Evolucion de las tecnicas de polimorfismos del ADN

Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010

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MODULO III

GENETICA FORENSE – BREVE ENFOQUE HISTORICO- APLICACIÓN EN CASOS

FORENSES.

CURSO DE POSTGRADO DE MEDICINA LEGAL Y LABORAL

FACULTAD DE DERECHO, CIENCIAS POLITICAS Y

SOCIALES UNNE- CORRIENTES

ALUMNA. LIC. DANIELA ROSA INSAURRALDE Posadas – Misiones – [email protected]

2006


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INTRODUCCION

Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN

La Hemogenética Forense nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner describe el

sistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisión

hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística cuyo objetivo era la

identificación genética tanto en casos de investigación criminal como en estudios biológicos

de la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos

eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas eritrocitarias y sistema

HLA. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse una persona como

posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigio

biológico hallado en el lugar de los hechos.

Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su estructura

y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula la Hemogenética Forense

evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy en día puede hablarse de una nueva

subespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense. Dicha ciencia estudia

básicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos

individuos, es decir, estudia regiones polimórficas del ADN. Así, analizando un determinado

número de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean genéticamente

iguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos).

Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su aplicación

en la resolución de casos judiciales no se produjo hasta 1985, cuando el Ministerio del

Interior Británico solicitó la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Genética de la

Universidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalística fueron resueltos gracias a

la técnica de los RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica). Jeffreys

descubrió la existencia de unas regiones minisatélites hipervariables dispersas por el

genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restricción generaban fragmentos de

longitud variable. Estudios posteriores realizados el mismo Jeffreys demostraron que las

diferencias en el tamaño de estos fragmentos se debían a que estas regiones consistían en

un determinado número de repeticiones en tándem de una secuencia central, el cual variaba

de unos individuos a otros.

El primer locus de ADN polimórfico fue descubierto por Wyman y White en 1980 usando

una sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de más de 15

longitudes diferentes en una pequeña muestra de individuos. Posteriormente se

encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana, en

el oncogen “ras”, en el pseudogen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci

hipervariables constaban de repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos

(11 a 60 pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados

dependían del número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (“Variable Number of

Tandem Repeat”).

Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que éstos podían ser aplicados a la

medicina forense y sustituir a los marcadores clásicos.

En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de la técnica

llamada hibridación con sondas o Southern blot. Esta técnica consta básicamente de las

siguientes etapas:

Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un ADN de alta

molecularidad.


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Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa.

Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados.

Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o nylon y fijación de

las mismas por medio de calor (80ºC).

Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares de unión

inespecíficos que pudiera haber en la membrana.

Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos (32 P normalmente).

Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a la

membrana, y lavado de la membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan

hibridado mal.

Revelado en placa radiográfica e

interpretación de los resultados.

Una vez amplificado el ADN, los

fragmentos resultantes son

separados en función de su tamaño

por medio de un proceso de

electroforesis. Actualmente se

utilizan dos tipos de electroforesis

en los laboratorios de Genética

Forense:

Electroforesis en geles verticales

de poliacrilamida

Electroforesis capilar

La electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de la Genética

Forense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical.

En este caso el proceso electroforético es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50

m de diámetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan

aplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los

primers o los dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcados

fluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia

a una determinada longitud de onda cuando son excitados por láser. El equipo en el que se

realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de

emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos

asignados. La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas

de electroforesis vertical como son:

Rapidez: ya que permite el análisis simultáneo de varios loci aunque éstos posean alelos con

tamaños solapantes.

Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeñas de ADN amplificado.

Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas de

interpretación de los resultados y facilita el análisis de los mismos a través de programas

informáticos.


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Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando

electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se

observan los patrones bandas podrá comprobarse como los

perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas

en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso

(S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

Caso de estudio biológico de la paternidad realizado con electroforesis capilar. Cada pico

corresponde a un alelo, el hijo (H) debe poseer un alelo de la madre (M) y otro del padre

(P) para que la paternidad sea compatible

Futuras tecnologías: biochips

Las técnicas de análisis genético se encuentran hoy en día en continuo desarrollo y

evolución. La necesidad de técnicas que permitan el aislamiento y análisis de los casi cien

mil genes que componen el genoma humano justifica la existencia de líneas de investigación

destinadas al descubrimiento de nuevos métodos que permitan monitorizar elevados

volúmenes de información genética en paralelo y que reduzcan tanto el tiempo empleado

como el coste por análisis.

Desde el análisis de los primeros polimorfismos de ADN con fines identificativos, la

Genética Forense ha sufrido una gran evolución. Los expertos en la materia han sido

testigos de cómo el descubrimiento de la PCR revolucionó las técnicas de identificación

genética. Es probable que la próxima revolución la constituyan los llamados biochips o

microarrays.

Los biochips surgen como consecuencia de una combinación entre técnicas

microelectrónicas empleadas para la fabricación de microprocesadores informáticos y

materiales biológicos. En general puede decirse que la principal característica de los chips

es su capacidad para generar información en muy poco espacio, ya que posibilitan el

procesamiento de multitud de ensayos simultáneamente. Esta característica es la que hace

que los biochips sean probablemente la tecnología del futuro en el campo de las

investigaciones biomédicas.

La fabricación de los biochips es similar a la de los chips informáticos: por medio de la

técnica denominada fotolitografía se depositan circuitos microscópicos sobre láminas de

silicio. En el caso concreto de los biochips, estas láminas son de vidrio y lo que se deposita

en dichas láminas son cadenas de ADN.


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Hay compañías comerciales que han desarrollado otras estrategias para la fabricación de

biochips. No obstante, los más usados actualmente y con mayor número de aplicaciones son

los basados en técnicas fotolitográficas.

DEFINICION

Con la denominación de genética forense se define el uso de ciertas técnicas empleadas en

genética para la identificación de los individuos en base al análisis de los polimorfismos del

DNA. Básicamente se centra en tres áreas:

Identificación de personas desaparecidas a partir del cadáver. Este test también ha

ayudado al forense a identificar cadáveres o restos no identificables, como un brazo u otro

trozo del cuerpo. El patrón genético de estos cadáveres puede comparase con el de los

parientes, lo que en definitiva puede llevar a una ulterior identificación.

Investigación de la paternidad, tanto desde el punto de vista de la reclamación como de la

impugnación.

Criminología, análisis de restos orgánicos como pelos, semen, saliva, sangre, etc. Que han

quedado en la escena de un crimen o de un delito sexual.

TIPOS DE ADN

La genética forense analiza el DNA genómico, también llamado cromosómico.

El ADN mitocondrial.

Y los polimorfismos del cromosoma Y.

Del DNA genómico se estudian las secuencias repetidas en tandem o VNTR (Variable

Number of Tandem Repeats) de las que hay dos tipos, MVR (minisatellite variant repeats) o

secuencias minisatélite de hasta 60 pb y microsatélite o STR (short tandem repeats) que

tienen una cadencia de hasta 6 pb, por ejemplo ATTC se repetiría 2 veces como

ATTCATTC. También se estudian marcadores como HLA-Clase I y Clase ll, que tienen

docenas de locis hipervariables que están estrechamente ligados y RPFLs.

El DNA mitocondrial tiene como característica que su herencia es siempre materna. Se

analizan dos regiones hipervariables del llamado lazo Z.

Los polimorfismos del cromosoma Y se analizan microsatélites (STRs) y el polimorfismo de

nucleótidos simples (SNPs). Sirve para analizar también la patrilínea.

El valor informativo de las secuencias de DNA que se emplean en la genética forense se

basa en el grado de polimorfismo y en la frecuencia de los alelos en la población. Las

ventajas del uso del DNA en la medicina legal son, entre otras, que bastan unos indicios

mínimos ya que se utiliza PCR para amplificar la muestra, la calidad de la muestra no se ve

especialmente comprometida ya que pueden emplearse los STR’s cuando se trata de tejidos

en putrefacción o muestras milenarias y, finalmente, que el DNA está presente en la

mayoría de los indicios que pueden recogerse de la escena de un crimen como el pelo, la piel,

el semen, sangre, etc.

IDENTIDAD GENÉTICA: EN AYUDA DE LA MEDICINA FORENSE

CASOS:

Fuente: ( Publicado en Revista Creces, Abril 1992 ) Desde que en 1988 una corte de Florida culpó a un individuo acusado de violación utilizando

como elemento de prueba su "huella digi ( Publicado en Revista Creces, Abril 1992 )

Desde que en 1988 una corte de Florida culpó a un individuo acusado de violación utilizando

como elemento de prueba su "huella digital genética", este revolucionario método

diagnóstico ha sido objeto de gran atención no sólo en el ambiente científico, sino también

en el campo médico y judicial.


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En julio de 1977, Mónica Lemos de Lavalle, embarazada de ocho meses, fue secuestrada por

los servicios de seguridad argentinos en la provincia de Buenos Aires, junto a su marido y

su hija María de 14 meses. Cinco días después, sus captores dejaron a la niña abandonada

cerca de la casa de su abuela materna. Del paradero del matrimonio, así como de la criatura

que Mónica gestaba nunca se tuvieron noticias. Algún tiempo más tarde, un hombre liberado

de un campo secreto de concentración en Argentina visitó a la abuela y le informó que

Mónica había permanecido en su mismo recinto de detención.

En 1985 las autoridades del nuevo gobierno democrático argentino detuvieron a una mujer

policía que había trabajado en ese campo. La mujer tenia una hija que, aseguraba, le

pertenecía. Dos años más tarde, una prueba genética desarrollada por un organismo

gubernamental demostró, con un 99,9 por ciento de certeza, que la niña era efectivamente

hija de Mónica Lemos. La niña vive actualmente con su hermana y su abuela materna. Los

padres no aparecieron y se presume que están muertos.

Este nuevo test genético, conocido como huella digital genética (genetic fingerprinting),

resulta de gran utilidad en Argentina para reunir a niños cuyos padres desaparecieron

durante el gobierno militar entre los años 1976 y 1983 con sus familias. Dado que los

abuelos de estos niños secuestrados son personas de avanzada edad, y muchos de los niños

aún no han sido localizados, el gobierno argentino ha establecido desde mayo de 1987 una

base de datos genéticos en la que se guardan muestras de sangre de los abuelos y de otros

parientes de los niños perdidos, para poder comprobar su identidad genética si ellos

aparecieran después del fallecimiento de sus familiares. En 1984, los jueces devolvieron

otra niña a sus abuelos. Se trata de Paula Logares Gripson.

PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA:

Aun cuando esta técnica ya es una práctica generalizada en los laboratorios de biología

molecular, deben tomarse muchas precauciones para no inducir a error, especialmente en la

toma de la muestra.

Generalmente las muestras, especialmente en casos forenses, no son puras. En casos de

violaciones, por ejemplo, la muestra vaginal no solo contiene espermatozoides sino también

células vaginales de la propia víctima, por lo que es necesario estudiar por separado el

patrón de migración del DNA de las células de la víctima, así como también el del supuesto

atacante. Un inconveniente que a menudo debe superarse es el hecho que el DNA decae

muy rápidamente, especialmente a la temperatura ambiente. Si esto ha ocurrido, algunos

trozos de DNA que contienen los puntos específicos a ser atacados por las enzimas de

restricción pueden perderse, y como resultado pueden aparecer muchos o muy pocos

fragmentos de DNA.

CONTAMINACIÓN DE LA MUESTRA

Otras veces, contaminantes como los colorantes de los blue jeans, se pueden combinar con

las enzimas de restricción, lo que es causa de que esta enzima corte el DNA en lugares

equivocados. Otras veces el DNA se puede mezclar con iones que también tienen carga

eléctrica y pueden hacerlo migrar en el gel a distancias no predecibles. También proteínas

del ambiente pueden tener algún efecto, uniéndose a fragmentos del DNA y alterando su

movilidad, ya que le agregan mayor peso.

Si el DNA está contaminado, aun el DNA de una misma persona, pueden producirse bandas

en que los extremos no se alineen, aun cuando sus posiciones relativas permanezcan iguales

(un problema conocido como corrimiento de bandas). En la etapa final, cuando se utilizan las

sondas, éstas pueden unirse al DNA contaminante en lugar de hacerlo a las muestras


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humanas, causando bandas espurias. El contaminante incluso puede interferir con las sondas

y no unirse a los fragmentos esperados, dando la impresión de que faltan bandas.

PROBLEMAS CON LOS PARIENTES

Estas pruebas genéticas suponen que los habitantes de un determinado país procrean de

modo tal que sus rasgos hereditarios se distribuyen al azar y que, por lo tanto, las bandas

observables en la prueba de fingerprint también se distribuyen homogéneamente en la

población. Algunos estudios realizados en EE.UU. ponen en duda esta afirmación.

En muchos países occidentales existen pequeños grupos étnicos y religiosos en los que

ciertas características genéticas pueden ser más comunes. Los miembros de dichos grupos

se unen frecuentemente con individuos de la misma comunidad, por lo que genéticamente

están más estrechamente relacionados.

Esta suerte de "inbreeding" aumenta las posibilidades de que un niño herede las mismas

secuencias repetidas que ambos padres y así sea homocigoto para esa secuencia. El

homocigoto lleva entonces dos bandas iguales de una determinada movilidad, ya que recibe

la misma secuencia de DNA de ambos padres. Por esa razón, y para esa secuencia en

particular, el individuo no tendrá dos bandas simples sino más bien una sola de mayor

intensidad, lo que puede complicar la interpretación de los resultados.

Los expertos están de acuerdo en que las técnicas han progresado y que prometen mucho,

siempre y cuando se tomen las adecuadas precauciones.

IDENTIFICACIÓN DE VIOLADORES

En el caso de violaciones, se puede tornar una muestra de la vagina de la víctima y también

del presumible violador. El pattern genético resultante se compara con el de la víctima

tomado de una muestra de sangre. Cualquier banda derivada de la muestra de DNA vaginal

que no esté presente en la sangre de la víctima, se puede asumir que pertenece al

victimario. Esto significa que la prueba genética no sólo permite identificar el victimario

sino además descartar a sospechosos inocentes.

Otros criminales, como asesinos y ladrones, pueden también identificarse si han dejado una

pequeña gota de sangre o algunos pocos pelos en la escena del crimen.

El test genético puede realizarse a partir de muestras tan pequeñas como cincuenta

microlitros de sangre, 0.5 microlitros de semen o 10 raíces de pelos. Muestras tan

pequeñas de DNA pueden amplificarse usando la técnica de la polimerasa en cadena, que

permite fabricar muchas copias de DNA a partir de Infimas cantidades. También se han

utilizado células descamativas de la mucosa de la boca, tejido muscular o material fetal y

en general cualquier tejido de cadáveres.

Jeffreys ha extraído el DNA de huesos que se supone pertenecían a Josef Mengele, el criminal. de guerra nazi, y al mismo tiempo está tratando de obtener muestras de sangre de los parientes que aún viven, con el objeto de determinar silos restos encontrados en Brasil realmente pertenecen a Mengele.

TOMA DE MUESTRAS

CONSENTIMIENTO APROBADO

SANGRE: punción venosa (5ml. EDTA). Punción dactilar (papel secante y secar a

temperatura ambiente) ¡OJO PERSONAS TRANSFUNDIDAS!

CELULAS EPITELIALES BUCALES: Hisopos- dejarlos secar y enfundar, sobre de papel.

PELOS CON RAIZ: 15 mínimo de diferentes zonas de la cabeza, con raíz. En sobre de

papel, rotulados.


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CADÁVER

FRESCO: sangre, punción cardíaca.

Músculo esquelético (10 gr. en recipiente plástica y tapa a rosca SIN conservante.

CUADRICEPS O CARDIACO. (MEJORES).

DIENTES: 4 Premolares o Molares: se puede dejar en reserva para evitar exhumación. LAS

PULPAS DENTALES TIENEN RESTOS DE ADN.

AVANZADO ESTADO O ESQUELETIZADO: Hueso largos FEMUR – HUMERO- se puede

lijar con lija previamente para sacar todo el resto de carne.

Pulpas dentales (4 premolares o molares) no dañados externamente.

CADAVER CARBONIZADO:

Cuando no es total: MUSCULO ESQUELETICO – ZONA PROFUNDA.

HUESOS – PIEZAS DENTALES.

MUESTRAS INDUBITADAS:

HOSPITALES: muestras de sangre- Biopsias en parafina.

PEINES – MAQUINITAS DE AFEITAR – SALIVA – SELLOS O SOBRES.

OTRO TIPO DE MUESTRAS:

MANCHAS SECAS (COLILLAS – ARMAS BLANCAS – LLAVES – ROPAS – VASOS – ETC.)

VIDRIO: Hisopo con H20 destilada ***SECAR***ENFUNDAR***sobre de papel madera. O

raspar con bisturí en sobre papel y guardar.

“NO SE PUEDE APLICAR NI HACER CIENCIA SIN LOS PASOS DEL METODO CIENTIFICO” EL MÉTODO CIENTÍFICO ES LA SISTEMATIZACION PARA LLEGAR A LA OBTENCION DE UNA DEDUCCION

VALIDA ACERCA DE ALGO.

PASOS: 1. OBSERVACIÓN. La observación consiste en fijar la atención en una porción del Universo. Mediante la observación nosotros identificamos realidades o acontecimientos específicos del cosmos a través de nuestros sentidos. 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: la pregunta debe ser congruente con la realidad o el fenómeno observado, y ser lógica. El investigador debe tener en cuenta que las preguntas “POR QUE”, son difíciles, pero no imposibles. EL INVESTIGADOR OBJETIVO DEBE COMENZAR SUS PREGUNTAS CON “QUE”, “COMO”, “DONDE”, “CUANDO”, o “PARA QUE”. 3. RAZONAMIENTO INDUCTIVO: trata de dar una o más respuestas lógicas a las preguntas. Cada respuesta es una introducción tentativa que puede servir como una guía para el resto de la investigación. Estas soluciones preliminares a un problema son las HIPÓTESIS.

4. PLANTEAMIENTOS DE HIPOTESIS: Hipótesis es una declaración que puede ser falsa o verdadera, y que debe ser sometida a comprobación (experimentación). Cada hipótesis

debe ser sometida a una prueba exhaustiva llamada experimentación. Los resultados de la

experimentación determinarán el carácter final (falso o verdadero) de la hipótesis.

5. RAZONAMIENTO DEDUCTIVO: sirve para darle consistencia a las observaciones e

hipótesis, se las puede llamar predicciones.

6. RECOLECCION DE DATOS: Incluye todo el trabajo de inteligencia, de campo, las

pericias científicas, etc.


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7. TEORIA: es la declaracion parcial o totalmente verdadera verificada por medio de la

experimentación o recoleccion de datos, de las evidencias y que son válidas sólo para un

tiempo y un lugar determinado. Por ejemplo un hecho en particular

INTERPRETACION DE DOS CASOS

Ejemplo de caso de Paternidad. Al leer las bandas queda claro que el padre es el Nº 1

Ejemplo de caso de violación, con dos sospechosos, donde por la presencia de las bandas, se

determina que el verdadero autor del hecho es el sospechoso Nº 1, en ambas evidencias

tomadas de la víctima.

CONCLUSION:

El presente trabajo es un pequeño compendio de artículos extraídos de diferentes

Fuentes, donde se trató de reflejar simplemente la importancia de la Genética Forense en

los casos de hechos de índole penal o civil, como los casos de paternidad o maternidad,

violaciones u homicidios.


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Si bien los datos técnicos y el protocolo del procedimiento en laboratorio están

estandarizados a nivel internacional, al igual que su aplicación en la Justicia Penal y Civil, el

criterio ético suele ser uno de los determinantes fundamentales al momento del análisis, e

interpretación, a los fines de la seguridad del resultado final.

Otro punto es La Toma de Muestra, fundamental la capacitación del personal encargado o

presente en un Hecho delíctivo, por el simple hecho de que si la muestra fue mal

preservada, nada se podrá hacer al respecto.

Otro factor en esta cadena de procedimientos para llevar a cabo la pericia de genética

molecular es la CADENA DE CUSTODIA, que garantiza la seguridad desde la Toma de

Muestra, pasando por el laboratorio, hasta las manos del Juez.

La Genética por si misma es una Ciencia, y pasa a ser auxiliar de la Medicina Legal en el

momento de tenerla en cuenta para casos forenses. No es una subespecialidad de la

Medicina como catalogan algunos autores.

Durante la Inspección de una Escena de un Crimen, donde comienza “todo”, el jefe que

dirige la investigación debe tener conocimientos sobre las distintas disciplinas que pueden

actuar en el hecho, Uno de los mayores errores que se cometen es el desconocimiento de

QUE, COMO, DONDE, CUAL? Elemento relevar, conservar, y para que sirve y a donde

remitir.

BIBLIOGRAFIA

CARMEN ESTRALA. TESIS DOCTORAL. Laboratorio de ADN forense, Depto. de

Medicina Legal, Universidad de Granada, España.

Extractado de un articulo original de Pauline Lowrie y Susan Wells publicado en New

Scientist, 16 de noviembre de 1991.

PRIMAROSA CHIERI- ZANNONI, EDUARDO. Prueba del ADN. 2da. Edic. Edit.

Astrea. (2005)

JEFFREYS, A.J.; WILSON, V.; THEIN, S.L. 1985 b. Individual specific

“fingerprints” of human DNA. Nature, 316:76-79

JEFFREYS, A.J.; WILSON, V.; THEIN, S.L. 1985 a. Hypervariable minisatellite

regions in human DNA. Nature, 314:67-73

Education

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