1997; RodrguezFragoso et al., 2000). Entre las proteinasas msmayor
estudiadas se encuentra las del tipo cisten, debido a que tienen un papel central en
Con formato: Fuente: Cursiva
13
diferentes funciones de protelisis en plantas superiores, desde: el catabolismo de las
protenas de reserva de semillas y en procesos fisiolgicos y de desarrollo comohasta
senescencia y muerte celular programada (Ho et al., 2000; Solomon et al., 1999).
La mayora de las cisten proteinasas pertenecen a la familia de la papana y en
su secuencia de aminocidos muestran regiones conservadas homlogas entre ellas
y son reguladas intracelularmente (en cuanto a su actividad) por protenas
denominadas inhibidores de cisten proteinasas o cistatinas, las cuales se unen de
una manera especfica y reversible al sustrato (Barrett, 1987).
2.7 Inhibidores de cisten proteinasas (cistatinas)
Los inhibidores de proteasas, son pequeas protenas, que generalmente se
encuentran en altas concentraciones (10% del contenido total de protenas) en tejidos
de almacenamiento de la planta, pero tambin se han detectado en las hojas como
respuesta al ataque de insectos y microorganismos patgenos (Johnson et al., 1989;
Ryan, 1990; Botella et al., 1993; Boulter, 1993; Urwin et al., 1997; Koiwa et al., 2000;
De Leo et al., 2002).
El nombre de cistatina lo utiliz por primera vez Barret en 1981, aplicndolo a una
protena obtenida de huevo de gallina, que present una alta inhibicin con varas
cisten proteasas. Un nmero considerable de otras protenas aisladas y
caracterizadas presentan tambin esta inhibicin de proteasas y de acuerdo a la
secuencia de aminocidos y su comparacin con la cistatina de huevo de gallina, se
ha formado una superfamilia (Barret et al., 1987). En base a estos datos, las
cistatinas se han clasificado en una familia de cuatro miembros que son: Las
estfinas, cistatinas, kiningenos y fitocistatina (Turk y Bode, 1991; De Leo et al.,
2002).
14
Las estefinas son protenas de una sola cadena polipeptdica y carecen de
puentes de disulfuro, tienen un peso molecular de 11 kDa, as mismo, todas las
protenas de esta familia contienen la regin conservada del pentapptido Gln-Val-
Val-Ala-Gly.
Las cistatinas, al igual que las estfinas son protenas de una sola cadena pero,
presentan dos puentes disulfuro, su peso molecular promedio es de 13 kDa, y
presentan el pentapptido Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly.
Los kiningenos, son reconocidos como precursores de los procesos de la
coagulacin de la sangre y de procesos inflamatorios, adems de su funcin como
inhibidor de cisten proteinasas del tipo de papaina. Son las protenas de mayor peso
molecular de esta familia con cerca de 120 kDa.
Las fitocistatinas son protenas que se encuentran ampliamente distribuidas en
diferentes tejidos de la planta. Las principales representantes de este grupo son las
oc-I y oc-II, que fueron las primeras aisladas de semillas de arroz (Arai et al., 2002).
Tienen un peso molculas entre 12 y 16 kDa, no presentan enlaces disulfuro, estn
implicadas en los procesos de germinacin, senescencia y en defensa contra plagas
y patgenos (Boris et el., 1998; Botella et al., 1993; De Leo et al., 2002).
En nuestro grupo de investigacin estamos enfocados en el grupo 2 de las
cistatinas por su importancia en diversos procesos celulares, fisiolgicos y de defensa
en plantas. La familia de las cistatinas generalmente esta compuesta de 115 residuos
de aminocidos y con un peso molecular promedio a 13 kDa (Turk y Bode, 1991).
Son fuertes inhibidores reversibles de la cisten proteasa como la papana que inhibe
desde 1x10 12 M (Song, 1995; Abraham, 1991). Presentan regiones consenso en
aminocidos principalmente los conformados por Gln 53-Val-Val-Asp- Glu 57, dando
lugar a un lazo conformado por puente de sulfuro que reacciona con el sitio cataltico
del sustrato, asimismo, tambin estn presentes los residuos glicina 9 y alanina -10,
estos dos aminocidos forman dos lazos independientes, que interactan a travs de
puentes de hidrgeno y junto con el amino terminal adoptan una conformacin
15
altamente complementaria al sitio activo de la papana e impidiendo por lo tanto su
accin cataltica sobre el sustrato (Fig. 4) (Abe; 1987a, Fanos, 1999; Solomon, 1999).
El inhibidor de proteasas ms estudiado es la cistatina C humanao (cch), aislado
de suero de pacientes con enfermedades autoinmunes y est presentes en altas
concentraciones en mucho fluidos biolgicos tales como:: plasma seminal, fluido
cerebroespinal y en bajas concentraciones en otros fluidos como saliva y orina
humana (Abrahamson et al., 1990). La cistatina de huevo de gallina tambin es uno
de los ms estudiados y es usado como modelo accin de los inhibidores de
proteasas sobre su sustrato (Bode, 1990). El mecanismo de accin propuesto se
describe en la Figura 4.
La actividad de las cistatinas como inhibidores de proteasas se ha demostrado
tanto in vitro como en plantas transgnicas. Por ejemplo, Pernas et al., (2000),
demostraron la actividad antifngica de cistatinas extradas del castao que inhibi el
crecimiento de B. Cinerea, asimismo, se demostr esta actividad de cistatinas
extradas de semillas del mijo (Valueva, 2004).
En plantas transformadas genticamente con cistatinas exgenas, se ha visto que
este tipo de inhibidores brindan proteccin contra diferentes plagas y patgenos
debido a que estas enzimas suprimen la actividad metablica de cisten proteinasas.
En lo referente a la proteccin contra virus en plantas transgnicas de tomate, se
demostr que la expresin de oryzacistatina I y II, inhiben la replicacin de virus de la
familia picornavirus (Valueva, 2004). Por otro lado, en plantas de tabaco transgnicas
con el gen de la ocI, mostraron resistencia contra el virus del jaspeado del tabaco y el
virus Y de la papa; ambos virus pertenecientes a los potyvirus que utilizan cisten
proteinasas para el proceso de su genoma (Gutirrez-Campos et al.,1999; Valueva y
Mosolov, 2004). En la resistencia contra nematodos fitopatgenos Urwin et al .,
(1998, 2000) generaron plantas de papa con el gen de la oc-I, demostrando
resistencia a Globodera pallida y Meleoidogine incognita, asimismo Atkinson et al.
(2004) demostraron resistencia a Radopholus similis en pltano transgnico con un
el gen sinttico de la ocI (OcID86). En insectos, se analiz la actividad inhibitoria de
16
oc-I in vitro sobre la actividad biolgica de cisten proteinasas de coleopteros,
observado una completa inhibicin. Varias plantas transgnicas con genes de
inhibidores de proteasas se han generado y se ha demostrado la resistencia contra
diferentes plagas de insectos (Lawrence, 2002).
2.8 Estudio molecular del gen de la cch
Los estudios sobre la expresin de la cch en humanos son escasos sin embargo,
se han podido aislar cDNAs y verificar su expresin en diferentes tejidos humanos
como hgado, cerebro, pncreas, intestino, estmago, vesculas seminales y pulmn
(Fanos, 1999).Las evidencias ms notorias fueron detectadas en RNA mensajeros de
vesculas seminales, lo que pone de manifiesto que en la mayora de los fluidos
biolgicos y en el plasma seminal se presenta la mayor expresin de la cch
(Abrahamson, 1990). Sin embargo, los estudios ms sobresalientes de la cch han
sido en sistemas de expresin bacterianos donde se ha logrado obtener grandes
cantidades de esta protena exhibiendo las propiedades fisicoqumicas similares a las
nativas (Abrahamson, 1988).
Figura 4. Mecanismo propuesto para la inhibicin de cisten proteasas por medio de Cistatinas (Bode, 1990).
17
Otra caracterstica importante de esta protena se refiere a los efectos que tiene
en el auto procesamiento del virus del ciruelo, ya que este tipo de inhibidores
interviene en la protelisis de la poliprotena viral producida por el virus impidiendo su
procesamiento infectivo (Garca et al., 1993; Gutirrez-Campos et al., 1999). La
propuesta hecha por Irie et al. (1996) sobre la funcin de las cistatinas como
inhibidores del autoprocesamiento de los potivirus han sugerido que la cch puede
jugar un papel clave en el reconocimiento e inhibicin de proteasas exgenos a tales
enzimas digestivas en los intestinos de los insectos.
2.9 Cultivo de tejidos en papa
El cultivo de tejidos vegetales (CTV), es el conjunto de tcnicas que permite el
establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de la planta, desde
una clula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales y axnicas. As
mismo, es una herramienta de gran valor para la resolucin de problemas bsicos y
aplicados en la Biologa Molecular y Biotecnologa vegetal, ya que brinda la
oportunidad de disear modelos ideales para el estudio de la fisiologa, bioqumica,
gentica, clonacin, conservacin, manipulacin in vitro y en la obtencin de plantas
genticamente modificadas (Ross y ONeill, 2000).
El desarrollo de cualquier tejido vegetal es un proceso bastante complejo en el cual
intervienen una serie de factores tanto internos como externos. Entre los factores
internos que controlan el desarrollo de los diferentes tejidos vegetales destacan las
fitohormonas u hormonas vegetales o tambin conocidos como reguladores del
crecimiento vegetal (RCV).
Los RCV se clasifican en 5 grupos bsicos dependiendo de su estructura qumica
y su efecto fisiolgico y son: Las auxinas son compuestos derivados comnmente del
triptofano, y generalmente son sintetizados en los pices y estn implicados en varios
eventos relacionados con el crecimiento y desarrollo celular de la planta. participan en
la regulacin de algunos procesos como el crecimiento celular, la acidificacin de la
18
pared celular, el inicio de la divisin celular, la formacin de tejido calloso, la
diferenciacin del tejido vascular y la formacin de rganos. La auxina de origen
natural ms importante es el cido indolactico (AIA) y entre los sintticos se
encuentran el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D), cido naftalen actico (ANA) y el
cido 4-amino-3, 5, 6-tricloropiridin-2-carboxlico (picloram) (Prez-Molphe, 1999).
Las Citocininas, Generalmente son derivados de la adenina y son sintetizados
en tejidos jvenes y races. Se le han atribuido dos propiedades fundamentales para
CTV: 1) estimulan la divisin celular y 2) rompen la latencia de las yemas axilares
hacindolas brotar. En las plantas completas, tiene la funcin de promover la
brotacin de yemas axilares, estimula la expansin de las hojas y retardan la
senescencia. Las citocininas naturales ms comunes son la zeatina, Isopentiladenina
(2iP) y el ribsido de zeatina, y entre las sintticas estn la benciladenina (BA), la
cinetina (CIN) y el N-fenil-N-1,2,3-tidiazolil-5-urea (TDZ Tidiazuron) (Martnez-
Garcia et al., 2002).
El cido giberlico, puede utilizarse en algunos casos para la elongacin de
estructuras como brotes, y la aceleracin de brotes en ciertos tipos de yemas y
meristemos. cido abscsico, es utilizado en algunos casos para inhibir la
germinacin de embriones maduros o para completar el proceso de los mismos.
Una de las vas posibles para aumentar la eficacia de los mtodos de
transformacin gentica mediante Agrobacterium tumefaciens es la optimizacin de la
capacidad de regeneracin in vitro de las plntulasespecies a trabajar. Aunque las
clulas vegetales son totipotenciales y poseen la capacidad de diferenciarse, algunos
tejidos son ms fciles de ser inducidos para formar nuevas plantas. Las condiciones
necesarias para la regeneracin eficiente varan entre clulas de la planta y tejidos
as como de la especie (Powell et al., 1990; Le, 1991; Ly et al., 1996; MHamdi et al.,
1998)
19
En lo referente a la plantaespecie de inters, ha sido posible la regeneracin de
plantas completas de diversos cultivares comerciales, a partir de diferentes explantes;
segmentos de tallo y hojas desarrolladas in vitro (Visser et al., 1989; Visser, 1991;
Hulm et al., 1992; Yadav y Sticklen, 1995; Gmez et al., 1997; Rodrguez et al.,
2000; Trujillo et al., 2001), anteras, (De Block, 1988) y plantas enteras partiendo de
discos de tubrculos (Marchetti et al., 2000). Esto con el fin de producir cultivos
transgnicos resistentes a diferentes tipos de plagas, produccin de vacunas orales
contra diferentes enfermedades y en aumentar la calidad nutricional de la papa (Van
der Meer, 1994; Wu et al., 1995; Beaujean et al., 1998; Veramendi et al., 1999;
Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Zeh, 2001; Vsquez et al., 2001; Urwin, 2001;
Lauterslager et al., 2001).
A pesar de que a nivel mundial se han realizado numerosos trabajos en papa en
regeneracin y transformacin, se ha demostrado que existe una gran dependencia
del genotipo en la capacidad y eficiencia de regeneracin (Park et al. 1995). Sin
embargo, el factor ms importante para que la regeneracin sea posible es el balance
adecuado de reguladores del crecimiento, tales como auxinas y citocininas. Entre las
auxinas mejorms empleadas para la brotacin estn el cido indolactico (AIA) y la
bencilaminopurina (BAP) (Park, 1995) y el uso de citocininas como la zeatina pueden
mejor la eficiencia de la regeneracin (Yadav y Sticklen, 1995).
La mayora de los protocolos de regeneracin en papa, se basan en colocar los
explantes en diferentes medios de cultivo. pPrimeramente en uno diseado, para la
induccin de tejido calloso, y luego en otro para la induccin de brotes y por ltimo en
un medio de Eenraizamiento. Este proceso de regeneracin, lo que en esta especie
hace que sea ms laboriosa y consuma tiempos ms largos (Park, 1995; Hulme et al,
1992; Curry y Cassells, 1999). Sin embargo, tambin existen protocolos de
regeneracin en un solo paso, y el cual consisten en colocar explantes en el mismo
medio de cultivo hasta la obtencin de plntulas (Trujillo et, al. 2001; Rodrguez et al.
2001).
Con formato: Fuente: Cursiva
20
2.10 Microtuberizacin
La propagacin in vitro de papa mediante brotes axilares ha sido reportado por un
gran numero de investigadores y ha llegado ser un sistema efectivo para una rpida
multiplicacin de nuevos cultivos o existentes libres de enfermedades (Alisdair y
Willmitzer, 2001). Como alternativa del producto final de la micropropagacin de papa
son los pequeos tubrculos o microtubrculos. Los microtubrculos se usan
convenientemente para almacenar o transportar germoplasma y tambin pueden ser
adaptados para una produccin a gran escala (Hussey y Stacey, 1981; Estrada et al.,
1986; Ortiz y Lozoya 1987; Banfalvi et al., 1997; Eugichi, 2000).
El tubrculo de la papa no se forma en la raz como comn se piensa, si no que se
desarrolla en un tallo subterrneo llamado estoln. En condiciones que no son
favorables para la formacin del tubrculo como por ejemplo. dDas largos (LD; por
sus siglas en ingls), los estolones frecuentemente emergen fuera del suelo y
producen un nuevo brote, sin embargo en condiciones favorables como das cortos
(SD: por sus siglas en ingls), los estolones siguen creciendo hasta el hinchamiento
de la punta para formar el tubrculo. Este hinchamiento es debido a que el estoln
deja de crecer y las clulas de la punta y del cortex se alargan y se dividen
transversalmente. Ms tarde las clulas en la regin perimedular se extienden y se
dividen en orientaciones al azar para formar el tubrculo maduro (Fig. 5). (Vecchio et
al., 1994; Alisdair y Willmitzer, 2001).
Con formato: Fuente: Cursiva
21
Figura 5. Proceso de tuberizacin en papa. La figura muestra las diferentes etapas de formacin del tubrculo de papa en la punta de los estolones (Viola et al. 2001).
Los procesos de desarrollo del tubrculo, son difciles de estudiar en campo o en
plantas crecidas en tierra, debido al bajo nivel de sincrona de los procesos de
tuberizacin en esas condiciones. Para evitar estos problemas, se han desarrollado
mtodos in vitro, que conducen a una sincronizacin de la tuberizacin, as como a
una alta frecuencia de produccin (Villafranca et al., 1998; Alisdair y Willmitzer, 2001;
Coleman et al.; 2001).
2.11 Factores que inducen la microtuberizacin
La induccin de la microtuberizacin es debido tanto a factores ambientales como
endgenos, haciendo que esta sea favorecida por: foto perodos principalmente de
das cortos (SD), principalmente; temperatura relativamente bajas (20-24 C), alta
concentracin de sacarosa (8-10%) al medio de cultivo, intensidad de luz alta, baja
cantidad de nitrgeno y la adicin de reguladores del crecimiento como citocininas
(Hussey y stacey, 1984; Suttle, 1998; Jackson, 1999; Alisdair y Willmitzer, 2001;
Martnez-Garca et al., 2002).
a) Efecto de la sacarosa sobre la tuberizacin.
Xu et al. (1998), mencionan que la microtuberizacin es altamente dependiente de
la concentracin de sacarosa, y que a su vez este carbohidrato es un inductor de
22
varios genes en el tubrculo, tales como Llos de la patatina (protena de reserva),
inhibidor de proteinasas II (regulador de proteasas) y ADP-Glc pirofosforilasa. Sobre
la concentracin de sacarosa, los mismos autores reportan, que existen altos niveles
de GA en la punta de los estolones (puesto que GA, es un inhibidor de la
microtuberizacin) cuando se agrega al medio una concentracin del 1% de sacarosa
y disminuyen cuando se incrementa la cantidad de sacarosa en un 8%, sugiriendo
que la sacarosa puede modular los niveles de GA en los estolones y desarrollar
mayor cantidad de estos para la induccin de los tubrculos. La prueba principal de
estos datos se basa en la produccin de plantas transgnicas de papa con el gen en
antisentido de la ADP-Glc pirofosforilasa, donde se observ que los tubrculos tienen
una baja actividad de esta enzima y por lo tanto niveles bajos de almidn, as mismo,
se observ que el nico cambio fue un incremento en el nmero de tubrculos
producidos y un decremento de tamao (Muller-Rober et al., 1992; Xu et al., 1998).
Aunque algunos investigadores han propuesto que no es necesario la adicin de
sacarosa al medio para la microtuberizacin ya que, esta se puede dar bajo otras
condiciones externas como temperatura y fotoperiodos de das cortos (Garner y
Blake, 1989). Sin embargo, existe un mayor nmero de investigadores que aseguran
que las altas concentraciones de sacarosa promueve la microtuberizacin y que
posiblemente esta se d sin sacarosa dependiendo del genotipo que se estudie
(Jackson, 1999).
b) Efectos del fotoperiodo sobre la tuberizacin
Algunas especies de papa tales como: S. dDemissum, y S. Ttuberosum son
plantas de das corto que requieren de 12 horas luz o menos para el proceso de la
microtuberizacin. El fotoperiodo tiene un efecto importante sobre los niveles de GA
en muchas especies de papa, puesto que existe un incremento de GA en plantas
puestas sobre LD que en SD. Por ejemplo, se ha visto que los niveles en la actividad
de GA decrecen en hojas de plantas de S. tuberosum ssp. Andigena, cuando son
transferidas de LD a SD (Dobranzki y Mandi, 1993; Seabrook et al., 1993; Jackson;
1999; Dobranzki, 2001).
23
En otros estudios se ha comprobado el efecto que tiene el fotoperiodo sobre la
ruta metablica del GA; en espinaca y chcharo, donde existe baja actividad de las
enzimas GA 20-oxidasa y de la GA12-aldehdo involucradas en la sntesis de GA y
por ende menos actividad de GA. Asimismo, estos estudios sobre los efectos del
fotoperiodo ha sido bien documentado por varios investigadores sobre una amplia
gama de variedades de papa obteniendo mayor cantidad de microtubrculos (Gopal
et al., 1998).
c) Efectos de la temperatura.
Las altas temperaturas (28 C o ms) son inhibitorias para la microtuberizacin ya
sea en SD o LD, aunque los efectos inhibitorios se han visto ms en SD.
Las altas temperaturas afectan la particin de los asimilados de carbono,
decreciendo la cantidad de estos hacia los microtubrculos e incrementando la
cantidad a otra parte de la planta. Este efecto se estableci mediante la variacin de
temperatura en diferentes partes de la planta (30 C 35 C alta y 17-26 C bajas)
donde se observ que las altas temperaturas dan origen a plntulas con brotes
laterales y e inhibiendo parcialmente la microtuberizacin, bloqueando el desarrollo
de los estolones (Jackson, 1999).
2.12 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por Agrobacterium tumefaciens
La transformacin gentica de diferentes variedades de papa mediada por A.
tumefaciens, ha sido mundialmente utilizada para la introduccin de genes forneos
(De Block 1988; Visser et al. 1989; Dymocket al., 1991; Mitten et al. 1990; Escudero
et al., 1995; Pfitzner, 1998; Chong y Langridge, 2000). Sin embargo, muchos de
estos mtodos son poco eficientes, debido principalmente a una baja produccin de
brotes en el medio utilizado para la regeneracin. A pesar de esto, se ha tenido xito
en la transformacin de diferentes variedades de papa para producir cultivos:
resistentes a varios tipos de plagas; con vacunas orales contra diferentes
enfermedades; y con mayor calidad nutricional (Van der Meer, 1994; Wu et al., 1995;
Urwin et al., 1995; Constabel, 1999; Veramendi et al., 1999; Kumar et al., 1995;
24
Bendalman et al., 2000; Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Urwin et al., 2001; et al.,
2001; Vsquez, 2001; Lauterslager et al., 2001).
En algunos casos ha sido necesario optimizar mtodos de transformacin para
variedades especficas de papa. Como Beaujean et al., (1998) quienes trabajaron
con Bintje, Desire y Kaptah Vande; y de Trujillo et al., (2001) trabajando con Diacol
Capiro (DC) y Parda Pastusa (PP). Sin embargo, Y een la mayora de los casos se
han utilizado sistemas de regeneracin ya establecidos para la misma o diferente
variedad, con el fin de verificar la expresin y funcionalidad del gen de inters. Por
ejemplo en la transformacin de la variedad Desire mediada por A. tumefaciens,
Lecardonnel et al., (1999) utilizaron los genes marcadores nptII y uidA y observaron
que la expresin en las hojas provoca rechazo alimenticio a larvas de Leptinotarsa
decemlineata S (escarabajo dorado de la papa); Zeh et al., (2001), expresaron el gen
en antisentido de la treonina sintasa con el fin de verificar el punto de divergencia
entre la sntesis de los aminocidos treonina y metionina, como consecuencia de
esto se obtuvo una alta acumulacin de metionina en las plantas transgnicas, lo que
hizo que estas tuvieran un gran valor nutricional; y Narvez y Ryan (2002) trabajando
con la misma variedad, pero con el gen precursor de la sistemina, transformaron
segmentos de tallo y secciones de microtubrculos donde se generaron plantas con
caractersticas resistentes a heridas y patgenos. En variedades Europeas como la
116/86, se utilizaron diferentes medios de regeneracin, tal es el caso de
Moravckova et al., (2004) quienes transformaron con los genes fusionados de la
quitinasa III y de la glucanasa I, donde las plantas transformadas mostraron
inhibicin del crecimiento del hongo Rhizoctonia solan, al estar en contacto con
estas; Chakraborty et al., (2000) trabajaron con la misma lnea pero con el gen AmA1
de Amaranthus hypochondriacus, que codifica para una protena rica en aminocidos
esenciales donde se logr obtener tubrculos con un alto valor nutricional para los
humanos. En algunas otras se obtuvieron plantas con caractersticas resistentes a
nematodos utilizando el gen de oryzacistatina I (Urwin et el., 1998; Cowgill et al.,
2002; Urwin et al., 2000; Urwin et al., 2003; Hussey et al., 2002; Williamson y
Hussey, 1996).
Comentario [EPMB1]: Estos son genes marcadores, no pueden conferir resistencia por si mismos
Comentario [EPMB2]: Sistemina?
25
III MATERIALES Y METODOS
3.1 Materiales
Material vegetal de tubrculo de papa variedad alfa, donado por el Ing. Roberto
Garcidueas del Comit Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Guanajuato
(CESAVEG).
Cepas bacterianas
Agrobacterium tumefaciens para la transformacin de las cepas EHA 105,
PGV 2260 y AGL1226.
Escherichia coli: cepa DH5, para la transformacin bacteriana en el diseo de las
construcciones utilizadas.
3.2 Mtodos 3.2.1 Construccin del plsmido pCAMBIA:cch
El gen de la cistatina C humana , se encontraba inicialmente clonado en el vector
pUC18 en los sitios de restriccin Eco RI. Con el fin de generar nuevos sitios de
restriccin en el gen de la cch y clonarlo en el vector de expresin de plantas
pCAMBIA 2301, primeramente se liber el gen de la cch del vector pUC18 mediante
restriccin con la enzima Eco RI, siguiendo el protocolo descrito por Sambrook et. al.,
(1989) este fragmento posteriormente se subclon en el vector pBSK- y luego en el
vector pKYLX80 (Fig. 6).
Como se puede apreciar en la Figura 7, el vector pCAMBIA carece del promotor
que dirija la expresin del transgen de la cch y as como de la secuencia de
terminacin. Para que el gen de la cch tuviera el promotor y el terminador, se fusion
el promotor del virus del mosaico de la coliflor potenciado (35S2 ) y el terminador de la
ribulosa bifosfato carboxilasa (rbcS 3), en el sitio de clonacin mltiple del vector
Comentario [EPMB3]: dnde se obtuvo?
26
pCAMBIA, ambos fragmentos fueron cortados mediante restriccin del vector
pKYLX80. El promotor se liber con las enzimas Eco RI y Bam HI y el terminador de
la rbcS 3, con Bam HI y Cla I (Fig. 7B).
La construccin pCAMBIA:cch, fue incorporada mediante transformacin gentica
bacteriana en la cepa curada DH5 de E. coli por choque trmico y la verificacin de
la transformacin se realiz mediante el aislamiento de DNA plasmdico de las
colonias como presuntas positivas; as como por anlisis de restriccin.
Figura 6. Mapa del vector pKYLX80 y fragmento linearizado del promotor, sitio mltiple de clonacin y el terminador. Organizacin del vector de expresin en plantas, que se utiliz para liberar el promotor potenciado del virus del mosaico de la coliflor (35S2) y el terminador de la ribulosa bifosfato carboxilasa (rbcS3). B) fragmento linearizado del vector pKYLX80 donde se muestra el sitio de restriccin Eco RI del promotor, sitio mltiple de clonacin, y el de rbcS3.
Promotor35S2
rbcS3Km
Hind III-BamHI-XhoI-PstI-SacI-XbaI
Eco RI
Eco RI BamHI ClaI
A B
27
Figura 7. Mapa del vector pCAMBIA:2301 y linearizacin del cassette de expresin. Organizacin del vector binario de expresin en plantas pCAMBIA:2301. El vector presenta el cassette de expresin limitado por los bordes izquierdo y derecho (t-border: left and right), donde esta presente el gen de seleccin a kamanicina, el gen reportero gus y el sitio mltiple de clonacin. B) linearizacin del cassette de expresin donde se muestra los sitios de restriccin Eco RI-Bam HI dentro del sitio mltiple de clonacin, este sitio fue utilizado para insertar el gen de la cch con su promotor y secuencia de terminacin.
A
Borde izq.
35sPoly A
Gen de seleccin de plantas
35S Lac Z 35S Gus Nos Poly A
Borde Der.
Sitio multiple de clonacin
EcoRI-BamHI
B
28
3.2.2 Aislamiento de DNA plasmdico mediante mini
preparaciones (minipreps) por el mtodo de Birboin
Se inocul una colonia aislada de las posibles transformantes en 3 ml de medio
LB (Sambrook y Maniatis, 1989) lquido con el antibitico carbenicilna (Cb), y se
incub a 37 C con agitacin constante durante toda la noche. Al da siguiente se
tom 1.5 ml de cultivo y se transfiri a un tubo para microcentrgufa y se centrfug a
12000g por 2 min. El sobrenadante se desech y la pastilla se resuspendi en 100
L de solucin I (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM) y se dej a
temperatura ambiente durante 5 min. Transcurrido este tiempo se agregaron 200 L
de la solucin II (NaOH 0.2N, SDS 1%) y se mezcl por inversin por 5 min.
Enseguida, se adicionaron 150 L solucin III (acetato de potasio 5M, cido glacial
actico 1N) y se dej precipitar en hielo por 5 min. Las muestras se centrifugaron a
12000g a 4 C durante 5 min. El sobrenadante se transfiri a un tubo nuevo y se le
agreg 2 L de RNAasa y se dej incubar a 37C por 30 min. Pasado ese tiempo, se
realizaron extracciones con fenol-cloroformo 1:1 (V:V), y cloroformo-alcoholisoamlico
24:1 (V:V). En ambos casos, se recuper la fase acuosa y los cidos nucleicos se
precipitaron con 2.5 volmenes de etanol absoluto fro, mezclando vigorosamente por
inversin e incubando despus a -70C por 30 min. La pastilla con el DNA se
recuper centrifugando a 12000g a 4C por 5 min. y se lav con etanol fro al 70%,
secando luego bajo vaco.
La integridad de la molcula de DNA plasmdico, se analiz mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer de corrida de TPE (Sambrook y
Maniatis,1989) 1X, el gel fue teido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz
ultravioleta.
29
3.2.3 Micropropagacin de plntulas axnicas de papa
mediante cultivo de tejidos vegetales
Tubrculos de papa de la variedad alfa fueron lavados suavemente con abundante
agua y Extran al 5% y posteriormente fueron secados y puestos sobre una capa de
algodn hmedo e incubados a temperatura ambiente y en oscuridad durante 4-5
semanas. Los brotes generados despus de ese tiempo, fueron lavados con Extran
al 5% por 5 min, y desinfectados dos veces con una mezcla de blanqueador
comercial (cloralex) al 1% y etanol 10% durante 10 min, finalmente se enjuagaron
dos veces con agua destilada estril.
Los brotes se cortaron en segmentos de aproximadamente 1 cm de longitud y
fueron colocados horizontalmente en medio basal MS propuesto por Murashige y
Skoog (1962) al 50% con sacarosa al 3% y 8 gL-1 de agar e incubados bajo
condiciones de luz continua a 25 C.
Las plntulas obtenidas mediante micropropagacin fueron cortadas por
segmentos nodales y propagados en el mismo medio y bajo las mismas condiciones
experimentales antes mencionadas. El material vegetal obtenido mediante este
proceso se utiliz como fuente de explantes para los experimentos de regeneracin
de papa por organognesis y microtuberizacin.
3.2.4 Regeneracin de papa por organognesis
Se utilizaron explantes de hoja y tallos de plntulas de 4 semanas crecidas in
vitro. Los explantes de hoja fueron cortados de su base y se colocaron con el haz en
contacto con el medio, mientras que los tallos fueron de regiones interndales de
aproximadamente 0.5 cm de longitud y colocados horizontalmente en el medio.
30
Como medio basal se utiliz el MS al 50% suplementado con casena hidrolizada
0.05%, cido ascrbico 40 mgL-1 y sacarosa 3%.
Los explantes se sometieron a cinco tratamientos diferentes con reguladores del
crecimiento como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Tratamientos analizados para la regeneracin de papa.
Se usaron 40 explantes de tallos y 40 de hoja por tratamiento y el experimento
completo se realiz cuatro veces de forma independiente. Los explantes fueron
incubados en la oscuridad durante 4-5 semanas hasta la aparicin de tejido calloso y
posteriormente bajo lmparas de luz fluorescente (54 mol/m2s) en ciclos de 8/16 h
luz/oscuridad a 25 C durante 4-5 semanas, para la induccin de brotes. El nmero
de brotes por explante se cuantific a los 60 das de iniciado el experimento.
3.2.5 Microtuberizacin
Se cortaron segmentos nodales de plntulas axnicas in vitro y se colocaron en
forma vertical en el medio de cultivo. Como medio basal se utiliz el MS al 50%,
probndose ocho diferentes condiciones diseadas para favorecer la
TRATAMIENTO (medio MS)
Concentracin de reguladores del Crecimiento en mg/l.
GA3 AIA TDZ BA 2IP Zeatina
MSR1 1 1 0 0.5 0 0
MSR2 1 1 0.1 0 0 0
MSR3 1 1 0.05 0.1 0 0
MSR4 1 1 0 0 3 0
MSR5 1 1 0 0 0 3
31
microtuberizacin (Tabla 2). Se utilizaron 10 explantes por cada tratamiento y el
nmero de microtubrculos se registr a los 28 das de iniciado el experimento.
Tabla 2. Tratamientos analizados para la microtuberizacin.
Donde sac; sacarosa, osc; oscuridad.
3.2.6 Registro y anlisis de datos
La toma de datos se realiz de acuerdo a lo especificado para cada medio en la
regeneracin de plantas, donde se tomaron los datos para la respuesta de induccin
de brotes .Se determin si existi diferencia significativa entre los 5 tratamientos
empleados con los explantes de tallo y hoja para cada uno. Para ello se emple la
prueba para el anlisis de varianza (anova) no paramtrico, para un diseo
completamente al azar, propuesta por Kruskal-Wallis, asimismo se realiz la prueba
de las medias de los rangos mltiples estandarizados de Tukey-Kramer con la
tratamiento Condiciones del medio Condiciones de incubacin
MST1
Slido con 3% sac.
16 hr Luz /8 h osc.
MST2 Slido con 8% sac.
8 h Luz/16 h osc.
MST3 Slido con 8% sac. Preincubacin por 14 das en osc. 8 h Luz /16 h osc.
MST4 Slido con 3% Sac. Preincubacin por 14 das en osc. 8 h Luz /16 h osc.
MST5 Lquido con 8% sac.
Luz continua.
MST6 Liquido con 3% sac.
Luz continua.
MST7 Slido, 3% sac. y 2.5 mg.L-1 cinetina.
8 h Luz /16 h osc.
MST 8 Slido, 8% sac.y 2,5 mg.L-1 cinetina.
Preincubacin por 14 das en osc. 8 h Luz /16 h osc.
32
finalidad de seleccionar el mejor tratamiento. El software estadstico utilizado para
esta prueba fue el INSTAT 2.
3.2.7 Germinacin de los microtubrculos y aclimatacin de
las plantas generadas
Los microtubrculos obtenidos fueron sometidos a dos tratamientos con el fin de
inducir su germinacin in vitro. En ambos tratamientos se utiliz como medio basal
MS 50%. El primer tratamiento fue libre de hormonas mientras que para el segundo
fue adicionado con 2,5 mgL-1 de cinetina. Ambos se incubaron bajo luz continua
durante 2 semanas. Adicionalmente, se intent la germinacin ex vitro, para lo cual se
colocaron los microtubrculos sobre una capa de algodn hmedo hasta su
germinacin. Los microtubrculos con brotes adventicios y races fueron transferidos
a suelo y aclimatados en el laboratorio y posteriormente bajo condiciones de
invernadero.
3.2.8 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por
Agrobacterium tumefaciens
Con el fin de establecer las condiciones de transformacin gentica de papa de la
variedad alfa utilizando la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens, se
analizaron varios protocolos de transformacin para diferentes variedades de papa
como se muestra en la tabla 2. A esta primera fase de anlisis donde se utiliz la
cepa EHA 105, se le denomin como primera transformacin y la segunda
transformacin fue aquella donde se trabaj con las cepas PGV 2260, AGL 1226 y
EHA 105, donde se utiliz como medio de regeneracin MS3, tal como se muestra en
la Tabla 3.
33
El protocolo en general para la transformacin fue el siguiente: Colonias aisladas
de Agrobacterium fueron incubadas en medio YEB a 28 C por 24 hrs. con agitacin
continua. La obtencin de la concentracin de la bacteria se hizo mediante
espectrofotometra a una absorbancia de 650 nm, y se diluy en medio fresco YEB a
una concentracin de 1x108 bacterias por ml. Como explantes se utilizaron regiones
interndales de tallo y hojas de 4 semanas de crecida in vitro. Antes de la infeccin,
los explantes, fueron incubados en medio MS para la primera transformacin y para la
segunda en MS3 durante 24 hrs. Pasado este tiempo, los explantes fueron incubados
en 20 ml de medio MS lquido el cual contena la bacteria y se incubaron en oscuridad
a 28C y en agitacin constante. Despus de la infeccin, los explantes fueron
secados en papel filtro y colocados en medio de cocultivo MS3 durante 48 hr.
Despus del cocultivo, los explantes fueron lavados en medio MS lquido adicionado
con 10 ml L-1 de antibitico PPM. Los explantes fueron lavados varias veces hasta
quitar el exceso de bacteria y fueron secados sobre papal filtro estril e incubados en
medio de seleccin hasta la obtencin de brotes.
Para la primera transformacin los medios de regeneracin y de seleccin fueron
los siguientes:
MS(A): ANA 200 mg L-1, GA320 mg L-1, 2-ip 2 mg L-1, Cb 250 mg L-1y Km 50 mg L-1.
MS (B): zeatina 0.8 mg L-1, 2,4-D 500 mg L-1, Claforam 500 mg L-1y Km 50.
MS(C): ANA 0.2 mg L-1, zeatina 2 mg L-1, PPM 20 mg L-1 y Km 50 mg L-1.
MS (D): zeatina 3 mg L-1, GA3 mg L-1, AIA 1 mg L-1, Km 150 mg L-1 y Cb 500 mg L-1.
MS1 (E): GA3 mg L-1l, BA 0.5 mg L-1, AIA 1 mg L-1. PPM 10-20 ml/l, Km 50-150 mg L-1.
MS3 (F): GA3 1 mg L-1l, AIA 1 mg L-1, TDZ 0.05 mg L-1, BA 0.1 mg L-1, PPM 10-20 ml/l, Km
50-150 mg/l. MS (G): PPM 20 ml/l y Km 50 mg/l.
Nota: el medio de seleccin en todos los casos fue el mismo que el de regeneracin
slo que con la adicin de antibitico.
34
Tabla 3. Primera transformacin gentica de plantas de papa.
Tabla 4. Segunda Transformacin gentica de plantas de papa.
P r im e ra t ra n s fo rm a c i n
C e p a d e A g ro b a c te r iu m
T ip o d e
e x p la n te y c a n tid a d
P re
t ra ta m ie n to
D il d e b a c te r ia y
t ie m p o d e in c u b a c i n (m in )
M e d io
R e fe re n c ia
T a llo 4 0 H o ja 4 0
N O
1 5 m in .
M S (A ) T a k a h a T . e t a l., (1 9 9 8 )
T a llo 4 0
(s e c c io n a d o s lo n g itu d in a l)
H o ja 4 0
M S
2 4 h rs .
1 :1 0
3 0 m in .
M S (B )
B e a u je a n e t a l., (1 9 9 8 )
T a llo 4 0 H o ja 4 0
M S 2 4 h rs .
1 :1 0 -1 :5 0 1 5 -3 0 m in .
M S (C ) M h a m d i M . e t a l., (1 9 9 8 )
T a llo 4 0 H o ja 4 0
M S 2 4 h rs .
1 :1 0 , 1 :5 0 , 1 :1 0 0
1 0 -3 0 m in .
M S (D ) T ru jil lo C . e t a l., (2 0 0 1 )
T a llo 4 0 H o ja 4 0
M S 2 4 h rs .
1 :5 0 , 1 :1 0 0 1 0 -3 0 m in
M S 1 (E )
T a llo 4 0 H o ja 4 0
M S 2 4 h rs .
1 :1 0 1 0 m in .
M S 3 (F )
F ra n c is c o M o ra le s P ro p u e s to p a ra e s ta te s is .
E H A R 1 0 5
S e c c io n e s d e m ic ro tu b rc u lo s
1 :1 0 0 1 0 m in .
M S (G )
S egun da transform ac in C epa de A. tum efac iens
D il. B act.
N o . D e ta llo s
N o . ho ja
Lavados con A n tib i tico
M ed io de S e lecc in M S 3
E H A 105: pC A M B IA :C C H
90 80 P P M 10m l/L 24 h rs.
P P M 10 m l/L K m 25 m g/L
E H A 105: C A M B IA :C C H
90 80 P P M 10m l/L 4 h rs .
P P M 10 m l/L K m 25 m g/L
A g l:C A M B IA :C C H
90 70 P P M 10m l/L 4 h rs .
P P M 10 m l/L K m 25 m g/L
pG V:C A M B IA :C C H
90 80 P P M 10m l/L 4 h rs .
P P M 10 m l/L K m 25 m g/L
35
3.2.9 Anlisis histoqumico del gen uidA
Los explantes y plntulas que crecieron en medio de seleccin, se analizaron para
comprobar transformacin mediante la tincin histoqumica del gen reportero uidA
que codifica para la -glucuronidasa (GUS).
El protocolo que se utiliz fue el propuesto por Jefferson (1987). Para monitorear
la expresin de GUS en los explantes, sSe tomaron 3 de tallo y 3 de hoja al azar a los
7, 15 y 21 das despus de la transformacin y para las plntulas hasta la aparicin
de brotes axilares. Los explantes se colocaron en un tubo para microcentrfuga de 1.5
ml y se cubrieron completamente con el reactivo para la deteccin histoqumica dede
GUS. Posteriormente se incubaron a 37 C en oscuridad durante 24 hr, enseguida se
elimin la clorofila de los explantes mediante lavados consecutivos con etanol al 70%,
hasta que los explantes quedaran transparentes y se pudiera observar la tincin azul.
3.2.10 Anlisis molecular de las plantas transformadas mediante
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Para analizar molecularmente las plantas como presuntas transformantes, fue
necesario extraer el DNA genmico y posteriormente la amplificacin enzimtica in
vitro de los transgenes de la cch, gus y nptII y as como descartar la presencia de
Aagrobacterium con la amplificacin de los genes vir, por medio de la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) (Vollenhofer et al., 1999).
El protocolo para la extraccin de DNA fue el de CTAB (Porebsky, 1997), con
algunas modificaciones hechas en el laboratorio para tejidos de papa. Se pesaron 30
mg de tejido vegetal y se congelaron con nitrgeno lquido y se pulverizo con la ayuda
del mortero. El tejido pulverizado, se pas un tubo para micro centrfuga de 1.5 ml y
se homogeniz con 3 volmenes de buffer de extraccin (apndice), se mezcl por
36
inversin durante 5 min., y se dej Incubar a 60 C durante 20 min con agitacin
constante. Las muestras se centrifugaron a 12 rpm durante 5 min y el sobrenadante
se paso a un nuevo tubo. Enseguida se hicieron extracciones con un volumen (1:1)
de fenol:cloroformo-alcoholisoamilico y una ms con cloroformo: alcoholisoamlico
(24:1). El sobrenadante de las extracciones se paso a un nuevo tubo y los cidos
nucleicos se precipitaron con un volumen de isopropanol e incubando a 20 C por 20
min. La pastilla de DNA se recuper centrifugando a 12 rpm por 5 min y se lav dos
veces con 200 l de etanol 70% para quitar el exceso de sal. Al final la pastilla se
resuspendi en 50 l de agua desionizada estril.
La integracin de la molcula de DNA se visualiz mediante electrofresis en gel
de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio y bajo luz ultravioleta.
La amplificacin de los genes de cch, nptII, gus y vir, se realiz acorde al protocolo
del kit comercial PCR Super Mix de Gibbco. La concentracin del templete de DNA
fue de 0.2 g y de oligos de 0.1 g. La mezcla de reaccin, se llevo a cabo en un tubo
para PCR de 0.5 ml durante 30 ciclos con las condiciones siguientes:
desnaturalizacin 94 C por 1 min., alineamiento, 55 C, 1 min y reaccin de la
polimerasa a 72 C por 1.30 min., la amplificacin de las muestras se llev a cabo en
el termociclador de Perkin Elmer 480.
37
IV RESULTADOS
4.1 Construccin y anlisis molecular del vector pCAMBIA:cch
El gen clona de la cch, estaba inicialmente clonado en el vector pUC18. El gen
fue liberado del vector mediante anlisis de restriccin con la enzima Eco RI. La
muestra de la digestin fue corrida por electroforesis, donde se observ claramente
el fragmento liberado de un peso de 772 pb (Fig. 8). Con el fin de tener un sitio de
restriccin que permitiera la insercin del gen de la cch en el vector de expresin de
plantas el pCAMBIA, se utiliz como generador de nuevos sitios de restriccin el
plsmido pBSK-, que fue digerido con la enzima Eco RI (Fig. 9). Posteriormente,
tanto el gen de la cch como el vector pBSK-:fueron corridos por electroforesis y
purificados del gel de agarosa, siguiendo el protocolo de un kit comercial (Gibco), y
se procedi con la ligacin de ambos. La orientacin de la construccin pBSK-:cch,
se verific mediante anlisis de restriccin con las enzimas Xho y Sac I; sitios que
fueron adicionados al gen de la cch y donde se muestra un aumento de 91pb
quedando a 863 pb. (Fig. 10). Una vez obtenido esta construccin se volvi a liberar
el fragmento y se clon en los vectores pKYLX80 y pCAMBIA. Con la construccin
pCAMBIA:cch (Fig. 11), se procedi a realizar la transformacin de Agrobacterium
tumefacienes cepa EHA105 mediante la tcnica de cruza triparental y la verificacin
fue mediante la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Comentario [SIP4]: En pgina aparte
38
1 2 3 4 5 6
Figura 8. Anlisis de restriccin de pUC18:cch con Eco RI y linearizacin del vector pBSK-. En los carriles1, 2 y 4 se observa el corte enzimtico de la construccin puc18:CCH, donde el 2.69 kb corresponde al vector y el fragmento de 772 a la CCH. Carril 3 MPM 1Kb. Carriles 5 y 6,corresponden al vector pBSK- linearizado con la enzima Eco RI. El gel fue teido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz ultravioleta.
Figura 9. Anlisis de restriccin de pBSK-:cch. Carriles 1 y 2, muestras de DNA plasmdico digerido donde se observa el plsmido de 2.96 kpb., y el fragmento de cch de 863 pb. Carril 3, DNA plasmdico falso positivo, y carril 4, MPM 1 kb.
pBSSK- 2.96 Kb.
pUC18 2.69 Kb.
gen cch
Aprox. 772 pb.
gen cch
Aprox. 863 pb.
Comentario [EPMB5]: Marcadores?
39
1 2 3 4 5
Figura 10. Anlisis de restriccin de pCAMBIA:cch con Xho y Sac. Carriles 1 al 4 muestras de la digestin, donde se observa una banda de alto peso molecular que corresponde al vector y otra de aproximadamente 863 perteneciente al peso molecular de la cch.
Figura 11. Mapa de la construccin pCAMBIA:cch. El gen de la cch fue insertado dentro del sitio mltiple de clonacin del vector dirigido por el promotor potenciado del virus del mosaico de la coliflor (35S2) y la secuencia de terminacin de la ribulosa 5 fosfato (rbcs3). El gen de seleccin nptII, se encuentra cerca del borde izquierdo bajo el promotor 35S y el gen uidA cerca del borde derecho con el promotor 35S.
Borde izq. CaMV35
Poly A
Gen de seleccin de plantas
35S Lac Z
35S Gus Nos Poly A
Borde Der.
35S 2 pKYLX80
rbcs 3 pKYLX80
cch
Cch, 863 pb
40
4.2 Produccin de brotes a partir de tubrculos de la papa
Se trabaj con tubrculos de papa esterilizadosdesinfectados, que fueron
incubados para la germinacin de brotes. Despus de tres semanas de incubacin los
tubrculos produjeron brotes de 3 cm de longitud. Estos brotes se cortaron en
segmentos de 1 cm de longitud con una yema axilar y de nueva cuenta fueron
desinfectados y colocados verticalmente en medio de propagacin (Fig. 12A), donde
crecieron sanamente hasta la formacin de plntulas completas y posteriormente
fueron utilizados para propagacin y regeneracin (Fig. 12B).
4.3 Propagacin de plntulas
Los brotes del tubrculo de la papa a las 4 semanas de ser incubados en medio
de propagacin, produjeron plntulas de 10 cm de longitud con apariencia sana,
vigorosas y races. Durante la primera semana de incubacin, se observ que todos
los segmentos nodales formaron plntulas entre 4-5 cm de longitud, a la segunda
semana tenan abundantes races y en la cuarta semana ya se tena plntulas de
aproximadamente 10-12 cm de longitud (Fig. 12B).
Figura 12. Micropropagacin in vitro de plntulas de papa. A) Segmentos nodales colocados en medio para propagacin provenientes de brotes del tubrculo. B) propagacin de plntulas a las 4 semanas de ser incubadas. Las condiciones de propagacin son: 25C, bajo luz contina.
A B
Comentario [SIP6]: Estos ya no fueron desinfectados, solo el tubrculo?
Comentario [SIP7]: Homogeneizar justificacin
41
4.4 Regeneracin
Para verificar que el sistema de regeneracin fuera eficiente se propuso un tiempo
mximo de 5 semanas para la induccin de tejido calloso y de 6 semanas para la
brotacin a partir de tejido calloso. La aparicin de tejido calloso en los extremos de
los tallos y en los bordes de las hojas se observ a las dos semanas de iniciado el
experimento (Fig. 13A y B), a partir de la quinta semana la formacin de tejido calloso
fue en todo el explante (Fig. 13C y D). La formacin de tejido calloso ocurri
principalmente en los tratamientos con TDZ 0.05 mgL-1 y con 0.1 BA mgL-1 (MS3),
BA 0.5 mgL-1 (MS1) y 2iP 3 mgL-1 (MS4). Con respecto a los medios tratados con
TDZ 0.1 mgL-1 y zeatina 3 mgL-1, no se observ induccin de tejido calloso y mucho
menos la aparicin de brotes.
Tabla 5. Efecto de varias combinaciones de los reguladores de crecimiento en la regeneracin de papa.
bencil adenina (BA), thidiazuron (TDZ), cido indolactico (AIA), cido
giberlico (GA3), Isopentiladenina (2ip) y zeatina. En la formacin de tejido calloso y la proliferacin de brotes adventicios en papa variedad alfa. Z los valores se refieren al porcentaje de explantes que producen tejido calloso. Y significa el nmero de brotes por explante. X anlisis de comparacin mltiple Tukey Kramer (P0.01)
Tratamiento Tipo de explante
Explante con Callo (%)z
Brotes por explantey
MSR1 Hoja 67.5 6.1 0.1b Tallo 71.3 6.5 0.1b
MSR2 Hoja 6.3 0.5 0.1c
Tallo 7.5 0.8 .02c
MSR3 Hoja 81.3 10 0.2
Tallo 91.3 10 0.2a
MSR4 Hoja 92.5 0
Tallo 95.0 0 MSR5 Hoja 0 0