Función de los genes en microorganismos - Bryan Lucero

Curso Internacional de Ciencia y Tecnología

Curso de Ciencias Para Profesores Julio 2013

20 de Julio 2013 Universidad Ricardo Palma Organizado por: Científicos Peruanos Jóvenes en el Perú y el Extranjero Centro de Preparación para la Ciencia y Tecnología Universidad Ricardo Palma

http://escueladeciencias.hol.es

http://escueladeciencias.hol.es/

“Descubriendo la función de los genes en los microorganismos”

Julio - 2013

UPCH-LID Bryan Lucero 1/31

Bryan Lucero

Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática.

Esquema

• Dogma Central BM.

• Estrategias de estudio

• Knock Out / Knock Down .

• M. tuberculosis.

• Pirazinamida.

• Metalochaperonas / bombas de eflujo.

• Limitaciones.

• Agradecimientos


Dogma Central de la Biología Molecular


Flujo de información

ADN

ARN Proteína

(Crick ,1970) “'Central Dogma of Molecular Biology. Nature 227, 561-563


Flujo de información

ARN

Proteína

ADN Transcripción

Traducción

Replicación

Knockout

KnockDown

M.O

¿Cómo descubrir la función de un gen?

Genética Funcional

Knockout Knock down

(Kaur, 2010)


TUBERCULOSIS

UPCH-LID Bryan Lucero 6/31 (WHO,2010)


• 4.42 Mb

• ~4124 genes.

• 65.62 GC%

GENOMA

(Broad Institute, 2013)

FÁRMACOS


Pirazinamida

(Minsa,2009)

Causas de resistencia

• Mal funcionamiento

de la PZAsa

• Falta Expresión de la PZAsa.

• Mutaciones en RpsA.

• Fallas en la bomba de eflujo.


(Zhang, 2003)

Falla por mutaciones en el promotor

Falla por mutaciones en el gen codificante


¿? 5 factores: 1. Entrada de PZA. 2. Actividad de PZAasa. 3. [PZAsa]. 4. Eficiencia de Bombas 5. [Bombas]



de la PZAsa





(Zhang, 2003)

MTCH



de la PZAsa





(Zhang, 2003)

(Zimic,2011)

¿conocemos todas la piezas?


Justificación

• Mejor entendimiento del mecanismo de resistencia

• Mejor diagnóstico de resistencia a PZA.

• Mejor tratamiento. Mas rápido , mas económico.


Determinar la relación directa del efecto del silenciamiento gradual en la expresión de los genes candidatos a bombas de eflujo/mtch

sobre el mecanismo de acción de la pirazinamida. • Hallar y priorizar genes candidatos a bombas de eflujo/mtch relacionados al

mecanismo de acción de la pirazinamida en el genoma de M. tuberculosis .

• Obtener cepas transformadas de M. tuberculosis que permitan un silenciamiento gradual de los genes blancos.

• Observar el efecto del silenciamiento gradual de las bombas de eflujo candidatas sobre la condición de resistencia a pirazinamida.

• Analizar estadísticamente el efecto directo del silenciamiento genético y la susceptibilidad de estas cepas hacia las droga.

OBJETIVOS


¿Está alguna de las bombas de eflujo/MTCH candidatas halladas en el genoma de Mycobacterium tuberculosis relacionada directamente al

mecanismo de acción de la pirazinamida ?

Pregunta problema

Hipótesis

El silenciamiento de por lo menos un gen candidato a bomba de eflujo estaría involucrado en el mecanismo de acción de la pirazinamida en el eflujo de ácido

pirazinoico.



A

Lista de genes candidatos encontrados en M. tuberculosis

back

Referencias

BLAST


Anotación

Búsqueda Directa

1


2

PZAsa RpsA

80 genomas

Bombas/MTCH

Cepas Resistentes

Selección de Candidatos


B

C

BamHI - NedI

Plásmido


Optimización del diseño

-Considerar el sitio de unión al ribosoma.

-Evitar estructuras secundarias que causen homodimerización.

C Transformación de cepas H37Rv

Knock Down

Considerando 6-9 nn antes de ATG/GAG y una longitud <400 nn



D

Wayne

Test de Wayne

El método de Wayne es una prueba colorimétrica que detecta POA, este es expulsado por el bacilo en el medio de cultivo y mediante la reacción de Wayne se forma un complejo químico de color rojo, mediante una lectura a una longitud de

450 nm se detectará la actividad de la pirazinamidasa en relación con el silenciamiento de las metalochaperonas hipotéticas.


pAZ: Gradiente de Inducción

WAYNE pH 7.4

Control de la matriz: 1 A Controles para PZA: A Controles para IPTG: 1

MATRIZ EXPERIMENTAL

H37Rv

12, 24,36,y 48 horas


(0-200 ug/ml)

(0-1000 ug/ml)

MIC pH 5.8

Control de la matriz: 1 A Controles para PZA: A Controles para IPTG: 1

MATRIZ EXPERIMENTAL

H37Rv


(0-1000 ug/ml)

(0-200 ug/ml)

.

p<0.05


E= x0 + x1*[pza] + x2*[iptg] + x3*[pza]*[iptg]

Pruebas Adicionales

RT-qPCR

• Genes blanco.

• Pirazinamidasa (control).


Inmunoblot

Resultados esperados

• Se espera encontrar niveles óptimos de silenciamiento genético para determinar eficientemente la funcionalidad.

• Se espera encontrar expresión diferencial inducida del gen antisentido que promueve una inhibición gradual del gen blanco.

• Este estudio espera encontrar diferencias significativas en el eflujo de ácido pirazinoico de las cepas transformadas con la cepa H37Rv wild type.

• Demostrar la condición de susceptibilidad de cepas transformadas.

• Se plantea hallar el gen específico que codifique a una bomba de eflujo involucrado en el mecanismo de acción de la pirazinamida.


Limitaciones


Condición del gen

Sesgo en los criterios de selección

Familia genética

Gracias por su atención

Agradecimientos Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática.


Otros Proyectos


@Joebluc

BioLuces

Education

Función de los genes en microorganismos - Bryan Lucero