EL DIAGNÒSTIC GENÈTIC I LES TERÀPIES DE LES MALALTIES HEREDITÀRIES

Les grans fites assolides en aquesta dècada i els reptes de futur

Roser Gonzàlez DuarteDepartament de Genètica

Facultat de Biologia - Universitat de Barcelona

EL GENOMA HUMÀ

23parellsdecromosomesSeqüenciciacióGENHUM:Evoluciódelconceptealarealitzaciód’unprojectederecercarevolucionariCharlesDeLisiDepartamentd’Energia,SalutiMediAmbientNIHJWatson,FCollins(geneBcmaps,physicalmaps,andfinallythecompletenucleoBdesequencemap)CraigVenter(TIGR)1.8MbH.Influenzae,nousmètodescomputacionalsLaseqüènciaespublica2001-2003.($16millionin1987;$3-billionin1990)Novesdades:3,234.83Mb;aprox.25,000gens;1.5%DNAquecodificaperproteïnesLarestacorresponaregionsreguladores,LINEs,SINEs,intronsiseqüènciesdefunciódesconeguda

NOVESPERSPECTIVESenmoltscampsdelaBIOLOGIA:biomedicina,antropologia,evolució,ancestres

REVOLUCIÓenLAIDENTIFICACIÓDENOUSGENSCAUSANTSDEPATOLOGIES

DIAGNÒSTICGENÈTICmalalBeshereditàries

CÀNCERestudidelDNAenteixitssomàBques

IDENTIFICACIÓGENÈTICA.DIAGNÒSTICDEPATERNITAT

MEDICINAFORENSE

APLICACIONS

FARMACOGENÈTICA

MALALTIES GENÈTIQUES HEREDITÀRIES

•  Errors en la informació genètica (DNA) que es transmeten de pares a fills

•  Aquests canvis es localitzen en el:1. DNA nuclear (cromosomas), herencia mendeliana2. DNA mitocondrial, herencia materna

TipusdecanvisGrans:reordenacionscromosòmiquesPeBts:subsBtucionsdebases,delecions,duplicacions

SEQÜENCIACIÓ DEL DNA

1975, mètode + i – ( Sanger and Coulson) 1977, mètode dideoxy, (Sanger) Fred Sanger

1918-2013 PremiNobel1980

1986,ABI370ADNAsequencer(1000bpaldia)1996,ABIPRISM310electroforesicapil.lar1998,ABIPRISM3700(96capil.lars)900,000bp/dia

MASSIVE SEQUENCING

Biesecker LG, Green RC. N Engl J Med 2014;370:2418-2425

Darrera generació de seqüenciadors: Illumina produeix 600 Gb (1 Gb = 109 pb) en cada cicle, 55 Gb/dia Genoma humà 3,3 Gb Objectius en el camp biomèdic: Identificar nous gens Identificar noves mutacions 21 x 103 gens 180 x 103 exons

HAN DE SER: -  polimorfismes neutres, - distribuïts, més o menys, a l’atzar als cromosomes - fàcil detecció

SNP,canvisenunasolaposiciónucleohdica>3mil·lions

Microsatèl.litUnitatderepeBció2-5pbACACACAC

Marcadors genètics

VNTr,unitatderepeBció6-100pbTTAACGTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGC

CoA

TheupperDNAmoleculediffersfromthelowerDNAmoleculeatasinglebase-pairlocaRon(aC/Apolymorphism)

AnàlisidelesmòmiesdeladinasBaXVIIIdelsFaraonsd’Egipte:GENEALOGIADE

TUTANKAMON

DegeneraciógenèBcacausadaperl’incestdelsFaraons

(Theyoungerlady)

Ancestry and Pathology in King Tutankhamun's Family

JAMA. 2010;303(7):638-647. doi:10.1001/jama.2010.121

The length of each microsatellite allele was determined in base pairs and converted by software into the number of actual reiterations of repeat motifs at the corresponding locus. All established genotypes differ from those of the laboratory staff and the ancient control group. Note that allele origins in KV21A and KV21B are suggestive and do not serve as proof of relationship with the Amenhotep III and Thuya lineages. See online interactive kinship analysis and pedigree.aIdentified as Tiye. See eAppendix for additional commentary.bIdentified as Akhenaten. See eAppendix for additional commentary. cData replication was successfully performed in the second Cairo laboratory.

AkhenatonTheyoungerlady

AkhenatoncultibeninstruïtconBnuaaquestespràcBques,introdueixlareligiómonoteistaaATON,unadeitatsolar

Tutankamonesvacasaramblasevagermanastra,Ankhesenamon,ellajahaviaestatcasadaambelseupareidesprésdelamortdeTutankamonesvacasarambelseuaviEje

TutankamoniAnkhesenamonvarenconcebredosfills.SónelsdosfetusembalsamatsenelsepulcredeTutankamon

AMENOFISIII,lariquesaielluxecaracteritzenelseuregne.Elcultereligiósprenunagranimportànciaielfaraóesdevél’amoiSenyor:“solbrillantsobretotselspaïsos”

Desprésde30anysderegnatesvacasaramblasevapròpiafilla:LagranesposareialEscreuquedespréshovaferambduesfillesmés.

AlasevamortesvatornaralareligióanBgaivananomanerfaraóaTutankamon

Construcció d’un retrat robot a partir del DNA (assignant l’origen geogràfic de les persones, mitjançant l’anàlisi de 40.000-130.000 SNPs)

UsinggenomicdatafromlargepopulaBonsofsubjectswithknownphenotypes,Parabon'sbioinformaBcistshavebuiltstaBsBcalmodelsforforensictraits,whichcanbeusedtopredictthephysicalappearanceofunknownindividuals.

DIAGNÒSTIC GENÈTIC: INTERÈS I OBJECTIUS

a) Asegura i clarifica el diagnòstic clínic (pronòstic, teràpia)

b) Identifica el tipus d’herència: especialment important en els casos aïllats

c) Identifica els portadors asimptomàticsd) És essencial pel:

consell genètic diagnòstic prenatal i preimplantacional

e) Requisit indispensable per optar a una teràpia gènica

GeneCards: reuneix més de 90 bases de dades diferents que informa sobre dels gens humans identificats i predits: genòmica, proteòmica, transcriptòmica, genètica (Institut Weizmann de Cièncias, 1997) OMIM: catàleg dels gens humans i de les patologies humanes amb base genètica V.A. McKusick (Johns Hopkins) En el genoma humà: Gens que codifiquen per proteïnes 21,965 Gens que causen malalties monogèniques >6.000

BASES DE DADES IMPORTANTS

INTERÉS DEL DIAGNÓSTICO GENÉTICO

a) Asegura el diagnóstico clínico

b) LHON, permite identificar y cuantificar la heteroplasmia

c) DOA, identifica los portadores asintomáticos

d) Señala el tipo de herencia en los casos aislados

e) Muy importante para:

- El estudio de las bases moleculares y celulares de la enfermedad

- Las terapias génicas emergentes

e) Necesario para el consejo genético y el diagnóstico prenatal

ThegenebasisofIRD

©1996-2014, Stephen P. Daiger, PhD and The University of Texas Health Science Center, Houston, Texas

ESTRUCTURADELARETINA

6gransBpusdecèl.lulesneuronalsorganitzaciómoltcomplexametabolismemoltacBususcepBbilitatal’estrèslumínicooxidaBucèl.lulesquenoregeneren

bloodvessels

OrganizaBonofreBnalcircuits

Ocularfundusphotograph

GenèBcaDistrofiesdereBna>250gensReBniBsPigmentosa>85gensADRP:27ARRP:55XLRP:3

Posarref

REPRESENTACIÓSIMPLIFICADADELARETINADELSMAMÍFERS

HemantKhanna.Cells2015,4,674-686;doi:10.3390/cells4040674

AnterogradetransportismediatedbyKinesin-II motor and the IFT-Bcomplexwhereastheretrogradetraffickingisregulatedby the IFT-A and the dynein motorsubunit.TZ:transiBon zone; BB: basal body; C:daughter centriole; G: Golgi; N:nucleus;M:mitochondria.

HemantKhanna.Cells2015,4,674-686;doi:10.3390/cells4040674

SchemaBc representaBon ofphotoreceptor TZ depicBng theidenBficaBonoftheIFT complexes and reBnal diseaseproteinsRPGRandNPHPcomplexproteins.TZ:transiBonzone; BB: basal body; DC:d a u g h t e r c e n t r i o l e ; M :mitochondria;OS:outersegment.

HemantKhanna.Cells2015,4,674-686;doi:10.3390/cells4040674

CilliarytransportFototransducBonUnknownCellularinteracBonsReBnolmetabolismIonchannelsRNAsplicingTranscripBonIntermediarymetabolismStructureLipidmetabolismProteinfoldinganddegradaBon

FuncBonalClassificaBonoftheMajorGenes(92)CausingNonSyndromicRP

1.-OverlappingofclinicaltraitsinIRD

STGD CRD RP

CD

ACHM

CHM

CSNB

LCA

STGD: Stargardt Disease CD: Cone Dystropphy CRD: Cone Rod Dystrophy ACHM: Achromatopsia LCA: Leber Congenital Amaurosis CSNB: Congenital Stationary Night

Blindness RP: Retinitis Pigmentosa CHM: Choroideremia

Cone Rod

AGE

AnnekeI.denHollanderetal.,TheJournalofClinicalInvesRgaRon120(9):3042-3053,2010

APROXIMACIONSTERAPEÙTIQUES:PRESENTIFUTUR

1.Terapiagènica 2.iPScells 3.OptogenèBca

1.TERÀPIAGÈNICA

TeràpiadeLHONMapa�sicdelaregiódelvirusAAV2/2quecontèelgenterapèuBc

HélèneCwerman-Thibaultetal.,Methods&ClinicalDevelopment(2015)2,15003;doi:10.1038/mtm.2015.3

Limitacions: midadelgenatransferir,màx.4,5Kb presènciadecèl·lulesfuncionals

Avantatges: nogenerareaccióimmunitàriaimportantenelpacientelevadaeficàciadetransducció

Bpusdecèlulesquetransdueix llargaduradadel’expressiódelgen

VirusquetransfereixelgenterapèuBcalescèl·lulesdelareBnadelpacient

GENTERAPÈUTIC

TERÀPIAGÈNICAINJECCIÓSUBRETINIANA

Anatomy&EmbryologyoftheEyePaulRiordan-Eva.McGraw-Hill

Virusrecombinant

BascompalmerEyeInsRtuteIniRatesPioneeringGeneTherapyTargeRngChoroideremia

ByronMLamMD

JohnGuy,M.D.

AltresteràpiesgèniquesenfaseclínicapermalalBesreBnianes

Spark therapeutics …We are a leader in the filed of gene therapy… •  Spark Therapeutics Announces Presentation of Additional Phase 3

Data on SPK-RPE65 at The American Academy of Ophthalmology 2015 Annual Meeting

•  Choroideremia

StarGen (Sanofi) Richard Weleber, MD Oregon Health & Science University, Portland, Oregon Jose-Alain Sahel, MD. Ph.D Hopital Nationale des Quinze-Vingt, Paris France StarGen™genetherapyforStargardtdiseaseandReBnoStat®genetherapyforwetage-relatedmaculardegeneraBonreceivedposiBveinterimsafetyreviewsfromaDataandSafetyMonitoringBoard,-Seemoreat:h�p://www.blindness.org/blog/index.php/gene-therapies-for-stargardt-disease-and-wet-amd-deemed-safe-thus-far/#sthash.qXuhB0fq.dpuf(2012)

Autotransplantamentdecèl·lulesmareperrestablirlafunciódelsfotoreceptorsaparRrdequeraRnòcitsdelpacient

Takahashi K, et al. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131:861–72.10.1016/j.cell.2007.11.019

TuckerBA,etal.2013.Pa_ent-specificiPSC-derivedphotoreceptorprecursorcellsasameanstoinves_gatere_ni_spigmentosa.eLife2:e00824.10.7554/eLife.00824

Mutacions USH2A

Cèl·lules mare pluripotens

Estudis funcionals Transplantament en la retina de ratolins Immunosuprimits: Desenvolupament normal Fotoreceptors que sintetitzen proteïnes específiques

2.iPScells

USH2A-associated photoreceptor precursor cells integrate into the dystrophic mouse retina and develop into mature photoreceptor cells.(A and B) Microscopic analysis of rhodopsin

kinase GFP expression in 150-day photoreceptor precursor cells at 14 ...

Tucker B A et al. eLife Sciences 2013;2:e00824

INFERÈNCIES A PARTIR D’AQUESTS RESULTATS

•  Es poden obtenir fotoreceptors a partir de queratinòcits i fibroblasts de pacients

•  Identificar la causa molecular de la patologia inclús en pacients en els que no s’ha identificat previament la mutació

•  Generar models animals que reprodueixin fidelment l’alteració genètica

•  Suggereix una nova via terapèutica