BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO

Generalidades de buenas practicas de laboratorio

Asegurar la ejecución de que los ensayos se realicen de manera detallada y ordenada.

Seleccionar y utilizar el equipo y material señalado en la técnica.

Colocar el material usado separado del material limpio, no dejarlo sobre la mesa de trabajo.Asegurar el buen funcionamiento de todos los equipos a utilizar, su conexión, calibración y ubicación.

Almacenar y manejar todas las muestras evitando su contaminación dentro del laboratorio.

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Preparar y almacenar los reactivos y medios de cultivo según los procedimiento establecidos.

Emplear la técnica analítica correcta y de manera exacta, cualquier cambio en el método debe estar debidamente validado y aprobado.

Asegurar el uso de los implementos de seguridad, tales como mandiles, gorras, extintores, etc.

Limpiar y desinfectar las mesas de trabajo antes y después de los análisis de un alimento

MATERIAL DE VIDRIO

Utilizar para los análisis, material de vidrio de baja alcalinidad o material de plástico libres de defectos y residuos tóxicos.

Examinar antes de cada uso el material de vidrio y desechar todos aquellos que presenten daños; si los bordes están rotos pueden ocasionar cortaduras, si las superficies internas están deterioradas o con rajaduras pueden retener parte del precipitado que desea analizar.

Lavar y/o estabilizar el material de vidrio antes de volver a usar

BOMBILLAS O AUXILIARES DE PIPETAS

Aspirar las muestras, diluciones de las muestras, soluciones de reactivos o suspensiones de microorganismos, utilizando los auxiliares de pipetas.

Cuando el auxiliar tenga contacto con las sustancias antes mencionadas, cambiar el filtro y colocar el auxiliar sin la bombilla de succión en alcohol al 70% por una hora o esterilizar sin la bombilla a 121 º C x 15 minutos si es necesario.

PERSONAL

El personal del laboratorio está obligado a usar bata y gorro de color blanco durante su permanencia dentro del laboratorio y además cuando se inicien los análisis y se efectúen pasajes utilizará una mascarilla naso-bucal.

El personal externo para su ingreso al laboratorio debe ponerse bata.

Tipos de siembre

Se deposita 500 micrlotros de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la más diluida. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45ºC (en baño o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario y antihorario y y hacia delante y hacia atrás.

En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no más de 3 mL por placa.

 

Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilución. Se realiza duplicado para cada dilución.

Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la más diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo estéril.

SIEMBRA INCORPORADA SIEMBRA EN SUPERFICIE

 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MÉTODOS:

Incorporado Superficie

Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra

Mayor precisión Menor precisión

Mejor aprovechamiento de nutrientes Peor aprovechamiento de nutrientes

Dificultades al subcultivar colonias Facilidad para subcultivar colonias

Visualización de colonias dificultosa Fácil visualización

Temperatura del agar puede afectar la viabilidad de algunos m.o.

No se afectan los m.o. termosensibles

Se desarrollan m.o. microaerofilicosEn aerobiosis sólo crecen aerobios y anaerobios facultativos

Spreaders

Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre la superficie o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como una. Cuando el spreader cubre más del 50% de la placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si están uniformemente distribuidas.

Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders

Medios de cultivo

Conservación de los medios preparados

Lo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchos casos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se guarda como medio preparado. El tiempo de vida del medio preparado dependerá de la propia naturaleza del medio, de la hermeticidad de los recipientes que lo contienen, de la temperatura de conservación y de las condiciones medioambientales. Si la hermeticidad es buena y la temperatura baja, 2-8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6 semanas.

Conservación de los medios preparados, listos para su uso

Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado de conservación, que es de varios meses si las condiciones de almacenamiento y transporte son las adecuadas. Se recomienda su almacenamiento por regla general por debajo de los 20ºC y protegidos de la luz. Algunos medios deben conservarse entre 2-8ºC, siendo este requisito especificado en la etiqueta del producto. Los medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo de 0ºC, ya que se alteraría la estructura del gel. La pérdida de agua puede provocar precipitados o hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo, así como originar grietas en las placas preparadas. En los medios de cultivo que deben refundirse y que deben contener aditivos lábiles, se suministra el medio basal preparado y según la necesidad se deben añadir los aditivos de forma estéril.

Refundido de medios sólidos

Cuando se precisa refundir los medios sólidos, preparados y estériles en frascos y tubos, para verterlos en placa, es aconsejable hacerlo en baño maría, en microondas o en autoclave a vapor fluente. En ningún caso debe aplicarse calor directo. Una vez fundidos, deberán dejarse enfriar hasta unos 50ºC para añadir los aditivos, si fuera necesario y para distribuirlos o sembrarlos. Hay que tener en cuenta que los medios refundidos tienen una cierta tendencia al oscurecimiento y precipitación, que aumenta cuando se mantienen fundidos durante periodos de tiempo prolongados y a temperaturas entre 45-65ºC y que ello puede suponer una pérdida de las características nutritivas o selectivas del medio, por lo que es aconsejable, no fundirlos más de una vez y no mantenerlos en el calor largos periodos de tiempo.

Introducción

¿Qué utilidad tiene conocer las condiciones que un microorganismos requiere para crecer?

# Obtenerlo en el laboratorio Cultivo

# Combatirlo o evitar su proliferación

Nutrientes

Substancias necesarias para asegurar supervivencia.

Proveen energía y elementos necesarios para síntesis de estructuras celulares.

Ingreso por absorción. Viabilidad: capacidad de

reproducción.

Nutrientes esenciales o Básicos

Asimilables por simple difusión o por transporte activo

Agua Fuentes de Carbono Compuestos de nitrógeno Fósforo (fosfatos inorgánicos)

Otros nutrientes Iones potasio Iones Magnesio Factores de Crecimiento u orgánicos

Vitaminas Aminoácidos

Oligoelementos Hierro Cobre Cobalto

Factores Estimulantes

Influyen en el proceso de crecimiento. No son imprescindibles. En presencia de factores estimulantes

crecen mas rápido y mejor.

Categorías Nutritivas

Fuente de Carbono Carbono inorgánico: dióxido de carbono

autótrofas o litótrofas Carbono orgánico: Heterótrofas u

organótrofas Fuente de Energía

Fotótrofas Quimiótrofas: energía suministrada por ATP

Crecimiento Bacteriano

Aumento de número (no de tamaño)

Multiplicación bacteriana: fisión simple o binaria Elongación Auto duplicación de ADN

cromosómico Tabicado central Invaginación membrana

celular Síntesis de pared

Tiempo de generación

Tiempo necesario para la duplicación celular

Distintiva de cada especie Puede influirse por factores estimulantes Varían de 20 minutos (Escherichia coli)

hasta 24 horas

Curva de Crecimiento Bacteriano

•Bacteria en medio adecuado

•Gráfico de coordenadas: número de bacterias (logaritmo) versus lapso de tiempo.

•Distinta para cada bacteria

•En todas se identifican cuatro etapas

Fase de Latencia

El número de microorganismos no varía Adaptación al medio, producción de

enzimas Tiempo variable: entre una hora a días. Tamaño relativo aumentado por división

Fase exponencial o de crecimiento logarítmico

Relación casi lineal entre el tiempo y el número de elementos.

Actividad metabólica incrementada

Depende del tiempo de generación de cada bacteria

Los antimicrobianos son mas activos

Puede haber variaciones entre el crecimiento in vitro e in vivo.

Fase Estacionaria

En determinado punto el crecimiento disminuye La población no aumenta Células nuevas reemplazan a las células

muertas Actividad metabólica mas lenta Células en animación suspendida Producción de metabolitos secundarios

Antibioticos Toxinas

Fase de Esporogenesis para las especies productoras de esporas

Fase de declinación o muerte

Recuento de células disminuye sensiblemente

El numero de células muertas supera al número de células vivas

Acumulación de productos tóxicos Disminución de nutrientes Aparición rápida : autolimitar

diseminación infecciones

Técnicas para determinar el número y viabilidad de las células

Contar al microscopio el número de células en un volumen conocido

Establecer el número de células por turbidimetria

Recuento de elementos viables por cultivo (Unidad Formadora de Colonias o UFC)

Efecto de la Temperatura

Temperatura mínima de crecimiento Temperatura óptima de crecimiento Temperatura máxima de crecimiento

Sicrófilos

Requieren bajas temperaturas 15 – 20 ºC La mínima puede ser muy baja Bacterias en el fondo del mar y en los

polos

Mesófilos

Rango de temperaturas: 25 – 40 ºC Temperatura óptima: 37 ºC ± 1 ºC Agentes que afectan al hombre y los

animales

Termófilos

Toleran altas temperaturas Temperatura óptima: 55 ºC Temperatura máxima: 80 ºC o mas.

Condiciones de pH

pH : Potencial Hidrógeno. Va desde 0 a 14.

pH < 6,5 ácido pH > 7,5 básico o alcalino pH 6,5 – 7,5 neutro Mas adecuado para

crecimiento bacteriano Bacterias que crecen hasta pH 4

Acidófilas (Por ejemplo: Lactobacillus) Vibrio cholerae : medio alcalino

Presión Osmótica

Los solutos (sales y azúcares) disueltos se desplazan a zonas de menor concentración. El agua se desplaza a zonas de mayor concentración de solutos

Una presión osmótica alta causa pérdida de agua y plasmólisis de la célula

Halófilas: bacterias que toleran altas concentraciones salinas

Halófilas facultativas : toleran hasta un 2 % de sales

Condiciones atmósféricas

Potencial de óxido-reducción o Redox (Eh)

Respiración bacteriana : reacciones de óxido-reducción, en cadena

El aceptor final de electrones o hidrogeniones es variable

Aerobios

Requieren oxígeno, aceptor final de hidrógeno

Formación de H2O y CO2 Producción de enzima Catalasa :

desdoblamiento del Peróxido de hidrógeno (H2O2) en H2O y oxígeno

Prueba de Catalasa para diferenciar microroganismos (Staphylococcus de Streptococcus)

GRACIAS