Biotecnología

El desarrollo de la ciencia básica y el entendimiento

de los procesos que gobiernan la biología y a los seres vivos es

fundamental.

Las tecnologías de ADN recombinante constituye una mezcla de técnicas, que permiten, la fragmentación, la separación, secuenciación, hibridación de ácidos nucleicos, clonaje de ADN y la ingeniería genética .

El ADN se puede fragmentar mecánicamente, si se hace pasar varias veces la suspensión de ADN a través de la aguja de una jeringa

La obtención de fragmentos específicos fue posible tras el descubrimiento de enzimas de restricción ( endonucleasas ). Estas enzimas pueden aislarse de bacterias, cortan la molécula de ADN de doble cadena en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos

Las enzimas de restricción pueden generar extremos: rombos o cohesivos

estas moléculas de ADN producidas se denominan moléculas de ADN recombinante.

En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes cohesivos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente

Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

Extremos cohesivos

las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen 6 pares de bases. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el ADN dando como resultado extremos “pejagosos”. Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: Hpal es de Hemophilus parainfluenzae; EcoRI es de E.coli y HindIII es de Hemophilus influenzae

Sirve para determinar con exactitud el tamaño de una molécula de ADN

En la electroforesis, se colocan partículas cargadas en un campo eléctrico y se les permite que migren hacia los polos positivo o negativo.

Las moléculas se separan porque se mueven a diferentes velocidades en función de su carga y su tamaño.

Las bandas de ADN serán invisibles a menos que el ADN esté marcado o teñido de alguna manera. Un método sensible de tinción del ADN consiste en sumergir el gel después de la electroforesis en el colorante bromuro de etidio que cuando se encuentra unido al DNA, es fluorescente con luz ultravioleta.Para marcar moléculas de ADN aisladas se utiliza la enzima polinucleótido quinasa para transferir un P 32 hasta el extremo 5’ de cada hebra de ADN

Electroforesis en gel de ADNEn la figura (a) se muestra Diagrama de un aparato de gel vertical que muestra sus componentes (b) Equipo comercial de electroforesis en gel. (c) Carril que contiene una serie de fragmentos de ADN de tamaño conocido. Los números indican el número de pares de pases que contiene cada fragmento. Los fragmentos más pequeños se desplazan una mayor distancia. El gel de la derecha muestra los fragmentos que se originan cuando el fago lambda es digerido con la enzima de restricción Hind III. 

Electroforesis de DNA

20 min

Secuenciación de una molécula de ADN

Se desarrollaron métodos que permitieron determinar de manera simple y rápida la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN purificado. Uno de los métodos más utilizados es el de Maxam y Gilbert o también conocido como el método químico. Este proceso se inicia con la obtención de un conjunto de moléculas de ADN de doble hebra marcadas en un extremo con P 32. en la primera etapa las hebras de ADN se disocian y se someten a un tratamiento suave con un agente químico que destruye una de las cuatro bases. Solo se destruye una de las bases, al azar. Esto genera distintos fragmentos de ADN de distintas longitudes, que reflejan los lugares en que se produjo la destrucción de la base.

Los fragmentos se separan en un gel y se detectan por autorradiografía. Para determinar la secuencia completa, se realizan procedimientos similares a cuatro muestras separadas de la misma molécula de ADN, utilizando compuestos químicos que rompan el ADN de forma preferente por T en la primera muestra, por C en la segunda, por G en la tercera y por A en la cuarta. Los fragmentos resultantes son separados en carriles paralelos del mismo gel, obteniéndose un patrón de bandas de ADN radiactivas a partir de las cuales se lee la secuencia de ADN.

__ __ __ __ ____ __ __ __ __ ______ __ __

La secuenciación del ADN permite determinar de manera simple y rápida la La secuencia nucleotídica. T C G A Al realizar la electroforesis se obtienen un patrón de bandas de ADN radiactivasa partir de las cuales se lee la secuencia.La lectura es del extremo 5’ a 3’ ( desdeabajo hacia a arriba).En este caso la secuencia seria 5’- AGTTAGCCTTAGGCT-3’ 

electroforesis    

Hibridación de ácidos nucleicos.Cuando se tienen una doble hélice que se disocia en dos hebras separadas, estas se pueden volver a renaturalizar o hibridizar, siempre que ambas cadenas tengan una secuencia de nucleótidos complementarias.Para hibridizar se requiere un fragmento puro de una cadena sencilla de ADN cuya secuencia sea complementaria a la del ácido nucleico (ADN o ARN) que se desea detectar. El ADN debe estar marcado radiactivamente. La molécula de ADN de cadena sencilla utilizada de esta forma como indicador se denomina sonda de ADN .

Clonaje de ADNMediante esta técnica un fragmento de ADN que contiene un gen de interés se inserta en el genoma de ADN purificado de un plásmido o virus. Por ejemplo es posible unir, en el tubo de ensayo, un fragmento de ADN que contiene un gen humano con el cromosoma de un virus bacteriano, e introducir la nueva molécula de ADN recombinante en la célula bacteriana. El plásmido o virus (vector) utilizado de esta forma se conoce como vector de clonaje, y se dice que el ADN propagado mediante inserción en él se ha clonado.

Plásmido

Librerías de ADN

Para clonar un gen se empieza construyendo una librería de ADN, una colección de fragmentos de ADN, clonado. La genoteca puede construirse utilizando como vector tanto virus como plásmidos, y en general se mantienen en una población de células bacterianas.

Plásmidos

2

Extremos cohesivos

Plásmido

3

Molécula de ADN recombinante

gen de resistencia a la ampicilina

Los vectores plasmídicos utilizados son pequeñas moléculas circulares de ADN de doble hebra. Los vectores se cortan con una enzima de restricción, y los fragmentos se añaden a los plásmidos cortados y se cierran, formando moléculas circulares de ADN recombinante. Son unidas mediante la enzima ADN ligasa.

Ensamblaje

Tecnología de DNA recombinante

EndonucleasasEl DNA se corta con enzimas

Ligasa T4El DNA se une a plásmidos

El siguiente paso consiste en introducir las moléculas circulares de ADN recombinante en bacterias; se dice que estas células han sido transfectadas con el plásmido. A medida que estas células se dividen , los plásmidos también se van replicando y produciendo un enorme de copias de ADN circulares que contienen el ADN foráneo.

Muchos plásmidos bacterianos transportan genes que les confieren resistencia a los antibióticos, una propiedad que sirve para seleccionar las células que han sido transfectadas con éxito; si la bacteria se hace crecer en presencia del antibiótico, solamente sobrevivirán las células que contengan los plásmidos. Cada una de las bacterias que fue transfectada contendrá, en general, un fragmento de ADN insertado diferente; este inserto será heredado por las células de la progenie de la bacteria que formaran una pequeña colonia en una placa de cultivo.

El procedimiento de cortar el genoma completo de una célula mediante enzimas de restricción y colocarlo en diferentes plásmidos constituye una librería genómica. Por lo tanto la colección completa de plásmidos se denomina una librería de ADN genómica.

Genoma de hongos: 44 millones de pares de basesHuesped: Escherichia coliVector: Bacteriófagos capacidad: 20 mil pares de bases

Genoma humano: 3000 millones de pares de basesHuesped: Saccharomyces cerevisiaeVector: YAC (cromosoma artificial de levadura) MegaYAC (capacidad: 1 millón de pares de bases)

Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...(insulina, hormona del crecimiento, factores de

coagulación antes seObtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidoscorporales)

Obtención de vacunas recombinantes(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)

La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico

Inyección de proteínas víricas en un chimpancé

plásmido bacteriano

Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levaduraADN

Extracción del ADN del virus

Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo

Mediante ingeniería genética se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo

ADN enfermo

ADN sano

ADN complementario del ADN enfermo

Diagnóstico de enfermedades de origen genético

ADN de la persona que se quiere diagnosticar

¿Hibridación?¿No hibridación?

Renaturalización del ADN con la sonda fluorescente

Desnaturalización del ADN

Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomalíaBiochip

MicroarrayDNAchip

DIAGNÓSTICO

Plantas transgénicas

tumores

célula vegetal

Proliferación de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesión

Plásmido Ti

núcleo

cromosoma

cromosoma

Agrobacterium

inductor de tumorescontiene oncogenes(genes onc)

Ingeniero genético natural tras sustitución de genes onc por genes de interés

Transgénesis= introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares.

Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas.Produce tumores

Clonación de animales (TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CÉLULAS EMBRIONARIAS)

Clonan cerdos destinados a trasplantar sus órganos a humanos

La empresa escocesa PPL Therapeutics logra retirar de los cerditos el gen que provoca el rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3 galactosil transferasa"

Enero 2002. AP Photo/Roanoke Times, Gene Dalton (IDEAL-EFE)

Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia de células u órganos de una especie a otra)

Ayudará a superar la escasez de órganos humanos para hacer trasplantes de todo tipo