Yoel BeovidesINIVIT, Cuba
Grupo MUSACUBINSTITUTO DE INVESTIGACIONES DE VIANDAS
TROPICALES (INIVIT, Cuba)
RED BIOALI: BIOTECNOLOGÍA PARA FORTALECER PROGRAMAS DE MEJORA DE ESPECIES DE
INTERÉS SOCIOECONOMICO
Instituto de Investigaciones de Viandas
Tropicales, fundado en 1967 (Ministerio
de la Agricultura, Cuba).
1967
Desarrolla Proyectos de Investigación-Desarrollo propios, con Institutos,Universidades y Empresas Cubanas e Internacionales.
Experiencia en Asesorías Técnicas a productores en Cuba y decolaboración en varios países.
casi 50 años de experiencia en
la investigación científica y
como soporte al desarrollo de
una agricultura sostenible
a 250 Km –Habana
a 35 Km – Santa Clara
Misión-INIVITProveer la base científico - técnica
fundamental para contribuir a lasostenibilidad y competitividad de la cadenaproductiva de:
– Raíces, rizomas y tubérculos(Manihot, Ipomoea,Xanthosoma/Colocasia/Alocasia,Dioscorea, Solanum)
– Plátanos y bananos (Musa spp.)
– Papaya (Carica papaya L)
– Granos (Phaseolus, Zea mays L)Ornamentales, forestales, frutales…
Una agricultura de bajos insumos
y alta eficiencia, económicamente
viable, con paradigmas biológico
y orgánico, compatible y
protectora del medio ambiente.
¿Cuáles son nuestros propósitos?
por una agricultura productiva, eficiente, sostenible
Objetivos de trabajo
�Obtención de cultivares con características superiores.
�Conservación, evaluación, documentación y explotación de los recursos genéticos.
�Producción de semilla original y básica por métodos convencionales, convencionales acelerados y técnicas biotecnológicas.
�Definición de tecnologías para el Manejo Integrado de plagas y enfermedades.
�Diagnóstico y saneamiento de las principales enfermedades.
�Desarrollo de técnicas biotecnológicas para el
Objetivos de trabajo
�Ajustes a la fitotecnia de los cultivos.
�Nutrición de los cultivos mediante el empleo de
fertilizantes químicos, biofertilizantes y abonos
orgánicos.
�Desarrollo de software con novedosa información
sobre los cultivos y sus tecnologías.
�Capacitación, asesoría y adiestramiento.
�Generalización de los resultados científicos y
transferencia de paquetes tecnológicos.
Estructura Administrativa
Dirección General
Dirección Administrativa
Dirección de Capital Humano
Dirección Económico Contable
Dirección Desarrollo Institucional
Dirección de Manejo de Plagas
Dirección de Genética y RecursosFitogenéticos
Dirección de Biotecnología Vegetal
Además, dos Estaciones Experimentales(Camagüey y Santiago de Cuba) y
Capital Humano INIVIT272 trabajadores (incluidos obreros, personal de
servicios, profesionales, investigadores, directivos).
33 investigadores
Por categoría investigativa: Por
categoría científica:
Investigador Titular – 11 Doctores
en Ciencias – 13
Investigador Auxiliar – 12 Master
en Ciencias – 17
Investigador Agregado – 6
de
,
Nuclear,
Amplio espectro de especialidades:
Agronomía, Biología,
Economía, Física Nuclear,
Cibernética, Mecanización
agrícola, etc.
Proyectos Nacionales de Investigación con: - otros Institutos del Ministerio de la Agricultura,- varias Universidades cubanas - Institutos del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación
(CITMA)
Proyectos Internacionales con:
- Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) –Colombia
- Centro Internatcional de la Papa (CIP) – Perú - Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) – Nigeria - Agencia Internacional de la Energía Atómica (AIEA)- Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (CATAS)- Center for International Research on Environment and
Development (CIRAD) – Guadalupe
Nigeria, Ghana,
Venezuela, Colombia,
Belize, Surinam,
México, Brazil,
Barbados, etc.
* FAO, CLAYUCA y
otras.
10
Researchlines
10 líneas
Mejora genética
Recursos genéticos
Producción,
conservación y
manejo de
semillas Prácticas
Culturales
Cosecha y post-
cosecha
Agro-economía
Informática
Agrícola
Nutrición (mineral, biológica
y orgánica)
Manejo integrado de plagas
Biotecnología
• Propagación masiva de plantas
� Organogénesis y embriogénesis somática� Automatización de la micropropagación� Sistemas de Inmersión Temporal (SIT)� Inmersión total con aireación constante
• Mejoramiento genético
� Selección in vitro a enfermedades� Mutagénesis in vitro� Embriogénesis somática
• Obtención de plantas libres de virus (D. Manejo de Plagas)
� Diagnóstico� Saneamiento
• Transformación genética (en inicios)
• Conservación de germoplasma in vitro
• Biología molecular (en colaboración con otras Instituciones)
� Selección asistida por marcadores moleculares
Líneas de Investigación
Plátanos y bananos
(Musa spp.)
354
Ñame (Dioscoreaspp.)
125
Yuca(Manihot esculenta
Crantz)
554
Malanga(Xanthosoma
spp.)
94
Malanga(Colocasia esculenta
Schott)
104
Boniato(Ipomoea batatas (L)
Lam)
700
cultivares resistentes a SN y MP programa
IMTP de INIBAP.
Producción semilla
original y básica
Trabajar con intencionalidad la obtención y generalización de cultivares y variedades
Raíces y tubérculosPlátanos y bananos Papaya
Institutos de
InvestigaciónProducción de
“Semilla” en Fincasy productoresespecializados
Categoría Certificada y Controlada
CategoríaRegistrada
CategoríaOriginal y
Básica
Empresas estatales y Fincas de
productores privados
INIVIT
Esquema nacional de producción de ‘Semillas’
Garantizar mayores
producciones50% incremento en rendimientos –nuevos clones y variedades (genética) y calidad de la semilla
cultivo in vitro
'INIVIT Y–93–4'
'INIVIT Y- 80+1'
'CEMSA 74 – 6329'
'CMC-40''SEÑORITA'
(Medero, 2008)
34 SSR – diversidad genética
(43,84% DM; 26,4 t.ha-1)
(45,84% DM; 26,9 t.ha-1).
Selección Asistida (Materia seca, SNPs)
Alta diversidad
genética
varios alelos únicos
Seis MM asociados
a MS
(37,48 t.ha-1)
(34,49 t.ha-1)(B.A.S.E., Beovides et al., 2015)
(Cultivos Tropicales, B.A.S.E., Beovides et al.,
2015)
CEMSA 78-354Ocupa el 40% (22000 ha)
INIVIT B-2 2005Ocupa 20 000 ha.‘Potencial: 56 t.ha-1.En producción: 40t.ha-1 en primavera.
INIVIT B-240-2006Ciclo corto (cuatro meses)Potencial: 55 t.ha-1. 17 t.ha-1 en producción.
‘INIVIT BS-16’
Nuevo clon con alto contenido de carotenos (provitamina A)
‘Morado INIVIT’
13 °Bx30 t/ha en
135 díasAntociani
nas
Tolerancia a Cylas formicarius
(Fab.)
‘INIVIT B 98-3’
45 t/ha en cuatro meses INIVIT BS 65-2013
Tolerante a la sequía extrema con rendimientos >17 t/ha.
(Alocasia, Xanthosoma andColocasia)
'INIVIT MC-2001'
'CAMERUM 14'
'INIVIT MX-2008'
'MÉXICO 8'
‘VERDE'
'BELEP' (D. alata)
'IRAT - 72' (D. alata)
'BLANCO DE GUINEA' (D. rotundata)
‘Ñame Pa' (D. esculenta)
Aclimatización
Micropropagación
OTROS CULTIVOS IMPORTANTES
‘Maradol Roja’Hortalizas (varias)
‘INIVIT P-2007’Nueva variedadmás tolerante alos mildius, altorendimiento.
Prácticas agroecológicasesencia del desarrollo
sostenible
Micorrizas Comp
ost
intercalamiento
Controles biológicos
Instituto de
Investigaciones en
Viandas Tropicales
INIVIT - CUBA
Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales
IINNIIVVIITT
CD-ROMCD-ROM
BOLETIN
ES
BOLETIN
ES
PLEGAB
LES
PLEGAB
LES
http://www.inivit.cu
Producción de
plátanos y bananos en
CubaPosee gran significación dentrode la producción de ‘Viandas’(más del 30% anual).
Actualmente esta producción estábasada en varios cultivarespertenecientes a los subgrupos:Cavendish (AAA),Plantain (AAB),Burros (ABB)y tetraploides introducidos de laFundación Hondureña deInvestigaciones Agrícolas (FHIA).
‘FHIA-21’
‘FHIA-25’
Mejoramiento
Genético de Musaspp. en Cuba
Mejoramiento
Genético de Musaspp. en Cuba
BANCO DE GERMOPLASMA
36
133120
41
24
0
20
40
60
80
100
120
140
Nú
me
ro d
e a
cc
es
ion
es
Número de accesiones por grupo genómico
Diploides Triploides (AAA) Triploides (AAB)
354
Variabilidad genética
forma y color de la pampana
Variabilidad
genética
Raquis desnudo
Burro CEMSA
aspecto del raquis
MÉTODOS DE MEJORA PREVISTOS
Cultivo de anteras
Selección temprana de mutantes
Inducción de mutaciones por agentes físicos
Selección clonal de individuos genéticamente superiores
Hibridación
Embriogénesis somática
OBJETIVOS
DELPROGRAMA DE
MEJORA DE MUSASPPIntroducción de nuevos genotipos diploides y
triploides como progenitores masculinos o femeninosen el Programa de MG.
Desarrollar mejores diploides mediante cultivo deanteras con talla baja, características agronómicassobresalientes y resistencia a plagas yenfermedades.
Obtención de bananos y plátanos híbridos a través dela hibridación.
Inducción de mutaciones con el uso de mutágenosfísicos en banano y plátano en busca de resistencia otolerancia a las principales plagas y porte bajo.
1
2
3
4
OBJETIVOS DEL
PROGRAMA DE
MEJORA DE MUSASPPEmbriogénica somática para la propagación y el
mejoramiento
Evaluación de nuevos cultivares obtenidos a travésde ensayos de campo y los métodos de deteccióntemprana para los niveles de resistencia a las plagas(insectos, ácaros, enfermedades y nematodos).
Desarrollo de estudios sobre la interacción genotipo -ambiente.
5
6
7
�RETO FUNDAMENTAL
Lograr una base clonal relativamente amplia
para evitar o minimizar la uniformidad genética,
y con ello obtener cultivares menos vulnerables
a los efectos del cambio climático (plagas,
temperaturas, sequía), con mejor calidad
nutritiva y altos rendimientos.
1. Amplio banco de germoplasma (todos los gruposgenómicos representados)
2. Áreas experimentales y laboratorios para apoyode la investigación.
3. Equipo multidisciplinario con experiencia en elmanejo del cultivo y la mejora convencional, queincluye:
� Mejoradores
� Fitopatólogos
� Fitotecnistas
� Biotecnólogos
� Nutricionistas
PROGRAMA DE MEJORA DE
MUSA SPP
Limitado acceso a técnicas
que facilitan y mejoran el
conocimiento de la
variabilidad y elevan la
eficiencia de la mejora
genética (basadas en
marcadores moleculares,
proteómica, metabolómica,
Disponer de nuevos cultivares diploidessilvestres o mejorados para su uso comoparentales masculinos.
Obtención de cultivares triploides otetraploides con característicasagronómicas deseables (reducción delporte de la planta, disminución del ciclo delcultivo, calidad de la fruta), posibletolerancia a plagas y sequía.
Caracterización, evaluación y
1
2
3
Mejora Convencional por
Hibridación
Selección de progenitores masculinos y femeninosEstudios de fertilidad del polen, caracterización morfoagronómica, otros.
Avances en el programa de Mejora
de Musa spp.
Evaluación frente a las principales plagasSigatoka Negra, Sigatoka Amarilla, Fusarium
oxysporum, Nematodos
En mejora convencional (hibridación)
Principales resultadosSe identificaron progenitores masculinos con altafertilidad polínica, y femeninos productores de semillas.Se estudió la compatibilidad entre ellos. Se hapropuesto una métodología para obtener híbridos queincluye el rescate de embriones mediante cultivo in vitroy la evaluación en campo de las plantas resultantes.
RESULTADOS EN EL FITOMEJORAMIENTO
Selección
clonalCultivares comerciales:
‘CEMSA ¾’ (AAB)
‘Burro CEMSA’ (ABB)
‘Manzano INIVIT’ (AAB)
INIVIT PV-2011 (AAB) 4
CEMSA ¾ (AAB)1
Burro CEMSA (ABB)
2
Manzano INIVIT(AAB)
3
Selección clonal
altura entre 2,0 y 2,65 m, racimo en forma de cono truncado con 12-16
dedos por mano y 30–32 dedos por racimo, con un peso del racimo entre
20,10 y 26,60 kg por racimo.
INIVIT PV 06-30 (AAB)
Primer híbrido de banano obtenido por el programa
de mejora del INIVIT
Tolerante a Sigatoka negra y nematodos.
Potencial de rendimiento de 65 t/ha para sistemas
extradensos.
Peso del racimo: 20-22 Kg
Nuevos Híbridos
Nuevo clon de plátano obtenido mediante el método de variación somaclonal, con un
rendimiento potencial de 50 t/ha para sistemas de
alta densidad.
Peso del racimo: 14-16 Kg
Nuevos Híbridos
Nuevo clon obtenido por método de selección, con
racimos de 25-30 kg de peso
Peso del racimo: 25-30 Kg
Híbrido cubano de alto potencial productivo (48
t/ha).
Resistente a plagas.
Adaptabilidad a la sequía.
Peso del racimo: 22-24 Kg
Resultados en la propagación y mejoramiento genético de Musa spp por
métodos biotecnológicos en INIVIT
López et al., 1999, INFOMUSA — Vol 8, No 2López et al. 2005. Biotec Veg, Vol. 5, No. 2: 115 - 119
Resultados en la propagación y mejoramiento genético de Musa spp por
métodos biotecnológicos en INIVIT
Reajuste del sistema de propagación tradicional in vitro
e implementación de la propagacion por Sistemas de Inmersión Temporal tipos RITA, BIT y Plant form
Desarrollo de un protocolo de regeneración de plantaspor embriogénesis somática en cultivares de plátanovianda Musa AAB con fines de propagacion y mejorapor inducción de mutaciones.
Uso de otras alternativas de la biotecnología para complementar la mejora genética clásica de Musa
mediante el rescate de embriones cigóticos, el doblajede cromosomas y el intercambio internacional de germoplasma
Fase preparativa
del explante
Establecimiento y propagación in vitro
Biotec Vegetal Vol. 6, No. 1, 2006, CubaRevista Colomb de Biotec XV (1): 98-107, 2013
Biotec Vegetal Vol. 6, No. 1, 2006, CubaRevista Colomb de Biotec XV (1): 98-107, 2013
Establecimiento (MS + 1 mg.L-1 BAP)
Multiplicación de material irradiado M1V1 – M1V3(MS + 3,5 mg.L-1 BAP +
1,5 mg.L-1 Kin)
Multiplicación en CRAS60 días
Aclimatización
Selección de plantas "plus"
Evaluación en campo II y III Ciclos. 24
meses
‘INIVIT PV 06 30’Selección en campo (I
ciclo) 12 meses
Propagación en CRAS
60 días
30 días
Extracción de ápices
meristemáticos(2,0-3,0 mm)
Enraizamiento M1V4
(MS) 30 días
30 días
30 días
45 días
Formación de yemas múltiples(MS + 3,5 mg.L-1 BAP + 1,5 mg.L-1
Kin)
Esquema empleo para la inducción de mutaciones a partir de brotes multiples utilizado en el cultivar ‘Zanzibar’ (AAB) para obtener mutantes de porte bajo.
Fig
ura 1. P
roto
colo
para el d
esarrollo
de la em
brio
gén
esis som
ática en
plátan
o vian
da M
us
aA
AB
Biotecnología Vegetal 5(1): 60-64. 2005
Biotechnologies at work for smallholders: Case studies fromdeveloping countries Publisher: FAO. ISBN 978-92-5-107877-8.Roma, pp 47-55. 2013
Germinación de embriones somáticos en Sistemas de Inmersión Temporal
Escalado de la propagación por embriogénesis somática a las biofábricas y su validación en condiciones de producción
1. Improvement of Bananas through Gamma Ray Irradiation.Philippine Journal of Crop Science (PJCS), 38 (2): 47-53. 2013.
2. Mutation Induction Using Gamma Irradiation and Embryogenic CellSuspensions in Plantain (Musa spp.) Protocols Springer 2017.
Rescate de embriones cigóticos
Híbridos en campo
Variantes somaclonales
Plantas de tipo hembras seleccionados de cultivar 'CEMSA ¾'
Philippine Journal of Crop Science (PJCS) August 2013, 38 (2):47-53 Copyright 2013
Gestión sostenible de enfermedades de plátanos y bananos
1.Evaluación de nuevos híbridos obtenidos en Programascubanos y foráneos de Mejoramiento de Musa aSigatoka y Fusariosis del banano.
2.Desarrollo de métodos de selección temprana aenfermedades del banano y stress a sequía.
3.Caracterización molecular de aislados de M. fijiensis y
Fusarium (Foc) (para esto necesitamos ayuda externa,tenemos la fortaleza de trabajar con el germoplasmacubano de Musa spp.)
4.Aislamiento de microorganismos de la rizofera delbanano. Potenciación biológica. Caracterizaciónmolecular de aislados de Trichoderma spp. y otrosmicroorganismos.
Gestión sostenible de enfermedades de plátanos y bananos
5. Desarrollo de sistemas integrales de gestión de lasenfermedades. Control biológico: (empleo debiofungicidas y plantas con propiedades biocidas),evaluación de compuestos orgánicos e inorgánicossobre lesiones de M. fijiensis, Control cultural,evaluación de nuevas moléculas.
6. Trabajo en planes de contingencia a la entrada deFusarium TR4. Manejo integrado del cultivo y de lasenfermedades para reducir el impacto del Fusarium
R1, R2, STR4, TR4.
7. Construcción de capacidades colectivas. Formaciónde facilitadores.
Tenemos experiencia con evaluación de híbridos procedentes del CIRAD, por tanto estaríamos en condiciones de plantar y evaluar nuevos híbridos y hacer investigaciones de campo en estos temas.
Tenemos experiencia con evaluación de híbridos procedentes del CIRAD, por tanto estaríamos en condiciones de plantar y evaluar nuevos híbridos y hacer investigaciones de campo en estos temas.
Resultadosrecientes
1-a
1-b
1-c
2-a 2-b
Fig. 1. Desarrollo del grano de polendesde tétrada (a) hasta el estadomaduro (c).Fig. 2. Formación de callo de laantera (a) y desdiferenciación de lamicrospora (b)
en la investigación agrícola y la asesoría a
productores
en la generalización de resultados científicos en la
agricultura
cultivares con alto potencial de rendimiento y
semilla de alta calidad
Amplias colecciones de germoplasma y áreas de
campo PERO… necesitamos acceder a fondos, capacitación y colaboración… complemento a la mejora clásica
4to. Simposio Internacional INIVIT’2007
Simposio Diversidad vegetal y adaptación al cambio climático:
enfoque de género
En el marco del XXI Congreso de la Sociedad Mesoamericana para la Biología y la Conservación (SMBC) “Conservación de la biodiversidad en manos de las
mujeres mesoamericanas”
Costa Rica (30 de Octubre al 03 de Noviembre, 2017), Hotel Crowne Plaza Corobicí, San José, Costa Rica.
Estrategias de mitigación y adaptación al cambio climático. Soberanía y seguridad alimentaria. Participación de la mujer.Desarrollo rural sostenible. Manejo y conservación de la diversidad vegetal autóctona. Agricultura familiar y equidad de género para el
Temáticas:
Paloma MoncaleánNeiker, España
Herramientas biotecnológicas para la producción de plantas en el
actual escenario de cambio climático
Inconvenientes:
Evaluar características deseables en fases maduras, mientras que
su multiplicación se limita a las fases juveniles
La mejor alternativa de producción de planta de alta calidad esla multiplicación vegetativa de individuos seleccionados quehayan expresado características fenotípicas de interés.
PROGRAMAS DE MEJORA
MEJORA CLÁSICA
Polinización controlada,
establecimiento de huertos semilleros, etc.
NUEVAS HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS:
CULTIVO IN VITRO
Organogénesis, embriogénesis, etc.
Multiplicación vegetativa
Neiker: Organogénesis de semilla
Neiker: Organogénesis de individuos adultos
Low rootingTransitory reinvigorationAnd more…..
¿Cual es el problema?
¿Hacia donde vamos?
Cortesía Pramod Gupta (Weyerhaeuser)
� PRODUCCIÓN DE PLANTASELECCIONADA TOLERANTE AESTRÉS BIÓTICO Y ABIÓTICO
�PRODUCCIÓN MASIVA A LA CARTA
� SILVICULTURA CLONAL DE ALTORENDIMIENTO.
� CLONACIÓN DE MATERIAL CONFINES DE INVESTIGACIÓN
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
Embriogénesis somática
SOMATIC EMBRYOGENESIS
INICIATION AND PROLIFERATION PERCENTAGES
MATURATION SUCCESS
GERMINATION RATES
NARROW COMPETENCE WINDOW
¿Cómo combatir la estrecha ventana de competencia?
0
5
10
15
20
25
14 jun 21 jun 28 jun 5 jul 12 jul 19 jul 26 jul
Pro
lifer
ació
n (
%)
aab
abc
bc
cd
de
e ESTADÍOS 2 A 4 DE DESARROLLO DEL EMBRIÓN ZIGÓTICO
0
20
40
60
80
100
EDM CGM
Pro
lifer
ació
n (
%)
a
b
EDM CGM
L-glutamine (550 mg L-1)
asparagine (525 mg L-1)
arginine (175 mg L-1)
L-citrulline (19,75 mg L-1)
L-ornitine (19 mg L-1)
L-lisine (13,75 mg L-1)
L-alanin (10 mg L-1)
L-proline (8,75 mg L-1)
EDM CGM
Casein hidrolized (1 gL-1)
L-glutamine (500 mgL-1)
¿Cómo mejorar las tasas de iniciación y proliferación?
AA-SOLUTION ABA SUCROSE CODE
EDM 60 µM 30 g/l A6S3ED
EDM 90 µM 30 g/l A9S3ED
EDM60 µM 60 g/l A6S6ED
EDM90 µM 60 g/l A9S6ED
CG60 µM 30 g/l A6S3CG
CG90 µM 30 g/l A9S3CG
CG60 µM 60 g/l A6S6CG
CG90 µM 60 g/l A9S6CG
L-glutamine (550 mgl-1) asparagine (525 mgl-1) arginine (175 mgl-1) L-citrulline (19.75 gl-1)L-ornithine (19 mgl-1) L-lysine (13.75 mgl-1) L-alanine (10 mgl-1) L-proline (8.75 mgl-1)
Casein Hidrolisate (1 gl-1)
L-glutamine (500 mgl-1)
• Fresh mass weight (150, 100 mg or less…..• With or without activated charcoal
¿Cómo mejorar la maduración de los embriones somáticos?
0
20
40
60
80
100
120
140
160
nº
em
bry
os
per
10
0 m
g
fresh
ma
ss
maturation media
¿Será una “super linea” celular?
¿Cómo mejorar la maduración de los embriones somáticos?
0 20 40 60 80
100
120
140
160
180
1(14-2)
19(14-5)
4(14-4)
10(14-5)
3(16-3)
1(16-2)
12(16-3)
13(16-3)
2(16-6)
11(16-6)
15(16-4)
11(16-4)
17(16-6)
25(16-6)
12(16-4)
4(18-3)
6(18-4)
8(18-4)
1(18-3)
1(19-4)
7(19-4)
6(19-3)
7(19-2)
13(19-4)
nº de embriones somáticos / 100 mg de peso fresco
Lín
eas celulares
¿C
óm
o m
ejorar la m
adu
ración
de lo
s emb
rion
es so
mático
s?
Containers: Petri dishes.
Culture media: EDM (Walter et al. 1998) with half strength macronutrients of LP
medium (Quoirin and Lepoivre 1977), 30 gL-1 sucrose, 2 gL-1 activated charcoal.
Gelling agent: Gelrite ® (5,5 gL-1)
Environmental conditions: 21 ± 1ºC under a 16-h photoperiod at 120 µmol m-2 s-1
¿Cómo mejorar la germinación de los embriones somáticos?
0%
20%
40%
60%
80%
100%
germination acclimatization
Su
rviv
al(%
)
Simplifications and contributions of this protocol:
• Low amount of ET required (100mg orless../plate).
• Eliminates subculturing during the maturationprocess.
• A great number of clones is obtained, due to thehigh productivity of the process.
• It is not necessary a pretreatment beforegermination, as the SE obtained present goodquality.
1500 embryos per 1g ET95% success in germination
1425 somatic plants per 1g of embryogenic tissue
150 embryos/100 mg ET
>19 shoots/embryo
60 % rooting
Combined somatic embryogenesis and organogenesis protocol
Pinus brutia
Cryptomerya
japonica
Sequoia
sempervirens
El gran reto: Es posible la embriogénesis somática utilizando
material adulto como explanto inicial?
Es posible la embriogénesis somática a partir de individuos adultos de Pinus radiata
En Pinus sylvestris se haobtenido tejidoembriogénico pero laconversión a planta no hasido posible (Aronen et al.
2009)
En Picea glauca se hanobtenido plantassomáticas a partir de unindividuo somáticoadulto (Klimaszewska et al.
2011)
Se ha conseguidoregenerar planta a partirde individuos adultos deespecies angiospermas(Rugini y Caricato 1995; Toribioet al. 2004)
Hipótesis de trabajo
Vegetative buds from 20 years old trees
6 collection dates from February to May 2008
5 genotypes
Culture conditions:
Material and Methods
DCR (Gupta y Durzan, 1985)
0.2 gL-1 PVP
1 gL-1 glutamine
1 gL-1 casein hydrolysate
1 gL-1 inositol
1,5 gL-1 gellam gum
20 μM 2,4-D
25 μM NAA
1 μM BA
(Walter et al. 1998)
L-glutamine (550 mgL-1)asparagine (525 mgL-1)
arginine (175 mgL-1)
L-citrulline (19.75 mgL-1)
L-ornithine (19 mgL-1)
L-lysine (13.75 mgL-1)
L-alanine (10 mgL-1)
L-proline (8.75 mgL-1)
3 gL-1 gellam gum
4.5 µM 2,4-D
2.7 µM BA
Slices of 1-1,5 mm, 22ºC in the dark
A
B(Malabadi and van Staden, 2005)
Korea, 2010
Embriogénesis de árboles adultos
AB
Proliferation could be observed
SLOW
FAST
Embriogénesis de árboles adultos
The tissue became yellow-brown andproliferation failed.
Embriogénesis de árboles adultos
Vegetative buds from 20 years old trees
3 collection dates from December 2009 to January 2010
5 genotypes
Embriogénesis de árboles adultos
Supervivencia Productividad
Temperaturas Disponibilidad de agua
¿Podemos encontrar especies y/o genotipos de especies productivas
tolerantes al estrés hídrico?
Cambio climático: IPCC 2007- actualidad
O2: P. radiata var. radiata
(Basque Country)
O3: P. radiata var. radiata(Australia)
O1: P. radiata var. binata × var. radiataO4: P. attenuata x P. radiataO5: P. radiata var. cedrosensis × P. radiata var. radiata
Six Pinus radiata ecotypes
Species hybridVariety hybrid
Variety hybrid
O6: P. radiata var. radiata(New Zealand)
Material vegetal
Plants/Ecotype peat:perlite (7/3, v/v) (T=
23ºC RH=70ºC)
Two-year-old plants
W- Control
(two-daily to field capacity)
D- Water stressed(without irrigation)
Scheme of the experiment
Drought (C1) Drought (C2)Rewatering
T0 T4 R7
4 weeks 1 week 50% plants with external symptoms
Drought
Hormonal dynamic
Physiological processes Osmotic adjustment
Growth Anatomy
Hardening?
Physiological processes
Water status:
RWC (%)
Ψpd, Ψleaf, Ψt
Gas exchange:
gs, E, AN (%)
Needle hydraulic conductance:
Kleaf
Electrolyte leakage:
E.L. (%)
Fluorescence parameters:
Fv/Fm, ΦPSII , qCN
Photosynthetic pigments:
Chl a, Chl b, carotenoids
Physiological parameters
Statistical analysis:
MANOVA, PC analysis, ANCOVA
O4- Pinus attenuata X Pinus radiata O5- var. Cedrosensis x P. radiata var. radiata
Physiology
Tolerance≅Ψleaf, Ψt, RWC
↓Ψπ ↑Active OA
↑ε < 4MPa
↑Put, Spd, Spm
↓Heigh
=Diameter
↓Substomatal chamber
= JA and ACC
−SA
−ABA and IAA
Hardening ↑Active OA
↑Pro, GABA, Glu
Morphology Phytohormones
O1- P. Radiata var. Binata X P. Radiata
O5 ≅ O4 but ↑ Biomass
Resultados estudios fisiológicos
Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD)(2014):Development of productive contingency species for
forestation in Spain and New Zealand may be better adapted to predicted changes in climate due to global warning.
SCION (Nueva Zelanda) NEIKER
Desarrollo de protocolos de embriogénesis
somática de híbridos de Pino
Estudio de procesos organogénicos de embriones
somáticos
Híbridos Pinus spp.: P. radiata x P. attenuata
Supervivencia Productividad
Temperatura Disponibilidad agua
¿Podemos modular la tolerancia a estrés abiótico?
Cambio climático: IPCC 2007- actualidad
Es posible generar tolerancia a estrés abiótico en Pinus radiata
En Arabidopsis thaliana se hademostrado que las condicionesambientales en las que viven losparentales pueden inducircambios moleculares (pool demiRNA, metilación del DNA) enestas plantas que conducen aadaptacionestransgeneracionales a diversostipos de estrés (Sunkar y Zhu2004; Boyko et al. 2010).
Las semillas de Picea abies
“recuerdan” las temperaturas(Johnsen et al. 2005a) y elfotoperiodo (Johnsen et al.2005b) al que han sidosometidos durante laembriogénesis zigótica y lamaduración de las semillas.
Las condiciones ambientalespueden inducir cambiosepigenéticos en la planta quefavorecen su adaptación a undeterminado estrés, pudiendo seréstos permanentes e inclusohereditarios (Mirouze y Paszkowski,2011)
Hipótesis de trabajo
Embriogénesis somática
Lineas celularesLineas celularesGran número de embriones
somáticos
Gran número de embriones
somáticos
Plantas somáticas adaptadas a
condiciones Ex vitro
Plantas somáticas adaptadas a
condiciones Ex vitro
Analizar el efecto de las condiciones físicas y químicas del ambiente de cultivodurante las fases de la embriogénesis somática en Pinus radiata y determinar sicondicionan la tolerancia al estrés hídrico de las plantas somáticas generadas.
2 g/L
3 g/L
4 g/L
2 g/L
3 g/L
4 g/L
Initiation Proliferation Maturation Germination
18 ºC
EDM
23ºC
4.5 g/L 9 g/L 7 g/L
2 g/L
3 g/L
4 g/L
23 ºC
28 ºC
FASE DE INICIACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO
LP
INITIATION EXPERIMENT
INITIATION EXPERIMENT
a
P. radiataMaturation rate:
89%
P. halepensisMaturation rate:
100%
Influencia a largo plazo
INICIACIÓN
Líneas celulares
18ºC – 4 gL-1DIVERSIDAD GENÉTICA
Eficiencia proceso
28ºC – 4 gL-1EMBRIONES SOMÁTICOS
Modificación de las condiciones ambientales en la maduración
18ºC
23ºC
28ºC
Initiation
Proliferation, Maturation and Germination
Stressed plants
Control plants
Estrés hídrico Rehidratación
ESTUDIOS FISIOLÓGICOS PARA ANALIZAR RESPUESTA A ESTRÉS HÍDRICO
• Water status determination
• Gas exchange parameters
• Phytohormone concentration
• Protein profile
Somatic plantsPhysiological
characterizationAnalysis of
survival and quality
PARAMETROS FISIOLÓGICOS ANALIZADOS
FASE DE INICIACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
00 5 10 15 20 25
ψ
Leaf
(M
Pa)
TimeLeaf Potential (MPa)
D 28ºC
D 23ºC
D 18ºC
W CONTROL
TL
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25
WU
E
Time
WUE
D 28ºC
W CONTROL
D 23ºC
D 18ºC
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25
Inta
ntan
eous
net
pho
tosy
nthe
sis
Time
Instantaneous net photosynthesis (AN)
D 28ºC
D 23ºC
W CONTROL
D 18ºC
ESTUDIOS FISIOLÓGICOS PARA ANALIZAR RESPUESTA A ESTRÉS HÍDRICO
3.5 g/L
4.5 g/L
5.5 g/L
3.5 g/L
4.5 g/L
5.5 g/L
Initiation Proliferation Maturation Germination
18 ºC
EDM
23ºC
9 g/L 7 g/L
3.5 g/L
4.5 g/L
5.5 g/L
EDM
23ºC
3 g/L
23 ºC
28 ºC
FASE DE PROLIFERACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO
8 g/L
9 g/L
10 g/L
8 g/L
9 g/L
10 g/L
Initiation Proliferation Maturation Germination
8 g/L
9 g/L
10 g/L
EDM
23ºC
7 g/L
18 ºC
23 ºC
28 ºC
EDM
23ºC
3 g/L 4.5 g/L
FASE DE MADURACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO
Endogenous Isoprenoid CKs: tZ, tZR, tZOG, tZROG, tZRMP, tZ7G, tZ9G, cZ, cZR, cZOG, cZROG, cZRMP, cZ9G, DHZ, DHZR, DHZOG, DHZROG, DHZRMP, DHZ7G, DHZ9G, iP, iPR, iPRMP, iP7G, iP9G.
Endogenous Aromatic CKs: BAP, BAPR, BAP9G, BAPR5MP, oT, oTR, oT9G, mT, mTR, mT9G, pT, pTR.
Endogenous IAA and conjugates: IAA, oxIAA, IAAsp, IAGlu.
Results:cis Z > trans Z23ºC-3g/L Endogenous CK content
HORMONAL PROFILE
Respuesta
% iniciación
% iniciación
2 g L-1
3 g L-1
4 g L-1
2 g L-1
3 g L-1
4 g L-1
2 g L-1
3 g L-1
4 g L-1
18 ºC
Tratamiento
Iniciación
HI
LI
139 spots expresión
diferencial significativa
LI:25 spots
HI: 2 spots
23 ºC
28 ºC
PROTEIN PROFILE
0 15 30 45
uncharacterized proteins
response to ROS
gene expression
defense response
carbohydrate metabolic process
Functional category
% expressed proteins
0 15 30 45
uncharacterized proteins
response to ROS
gene expression
defense response
carbohydrate metabolic process
Functional category
% expressed proteins
Categorias funcionales (Swiss-Prot)
•Estudiar el efecto de condiciones más extresantes, aumentando la temperatura decultivo.
•Analizar si existen marcas epigenéticas en las masas embriogénicas y en las plantassomáticas resultantes.
•Obtener macadores de tolerancia al estrés hídrico: estudios hormonales, etc….
•Profundizar en los estudios de estrés inducido en invernadero para corroborarresultados en las diferentes fases del proceso embriogénico.
•Desarrollo de ensayos en campo con plantas somáticas con aparente diferente“tolerancia” a estrés, en diferentes ambientes climatológicos.
PERSPECTIVAS FUTURAS
Socios y colaboradores:
Mariano Toribio (IMIDRA, España)
Isabel Arrillaga (Universidad de Valencia, España)
Mari Carmen San José (CSIC-Galicia, España)
Dra. Hargreaves (SCION, Nueva Zelanda)
Dr. Strnad (Palacky University, Czech Republic)
Dr. Jorge Canhoto (University of Coimbra, Portugal)
Dra. Klymaszewska (Forest Research Institute, Canadá)
¡¡GRACIAS¡¡
Taller TécnicoSandra Correia, Universidad de Coimbra, Portugal
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA
EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Proteomics
Functional genomics
Immunohysto-chemical analysis
Plant physiology
Plant tissue
culture
Genetic transformation
Molecular Biology toolsMolecular Biology tools
Auxins (2,4-D, picloram)High sucrose
No PGRsLow sucrose
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
TamarilloTomate de árbol
(Solanum betaceum) somatic embryogenesis
B
C
A
D E
nec
em
F G
H I J
1 cm
5 mm 5 mm
5 mm
1 cm
5 mm
5 mm
2 cm
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Tamarillo somatic embryogenesisTamarillo somatic embryogenesis
EMBRYOGENIC CELLS
NON-EMBRYOGENIC CELLS
In vitro establishment
Seeds (mature zygotic
embryos)
Tamarillotree
Young leaves
SHOOT MULTIPLICATION SE INDUCTION SOMATIC EMBRYO DEVELOPMENT EMBLINGS ACLIMATIZATION
MS basal mediumHigh sucrose levels
Auxin (2,4-D or picloram)
MS basal mediumLow sucrose levels
No PGRs
Plant cloning CryopreservationCryopreservationGenetic
transformationGenetic
transformationCell suspension
culturesCell suspension
culturesProtoplastsProtoplasts
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
What We Can Learn from Proteomics?
Somatic embryogenesisSomatic embryogenesis
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
TCA/acetoneIEF solubilization buffer
13 cm-long IPG strips (pH 3–10)10% acrylamide gels
Colloidal Coomassie Blue G-250
PDQuestTM 8.0
MASCOT Protein Pilot software
Proteomic analysis of embryogenic competence acquisition
Embryogenic callus Non-embryogenic callus
EC
an
dN
EC
lin
es
main
ten
an
ce
MS
+ A
UX
IN
+ 9
% s
ucro
se
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Pic
loram
ind
uced
2,4
-D i
nd
uced
2D-electrophoresis analysis
Proteomic analysis of embryogenic competence acquisition
Zygotic
Embryo
Embryogenic
Callus
420 spots
Leaf
Embryogenic
Callus
374 spots
Zygotic
Embryo Non-
Embryogenic
Callus
322 spots
Leaf Non-
Embryogenic
Callus
313 spots
ZEEC
LEC
ZENEC
LNEC
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Zygotic
Embryo
Embryogenic
Callus
420 spots
Leaf
Embryogenic
Callus
374 spots
Zygotic
Embryo Non-
Embryogenic
Callus
322 spots
Leaf Non-
Embryogenic
Callus
313 spots
2D-electrophoresis analysis
Proteomic analysis of embryogenic competence acquisition
• Up-regulated in EC
• Up-regulated in NEC
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
MIPS Functional Catalogue Database(Munich Information Center for Protein Sequences)
Zygotic
Embryo
Embryogenic
Callus
420 spots
Leaf
Embryogenic
Callus
374 spots
Zygotic
Embryo Non-
Embryogenic
Callus
322 spots
Leaf Non-
Embryogenic
Callus
313 spots
2D-electrophoresis analysis
Proteomic analysis of embryogenic competence acquisition
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Non-embryogenic callus
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Embryogenic callus
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGASDESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS
Non-embryogenic callus Embryogenic callus
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGASProteomic analysis of embryo development in Pinus radiata
Plant Biotechnology 33, 143–152 (2016)
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGASProteomic analysis of embryo development in Pinus radiata
EnolasePhosphoglycerate kinase
Chaperone proteins
Vicilin
Plant Biotechnology 33, 143–152 (2016)
Mass Spectrometry Unit Anjo et al., Proteomics 2015, 15, 757-762Anjo et al., Proteomics 2017, 17, 1600278
SWATH-MS method
Protein patterns associated with tamarillo somatic embryogenesis
Protein patterns associated with Quercus suber somatic embryogenesis
SE1 SE2 SE3 SE4 EA COTEC
Plant cloningPlant cloning CryopreservationCryopreservationGenetic
transformationGenetic
transformationCell suspension
culturesProtoplastsProtoplasts
� 3363 mg of increment per 100 mg of initial cell mass
Weight increment
W/V ratio
� 40 mg of cells cultured in 20 ml of TP liquid medium
Growth ability of different types of calli
Embryogenic calli proliferation in liquid medium
Alves et al. (in press)
DARKNESS 25 ºC
GI 13 weeks 3 weeks GI 2 GI 33 weeks
EC1
NEC
EC250 ml liquid
medium TP
80 rpm
Stops at GI 1
Cell suspension filtration
(0.22μm membrane)
Culture media protein precipitation(ammonium sulfate) andsolubilization (30 mM
sodium phosphate buffer, pH 7)
SDS-PAGE
NEC
EC2
EC1
NEC
EC2
EC1
DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS mRNA isolation
cDNAs library
Protein expression
Antibody hybridization
Sequencing
ComparativeSDS-PAGE analysis
cDNAs
E. coli infection
Embryogenic callus
Non-embryogenic callus
NEP-TCNon-Embryogenic Protein
from Tamarillo Callus (GenBank JQ766254)
Faro, M.R. et al. 2003. 7th Int.
Botanical Meeting – Plant Cell
Biology. Lisbon.
� Non Embryogenic Protein of
Tamarillo Callus
� 26.5 kDa protein expressed
consistently in NEC
� tRNA/rRNA methyltransferase
(76% homology)
� SpoU Methylase family: SAM-
dependent
methyltransferases (PF00588)
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)PROTEIN and GENE EXPRESSION
D
NEP-TC 175 bp
EF1α 380 bp
t0 t10 t12 EC NEC Ct0 t4 t6 t8 t10 t12 EC NEC
NEP-TC ~25 kDa
B
t0 t4 t6 t8 t10 EC NEC
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)IMMUNOLOCALIZATION
t4 t6 t8 t10 EC NEC
4w
6w
8w
10w
EC
NEC
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)IMMUNOGOLD LABELLING
Cytosolic location
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)
Is NEP-TC a tRNA/rRNA methyltransferase?
Methyltransferase activity in protein extracts of calli
Methyltransferase Activity (Kit Enzo Life Sciences)
Time (min)
Flu
ore
scen
ce (
RFU
)
Recombinant NEP-TC expression
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)
Is NEP-TC a tRNA/rRNA methyltransferase?
Transformation of E.coli cells (BL-21 strain)
Induction of expressionwith IPTG (1mg/mL) and culture growth(30ºC, overnight)
Culture lysis andprotein purification
(affinitycromatography) SDS-page / Western blot
Culture growth in LB media (4h, 37ºC, O.D. 0,7-0,8)
Recombinant NEP-TC purification
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)
Is NEP-TC a tRNA/rRNA methyltransferase?
1 L of expression medium
4.1 mg of recombinant NEP-TC
Ion-Metal Affinity Chromatography(IMAC)
Molecular Exclusion Chromatography (Superdex
200-PG column)
Methyltransferase activity
Recombinant NEP-TC EXPRESSION and PURIFICATION
Calbiochem’s SAM Methyltransferase Assay kit (CBA096)
O.D. (510nm) - production of SAH in SAM-dependent methylation reactions
MTase
Expression of target protein in E.coli BL21.
Purification of the target protein.
Western Blot analysis of purified NEP-TC with anti-his tag antibody
NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)
Is NEP-TC a tRNA/rRNA methyltransferase?
Calbiochem’s SAM Methyltransferase Assay kit (CBA096)
O.D. (510nm) - production of SAH in SAM-dependent methylation reactions
MTase
Substrate Specific activity (nmol/min/ mg protein)
RNA 0.0323 ± 0.0245
DNA 0 - 0.0228
Ribosomes 0.0393 ± 0.0285
rRNA 0.3370 ± 0.1520
NEP-TC down regulationNEP-TC down regulation
• Final product of recombination
contains: one spliceable intron and
nptII as plant selectable marker gene.
• T-DNA constructs will produce double-stranded RNA
- hairpin RNA - from the NEP-TC gene sequence,
triggering post-transcriptional gene silencing.
GATEWAYTM vector(Invitrogen)
Construct sequence verification by PCR and
restriction analysis, before incorporation
into LBA4404 Agrobacterium strain.
• NEP-TC 264 bp PCR products generated with
attB1 and attB2 recombinant sites;
Liquid induction medium + AS 20µM+ Bacterial suspension
LB broth (pH 7.2) rif (50)+spec(50)Induction medium (+AS) plates
2-3 months
Cefo + Carb + Kan (250mg/l)
Cefo + Carb (125mg/l)Kan (100mg/l)
Kan (50mg/l)
2 weeks
Kan (50mg/l)
1 month
Kan (50mg/l)
CO
NT
RO
L(w
ith
ou
t an
tib
ioti
cs)
SE
LEC
TIO
N
PLA
TE
S
Plant cloningPlant cloning CryopreservationCryopreservationGenetic
transformationCell suspension
culturesCell suspension
culturesProtoplastsProtoplasts
Agrobacterium mediated genetic transformation
NEP-TC down-regulated tamarillo lines
PCR analysis of
putative transgenic
plants
≈ 75% transformed
plants
0.5 µm0.5 µm
0.5 µm
NECEC
Development of a reliable method to targetand isolate uniform populations of embryogenic
cells at the very early stages of SE.
2 mg/l 2,4-D or5 mg/l picloram9% sucrose8-10 weeks
3% sucrose3-4 weeks
NEP-TCrRNA methyltransferase?
EndogenousAUXIN levels
Endogenous auxin levelsEndogenous auxin levels
IAA quantification by HPLC
Endogenous auxin (IAA)IMMUNOLOCALIZATION
Laser
++
++
+
+
+
--
--
-
-
-
Original embryogenic tissue sample (mixture of cells/protoplasts)
Empty drop
Embryogenic cell
Non-embryogenic cell
Non-discriminated event
New drop
+
-
SE-induced tissue sampling
Protoplast isolation
Protoplast purification
FACS
Next generation sequencing
Tissue cryofixation
Cryosectioning
Immunodetection
Confocal microscopy
Anti-IAA Anti-NEPTC
2nd antibody2nd antibody
Embryogenic tissue section
Immunolocalization
FLUO RESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Leaves Embryogeniccallus
Induced explants Non-embryogeniccallus
Enzymatic isolationCelulase/macerozyme/driselase/pectinase;27 ºC -30 ºC; 6h - overnight
Protoplast purificationPellet / interphasic band100 - 300 g; 5 – 10 min
Viability and yieldFDA / Evans blueHemocytometer
pellet pellet
Interphasic
band
Plant cloningPlant cloning CryopreservationCryopreservationGenetic
transformationGenetic
transformationCell suspension
culturesCell suspension
culturesProtoplasts
Protoplasts isolation and purification
Fluorescence activated cell sortingFluorescence activated cell sorting
ORI
GIN
AL
SAM
PLE
bright field green blue
SORT
ED E
C
POPU
LATI
ON
Center for Bioinformatics and Computational Biology
Sorted populations of
cells
Sorted populations of
cells
Total RNATotal RNA
RNAseq librariesRNAseq libraries
SequencingSequencing
Bioinformaticsdata analysis
Bioinformaticsdata analysis
Laser capture microdissection
LCM cellsLCM cells
Total RNATotal RNA
RNAseq librariesRNAseq libraries
SequencingSequencing
Bioinformaticsdata analysis
Bioinformaticsdata analysis
Fluorescence activated cell sorting
Hystochemical analysisHystochemical analysis
Correia et al. (2012) Plant Cell Tiss Org Cult. 109:143–152
Increased tolerance to water stress of acclimatized tetraploid plants of Solanum betaceum
Plant physiologyPlant physiology
WATER STRESSAcclimatizationMicropropagation
Tetraploid vs Diploid plants2nWS
4nWS
Increased tolerance to water stress of acclimatized tetraploid plants of Solanum betaceum
Sugars |Proline |MDA
Plant growth
Photosynthetic performance
Water potential
Plant physiologyPlant physiology
2nWS
4nWS
Increased tolerance to water stress of acclimatized tetraploid plants of Solanum betaceum
Sugars |Proline |MDA
Plant growth
Photosynthetic performance
Water potential
Plant physiologyPlant physiology
2nWS
4nWS
Increased tolerance to water stress of acclimatized tetraploid plants of Solanum betaceum
Sugars |Proline |MDA
Plant growth
Photosynthetic performance
Water potential
Plant physiologyPlant physiology
2nWS
4nWS
Paula Veríssimo (Univ Coimbra, PT)
José Feijó (Univ Maryland, USA)
Jörg Becker (IGC, PT)
Célia Miguel (ITQB-IBET, PT)Margarida Oliveira (ITQB-IBET, PT)
Glória Pinto (Univ Aveiro, PT)
Paloma Moncálean (Neiker, ES)Itziar Montalbán (Neiker, ES)
Ana Alhinho
Ana Alves
Ana Braga
Ana Pedrosa
André Caeiro
Bruno Casimiro
Cátia Pereira
Diana Augusto
Diana Graça
João Martins
Pedro Antunes
Taller TécnicoPablo González Goicoechea, Neiker, España
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Aplicación de herramientas –ómicas en los programas de mejora
agroalimentaria
Pablo G [email protected]
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Resumen
• Una historia del desarrollo de herramientas genómicas en los robles blancos europeos
• Descanso
• Bioinformática para mejoradores
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Quercus sp en alimentación
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Objetivos Mejora GenéticaEliminar intermediarios
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Los Actores
…
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Los Robles Blancos EuropeosQ. robur
Q. petraeaDos especies condistribución amplia
e importanciaeconómica y ecológica
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Los Robles Blancos Europeos… Y UNA VEINTENA DE “ESPECIES MENORES”
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
“Ancient Knowledge” in IberiaThe syngameon
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Barreras Reproductoras
Además, la diferenciación entre especies de los genes candidatos fue mayor que la de otros genes elegidos al azar !!
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Análisis Genéticos ClásicosEnsayos de Procedencias
EnsayoRecolección
Ducousso et al., 1996Kremer et al., 2002Banach & Lienowiecki, 2011
Evaluación
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Análisis Genéticos ClásicosMapa Genético 1ª Generación
Barreneche et al., 1999)
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Análisis Genéticos ClásicosQTLs
x
Evaluación
CruzamientosProgenie
Saintagne et al., 2004; Parelle et al., 2007;Brendel et al., 2008; Deroy et al., 2010
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Los Robles Blancos EuropeosPhylogeography
Petit et al., 2002
cpDNA haplotypes
Olalde et al., 2002
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Diferencias Entre EspeciesEscaneado Genómico (AFLPs, gSSRs)
P-R1
P-R3
P-R10
P-R4
P-R7
P-R5
P-R12
P-R6
R9
P-Py4b
Scotti-Saintagne et al., 2005
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
EVOLTREEEVOLution of TREEs as drivers of terrestrial diversity – Es una Red de Excelencia nacida bajo UE FP6. En la actualidad se financia mediante las aportaciones de los socios. Integrada en EFIATLANTIC.
http://www.evoltree.org
Objetivo
Infraestructuras Comunes46 genotecas de robles (>106 clones)15.000 BAC clones> 100.000 EST-SSRs
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Desarrollo y Mapeo EST-SSRsThe markers
4 cDNA librariesBudsLeavesRootsXylem
stackPACK
Cross_Matchd2_clusterPHRAPCRAW
103,000 Unigene ESTsmreps
5,218 EST-SSRsESTScanFrameDP
Coding vs non-coding regions
Durand et al., 2010BMC Genomics
748 primersPrimer3
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Desarrollo y Mapeo EST-SSRsThe maps
278 F1s X 953 markersBudsLeavesRootsXylemMissing data > 0.5
LOD score > 3.0
66 F1s X 128 markers
Joinmap
Framework MapsMapPopGenoPlayer
Bin-maps (14 F1s)
Durand et al., 2010BMC Genomics
2nd Generation Genetic MapBodénès et al., 2012BMC Plant Biology
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
Los robles blancos de IberiaRanges - Blanco-Castro et al. 1997
Pictures – Galan-Cela et al., 2013
Quercus fruticosa
El Aljibe Bot. Garden
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA
POR QUE IMPORTA LA DIVERSIDAD GENETICA?
La diversidad genética constituye el material de base con el que trabajala EVOLUCION
ESPECIACION
Rob
les
del P
N Iz
ki
ADAPTACION
Latitud: 59.3 Latitud: 42.7
mal drenado bien drenado
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Re-sprouting oaks (Rebollos)Quejigos (Q. faginea) and Melojos (Q. pyrenaica)
Acid Soils
Calcareous soils mainlyOut-competed by Q. pyrenaica on acid soils
Complementary distribution in relation to: - soil types (mainly)- climate
root-suckers stem sprouts
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Range-wide DifferentiationSpeciation Genes
LG1 LG2 LG3 LG4 LG5 LG6
66 markers8 populations x 12 trees x 2 species
STRUCTUREGENOME SCANS
6 outliers in 5 bins
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Range-wide DifferentiationSpeciation Genes
Genotyping 29 additional EST-SSRs from the 5 bins
6 additional outliers
Outliers are grouped
Three-marker haplotypes• Highly Significant LD• Co-location QTLs
Goicoechea et al., 2014Heredity
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The genetic mosaic of speciationPopulation-wise Speciation Genes
Quercus faginea
Quercus pyrenaica
Pn Izki
PN Cabañeros
Pn Collado deLos Jardines
Pn Font Roja
Pn Sierra Nevada
Goicoechea et al. unpublished
48 treesper pop
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110 SSRs (103 EST-SSRs y 7 gSSRs)
The genetic mosaic of speciationPopulation-wise Speciation Genes
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Clasificacion GenéticaSTRUCTURE (locprior=localidad/especie)
RESULTADOS
K=2
K=4
K=7
HAY POBLACIONES QUE SE PARECEN MASA LA OTRA ESPECIE QUE A LA PROPIA
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Jost’s D
IUFRO – Arcachon – 2016/05/30
The genetic mosaic of speciationPopulation-wise Speciation Genes
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BAYESCAN
MSA
Outliers identifythe knownregions of inter-specificdifferentiation in LGs# 2, 3 and 12.
New EST-SSRs that had not been genotyped earlier identified highly divergent markers in LGs# 1, 4 and 7
The genetic mosaic of speciationPopulation-wise Speciation Genes
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SpeciationPairwise (Inter-sp)
2bp 3-6bp
2bp 2bp3-6bp 3-6bp
GOT021 in 10 / 12
Cluster from LG#12 in 6/12
Cluster from LG#2 in 7/12
GOT021 non-significant
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Intra-specific Genome ScansAdaptation Genes
Large % of theoutliers are thesame in the twooak species.
13-15 outliers per species
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LOCAL ADAPTATIONEnvironmental Data
January Tmax
I. 2300 weather stations
II. Lengths of the records: from15 to 50 years
III. Spatial resolution of 200m
IV. Datasets: Tmin, Tmax, Rainfall, Solar Radiation
Nimyerola et al., 2005
Open GIS Map Serverhttp://opengis.uab.es/wms/iberia/index.htm
6 sampling locations
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BIO1 = Annual Mean TemperatureBIO2 = Mean Diurnal Range (Mean of monthly
(max temp - min temp))BIO3 = Isothermality (BIO2/BIO7) (* 100)BIO4 = Temperature Seasonality (standard
deviation *100)BIO5 = Max Temperature of Warmest MonthBIO6 = Min Temperature of Coldest MonthBIO7 = Temperature Annual Range (BIO5-BIO6)BIO8 = Mean Temperature of Wettest QuarterBIO9 = Mean Temperature of Driest QuarterBIO10 = Mean Temperature of Warmest QuarterBIO11 = Mean Temperature of Coldest QuarterBIO12 = Annual Precipitation…BIO27 = Radiation of coldest quarter (W m-2)
TmaxTminRainfallSolar Radiation
BIOCLIM VARIABLESCLIMATE ATLAS
From 6 sampling sites (7 populations)
IUFRO – Arcachon – 2016/05/30
LOCAL ADAPTATIONEnvironmental Data
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Local AdaptationGEAs – The modelBayeScEnv: de Villemereuil and Gaggiotti (2015)
Where gi = local adaptation effect on locus i, caused byEj = environmental differentiation of population j
BayeScan
Null model (βj. = pop differentiation)
Locus-specific effect αi
IUFRO – Arcachon – 2016/05/30
Allows to distinguish departures from the neutral model due to unknown factors, from departures due to local adaptation caused by an environmental factor
Other ModelFeatures
1) each environmental variable is tested individually
2) Significance -tests based on the FDR
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BLAST2GO: Conesa et al., 2005
Lightred, far-red
Cytokinin
Light UV
Brassinoster…
RNAi
Heat, cold
Osmoticwater, salt
JA
Landscape GenomicsGenomic-Environmental Associations
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..in the meantime...
Quercus robur es tolerante a periodos de encharcamiento y Q. petraea prefiere suelos bien drenados.
- Genes Candidatos- Genotecas SSH- qPCR
Sobre-expresado en Q. robur
Sobre-expresado en Q. petraea
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The end?
Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑAEskerrik Asko
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Genomics for Breeders
A rough guide to complexity reduction techniques
and Bioinformatic needs
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Genomics for BreedersSugerencias
1. Olvidense de secuenciar genomascompletos (probablemente está hecho o alguien lo está haciendo)
2. Reducción de problemas Bioinformáticos3. Diferentes soluciones adaptadas a
muchos presupuestos y necesidades
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Complexity ReductionFamiliarity with AFLPs
Complexity reduction by usingTwo Restriction Enzymes and Selective PCR primers
Next-Generation Sequencing
1. Genotyping By Sequencing
2. RAD-seq
3. Gene Capture
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Comparación entre métodos
Chen et al. 2013PLOS One
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Genotyping-By-Sequencing
Elshire et al.,2011PLoS ONEMyles et al., 2013 TGs
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GBS in Agrogenomics
Aggenome.com
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RAD-seqddRAD, 2bpRAD, ezRAD …
Floragenex.com
ddRAD PROTOCOL
Peterson BK, Weber JN, Kay EH, Fisher HS, Hoekstra HE (2012) Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species. PLoS ONE 7(5): e37135. doi:10.1371/journal.pone.0037135
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Sequence CaptureTargeted Gene Capture
Posibilidad de analizar 1 gen o miles de genes, rutas metabólicas, gruposde candidatos, etc.
Permite altas coberturas(variantes raras)
Pero …
Se necesitan recursosgenómicos de la especie o especie relacionada
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Sequence Capture
Agilent
Puede combinarse con RAD libraries para reducir aún másla complejidad del genoma.
Posibilidad de secuencias muylargas (> 20 kb,Dapprich et al., 2016 BMC
Genomics)
Facilita la bioinformática
Método con mayor futuro??
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Sequence CaptureBioinformatics
Transcriptoma secuenciado
970 baits (targets)
Blast, RepeatMasker
353 tolerancia sequia,aquaporinas y ABA
617 non-synonimousSNPs (subspecies)
Genomic DNA:Sonication + Illumina’s TruSeq Nano DNAHybrid Capture:MyBaits protocol v.212 ciclos PCR post-captura89 muestras:1 línea Illumina HiSeq 2000
Illumina CASAVA pipeline
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Sequence CaptureBioinformatics
FastQC – Calidad de secuencias (alta, no necesidad de “trimming”)
BWA – Mapeo de secuencias al transcriptoma de referencia
Default settings – Ficheros indexados SAM de referencia
Picard tools – comprimir ficheros SAM, ordenar secuencias y marcar duplicados
SAMtools ‘mpileup’– variant calling, output genotype probabilities in VCF files
bcftools ‘call’ – merge VCF files and call genotypes
VCFTools – Filtrar SNPs por frecuencia y % datos perdidos
PLINK LD filtering tool – Filtrar SNPs por LD
GENODIVE – Filtrar SNPs con Fis negativa (parálogos?)
Genética de Poblaciones
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Gracias!!