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GENES IX LEWIN
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Los genes son DNA
ESQUEMA DEL CAPITULO r-----------------------_/..-
...
Introduccion
El acido desoxirribonucleico (DNA,deoxyribonucleic acid) es el material genetico delas bacterias• La transformacion bacteriana proporciono la primera prueba
de que el DNA es el material genetico de las bacterias. Laspropiedades genHicas pueden ser transferidas de una cepabacteriana a otra extrayendo el DNA de la primera cepa yafiadiendolo a La segunda.
El DNA es el material genetico de los virus• La infeccion por fagos demostro que el DNA es el
material genetico de los virus. Cuando el DNA y loscomponentes proteinicos de los bacteri6fagos sonmarcados con is6topos radioactivos diferentes, solo el DNAes transmitido a la progenie de fagos producida por lasbacterias infecciosas.
El DNA es el material genetico de las cHulasanimales• El DNA puede ser utilizado para introducir nuevas
caracteristicas geneticas en celulas ani males 0 en animalescompletos.
• En algunos virus, el material genetico es el RNA.
Los polinucleotidos tienen bases nitrogenadasligadas a un esqueleto de azucar-fosfato• Un nucleosido esta formado por una base purica 0
pirimidica ligada a una pentosa (azucar de cinco carbonos)en la posici6n 1.
• Las posiciones en eL anillo de ribosa se describen con elsimbolo matematico de primo ('), para distinguirlas.
• La diferencia entre el DNA y el RNA radica en el grupolocalizado en la posici6n 2' del azucar. El DNA tiene un azucardesoxirriboso (2'-H); el RNA tiene un azucar riboso (2'-OH).
• Un nucle6tido consiste en un nucleosido ligado a un grupofosfato en la posicion 5' 0 3' de la (desoxi)ribosa.
• Los residuos sucesivos de (desoxi)ribosa de una cadena depolinucleotidos estan unidos por un grupo fosfato entre Laposicion 3' de un azucar y la 5' del siguiente.
• Un extremo de La cadena (convencionalmente el izquierdo)tiene una punta 5' libre y, en el otro, la punta libre es 3'.
• El DNA contiene las cuatro bases, adenina, guanina,citosina y timina; el RNA posee uracilo en vez de timina.
El DNA es una helice dupLex• La forma Bdel DNA es una helice dupLex formada por dos
cadenas polinucleotidicas que corren de forma antiparalela.
• Las bases nitrogenadas de cada cadena son anillos planosde purina 0 de pirimidina orientados hacia el interior quese aparean uno a otro a traves de puentes de hidrogenopara formar unicamente pares de A-To G-c.
• El diametro de la helice duplex es de 20 A, ademas de unavuelta completa cada 34 A, con diez pares de bases por vuelta.
• La helice dupLex forma un surco profundo (ancho) y unsurco superficial (angosto).
_ La duplicacion del DNA es semiconservadora• En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz6 marcaje de
densidad para demostrar que la cadena polinucleotidicaindividual es la unidad del DNA que se conserva durante laduplicaci6n.
• Cada cadena de un DNA duplex actua como molde parasintetizar a una cadena hija.
• Las secuencias de las cadenas hijas estan determinadas porapareamiento complementario de bases con las cadenasprogenitoras separadas.
lID Las cadenas de DNA se separan en la horquilla deduplicaci6n
• La duplicacion de DNA es emprendida por un complejode enzimas que separan a las cadenas progenitoras y quesintetizan a las cadenas hijas.
• La horquilla de duplicacion es el punto en el cuallascadenas progenitoras se separan.
• La enzimas que sintetizan DNA se denominan DNApolimerasas; las enzimas que sintetizan RNA son conocidascomo RNA polimerasas.
• Las nucleasas son enzimas que degradan a los acidosnucleicos; entre otras, DNAsas y RNAsas, que puedendividirse en endonucleasas y en exonucleasas.
.. La informacion genetica puede ser proporcionadapor el DNA 0 eL RNA• Los genes celulares son DNA, pero los virus y los viroides
pueden tener genomas de RNA.• El DNA se convierte en RNA por transcripcion, y el RNA
puede convertirse en DNA por transcripci6n inversa.• La traducci6n del RNA a proteinas es unidireccional.
aD Los acidos nucleicos se hibridan por apareamientode bases• El calentamiento provoca que las dos cadenas de un DNA
dLlplex se separen.• La Tro es el punto medio del rango de tem peratura para la
desnaturalizaci 6n.• Las cadenas complementarias Lmicas pueden renaturalizarse
cuando se reduce la temperatura.
Continua en la siguiente pagina
1
• La desnaturalizaci6n y La renaturaLizacion/hibridacionpueden ocurrir con combinaciones de DNA-DNA, deDNA-RNA 0 de RNA-RNA y pueden ser intermoLeculareso intramoleculares.
• La capacidad de dos preparaciones de acidos nucleicosde una soLa cadena para hibridarse es indicio de sucomplementariedad.
1m Las mutaciones cambian la secuencia del DNA• Todas las mutaciones consisten en cam bios de la
secuencia del DNA.• Las mutaciones pueden ser espontaneas 0 inducidas
por mutagenos.
... Las rnutaciones pueden afectar a pares debases individuales 0 a secuencias mas largas• Una mutaci6n puntual cambia a un solo par de bases.• Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas
par la conversion qui mica de una base en otra a parerrores durante la duplicacion.
• Una transici6n rem plaza a un par de bases G-C par unpar de bases A-To viceversa.
• Una transversion rem pLaza a una purina par unapirimidina, par ejemplo, cambiando A-T aT-A.
• Las inserciones son el tipo mas comun de mutacion,y son resultado del movimiento de elementostransponibles.
IIID Los efectos de las mutaciones puedenser revertidos• Las mutaciones primarias desactivan a un gen,
mientras que las inversas (0 retromutaciones) reviertensus efectos.
III Introducci6nLa naturalez3. hereditaria de todo organismo vivientees definida por su genoma, el cual consiste en unasecuencia larga de acido nucleico que proporcionala informaci6n necesaria para construir el organismo.Se utiliza el termino "informacion" debido a que elgenoma por si mismo no desempefia ninguna funcion activa en la construccion del organismo, masbien es la secuencia de las subunidades individuales(bases) del acido nucleico la que determina las caracteristicas hereditarias. Por una compleja serie deinteracciones, esta secuencia se utiliza para producirtodas las proteinas del organismo en el momenta yellugar apropiados. Las protefnas forman parte dela estructura del organismo 0 tienen la capacidadde construir estructuras 0 llevar a ca bo las reacciones metabolicas necesarias para la vida.
El genoma contiene el conjunto completo deinformacion hereditaria para cualquier organismo.Fisicamente, el genoma puede ser dividido en varias moleculas diferentes de acido nucleico y funcionalmente, en genes. Cada gen es una secuenciaque dentro del acido nucleico representa a una solaprotefna. Cada una de las moleculas de acido nucleico que componen el genoma puede contener
2 CAPITULO 1 Los genes son DNA
• Las inserciones pueden revertirse par deleci6n delmaterial insertado, pero las deleciones no puedenrevertirse.
• La supresion ocurre cuando una mutacion de unsegundo gen anula el efecto de la mutaci6n del primergen.
IIDI Las mutaciones se concentran en puntoscalientes• La frecuencia de la mutaci6n en cualquier par de bases
en particular depende de fluctuaciones estadisticas,excepto en los puntos calientes, en Los cuales lafrecuencia se incrementa cuando menos en un ordende magnitud.
_ Numerosos puntos calientes son resultadode bases modificadas• Una causa comun de los puntas calientes es La base
rnodificada 5-metilcitosina, la cual experimentadesarninacion espontanea y se convierte en tirnina.
1m Algunos agentes hereditariosson extremadamente pequenos• Algunos agentes hereditarios rnuy pequeiios no
codifican proteinas, sino que constan de RNA aproteinas que poseen propiedades hereditarias.
1m Resumen
gran numero de genes. Los genomas de los organismos vivos pueden contener incluso <500 genes(como un micoplasma, que es un tipo de bacteria)0>25 000 en el ser humano.
En este capitulo se analizan las propiedades delgen en cuanto a su construccion molecular basica.En la iUkJ' se resumen las etapas de transiciondel concepto historico del gen a la definicion moderna del genoma.
Un genoma consiste en el conjunto completode cromosomas de cualquier organismo espedfico, demodo que comprende una serie de moleculas de acido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)(una para cada cromosoma), cada una de las cualescontiene numerosos genes. La principal definicionde un genoma es deterrninar la secuencia del DNA decada cromosoma.
La primera definicion del gen como unidad funcional se derivo del descubrimiento de que cada genes responsable de la produccion de proteinas espedficas. La diferencia en las caracteristicas qufmicasdel DNA del gen y su producto protefnico condujoal concepto de que un gen codifica a una protefna.A su vez, esto llevo al descubrimiento del aparatocomplejo que permite que la secuencia de DNA deun gen genere la secuencia de aminoacidos de unaprotefna.
•.. • ~ .••• ~ ~.[iJ.~.J!.ifiL=~1865 Los genes son lactores particulados
1871 Descubrimiento de los acidos nucleicos
1903 Los cromosomas son las unidades hereditarias
1910 Los genes residen en los cromosomas
1913 Los cromosomas son secuencias linealesde genes
1927 Las mutaciones son cam bios ffsicos enlos genes
1931 La recombinaci6n ocurre por entrecruzamiento
1944 EI DNA es el material genetico
1945 Un gen codilica a una protefna
1951 La primera secuencia protefnica
1953 EI DNA es una helice duplex
1958 EI DNA se replica de forma semiconservadora
1961 EI c6digo genetico esta determinado por tripletes
1977 Los genes de las eucariotas son interrumpidos
1977 Posible secuenciaci6n del DNA
1995 Secuenciaci6n de los genomas bacterianos
2001 Secuenciaci6n del genoma humano
Breve historia de la genHica.
un gen es una secuencia de DNA que codifica a un RNA;en los genes codificadores de proteinas, el RNA a su vezcodifica a una proteina.
A partir de la demostracion de que un gen consiste en DNA y de que un cromosoma consiste enun tramo largo de DNA que representa a numerososgenes, se llega a la arganizacion global del genomaen funcion de su secuencia de DNA. En el Capitulo 3,El gen interrumpido, se retoma en mas detallela organizacion del gen y su representacion en proteinas. En el Capitulo 4, El contenido del genoma, seanaliza el numero total de genes, y en el Capitulo 6,Agrupamientos y repeticiones, se describen otroscomponentes del genoma y el mantenimiento desu organizacion.
.. El DNA es el material geneticode las bacterias
Concepto principal
• La transformaci6n bacteriana proporcion6 la primera
prueba de que el DNA es el material genetico de
las bacterias. Las propiedades genHicas pueden ser
transferidas de una cepa bacteriana a otra extrayendo
el DNA de la primera cepa y sumandolo a la segunda.
La idea de que el material genetico es acido nucleicotiene sus rakes en el descubrimiento de la transformacion, en 1928. La bacteria Pneumococcus mata deneumonia a los ratones. La virulencia de la bacteriadepende de su polisacarido capsular, componente dela superficie que permite que la bacteria escape de ladestruccion provocada par su hospedador. Diversostipos de Pneumococcus (1, II Yill) tienen polisacaridoscapsulares diferentes; su aspecto es lisa (5, smooth).
Todos los tipos de Pneumococcus lisos puede darlugar a variantes incapaces de producir el polisacarido capsular, en cuyo caso, la superficie de la bacteria es rugosa (R, rough) ([armada por el materialque estaba debajo del polisacarido capsular). Estasbacterias son avirulentas, no matan a los ratonesporque la ausencia del polisacarido permite que elanimal destruya a la bacteria.
Cuando par medio de tratamiento calorico sematan bacterias lisas, pierden la capacidad de danaral animal, sin embargo, la combinacion de bacterias 5 desactivadas con calor y la variante ineficaz Rproduce un efecto considerablemente diferente delde cada bacteria por separado. En la • semuestra que cuando se inyectan conjuntamente enun animal, el raton muere como resultado de unainfeccion por Pneumococcus. Las bacterias 5 virulentas pueden ser recuperadas del raton muerto.
Secuencia de aminoacidosProteina e51.~~
RNA Secuencia de nucle6tidos
'IGUR 1" Un gen codifica una molecula de RNA, la cualcodifica una proteina.
Entendiendo el proceso par media del cual ungen se expresa, permite una definicion mas rigurosa de su naturaleza. En la FT U A 1. se ilustra eltema basico de esta obra. Un gen es una secuenciade DNA que produce otro acido nucleico, el acidoribonucleico (RNA, ribonucleic acid), que cuenta condos cadenas de acido nucleico, mientras que el RNAtiene una sola. La secuencia del RNA es determinada par la secuencia del DNA. (De hecho, es identicaa una de las cadenas de DNA.) En muchos casos,pero no en todos, el RNA se utiliza a su vez paradirigir la produccion de una proteina. Por 10 tanto,
DNA'W~ Secuencia de nucle6tidos
l
Gen Naturaleza quimica
1.2 El DNA es el material genetico de las bacterias 3
Tipos de PneumococcusInyeccionde celulas Resultado
formante, se demostr6 que este es acido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid).
Ni las bacterias tipo S asesinadas con calor ni lasbacterias tipo Rvivas pueden matar a los ratones, pero la inyeccion simultanea de ambos tipos de bacterias puede matar a losratones de forma tan efectiva como la bacteria tipo S viva.
/Sin capsula,~ Bacteria S muertade aspecto~ y bacteria R viva
rugosa (R)
Muere~ • La infeccion por fagos demostro que el DNA es elmaterial genetico de los virus. Cuando el DNA y loscomponentes proteinicos de los bacteri6fagos sonmarcados con diferentes is6topos radioactivos, s6lo elDNA es transmitido a la progenie de fagos producidapor las bacterias infecciosas.
Concepto principal
.. El DNA es el material geneticode los virusa
aVive
Vive
Muere~Bacteria S viva
Bacteria S muerta
Bacteria R viva
Can capsula,de aspectolisa (S)
\
Bacterias S vivasrecuperadas del
\
raton muertoSe extraeel DNA
Wl\VJW/.......... )
Bacteria R Transformacion Bacteria S
El DNA de la bacteria de tipo S puede transformara la bacteria de tipo Ren el mismo tipo S.
En este experimento, las bacterias 5 muertasfueron de tipo III y las R vivas, de tipo II. La cubierta de las bacterias virulentas recuperadas de lainfeccion mixta era lisa, de tipo III, por 10 tanto,alguna propiedad de las bacterias 5 tipo III, muertas,puede transformar a las bacterias R, induciendo laformacion del polisacarido capsular tipo III, que lastorna virulentas.
En la se muestra la identificacion delcomponente de las bacterias muertas responsable dela transformacion, el cual se denomin6 principiotransformante, que se purific6 desarrollando unsistema libre de celulas, en donde los extractos delas bacterias 5 muertas podfan agregarse a las bacterias R vivas antes de ser inyectadas al animal. En1994, mediante la purificacion del principio trans-
Una vez que se comprob6 que el DNA es e) material genetico de las bacterias, el siguiente paso fuedemostrar que el DNA proporciona el material genetico en un sistema bastante diferente. El fago T2es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli.Cuando las partfculas del fago (virus) se agregana las bacterias, estas se adsorben en la superficieexterior, parte del material entra en la bacteria y, alcabo de -20 min, cada bacteria explota (se lisa) paraliberar una numerosa progenie de fagos.
En la se ilustran los resultados de unexperimento realizado en 1952 en el cual se infectaron bacterias con fagos T2, los cuales habfan sidomarcados radioactivamente en su componente deDNA (con 32P) 0 en su componente protefnico (con355). Las bacterias infectadas se mezclaron en unalicuadora y dos fracciones se separaron por centrifugaci6n. Una de estas contenfa las cubiertas de fagosvadas liberadas de la superficial de la bacteria, entanto que la otra estaba formada por las bacteriasinfectadas. *
Gran parte del marcador 32p se encontro en lasbacterias infectadas. Las partfculas de la progenie defagos producidas por la infeccion contenfan - 30%del marcador 32p original. La progenie recibio unacantidad muy pequena, menos dell %, de la protefna contenida en la poblaci6n original de fagos. Lascubiertas de fago estaban formadas por protefnas, ypor 10 tanto portaban el marcador radioactivo 355.Asf pues, con este experimento se demostr6 directamente que s610 el DNA de los fagos progenitoresentra en las bacterias y que despues formara partede los fagos de la progenie, exactamente el patron deherencia que se espera del material genetico.
* N del T: este parrafo implica que los virus fueron marcados enun componente a en Olro (pero no en los dos). mientras que ladescripci6n de los resultados sugiere que tanto un componentecomo el Olro fueron marcados.
4 CAPiTULO 1 Los genes son DNA
. I •
DNA marcadocon 32p _
proteina'~• marcada con 35S
/~ Adici6n de DNA TK+
Las celulas que carecen del gen TK no puedenproducir timidina cinasa y mueren sin timidina
Coloniade celulas TK+
Algunas celulas incorporan al gen TK; los descendientesde una celula sometida a transfecci6n se agrupan en una colonia
Las bacteriasinlectadascontienen70% delmarcador 32p
Los fagos de laprogenietienen 30% delmarcador 32py <1% del
\. marcador 35S
ISe separan las cubiertas de loslagos de la bacteria infectada
J\J'l-A ~1 (~S
Las cubiertas delos lagos contienen I80% del marcador Se afslan las partlculas35S de la progenie de lagos
~
Se inlecta a la bacteria conlagos marcados.
t Lt
lGURA 1 5 El material genetico del fago T2 es el DNA. 1 f Las celulas eucariotas pueden adquirir un fenotiponuevo como resultada de la transfecci6n par adici6n de DNA.
Un fago se reproduce ordenando ala maquinaria de una celula hospedadora infectada que produzca mas copias de sf misma. El fago posee material genetico cuyo comportamiento es analogo alde los genomas celulares: sus rasgos son fielmentereproducidos y estan sujetos a las mismas reglas quegobiernan la herencia. El caso de los T2 refuerza laconclusion general de que el material genetico esel DNA, ya sea que forme parte del genoma de unacelula 0 de un virus.
III El DNA es el material geneticode las celulas animales
Conceptos principales
• El DNA puede ser utilizado para introducir nuevascaracteristicas genHicas en celulas ani males 0 enani males completos.
• En algunos virus, el material genetico es RNA.
Cuando se agrega DNA a poblaciones de celulas eucariotas individuales en cultivo, el acido nucleicoentra a las celulas, 10 cua!, en algunas, resulta en laproduccion de protefnas nuevas. Cuando se utilizaDNA purificado, su incorporacion da lugar a la produccion de una protefna en particular. En la
se representa uno de los sistemas estandar.
Aunque por razones historicas estos experimemos se describen como transfeccion cuandoson realizados con celulas eucariotas, constituyenuna contraparte directa de la transformacion baeteriana. El DNA introducido en la celula receptora seincorpora a su material genetico y es heredado en lamisma forma que cualquier otra parte. Su expresionconfiere un nuevo rasgo a las celulas (sfntesis detimidina-cinasa en el ejemplo de la Figura 1.6). Enun principio, estos experimentos solo tuvieron exitocon celulas individuales adaptadas para crecer en unmedia de cultivo, pero desde entonces, el DNA hasido introducido en ovulos de raton por microinyeccion, y puede llegar a ser una parte estable delmaterial genetico del animal.
Dichos experimemos muestran directamenteno solo que el DNA es el material genetico de laseucariotas, sino tambien, que puede ser transferidoentre especies dlferentes y seguir siendo funcional.
El material genetico de todos los organismosconocidos y de numerosos virus es el DNA. Noobstante, algunos virus usan un tipo alternativo deacido nucleico, el ribonucleico (RNA, ribonucleic acid),como material genetico. El principia general de lanaturaleza del material genetico, par 10 tanto, esque siempre es acido nucleico; de hecho, es DNA,excepto en los virus de RNA.
1.4 El DNA es el material genHico de las celulas ani males 5
III Los polinucle6tidos tienenbases nitrogenadas ligadas aun esqueleto de azucar-fosfato
Conceptos principales
• Un nucle6sido esta formado por una base purica 0
pirimidica ligada a un azucar pentosa en la posici6n 1.
• las posiciones en el anillo de ribosa se describen conel simbolo (') para distinguirlas.
• la diferencia entre el DNA y el RNA radica en el grupolocalizado en la posici6n 2' del azucar. El DNA tiene unazucar desoxirribosa (2'-H) Y el RNA, un azucar ribosa(2'-OH).
• Un nucle6tido consta de un nucle6sido ligadoa un grupo fosfato en la posici6n 5' 0 3' de la(desoxi)ribosa.
• los residuos sucesivos de (desoxi)ribosa de unpolinucle6tido estan unidos por un grupo fosfatoentre la posici6n 3' de un azucar y la posici6n 5' de lasiguiente.
• Un extremo de la cadena (convencionalmente elIzquierdo) tiene una punta 5' libre y en el otro, unapunta 3' libre.
• El DNA contiene las cuatro bases, adenina, guanina,citosina y timina; el RNA posee uracHo en vez detimina.
El componente basico de los acidos nucleicos es elnucle6tido, que tiene tres componentes:
• una base nitrogenada,• un azucar y• un fosfa to.
La base nitrogenada es un anillo de purina 0 depirimidina. La base esta ligada a la posici6n 1 en unapentosa por medio de un enlace glucosfdico del N
J
de las pirimidinas 0 el Ng de la purinas. Para evitarambiguedades entre los sistemas de numeraci6n delos anillos heterocfclicos y del azucar, a las posiciones de la pentosa se agrega un sfmbolo (').
Los acidos nucleicos son nombrados segun eltipo de azucar que eontienen; el DNA posee 2' -desoxirribosa, mientras que el RNA tiene ribosa.La diferencia radica en que el azucar del RNA tiene ungrupo OR en la posiei6n 2' del anillo de pentosa. Elazuear puede ligarse en las posiciones 5' 0 3' a ungrupo fosfato.
Un aeido nucleico consiste en una cadena largade nucle6tidos. En la 'IGlJF: ~ se muestra que elesqueleto de la cadena polinucleotfdiea consta deseries alternas de residuos de fosfato y de pentosa(azuear) a traves de la uni6n de la posici6n 5' deun anillo de pentosa con la posici6n 3' del siguienteanillo de pentosa mediante un grupo fosfato. Por
6 CAPITULO 1 Los genes son DNA
eso se dice que el esqueleto de azucar-fosfato consiste en enlaces 5'- 3' fosfodiester. Las bases nitrogenadas "sobresalen" del esqueleto.
Cada acido nucleico contiene cuatro tipos de bases. Las mismas dos purinas, adenina y guanina, estanpresentes tanto en el DNA como en el RNA. Las dospiriruidinas del DNA son dtosina y timina; en el RNAse encuentra uracilo, en vez de timina. La unica diferencia entre el uracHo y la timina es un grupo metilosuplantador en la posicion C
5. Las bases suelen nom
brarse par sus iniciales. El DNA contiene A, G, C YT;el RNA contiene A, G, C YU.
El nucleotido terminal de un extrema de la cadena tiene un grupo 5' libre; el nucleotido terminaldel otro extrema tiene un grupo 3' libre. Se ha convenido en escribir las secuencias de acido nucleicoen direccion 5' a 3', es decir, del extremo 5' de laizquierda al extrema 3' de la derecha.
III El DNA es una helice duplex
Conceptos principales
• la forma Bdel DNA es una helice duplex formada pordos cadenas polinucleotidicas antiparalelas.
• las bases nitrogenadas de cada una son anillos planosde purina 0 pirimidina orientados hacia el interior yque se aparean mediante puentes de hidr6geno paraformar unicamente pares de A-TYG-c.
• El diametro de la helice duplex es de 20 A, y cada 34 Ahay una vuelta completa, con diez pares de bases porvuelta.
• La helice duplex forma un surco principal profundo(ancho) y uno menor (angosto).
La observacion de que las cantidades de bases presentes en los DNA varfa segun la especie, condujoal concepto de que la secuencia de bases es la forma enque se porta la informacion genetica. Hacia la decada de1950, el concepto de informacion genetica era comun: el par de problemas que planteaba era determinar la estructura del acido nucleico y explicar comouna secuencia de bases del DNA podia representar lasecuencia de aminoacidos de una proteina.
Tres nociones convergieron en la construccionde un modelo de helice duplex del DNA, desarrollado por Watson y Crick en 1953:
• Los datos de la difraccion de los rayos X demostraron que el DNA tiene la forma de unahelice regular que da un giro completo cada34 A (3.4 nm), can un diametro de -20 A(2 nm). Como la distancia entre nucleotidosadyacentes es de 3.4 A, debe haber 10 nucleotidos par vuelta.
Los !ostatostienen cargasnegativas
Base pirimfdica
Base puriea
DNA,
5~
Enlacesfosfodiester 5'-3'
Puentes de hidr6geno 3'. H I
/ 05' H3C 0-- H-N NyH'rl
~H~N-H--N~/~~o-1
N-{ )=N 0
o H
HJ-H"O N H d"o H-fC\N--H-~l- o'
N-{, rNo-·H-N
\H
H 0N=<, }-N
ESq~:leto ~0r-;:~N---H -~H .
_a_ZD_ca_r'_fO_Sf_at_or . H'" N ~N-H- -'0:-qC3 .
N-H--'O
0-:N=< }-N
o N-\.G!,-H--'~~C)-H 0
.h-~ K 5'o H N O--·H-N H\ "H3' EI interior es hidr6fobo
La helice duplex mantiene un grosor constante porque laspurinas siempre enfrentan a la pirimidinas en los pares de bases complementarios A-T YG-c. La secuencia que se ilustra en la figura es T-A,CoG, A-T, G-C.
Una cadena polinucleotidica esta formada por unaserie de enlaces azucar-fosfato 5'-3' que forman un esqueletocon las bases prominentes.
• La densidad del DNA sugiere que la helicedebe contener dos cadenas de polinuc1eotidos. EI diametro constante de la helicepuede explicarse si las bases de cada cadenaapuntan hacia adentro y son restringidas demanera que una purina siempre se opongaa una pirimidina, evitando asociaciones purina-purina (demasiado ancha) 0 pirimidina-pirimidina (demasiado angosta).
• Independientemente de las cantidades absolutas de cada base, la proporcion de G essiempre igual a la de C en el DNA, y la proporcion de A siempre es la misma que la deT, de manera que la composicion de cualquier DNA puede describirse par la proporcion de sus bases, es decir, G + C, que fluctuaentre 26 y 74% en diferentes especies.
Watson y Crick propusieron que las dos cadenaspolinucleotfdicas de la helice duplex se relacionanmediante puentes de hidr6geno entre las bases nitrogenadas. La G puede formar puentes de hidrogenoespecfficamente solo con la C, y la A, solo can la T.Estas reacciones se describen como apareantientode bases, y se dice que las bases apareadas (G conC a A can T) 'son complementarias.
EI modelo proponfa que las dos cadenas polinucleotfdicas corren en direcciones opuestas (antiparalelas), como se ilustra en la ~l . Observando a 10 largo de la helice, una cadena va en direccion5' a 3', mientras que su pareja carre de 3' a 5'.
EI esqueleto de aZllcar-fosfato esta en la parteexterior y porta cargas negativas en los grupos fosfato. En solucion in vitro, las cargas del DNA se neutralizan por la union de iones metalicos, tfpicamenteNa+. En la celula, las protefnas con carga positivaproporcionan parte de la fuerza neutralizante. Estasprotefnas desempefian una funcion importante enla determinacion de la organizacion del DNA en lacetula.
Las bases se encuentran en el interior; son estructuras planas, en pares perpendiculares al eje dela helice. Considerese la helice dllplex como unaescalera espiral: los pares de bases forman los escalones, como se ilustra esquematicamente en laJ:IGUR 1 J. Al ir avanzando por la helice, las basesestan una sobre otra, como una pila de platos.
Cada par de bases gira - 36° en tomo al eje de lahelice, respecto del siguiente par de bases, de modoque -10 pares de bases forman una vuelta completade 360°. La torsion de las cadenas sabre sf mismasforma una helice duplex can un surco menor (-12A de ancho) y un surco mayor (-22 A de ancho),como puede observarse en el modelo a escala dela FICURA 1.10. La helice duplex es dextrogira, esdecir, que gira en la direccion de las manecillas del
1.6 El DNA es una helice duplex 7
Azucar Base Fosfato
reloj observada a 10 largo del eje helicoidal. Estascaracterfsticas representan el modelo aceptado para10 que se conoce como forma B del DNA.
Es importante percatarse de que la forma B representa un promedio, no una estructura especificada con toda precision, pues la estructura del DNApuede cambiar localmente. Si tiene mas pares debases por vuelta se dice que esta sobregirada, de 10contrario, sera laxa. La torcion local puede ser afectada pOI la conformacion global de la helice duplexdel DNA en el espacio 0 por la union de proteinasen sitios especificos.
III La duplicaci6n del DNAes semiconservadora
, Los pares de bases planos yacen perpendicular-mente al esqueleto de azucar-fosfato.
Las dos cadenas del DNA forman una helice duplex. Fotografia © Photodisc.
8 CAPITULO 1 Los genes son DNA
Conceptos principales
• En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz6marcaje de densidad para demostrar que la cadenapolinucleotidica individual es la unidad del DNA que seconserva durante la duplicaci6n.
• Cada cadena de un DNA duplex (0 DNA duplohelicoidal,DNA de doble cadena a DNA de doble banda) hace lasveces de molde para sintetizar una cadena hija.
• Las secuencias de las cadenas hijas dependen delapareamiento complementario de las bases con lascadenas progenitoras separadas.
Es crucial que el material genetico se reproduzcacon exactitud. Las dos cadenas polinucleotidicas estan unidas solo por puentes de hidrogeno, de mo.doque pueden separarse sin necesidad de romper enlaces covalentes. La especificidad del apareamiento de bases sugiere que cada una de las cadenasprogenitoras separadas puede hacer las veces decadena molde para la sfntesis de una cadena hijacomplementaria. En la A se representa elprincipio de que una nueva cadena hija es ensamblada en cada cadena progenitora. La secuencia dela cadena hija es dictada por la cadena progenitora;una A en la cadena progenitora ocasiona la colocacion de una Ten la cadena hija, en tanto que una Gprogenitora provoca la incorporacion de una Chija,y asf sucesivamente.
En la parte superior de la Figura 1.11 se muestra un duplex progenitor (no replicado) formadopor las dos cadenas progenitoras originales. La parteinferior muestra las dos duplex hijas que estan siendo producidas por el apareamiento complementariode bases. Cada una de las duplex hijas es identicaen secuencia original y contiene una cadena progenitora y una cadena recientemente sintetizada. La
- • to
La duplicaci6n del DNA es semiconservadora.IRA 1.
.1' I I .. I . .... . ...DNA progenitor Generaci6n 1 Generaci6n 2
Duplicaci6n W~
en media W~----<: HIBRIDOde densidad .Ii''''=<HIBRIDO \.'O'iDiU\/j\f,V/ L1GERO
PESADO ~~~~
'W't'O\Y/----<: L1GEROHIBRIDO ~
Analisis de densidad HIBRIDO.
- - - - .Ligero ••••. Ligero --_. Ligero- - - -. Hfbrido ._. Hfbrido • -_. H[brido--··Pesado - - - -. Pesado - - - -. Pesado
~ ....~
~::~~~;;;;~~~.... (C). I~~""'.~
~ Lascadenas~~~ - progenltoras _...- ('f)T,-{~~ se desenrollan ~
V:::::~ ~:::::~
v----©.C .~. -If.. ~ .'i' _.:..::~y y --.Q::~.. .
~;;;n~ .nn ...
~:::::<C<d
...
1 1 El apareamiento de bases proporciona el meca-~smo necesario para la duplicaci6n del DNA.
.~:TUctura del DNA porta fa informacion necesaria para~?TpetuaT su secuencia.
Las consecuencias de este modo de duplicacion5-e ilustran en la . El duplex progenitor~ replica para formar dos duplex hijos, cada uno de. ') cuales esta formado por una cadena progenitora.. una cadena hija (de sfntesis reciente). La unidad..;:.e se conserva de una generacion a fa siguiente es una de~- dos cadenas individuafes que forman ef duplex proge':':"7. Este comportamiento se conoce como dupli-
;::adon semiconservadora.En la Figura 1.12 se Hustra una prediccion de
=-:e modelo. Si el DNA progenitor porta un mar'~~e de densidad "pesada" porque el organismo ha_io cultivado en un medio que contiene un isotopo~':::ecuado (como 15N) (N del T: en otras bibliogra.:::.=.- aparece como N15, el resto de los marcadores=z:lCionados en este capitulo tambien aparecen con= lllimero despues de la letra p. ej., p32 y S35), sus2denas pueden ser distinguidas de las sintetizadascando el organismo es transferido a un medio que- :::;~enga isotopos "ligeros" normales.
£1 DNA progenitor consiste en un duplex de dos2':::enas pesadas (rojas). Despues de una generacion_z crecimiento en medio ligero, el DNA duplex es'JUijrido" en cuanto densidad. 0 sea que esta forma_ ' par una cadena progenitora pesada (roja) y por~ cadena hija ligera (azul). Despues de la segunda==-;::.eracion, las dos cadenas de cada duplex hfbrido
;: ~an separado. Cada una adquiere a una pareja=~:-d. de tal forma que la mitad de los DNA d{lplex
Cadena hija / \ Cadena hija siguen siendo hfbridos y la otra mitad es completamente ligera (ambas cadenas son azules).
Las cadenas individuales de estos duplex son completamente pesadas a compfetamente ligeras. Este patron seconfirmo experimentalmente en la prueba de Meselson-Stahl en 1958, que siguio a la duplicacionsemiconservadora del DNA a traves de tres generaciones de crecimiento de E. coli. Cuando el DNA fueextrafdo de las bacterias y su densidad se midio porcentrifugacion, el DNA forma bandas correspon'dientes a su densidad, pesada en las progenitoras,hfbrida en la primera generacion, y mitad hlbrida ymitad ligera en la segunda generacion.
III Las cadenas del DNA se separanen la horquilla de duplicaci6n
Conceptos principaLes
• La duplicaci6n del DI~A es llevada a cabo par uncomplejo de enzimas que separan las cadenasprogenitoras y sintetizan las cadenas hijas.
• La horquilla de duplicaci6n es el punta en que seseparan las cadenas progenitoras.
• Las enzimas que sintetizan el DNA se llaman DNA
pol.i merasas; las enzi mas que si ntetizan el RNA se
conacen como RNA polimerasas.
• Las nucleasas son enzimas que degradan a los acidosnucleicos; incluyen DNAsas y RNAsas, y pueden
dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.
La duplicacion exige la separacion de las dos cadenas de un d{lplex progenitor; sin embargo, el rompimiento de la estructura es transitorio, y se revierteconforme se forma el duplex hijo. En algun mo-
1.8 Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicaci6n 9
do sintetizada. Las enzimas se nombran segun eltipo de cadena que sintetizan: las DNA polimerasas sintetizan DNA, las RNA polimerasas, RNA.
La degradacion de los acidos nucleicos tambien requiere de enzimas especfficas: las desoxirribonucleasas (DNAsas) degradan alDNA y las ribonucleasas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasasse incluyen en las clases generales de exonucleasas y endonucleasas:
• Las endonucleasas cortan enlaces individuales en el interior de las moleculas de DNA yde RNA y generan fragmentos discretos. Algunas DNAsas dividen ambas cadenas de unDNA duplex en el sitio diana, mientras queotras dividen solo una de ellas. Las endonucleasas participan en reacciones de corte,como se observa en la FIGURA 1 14.
• Las exonucleasas eliminan los residuos, unoa uno, a partir del extrema de la molecula, ygeneran mononucleotidos. Siempre actuanen una sola cadena de acido nucleico, y cadaexonucleasa avanza en una direccion especffica, es decir, empieza en un extrema 5' 0 3'para dirigirse hacia el otro. Estan involucradas en reacciones de ajuste, como se muestraen la v
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-. ",""__.I1""~ L...-.II __~.t'.,.....:.1 III r.
Enlace roto
~I. Una endonucleasa divide a un enlace en un acido
nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca auna cadena de un DNA duplex.
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La horquilla de duplicaci6n es la regi6n del DNAen la cual hay una transici6n del duplex progenitor desenrollado a los duplex hijos recientemente replicados.
..-...
Una exonucleasa elimina bases, una a la vez,dividiendo el ultimo enlace de una cadena polinucleotidica.
III La informacion genetica puedeser proporcionada por el DNAo el RNA
Conceptos principales
mento, solo un tramo pequeno del DNA duplex sesepara en cadenas individuales.
La estructura helicoidal de una mol<.~cula deDNA dedicada a la duplicacion se ilustra en la
.\ . La region no replicada es el duplex proge-nitor que se abre hacia la region replicada, dondese han formado los dos duplex hijos. La estructurahelicoidal doble se rompe en la union entre las dosregiones, llamada horquilla de duplicacion. Laduplicacion implica el movimiento de la horquilla de duplicacion a 10 largo del DNA progenitor, demodo que hay un desenrollamiento continuo de lascadenas progenitoras y un enrollamiento de los duplex hijos.
La sfntesis de acidos nucleicos es catalizada porenzimas especfficas, las cuales reconocen el moldey emprenden la tarea de catalizar la adicion de subunidades a la cadena polinucleotidica que esta sien-
• Los genes celulares son DNA, pero los virus y losviroides pueden tener genomas de RNA.
• El DNA se convierte en RNA por transcripci6n, y el RNApuede convertirse en DNA por transcripci6n inversa.
• La traducci6n del RNA a proteina es unidireccional.
El dogma central define el paradigma de la biologfamolecular. Los genes se perpetllan como seCl1enciasde acido nucleico, si bien actuan al ser expresadosen forma de proteinas. La duplicacion es responsable de la herencia de la informacion genetica. Latranscripcion y la traduccion son responsables de laconversion de una forma a otra.
En la 1\, 1 16 se ilustran las funciones de laduplicacion, la transcripcion y la traduccion desdela perspectiva del dogma central:
• La perpetuaci6n del dcido nucleico suele implicaral DNA 0 el RNA como el material genhico. Lascelulas utilizan unicamente DNA, en tantoque algunos virus usan RNA, y la duplica-
10 CAPITULO 1 Los genes son DNA/
Proteina
Molde de doblecadena --< J.(j~ Cadena antigua
~~ J- Cadenasnuevas
'YJy} Cadena antigua
La duplicaci6n genera dos duplex hijos, cada uno de loscuales contiene una cadena progenitora y una cadenafabricada recientemente
Molde de cadenaindividual
VV\---+ YRfR{'IVV --.VV\
Transcripci6ninversa
···..........
-<- ••••••• ".
@ RNA
Duplicaci6n
at ~DNADuplicaci6n
1 7 Los acidos nucleicos, tanto los de dobLe cadenacomo los de cadena individuaL, se replican por la sintesis decadenas compLementarias regida par las reg las del apareamiento de bases.
GURA 1.16 El dogma centraL manifiesta que La informa:ion deL acido nucleico puede ser perpetuada 0 transferida,-in embargo La transferencia de la informacion a proteinas es'rreversibLe.
La cadena progenitora individuales utilizada para sintetizar unacadena complementaria
La cadena complementaria esutilizada para sintetizar una copiade la cadena progenitora
cion del RNA vfrico ocurre en la celula infectada.
• La expresion de la informacion genetiea eelularsuele ser unidireeeionai. La transcripcion delDNA genera moleculas de RNA que unieamente pueden ser u tilizadas otra vez paragenerar secuencias de protefnas; en generalno pueden recuperarse para usarlas comofuente de informacion genetica. La traduccion del RNA a protefna siempre es irreversible.
Estos mecanismos son igualmente efectivos. ara la informacion genetica celular de procario:35 0 eucariotas y para la informacion transportada;Jor los virus. Los genomas de todos los organismos-ivos estan formados por DNA duplex. Los virus. seen genomas de DNA 0 RNA, Yde cada tipo hayc~emplos de doble cadena (ds, double stranded) 0 de.::adena unica (ss, single stranded). Los detalles del=:Iecanismo de replicacion del acido nucleico varian=:::nre los diferentes sistemas vfricos, pero el princi;-:0 de duplicacion por slntesis de cadenas comple:::lentarias sigue siendo el mismo, seglll1 se ilustrae~ la FIGURA 1.1 .
Los genomas celulares reproducen el DNA por0:. mecanismo de duplicacion semiconservadora. Los~enomas vfricos de doble cadena, sean de DNA 0
::t: A, tambien se replican utilizando como molde-.as cadenas individuales del duplex para sintetizar.31 las cadenas complementarias.
Los virus con genomas de una sola cadena la_:ilizan como molde para sintetizar una cadena.:amplementaria, la cua!, a su vez, es utilizada para
sintetizar a su complemento, que, por supuesto, esidentico a la cadena original inicial. La duplicacionpuede implicar la formacion de intennediarios estables de doble cadena 0 uti}izar acido nucleico dedoble cadena solo como una fase transitoria.
La restriccion de la transferencia unidireccionalde DNA a RNA no es absoluta, ha sido superada porlos retrovirus, cuyos genomas estan formados pormoleculas de RNA de una sola cadena. Durante elciclo infeccioso, el RNA se convierte en una cadena{ll1ica de DNA por el proceso de transcripcion inversa; dicha cadena, a su vez, es convertida en unDNA de doble banda. Este DNA duplex se convierte en parte del genoma de la celula y es heredadocomo cualquier otro gen, de manera que la transeripcion inversa permite que una seeueneia de RNA sea reeuperada y utilizada como informacion genetiea.
La existenciC! de la duplicacion del RNA y de latranscripcion inversa establece el principia generalde que la informacion en eualquier tipo de seeuencia dedcido nucleieo puede eonvertirse en el otro tipo. Sin embargo, en el curso normal de los hechos, la celuladepende de los procesos de duplicacion, transcripcion y traduccion del DNA. No obstante, algunavez la informacion de un RNA celular se convierteen DNA y se inserta en el genoma (evento posiblemente mediado par un virus RNA). Aunque latranscripcion inversa no participa en las operacionesregulares de la celula, llega a ser un mecanismo potencialmente importante cuando se analiza la evolucion del genoma.
1.9 La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA 0 eL RNA 11
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La horquilla de duplicaci6n es la regi6n del DNAen la cual hay una transici6n del duplex progenitor desenrollado a los duplex hijos recientemente replicados.
do sintetizada. Las enzimas se nombran segun eltipo de cadena que sintetizan: las DNA polimerasas sintetizan DNA, las RNA polimerasas, RNA.
La degradacion de los acidos nucleicos tambien requiere de enzimas especificas: las desoxirribonucleasas (DNAsas) degradan al DNA y las ribonucleasas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasasse incluyen en las clases generales de exonucleasas y endonucleasas:
• Las endonudeasas cortan enlaces individuales en el interior de las moleculas de DNA yde RNA y generan fragmentos discretos. Algunas DNAsas dividen ambas cadenas de unDNA duplex en el sitio diana, mientras queotras dividen solo una de ellas. Las endonudeasas participan en reacciones de corte,como se observa en la FIGURA 1 14.
• Las exonucleasas eliminan los residuos, unoa uno, a partir del extrema de la molecula, ygeneran mononucleotidos. Siempre actuanen una sola cadena de acido nucleico, y cadaexonucleasa avanza en una djreccion especifica, es decir, empieza en un extrema 5' 0 3'para dirigirse hacia el otro. Estan involucradas en reacciones de ajuste, como se muestraen la ".1" n 1
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Una endonucleasa divide a un enlace en un acidonuclei co. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca auna cadena de un DNA duplex.
'1Moleculas de DNA repllcadas ,
Horquilla de duplicaci6n
Enlace rota
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Una exonucleasa elimina bases, una a la vez,dividiendo el ultimo enlace de una cadena polinucleotidica.
III La informacion genetica puedeser proporcionada por el DNAo el RNA
Conceptos principales
mento, solo un tramo pequeno del DNA duplex sesepara en cadenas individuales.
La estructura helicoidal de una molecula deDNA dedicada a la duplicacion se ilustra en la
. La region no replicada es el duplex progenitor que se abre hacia la region replicada, dondese han formado los dos duplex hijos. La estructurahelicoidal doble se rompe en la union en tre las dosregiones, Hamada horquilla de duplicacion. Laduplicacion implica el movimiento de la horquilla de duplicacion a 10 largo del DNA progenitor, demodo que hay un desenrollamiento continuo de lascadenas progenitoras y un enrollamiento de los duplex hUos.
La sintesis de acidos nucleicos es catalizada porenzimas especificas, las cuales reconocen el moldey emprenden la tarea de catalizar la adicion de subunidades a la cadena polinucleotidica que esta sien-
• Los genes celulares son DNA, pero los virus y losviroides pueden tener genomas de RNA.
• El DNA se convierte en RNA por transcripci6n, y el RNApuede convertirse en DNA por transcripci6n inversa.
• La traducci6n del RNA a proteina es unidireccional.
El dogma central define el paradigma de la biologiamolecular. Los genes se perpetuan como seclienciasde acido nucleico, si bien actuan al ser expresadosen forma de protefnas. La duplicacion es responsable de la herencia de la informacion genetica. Latranscripcion y la traduccion son responsables de laconversion de una forma a otra.
En la GI 1 ~6 se ilustran las funciones de laduplicacion, la transcripcion y la traduccion desdela perspectiva del dogma central:
• La perpetuaci6n del dcido nucleico suele implicaral DNA 0 el RNA como el material genitico. Lascelulas utilizan unicamente DNA, en tantoque algunos virus usan RNA, y la duplica-
10 CAPITULO 1 Los genes son DNA
---
Proteina
Cadena antigua
} Cadenas nuevas
r Cadena antigua
Molde de doble --:"Il
YJ\YAy--<;~
Molde de cadenaindividual
VV\---. YJWR{'IVV -+VV\
La duplicaci6n genera dos duplex hijos, cada uno de loscuales contiene una cadena progenitora y una cadenafabricada recientemente
Transcripci6ninversa
..
...........
..............
RNA
@' Wl\l{/ DNA
Duplicaci6n
@Duplicaci6n
• 1 Los acidos nucleicos, tanto los de doble cadenacomo los de cadena individual, se replican por la sintesis decadenas complementarias regida por las reg las del apareamiento de bases.
URA 1.16 El dogma central manifiesta que la informa:" n del acido nucleico puede ser perpetuada 0 transferida,:'a embargo la transferencia de la informacion a proteinas es~eversible.
La cadena progenitora individuales utilizada para sintetizar unacadena complementaria
La cadena complementaria esutilizada para sintetizar una copiade la cadena progenitora
cion del RNA virico ocurre en la c€lula infectada.
• La expresion de la informacion genetiea eelularsuele ser unidireecional. La transcripcion delDNA genera moleculas de RNA que {tnieamente pueden ser utilizadas otra vez paragenerar secuencias de proteinas; en generalno pueden recuperarse para usarlas comofuente de informacion genetica. La traduccion del RNA a protelna siempre es irreversible.
Estos mecanismos son igualmente efectivos- a la informacion genetica celular de procario
.0.5 0 eucariotas y para la informacion nansportadar los virus. Los genomas de todos los organismos
:"os estan formados por DNA dllplex. Los viruseen genomas de DNA 0 RNA, Yde cada tipo hay
::~ mplos de doble cadena (ds, double stranded) 0 de:~dena unica (ss, single stranded). Los detalles del-ecanismo de replicacion del acido nucleico varian::::me los diferentes sistemas viricos, pero el princi-
.0 de duplicacion por sintesis de cadenas comple
.entarias sigue siendo el mismo, segun se Hustra:: , la FIGURA 1.17.
Los genomas celulares reproducen el DNA por=~ mecanismo de duplicacion semiconservadora. Los=~nomas vfricos de doble cadena, sean de DNA 0
- -A, tambien se replican utilizando como molde= cadenas individuales del d{lplex para sintetizaro~ las cadenas complementarias.
Los virus con genomas de una sola cadena la__~zan como molde para sintetizar una cadena::cmplementaria, la cual, a su vez, es utilizada para
sintetizar a su complemento. que, por supuesto, esidentico a la cadena original inicia1. La duplicacionpuede implicar la formacion de intermediarios estables de doble cadena 0 utilizar acido nueleico dedoble cadena solo como una fase transitoria.
La restriccion de la transferencia unidireccionalde DNA a RNA no es absoluta. ha sido superada porlos retrovirus, cuyos genomas estan formados pormoleculas de RNA de una sola cadena. Durante elcielo infeccioso, el RNA se convierte en una cadena{mica de DNA por el proceso de transcripci6n inversa; dicha cadena, a su vez, es convertida en unDNA de doble banda. Este DNA d{lplex se convierte en parte del genoma de la celula y es heredadocomo cualquier otro gen, de manera que la transeripcion inversa permite que una seeueneia de RNA sea reeuperada y utilizada como informacion genetiea.
La existenc~a de la duplicacion del RNA y de latranscripcion inversa establece el principio generalde que la informacion en eualquier tipo de seeueneia deCicido nucleieo puede eonvertirse en el otro tipo. Sin embargo, en el curso normal de los hechos, la celuladepende de los procesos de duplicacion, transcripcion y traduccion del DNA. No obstante, algunavez la informacion de un RNA celular se convierteen DNA y se inserta en el genoma (evento posiblemente mediado por un virus RNA). Aunque latranscripcion inversa no participa en las operacionesregulares de la celula, llega a ser un mecanismo potencialmente importante cuando se analiza la evolucion del genoma.
1.9 La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA 0 el RNA 11
" f'. WU utra~4' C"R"'au·II"Ui"Ui'J(S'z"j'ruu·'i'f;''-'VJu,-Genoma Numero de genes Pares de bases
OrganismosPlantas <50 000 <1011
Mamiferos 30 000 -3 X 109
Gusanos 14 000 _108
Moscas 12 000 1.6 x 108
Hongos 6 000 1.3 x 107
Bacterias 2-4 000 <107
Micoplasma 500 <106
Virus DNAdsVaccinia <300 187 000Papova (SV40) -6 5226Fago T4 -200 165 000
Virus DNAssParvovirus 5 5 000FagofX174 11 5387
Virus RNAdsReovirus 22 23 000.Virus RNAssCoronavirus 7 20 000Influenza 12 13500TMV 4 6400Fago MS2 4 3569STNV 1 1300
ViroidesPSTV RNA a 359
La cantidad de acido nucleico del genoma variaen un range enorme. ds, doble cadena; 55, cadena unica.
Los mismos principios se aplican a la perpetuacion de la informacion genetica tanto en los genomas enormes de plantas 0 anfibios como en los genomas diminutos del micoplasma y en la informacion genetica aun mas pequefia de los virus de DNAo RNA. En la se resumen algunos ejemplos de la gama de tipos y tamanos de los genomas.
En toda la gama de organismos, cuyo comenido total de genomas varia en un rango superior alas 100 000 veces, prevalece un principio comun:el DNA codifica a todas las proteinas que la(s) dlula(s)del organismo debe(n) sintetizar, y las proteinas, a su vez(directa 0 indirectamente), proporcionan las funcionesnecesarias para la supervivencia. Mediante un principio similar se describe la funcion de la informaciongenetica de los virus, ya sea de DNA 0 RNA: el dcidonucleico codifica a la(s) protefna(s) necesaria(s) para empaquetar al genoma y tambien para cualquier funci6nadicional a las proporcionadas por la dlula hospedadoranecesaria para la reproducci6n del virus durante su cicloinfeccioso. (El virus mas pequeno, el virus satelite dela necrosis del tabaco [STNV, satellite tobacco necrosisvirus], no puede replicarse de forma independiente,requiere de la presencia simultanea de un virus "cooperador", el virus de la necrosis del tabaco [TNV,tobacco necrosis virus], que por si mismo es un virusnormalmente infeccioso.)
12 CAPITULO 1 Los genes son DNA
III Los acidos nudeicosse hibridan por apareamientode bases
Conceptos principales
• El calentamiento provoca que las dos cadenas de unDNA duplex se separen.
• La Tm es el punto medio del rango de temperatura dedesnaturalizaci6n.
• Las cadenas complementarias unicas puedenrenaturalizarse cuando 5e reduce la temperatura.
• Puede haber desnaturalizaci6n y renaturalizaci6njhibridaci6n con combinaciones de DNA-DNA, DNA
RNA a RNA-RNA, y pueden ser intermoleculares aintramoleculares.
• La capacidad de dos preparaciones de acido nucleicode una sola cadena para hibridarse demuestra sucomplementariedad.
Una propiedad clave de la helice duplex es su capacidad para separar las dos cadenas sin afectar losenlaces covalentes; esto hace posible dicha separacion, y que se reformen en condiciones fisiologicas ala velocidad necesaria (muy rapida) para mamenerlas funciones geneticas. La especificidad del procesodepende del apareamiento complementario de lasbases.
El concepto de apareamiento de las bases es fundamental para todos los procesos relacionados con los dcidos nucleicos. La separaci6n de los pares de bases es un aspecto crucialde la funci6n de una mol&ufa de doble cadena, mientrasque la capacidad para formar pares de bases 10 es parala actividad de un dcido nucleico de cadena (mica. En la
se muestra que el apareamiento de basesperrnite que los acidos nucleicos complementarios decadena unica formen una estructura duplex.
• Una region duplex intramolecular puedeformarse por apareamiento de las basesentre dos secuencias complementarias queforman parte de una molecula de cadenaunica.
• Una molecula de cadena unica puede aparearse a traves de las bases con una moleculade cadena unica, complementaria e independiente, para formar un duplex intermolecular.
La formacion de dominios duplex a partir deacidos nucleicos de cadena unica es mas importantepara el RNA, pero tambien existe un DNA de cadena unica (en forma de genomas viricos). El apareamiento de las bases entre cadenas complementariasunicas e independientes no esta restringido a combinaciones DNA-DNA 0 RNA-RNA, tambien puedeocunir entre una molecula de DNA y una de RNA.
./
• • • 1 • •• • ~ I •
19 El apareamiento de bases ocurre en los DNA~_:31( e incluso en las interacciones intermoleculares e intra-: -=:ulares del RNA (0 del DNA) de cadena individual.
DNArenaturalizado
DNA de doblecadenal (Desnaturalizaci6n )
VVVV DNA de cadena/V individual
-:: areamiento-. amolecular:el RNA
areamiento RNA largo
- ermolecular entre VV' RNA cortooleculas cortas
. largas de RNA ,
La carencia de enlaces covalentes entre cadenasplementarias pennite manipular al DNA in vitro.
- ;- fuerzas no covalentes que estabilizan a la heliceplex se intern.unpen por calentarniento 0 exposi
a concentraciones bajas de sales. Las dos cade;- de la helice duplex se separan completamente
__ando se rompen lOdos los puentes de hidrogeno::..:e las unen.
EI proceso de separacion de cadenas se llamaesnaturalizacion 0 (coloquiatmente) fusion. (EI
-;;:rmino "desnaturalizacion" tambien se utiliza para_5cribir la perdida de la estructura autentica de una-:- efna; es un termino general que implica que la~ nformacion natural de una macromolecula se ha::-- sformado.)
La desnaturalizacion del DNA se presenta en un:; go lirnitado de temperatura y da lugar a cambios: rprendentes en muchas de sus propiedades flsicas.:=: punto medio del rango de temperatura en que las-- enas del DNA se separan se conoce como temper.::ura de fusion (T
m, melting temperature), la cual de
~ nde de la proporcion de pares de bases G-c. Como:::.i a uno de estos pares tiene tres puentes de hidro5eno, es mas estable que un par de bases formado~ r A-T, el cual solo cuenta con dos de dichos puen: . Entre mas pares de G-C contenga el DNA, mayor: ra la cantidad de energfa necesaria para separar las- denas. En solucion y en condiciones fisiologicas,::n DNA con 40% de puentes G-C, valor tfpico de lossenomas de los marnfferos, se desnaturaliza a una T
maproximada de 87°C, de modo que el DNA duplexes estable a la temperatura de la celula.
La desnaturalizacion del DNA es reversible en·ondiciones apropiadas. La capacidad de las dos-adenas complementarias separadas para volver a:ormar una helice duplex se llama renaturalizadon, la cual depende del apareamiento especffico'e las bases entre las cadenas complementarias. En
.a "2 se observa que la reaccion tiene lugar
Las cadenas individuales de DNA desnaturalizadas pueden renaturalizarse para formar una estructura duplex.
en dos etapas. Primero, las cadenas individuales deDNA que estan en la solucion se encuentran porcasualidad; si sus secuencias son complementarias,aparearan sus bases para generar una region cortade helice duplex. Posteriormente, dicha region seextiende a 10 largo de la molecula como una cremallera para formar una molecula duplex larga.La renaturalizacion de la helice duplex restaura laspropiedades originales perdidas con la desnaturalizacion del DNA.
La renaturalizacion describe la reaccion entre dossecuencias complementarias separadas por desnaturalizacion. Sin embargo, la tecnica puede ampliarsepara permitir que cualesquiera dos secuencias complementarias de acidos nucleicos reaccionen entre sfpara formar una estructura duplex. A este procesose le llama asociacion, si bien la reaccion se describe de forma mas general como hibridacion cuandoparticipan acidos nucleicos de diferentes orfgenes,como sucede cuando una preparacion es DNA y laotra, RNA. La capacidad de dos preparaciones de !lcidosnucleicos para hibridarse demuestra con precision su complementariedad, pues solo las secuencz'as complementariaspueden formar una estructura duplex.
El principio de la reaccion de la hibridacion esponer frente a frente dos preparaciones de acidosnucleicos de cadena individual y despues calcular lacantidad de materia de doble cadena que se forma.En la se Hustra un procedimiento porel cual se desnaturaliza una preparacion de DNA yse adsorben en un filtro las cadenas unitarias. Posteriormente se aiiade una segunda preparacion deDNA (0 de RNA) desnaturalizado. EI filtro es tratadode tal forma que la segunda preparacion se adsorba solo si puede formar pares de bases con el DNAadsorbido en un principio. Usua]mente la segunda
1.10 Los acidos nucleicos se hibridan por apareamiento de bases 13
YJ\:i
~
Conceptos principales
mas, un cambio en el fenotipo del organismo puedepermitir que se identifique la funcion de la protefna.La existencia de numerosas mutaciones en un genpermite que se comparen numerosas variantes deuna protefna, y mediante un anatisis detallado seidentificaran las regiones de la protefna responsablesde una funcion enzimatica 0 de otras funciones.
Todos los organismos experimentan cierto numero de mutaciones como resultado de las operaciones celulares normales 0 de las interaccionesaleatorias con el ambiente a las cuales se les llamamutaciones espontaneas; la velocidad a la que seproducen es caracterfstica del organismo especffico,yen ocasiones se Ie llama nivel de Condo. Las mutaciones son eventos raros y, por supuesto, las quedafian a un gen son descartadas con la evolucion,de modo que es dificil obtener grandes cantidadesde mutantes espontaneos para estudiarJos en las poblaciones naturales.
La incidencia de las mutaciones suele incrementarse mediante tratamientos can ciertos compuestos;se les llama mutagenos, y los cambios que provocan se conocen como mutaciones inducidas. Lamayorfa de los mutagenos actuan directamente envirtud de su capacidad para modificar una base especffica del DNA 0 para incorporarse en el acido nucleico. La efectividad de un mutageno se juzga porla medida en que incrementa la tasa de mutacionesrespecto del nivel de fondo. Utilizando mutagenas sepueden inducir numerosos cambios en un gen.
Las mutaciones espontaneas que desactivanel funcionamiento de un gen tienen lugar en losbacteriofagos y en las bacterias a una tasa relativamente constante de 3 a 4 x 10-3 por genoma, porgeneracion. Dada la gran variacion en el tamaliode los genomas entre bacteriofagos y bacterias, estatasa corresponde a amplias diferencias en el ritmode las mutaciones par par de bases, 10 cual sugiereque la tasa global de mutacioh ha estado sujeta afuerzas selectivas, que han equilibrado los efectosnocivos de la mayorfa de las mutaciones respectode los favorables de algunas mutaciones. Esta conclusion se refuerza por la observacion de que unaarqueobacteria que vive en condiciones adversasde altas temperaturas y acidez (que supuestamente dafian el DNA) no muestra una tasa elevada demutaciones, de hecho la tasa de mutacion globalapenas es menor al rango promedio.
En la FIGURA 1 22 se muestra que en las bacterias,la tasa de mutaciones corresponde a -10--6 eventospor locus par generacion, 0 a una tasa promedia decambio por par de bases de 10-9 a 10-10 por generacion. La tasa en pares de bases individuales varfaconsiderablemente, en un rango de 10 000 veces. Nohay un dlculo preciso de la tasa de mutaciones en
5e desnaturalizael DNA en soluci6n
~
"WA.YAlU5e desnaturaliza el DNAy se adsorbe en un fHlro
~
(~...~)
5e sumerge el filtro en la soluci6n
l
~5e determina el DNA unido al filtro
l~~.\(~~\
~T." , La hibridaci6n en filtro establece si la soluci6n
de DNA (0 RNA) desnaturalizado contiene secuencias complementarias a las cadenas inmovilizadas en el filtro.
'''' ElexpirTmentodelfiitroevalua la complemenlariedad
Las mutaciones proporcionan evidencias determinantes de que el DNA es el material genetico. Cuandoun cambia en la secuencia del DNA provoca una modificacion en la secuencia de una protefna, se puedeconcluir que el DNA codifica a dicha protefna. Ade-
• Todas las mutaciones consisten en cambios en lasecuencia del DNA.
• Las mutaciones pueden ser espontaneas 0 inducidaspor mutagenos.
preparacion se marca radioactivamente, de maneraque se pueda medir la reaccion como la cantidad demarcador radioactivo retenido par el filtro.
La extension de la hibridacion entre dos acidosnucleicos de cadena individual depende de su complementariedad. No es necesario que dos secuenciassean perfectamente complementarias para hibridarse. Si estan estrechamente relacionadas, pero noson identicas, se farma un dllplex imperfecto en elcual el apareamiento de bases se interrumpe en lasposiciones en que las cadenas individuales no corresponden.
• Las mutaciones cambianla secuencia del DNA
14 CAPITULO 1 Los genes son DNA
tipo silvestre
. .H
CITOSINA ~r7'Y 'H
/N)(~ )
URAGlLa a a
~....NvN,
. II Ho
U
~mutanteA
C
C
....
G
Acidonitroso
. ..
EI genoma,1 en 300generaciones
Cualquier gen,1 en 105-106
generaciones
Cualquier par debases, 1 en 109-1010
generaciones
Tasa de mutaci6n
TCGGACTTACCGGTT~ ..
.~~ fu~-AGCCTGAATGGCCAAT ..
G
. Un par de bases muta a una tasa de 10-9 a 10-10
::- ;eneraci6n, un gen de 1 000 pares de bases muta a una tasa:" -:0-6 por generaci6n, en tanto que un genoma bacteriano- .3 a una tasa de 3 x 10-3 por generaci6n.
Las mutaciones pueden ser inducidas por modificacion quimica de una base.
1.12 Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales 0 a secuencias mas largas 15
=...:cariotas, aunque en general se piensa que hasta-eno punta es similar a la de las bacterias, calculada_ !" locus y por generacion.
Las mutaciones pueden afectara pares de bases individualeso a secuencias mas largas
(onceptos principales
• Una mutaci6n puntual modifica a un solo par de bases.
• Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas por laconversi6n quimica de una base en otra 0 por erroresdurante la duplicacion.
• Una transicion rem plaza un par de bases G-C con unpar de bases A-T, 0 viceversa.
• Una transversion remplaza una purina con unapirimidina, por ejemplo, A-TaT-A.
• Las inserciones son el tipo mas comun de mutaci6n,son resultado del movimiento de elementostransponibles.
-:wlquier par de bases del DNA puede mutar. Unamutacion puntual cambia solo un par de bases, y
ede ser provocada por dos tipos de eventos:• La modificacion qufmica del DNA convierte
directamente una base en otra diferente.• Un mal funcionamiento durante la duplica
cion del DNA provoca la insercion de unabase equivocada en una cadena polinueleotfdica durante la sfntesis del DNA.
Las mutaciones puntuales pueden ser de dos tipos, dependiendo de la naturaleza del cambio cuando una base es sustituida por otra:
• La elase mas comun es la transicion, queconsiste en la sustitucion de una pirimidinapor la otra, 0 de una purina por la otra, encuyo caso, un par G-C es remplazado par unpar A-T, 0 viceversa.
• La elase menos comun es la transversion,en la cual una purina es remplazada por unapirimidina 0 viceversa, de tal forma que unpar A-T se convierte en T-A 0 en CoG.
Los efeetos del acido nitroso constituyen unejemplo elasico de transicion porIa conversionqufmica de una base en otra. En la semuestra que el acido nitroso lleva a cabo una desaminacion oxidativa que convierte a la citosina enuracilo. En eJ cielo de duplicaci6n que sigue a latransici6n, el U se aparea can una A, y no con la G,con la cualla C original se habrfa apareado. De estamanera, el par CoG es remplazado por un par T-Acuando la A se aparea con la T en el siguiente cielode duplicacion. (EI acido nitroso tambien desaminaa la adenina, provocando la transicion inversa deA-T a G-C.)
Las transiciones tambien son provocadas porapareamiento erroneo de bases, cuando parejas inusuales se aparean desafiando la restricci6nusual de los pares de Watson y Crick. En generaL elapareamiento erroneo de bases es una aberraci6n,resultado de la incorporacion en el DNA de una baseanormal que tiene propiedades ambiguas de apareamiento. En la se muestra el ejemplo delbromouracilo (BrdU), molecula analoga a la timina
~ .'.~t:;7i- .~ .. ~~~._~ -.. ~.l ... '.J -.:rc.- . ;II - ~ L.,.. 'E:~..,.t' ._.......,. -....
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. .~. , .~~:. ~- ic=~-t;'T ...~.
CH3
HC""'C'Q;<'O, ,N N 'H....W'H
/ Y'H, 1., " "N""C....C;;-N
Azucar 0 I II ~H
Par A.T HC""N"'C.....JEI SrdU se aparea can I )ucarla A en la duplicacion t
Sr
H~""'C""C<'O"N N '·H.......H
./ ..... ./ 'H ~., ~ '·,N"'"C....C-N
Azucar 0 I II ~HHC"" "'C.....N'
N ~Par SrdU-A Azucar
EI cambia ceto-enol permite que el SrdU se aparee can la G
Sr SrI I
HC""C'c"'~) Cambia ceto-enol HC""C....C...OHI I~ • I II
./N.....CN,H /N....C"'N., II ., 11
Azucar 0 Azucar 0
I EI SrdU se apareat can la G en la duplicacion
SrI
HC"'CC"'0"H. Par SrdU-GI II '"
./N....C...N,. .?., II "H'N"'~C-N
Azucar 0" I II ~CH, 'H'N...G""-"C.....N'
H N ~Azucar
Se pueden inducir mutaciones al incorporar analogos de bases en el DNA.
que contiene un aromo de bromina en lugar del grupo metilo de la timina. EI BrdU se incorpora al DNAen lugar de la timina. No obstante, sus propiedadesde apareamiento son ambiguas porque el atomo debromina permite que se realice un cambio en el cualla base modifica su estructura, de una forma ceto(=0) a una forma enol (-OR). Esta tlltima puedeaparearse con la guanina, to cual conduce a la susJitucion del par original A-T pOl' un par G-c.
EI apareamiento erroneo puede ocurrir durantela incorporacion original de la base 0 en un ciciosubsigulente de duplicacion. La transicion es inducida con cierta probabilidad en cada cicio de duplicacion, de modo que la incorporacion de BrdU tieneefectos continuos en la secuencia del DNA.
Durante mucho tiempo se penso que las mutaciones puntuales eran la via principal de cambio
16 CAPITULO 1 los genes son DNA
en genes individuales, pero ahora sabemos que lasinserciones de fragmentos de material adicionalson muy frecuentes. La fuente del material insertado yace en los elementos transponibles, queson secuencias de DNA susceptibles de cambial' delugar (vease Capitulo 21, Transposones, y Capitulo22, Retrovirus y retroposones). Normalmente, unainsercion suprime la actividad de un gen, y dondehan ocurrido dichas inserciones, despues puedenproducirse deleciones de una parte 0 todo el material insertado, y hasta de los dominios adyacentes.
Una diferencia significativa entre las mutaciones puntuales y las inserciones/deleciones es quela frecuencia de las primeras puede incrementarsepOl' los mutagenos, mientras que la incidencia delos cambios provocados pOl' elementos transponibles no se ve afectada. Sin embargo, las inserciones y deleciones tambien pueden ser producto demecanismos, pOl' ejemplo, los que implican errorescometidos durante la duplicacion 0 la recombinacion, aunque probablemente sean menos comunes.Por otra parte, una clase de mutagenos, las acridinas, dan lugar a inserciones y deleciones (muypequeii.as) .
lID Los efectos de las mutacionespueden ser revertidos
Conceptos principales
• las mutaciones directas desactivan a un gen, en tantoque inversas (0 revertientes) revierten sus efectos.
• las inserciones pueden revertir por deleci6n delmaterial insertado, pero las deleciones no puedenreverti rse.
• la supresi6n ocurre cuando una mutaci6n de un segundogen anula el efecto de la mutaci6n del primero.
En la 2 se muestra que el aislamiento delos revertientes es una caracterfstica importanteque distingue las mutaciones puntuales y las inserciones de las deleciones:
• Una mutacion puntual puede revertirse alrestaurar la secuencia original 0 al adquiriruna mutacion compensadora en alguna otraparte del gen.
• Una insercion de material adicional puedeser revertida por delecion del material insertado.
• Una delecion de una parte de un gen nopuede revertirse.
Las mutaciones que desactivan a un gen son llamadas mutaciones directas, y sus efectos son revertidos por mutaciones inversas, las cuales sonde dos tipos, reversion verdadera y reversion supresora intragenica.
ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT
Mutaci6n Ipuntual tATCGGACOACCGGTTATAGCCTGAGTGGCCAAT
Reversi6n ~
ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT
ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT
Inserci6n
ATCGGACTTXXXXXACCGGTTATAGCCTGAAYYYYYTGGCCAAT
Reversi6n Ipar deleci6n tATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT
ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT
ATCGGACGGTTATAGCCTGCCAAT
Reversi6n imposible
FlGl. Las mutaciones puntuales y las insercianes pue-den ser revertidas, pero las deleciones son irreversibles.
Una reversion exacta de la mutacion originalse llama reversion verdadera, de tal manera quesi un par A-I ha sido remplazado pOI un par G-C,otra mutacion que restituya el par A-I regeneraniexactamente la secuencia de tipo silvestre.
El segundo tipo de mutacion inversa, la reversion supresora intragenica, puede tener lugaren otro sitio del gen, y sus efectos compensan ala primera mutacion. Por ejemplo, un cambio deaminoacido en una protefna puede aboUr la funcion del gen, pero una segunda alteracion puedecompensar por la primera y restaurar la actividadde la protefna.
Una mutacion directa resulta de cualquier cambio que desactive un gen, mientras que una mutacion inversa debe restaurar la [uncion de una protefna danada por una mutacion directa en particular,de modo que las demandas de una mutacion inversason mucho mas especfficas que las de una mutaciondirecta. En proporcion, la tasa de retromutacion esmenor que la de mutacion directa, normalmente porun factor de -10 veces.
Las mutaciones tambi61 pueden ocunir enotros genes para contrarrestar los efectos de unamutacion en el gen original, deeto que se conocecomo supresion. Se llama supresor al locus enque una mutacion suprime el efecto de una mutacion en otro.
lID Las mutacianes se cancentranen puntas calientes
(oncepto principal
• La frecuencia de las mutacianes en cualquier parde bases en particular depende de una fluctuaci6nestadistica, excepto en los puntas calientes, en loscuales la frecuencia se incrementa cuando menos en unorden de magnitud.
Basta ahora se han descrito las mutaciones en funcion de los cambios individuales en la secuenciadel DNA que influyen en la actividad de la unidadgenetica en la cual ocurren. Cuando se analizanlas mutaciones desde la perspectiva de la desactivacion del gen, la mayorfa de los genes de unaespecie muestran tasas mas 0 menos similares demutacion respecto de su tamano, 10 cual sugiereque el gen puede ser considerado como un objetivode la mutacion, y que un dana en cualquiera de suspartes puede abolir su funcion, pOI consiguiente, lasusceptibilidad a la mutacion es aproximadamenteproporcional al tamano del gen. Pero considerando los sitios de mutacion de la secuencia del DNA,,)odos los pares de bases de un gen son igualmentesusceptibles 0 algunos son mas propensos que otrosa sufrir mutaciones?
(,Que sucede cuando se afsla un numero importante de mutaciones independientes del mismogen? Se obtienen numerosos mutantes, cada unode los cuales es resultado de un evento mutacionalindividual. Posteriormente se determina el sitio decada mutacion. La mayorfa de las mutaciones radicaran en sitios diferentes, si bien algunas estaranen la misma posicion. Dos mutaciones aisladas demanera independiente en el mismo sitio puedenconstituir exactamente el mismo cambio en el DNA(en cuyo caso el mismo evento mutacional ha sucedido en mas de una ocasion), 0 pueden constituircambios diferentes (en cada par de bases son posibles tres mutaciones puntuales diferentes).
En el histograma de la se muestrala frecuencia con la cual se encuentran mutaciones en cada par de bases del gen lac! de E. coli. Laprobabilidad estadistica de que ocuna mas de unamutacion en un sitio particular se determina porcinetiea de impactos aleatorios (como se observa en
1.14 Las mutacianes se cancentran en puntas calientes 17
50 100 150 200 250 300 bpDistancia a 10 largo del gen
Las mutaciones espontaneas ocurren a lo largodel gen lacI de la bacteria E. coli, perc estan concentradas enun punto caliente. La desaminaci6n de la citosina produce uracilo,
y la de 5-metilcitosina, timina.
Citosina 5-metilcitosina CH3 H
IY~'H/'Nf(N )
o
CH 3Timina 1 ~O
f'1f'N N/' II 'H
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g 40'(3
5 30E(1) 20D0ID 10E
'OJz
la distribucion de Poisson). Por 10 tanto, algunossitios adquiriran una, dos 0 tres mutaciones, mientras que otros no obtendran ninguna. Algunos sitiosadquieren muchas mas mutaciones de las esperadasen una distribucion aleatoria; pueden presentar 10 eincluso 100 veces mas mutaciones que las predichaspor los impactos aleatorios. Estos sitios se Hamanpuntos calientes. En los puntos calientes puedenocurrir mutaciones espontaneas, y mutagenos diferentes pueden tener diferentes puntos calientes.
III Numerosos puntos calientes sonresultado de bases modificadas
Concepto principal
• Una causa comLin de puntos calientes es la basemodificada 5-metilcitosina, la cual sufre desaminaci6nespontanea y se convierte en timina.
Una causa importante de mutacion espontanea resulta de la presencia de una base inusual en el DNA.Ademas de las cuatro bases que se insertan en estecuando es sintetizado, en ocasiones se pueden observar bases modificadas cuyo nombre refleja suorigen; son producidas al modificarse quimicamenteuna de las cuatro bases ya presentes en el DNA. Labase modificada mas comun es la 5-metilcitosina,generada par una enzima metilasa que agrega ungrupo metilo a ciertos residuos de citosina en sitiosespecfficos del DNA.
Los sitios que contienen 5-metilcitosina proparcionan puntos calientes para que se desarrollen mutaciones puntuales espontaneas en E, coli. En cadacaso, la mutacion adquiere la forma de una transicion de G-C a A-T. Las cepas de E. coli incapaces demetilar la citosina carecen de puntos calientes.
La razon de la existencia de los puntos calienteses que las bases de citosina sufren desaminacion
espontanea con frecuencia considerable. En esta reaccion, el grupo amino es remplazado por un grupoceto. Recuerdese que la desaminacion de la citosinagenera uracilo (vease Figura 1.23). En la • U
se compara esta reaccion con la desaminacion de5-metilcitosina, en donde la desaminacion generatimina. El efecto en el DNA es la generacion de pares de bases G-U YG-T, respectivamente, donde hayun apareamiento erroneo entre parejas.
Todos los arganismos cuentan con sistemas dereparacion que corrigen pares de base apareadoserroneamente eliminando y remplazando una delas bases. La operacion de estos sistemas determinasi los pares apareados erroneamente, como G-U YG-T, resultan en mutaciones.
En la se muestra que las conse-cuencias de la desaminacion son diferentes para la5-metilcitosina y para la citosina. La desaminacion(poco frecuente) de la 5-metilcitosina provoca unamutacion, en tanto que la desaminacion de la citosina mas comun no tiene este efeeto porque los sistemas de reparacion son mucho mas efectivos parareconocer G-U que G-T.
La E. coli contiene una enzima, uracilo-DNAglucosidasa, que elimina los residuos de uracilo delDNA (vease la seccion 20.5, La inversion de baseses utilizada por las metilasas y las glucosilasas). Estaaccion deja sin aparear un residuo de G, y posteriormente "un sistema de reparacion" inserta una base Cpara aparearlo. El resultado final de estas reaccioneses la restauracion de la secuencia original del DNA.Este sistema protege al DNA de las consecuenciasde la desaminacion espontanea de la citosina (perono es 10 suficientemente activo como para prevenirlos efectos del alto nivel de desaminacion provocadopor el acido nitroso; vease la Figura 1.23).
Notese que la desaminacion de la 5-metilcitosina produce tirnina, 10 cual da lugar a un par de basesapareadas erroneamente, G-T. Si el apareamiento
18 CAPITULO 1 Los genes son DNA
La remocion del uracilo evita las mutaciones - ;::;
c Me C~Y7\.'VAYAW
G GDesaminaci6n oxidativa
La T remplaza a la Me-C I EI U remplaza a la CT .. u
~YA±lA.lVGIG
T .. Eliminaci6n del uracilo
~~WG G
I Insercion de citosinaT .. C
~--.u\.YA.l()\.Y7VJ.VG G
Duplicaci6n
C ~ C~Y7\.YAYJ\JU
G GT Y c
W'WAYAYAJUA G
la T se aparea cin la A I
Mutaci6n Sin mutaci6n
FIGURA 1 2 La desaminaci6n de la 5-metilcitosina producetimina (por transiciones de C-G a T-A), en tanto que la desaminaci6n de la citosina produce uracilo (que suele ser eliminadoy posteriormente remplazado por citosina).
erroneo no se corrige antes del siguiente cido deduplicacion, resulta una mutacion. En la siguiente duplicacion, las bases del apareamiento erroneoentre G y T se separan y posteriormente se apareancon nuevas parejas para producir un par G-C de tiposilvestre y un par A-T mutante.
La desaminacion de la 5-metilcitosina es la causa mas comun de la produccion de pares erroneosde G-T en el DNA. Los sistemas de reparacion queactuan en dichos pares tienden a remplazar T por C(en vez de la alternativa de remplazar G por A), 10cual ayuda a reducir la tasa de mutacion (vease laseccion 20.7, Control de la direccion de la reparacion del apareamiento erroneo) . No obstante, estossistemas no son tan efectivos como la remocion deV de los pares erroneos G-V, de modo que la desaminacion de la 5-metilcitosina provoca mutacionescon mucha mayor frecuencia que la desaminacionde la citosina.
La 5-metilcitosina tambien crea puntos calientes en el DNA de eucariotas, fenomeno comlm endinudeotidos CpG concentrados en regiones denominadas islas CpG (vease la seccion 24.19, Losislotes CpG son dianas reguladoras). Si bien la 5metilcitosina representa -1 % de las bases del DNAhumano, los sitios que contienen la base modifica-
da representan -30% de las mutaciones puntuales;esto hace del estado de la 5-metilcitosina un factordeterminante de mutacion muy importante en lascelulas animales.
Los efectos de la eliminacion de la enzima delraton MBD4, glucosilasa susceptible de eliminar T(0 V) de pares erroneos con G, subrayan la importancia de los sistemas de reparacion para reducirla tasa de mutaciones; el resultado es una tasa demutacion tres veces mayor en los sitios CpG. (Larazon de que eJ efecto no sea mayor es que la MBD4constituye solo uno de los numerosos sistemas queinciden en los pares erroneos G-T; es de imaginarque la eliminacion de wdos los sistemas incrementara mucho mas la tasa de mutacion.)
La operacion de estos sistemas proyecta una luzinteresante en el uso de la T en el DNA respecto dela V en el RNA que quiza se relacione con la necesidad de estabilidad de la secuencia del DNA; el usade T significa que cualquier desaminacion de C sedetecta de inmediato debido a que genera una base(V) que suele estar ausente del DNA 10 cual incrementa en gran medida la eficiencia con que puedenfuncionar los sistemas de reparacion (comparadoscon la situacion en que tienen que detectar apareamientos erroneos G-T, los cuales tambien puedenser producidos por situaciones en que la eliminacionde la T no serla la respuesta apropiada). Asimismo, el enlace fosfodiester del esqueleto es mas labilcuando la base es V.
lID Algunos agentes hereditariosson extremadamente pequefios
Concepto pri nci pal
• Algunos agentes hereditarios muy pequeiios nocodifican proteinas, pero constan de RNA 0 deproteinas que tienen propiedades hereditarias.
Los viroides son agentes infecciosos que producenenfermedades en plantas superiores; son moleculas circulares de RNA muy pequeiias. A diferenciade los virus, en los cuales el agente infeccioso esun virion, genoma encapsulado en una cubiertade protefna, el RNA viroide es el agente infeccioso. EIviroide esta formado unicamente por RNA cuyasbases estan extensamente apareadas pero de formaimperfecta, de modo que forman una barra caracteristica, como la ilustrada en la ! II . J. Lasmutaciones que interfieren con la estructura de estabarra reducen su capacidad infecciosa.
Un RNA viroide consiste en una especie molecular individual que se replica de forma autonomaen cHulas infectadas y cuya secuencia se perpetlla
1.16 Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeiios 19
'J..."tIU~'T. ..~....r~.!JllIn ~~
, PSTV grave ~ ., 00 ,~ 'M
j j { I I j ,','" C UOu C o"'c U /,:>. A"'A AO GC oG A GAA/fl /flC ","II AC A e" C e u u cc C
°O"ACU AACU ouoouuec GGUU CACCU CUCC OAoeAO AAGA OAAOGCGG CUCGG Gil. GCUUCAO uec eCGGO CC\OAOCOA UGGC A"'AGG GGUGOGG GUO CC BCGG co AOOAO ccca GAAA AOGGUUU11111111111111111 1111 111111 11111111111111 11IlllIIIIIlll II 1111111 11111111 1111111111111 IIIII llllll! III II 1111111 II1II 11111111 1111
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l AC uGu c1 GAc U AAA I NJ GC GGJ - GAAA U AG Jjt'" AG A G ACt UAAUU cc C~CU AACU GuOOUUOC GGUU CACCU COCC GN3CN3AAANJA ~AAOOCGGCUCGG GA GCUUCA.G vee CCGGG CC GGAGCGA UGGC UAAGG GGUGGGG GUG CG GCGG CO AOOAG cere GAAA AGOGUU,U 11I1I II [I 11111111 II t I 111111 1111 1[1111111111 111111111 1111' [I 1111111 III 11111 II 1111111 'Ill 11II1 1111111 \11 II 1111 11 1I11I 1111 1111 1111 ,
IeCuuoo UUGA CGCCAAOO CCOA UGUOOG GGOO uUCGUUuuuucu uuuuutGCc GAGCC co OOAAGUc AOO GGCCC GoG cuUCGCU GUCG GUuuc CtGCUCC CAC GG CGCC GC UCCUU GGGC CUUU UUUUA
CUuC UU I "GC C tC, A C AA A A U A C C ceCA A C GC C U UU CdJ I
Vcu \ ACA\ VCAU I I CuG
359 330 300 210 240 210 180
+U A-.U
El RNA del PSTV es una molecula circular que forma una estructura extensa de doble cadena interrumpida por numerosos lazos interiores. La forma leve difiere de la grave en tres sitios.
fielmente en sus descendientes. Los viroides pueden clasificarse en numerosos grupos. Un viroidedado se identifica con un grupo porIa similitud desu secuencia con la de otros miembros del grupo.POl' ejemplo, cuatro viroides relacionados con el deltuberculo ahusado de la papa (PSTV, potato spindletuber viroid), muestran similitudes de secuencia del70 al 83 pOl' ciento. Los diferentes aislamientos deuna cepa de un viroide en particular pueden va rial'entre ellos, y el cambio puede afectar al fenotipode celulas infectadas. POl' ejemplo, las cepas levesy severas de PSTV difieren par tres sustituciones denucleotidos.
Los viroides se asemejan a los virus en que susgenomas de acido nucleico son heredables porquecumplen con todos los requisitos de la informaciongenetica, aunque los viroides, lIamados en ocasiones patogenos subviricos, difieren de los virus enestructura y funcion. EI RNA viroide no parece sertraducido a protefnas, pOl' 10 tanto no puede codificar pOl' sf mismo las funciones necesarias para su supervivencia, fenomeno que genera dos interrogantes: cComo se replica el RNA viroide? cComo afectaal fenotipo de la celula de la planta infectada?
La duplicacion debe ser realizada pOl' enzimasde la celula hospedadora, subvertidas de su funcionnormal. La heredabilidad de la secuencia del viroideindica que el RNA viroide proporciona el molde.
Presumiblemente, los viroides son patogenicosporque interfieren con los procesos celulares normales, quiza de forma relativamente aleatoria, pOl'ejemplo, secuestrando una enzima esencial para supropia duplicacion 0 interfiriendo con la produccion de moleculas necesarias de RNA celular, 0 bien,pueden comportarse como moleculas reguladarasanormales con efectos particulares en la expresionde genes individuales.
Un agente aun menos comun es la encefalopatfa espongiforme de ovejas y cabras (scra-
20 CAPITULO 1 Los genes son DNA
pie), enfermedad neurologica degenerativa de ovejas y cabras que se relaciona con kuru y sfndromede Creutzfeldt-Jakob, enfermedades humanas queafectan la funcion cerebral.
El agente infeccioso del scrapie no contiene dcidonudeico. Este agente extraordinario lIamado prion(agente infeccioso proteinaceo) es una glicoprotefna hidrofoba de 28 kD, 0 PrP, codificada pOl' ungen celular (conservado entre los mamfferos) quese expresa en el cerebro normal. La protefna existeen dos formas, el producto que se encuentra en elcerebra normal conocido como Prpc, que es completamente degradado por proteasas. La protefna encontrada en los cerebros infectados se conoce comoPrpsc y es extremadamente resistente a la degradacion por proteasas. La PrPC se convierte en PrPSC poruna modificacion 0 cambio conformacional queconfiere resistencia a las proteasas y que aun no hasido descrita por completo.
Como agente infeccioso del scrapie, el PrPSC debemodificar de alguna manera la sfntesis de su contraparte celular normal, de tal forma que, de ser inocuose tome en infeccioso (vease la seccion 31.12, Lospriones provocan enfermedades en los mamfferos).Los ratones que carecen del gen PrP no pueden serinfectados para que en ellos se desarrolle scrapie, 10cual demuestra que el PrP es esencial para el desarrollo de la enfermedad.
III ResumenMediante dos experimentos clasicos se demostroque el DNA es elmaterial genetico. El DNA aislado de una cepa de la bacteria Pneumococcus puedeconferir propiedades de dicha cepa a otra. Ademas,el DNA es el unico componente heredado porIaprogenie de los fagos progenitores. EI DNA puedeutilizarse para transferir nuevas propiedades a celulas eucariotas.
El DNA es una helice duplex formada par cade"as antiparalelas en las cuales los nucleotidos estan
idos pOl' enlaces fosfocliester 5'a -3'. El esqueleto:orma la parte exterior; las bases de purina y de piri::niclina estan apiladas en el interior formando pares,::ll los cuales la A es complementaria de la T, y la G,":'e la C. Las cadenas se separan y recurren al apa::-eamiento complementario de bases para ensamblar-- enas hijas siguiendo un patron de duplicacion= miconservadora. El apareamiento complementa_:0 de bases tambien se u tiliza para transcribir un~\A que representa una sola cadena de un DNAiiiplex.
Un fragmento de DNA puede codificar a una~,oteina.El codigo genetico describe la relacion en=e la secuencia del DNA y la secuencia de la protei-
-. Solo una de las dos cadenas del DNA codifica a'..:na proterna. Un codon esta farmado pOl' tres nu~eotidos que representan un solo aminoacido. Una=e enda codificadora de DNA consiste en una serie.:: codones, los cuales son leidos desde un punto de:.aicio predeterminado. En general, uno de los tres_arcos de lectura posibles puede ser traducido en_,oteinas.
Una mutacion es un cambio en la secuencia de_Q pares de bases A-T y G-C del DNA que, en una=:.'cuencia codificadora, puede cambiar la secuenciaie aminoacidos de la proteina correspondiente. Una:2utacion por desplazarniento del marco de lectura::J.odifica el marco de lectura subsiguiente insertando~ eliminando una base, de modo que se produce una=erie completamente nueva de aminoacidos a partir'el sitio de la mutacion. Una mutacion puntual cam
.=":a solo al arninoacido representado par el condon en':~ cual sucede la mutacion. Las mutaciones puntua,::5 pueden ser revertidas por mutacion inversa de la:::mtacion original. Las inserciones pueden revertirse:- r la perdida del material insertado, pero las de.::ciones son irreversibles. Las mutaciones tambien." ;Jeden ser suprimidas de manera inclirecta cuando~a mutacion de un gen diferente antagoniza al de'::GO original.
La incidencia natural de las mutaciones se in=ementa pOl' medio de mutagenos. Las mutacio:::es pueden concentrarse en puntos calientes. Una':rri.edad de punto caliente responsable de algunas
=·.naciones puntuales es provocada por la desami~-cion de la base modificada 5-metilcitosina.
Las mutaciones directas ocurren a una tasa de- ~ 0-6 pOl' locus por generacion; las retromutaciones
mutaciones inversas) son menDs comunes. Noas las mutaciones inciden en el fenotipo.Aunque toda la informacion genetica de las ce
___as es transportada por el DNA, los virus tienen=:=::lOmas de doble cadena 0 de una sola cadena de
o de RNA. Los viroides son patogenos subviri-
cos formados unicamente por moleculas circularespequeiias de RNA, sin cubierta protectora. El RNAno codifica proteinas; se desconoce su forma de perpetuacion y de patogenesis. El scrapie es un agenteproteinico infeccioso.
Referencias
III Introducci6n
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22 CAPITULO 1 Los genes son DNA
l1li Numerosos puntos calientes son resultado de basesmodificadas
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Los genes codifican proteinas
--......
...
ESQUEMA DEL CAPITULO JIntroducci6n
Un gen codifica a un solo polipeptido• La hip6tesis de un gen : una enzima resume Las bases de la
genHica moderna: que un gen es un fragmento de DNA quecodifica a una sola cadena polipeptidica.
• La mayoria de las mutaciones deterioran La funci6n del genen el cual se producen.
Las mutaciones que se presentan en el mismo genno se pueden complementar• Una mutaci6n en un gen afecta s6Lo a La proteina
codificada por la copia mutante del gen y no a lasproteinas codificadas por algun otro alelo.
• La incapacidad de dos mutaciones para complementarse(producir un fenotipo silvestre cuando se presentan enconfiguraci6n trans en un heterocigoto) significa queforman parte del mismo gen.
Las mutaciones pueden provocar perdidao ganancia de funci6n• Las mutaciones recesivas son provocadas por perdida de
funci6n del producto proteinico.• Las mutaciones dominantes son resultado de una ganancia
de funci6n.• La evaluaci6n de la esencialidad de un gen requiere de una
mutaci6n nula (que elimine por completo su funci6n).• Las mutaciones silenciosas no tienen ningun efecto porque
el cambio de base no altera la secuencia ni la cantidad deproteina, 0 porque el cambio de la secuencia de la proteinano tiene ningun efecto.
• Las mutaciones rezumantes (0 hipomorfas) inciden en lafunci6n del producto del gen, pero no se observan en elfenotipo debido a que prevaLece la actividad suficiente.
Un locus puede tener numerosos alelos mutantesdiferentes• La existencia de varios alelos permite ocurrencia de
heterocigotos con cualquier combinacion en pares de alelos.
Un locus puede tener mas de un alelo de tiposilvestre• Un locus puede tener una distribucion polim6rfica de alelos
sin un aLeLo individual que pueda ser considerado como elunico de tipo silvestre.
La recombinaci6n ocurre por el intercambio fisicode DNA• La recombinaci6n es resultado del entrecruzamiento que
ocurre en los quiasmas e involucra a dos de las cuatrocromatidas.
• La recombinacion se debe a un rompimiento y una reuni6nque tienen Lugar a traves de un intermediario de DNA hibrido.
El c6digo genetico se lee en tri pletes• EL c6digo genHico se lee en tripletes de nucleotidos
denominados codones.• Los tripletes no estan superpuestos y se leen a partir de un
punta fijo de inicio.• Las mutaciones que insertan 0 eliminan bases individuales
provocan un cambio en Los grupos de tripletes despues delsitio de la mutaci6n.
• Las combinaciones de mutaciones que insertan 0 eliminantres bases (0 multiplos de tres), insertan 0 eliminanaminoacidos, pero no cambian La lectura de Los tripletesmas aLla del ultimo sitio de mutacion.
(ada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles• Usualmente solo un marco de lectura es traducido y
los otros dos son bloqueados por senales frecuentes determinaci6n.
Los genes procari6ticos son coli nealescon sus proteinas• Un gen procari6tico es un fragmento constante de 3N
nucleotidos que codifica a N aminoacidos.• El gen, el RNAm y la proteina son todos colineales.
Numerosos procesos son necesarios para expresarel producto protelnico de un gen• Un gen procari6tico se expresa por transcripci6n en RNAm
y posteriormente por traducci6n del RNAm en una proteina.• En Las eucariotas, un gen puede contener regiones internas
no representadas en la proteina.• Las regiones internas son eliminadas del transcrito de RNA
por el corte y empaLme de este para dar origen a un RNAmcolineal respecto del producto proteinico.
• (ada RNAm esta formado por una regi6n lider 5' notraducida, una regi6n codificadora y una regi6n posterior 3'no traducida.
Las proteinas actuan en trans, pero los sitios delDNA, en cis• Todos los productos de los genes (RNA 0 protejnas) actuan
en trans; pueden actuar en cualquier copia de un gen en lacelula.
• Las mutaciones de actuacion en cis identifican a lassecuencias de DNA que son el objetivo de reconocimientode los productos de actuaci6n en trans. No se expresancomo RNA ni como proteinas, y afectan s6lo al fragmentocontiguo de DNA.
Resumen
23
gen son las diferentes formas que se encuentran ensu locus.
La clave para comprender la organizacion de losgenes en los cromosomas fue el descubrimiento delligamiento genetico, 0 tendencia de los genes de unmismo cromosoma a mantenerse juntos en la progenie, en Lugar de ordenarse de manera independiente, como pronostican las leyes de Mendel. Unavez que se introdujo la unidad de recombinacion(reordenamiento) como medida de vinculacion, fueposible construir mapas geneticos.
La resolucion del mapa de recombinacion deuna eucariota superior esta restringida por 10 reducido de la progenie que puede obtenerse de cadacruza. La recombinaci6n es tan poco frecuente entre puntos cercanos, que se observa rara vez entremutaciones diferentes del mismo gen. Por ello, enlos mapas de ligamiento clasico de las eucariotas sepuede colocar a los genes en orden, perc no es posible determinar las relaciones en un gen. Al cambiara un sistema microbiano en el cual se puede obteneruna progenie muy numerosa de cada cruza genetica, los investigadores pudieron demostrar que larecombinacion ocurre dentro de los genes y que sigue las mismas reglas que se dedujeron previamentepara la recombinacion entre genes.
En un gen, las mutaciones pueden estar organizadas de forma lineaL con 10 cual se demuestra queel gen mismo posee la misma construccion linealque el ordenamiento de genes en un cromosoma, demodo que el mapa genetico es lineal en los loci y entre estos: esta formado por una secuencia continuadentro de la cual residen los genes. Esta conclusioncondujo naturalmente a la perspectiva modernaque se resume en la I U A 2. , en la cual se considera que el material genetico de un cromosoma estafarmado por una molecula ininterrumpida de DNAque representa a numerosos genes.
- ...... .. . .• • • ••• AA
EI cromosoma contienenumerosos genes
EI gen es la unidad funcional de la herencia queconstituye una secuencia del genoma cuya funciones dar origen a un producto discreto (ya sea unaprotefna 0 un RNA); su comportamiento basico fuedefinido por Mendel hace mas de un siglo. Resumido en sus dos Leyes, el gen fue reconocido como un"factor de partfculas" que se transmite sin cambiosdel progenitor a su progenie. Un gen puede existiren formas alternas que se conocen como alelos.
En los organismos diploides, los cuales tienendos conjuntos de cromosomas, una copia de cadauno de ellos se hereda de cada progenitor, mismocomportamiento exhibido por los genes. Una de lasdos copias de cada gen es el alelo paterno (heredadodel padre), el otro es el materna (heredado de la madre). La equivalencia condujo al descubrimiento deque, de hecho, los cromosomas portan a los genes.
Cada cromosoma consiste en una estructura lineal de genes. Cada gen reside en una localizacionparticular del cromosoma. La localizacion se conocede manera mas formal como locus. Los alelos de un
III Introducci6n
Un cromosoma es una molecula de DNA muy larga . 00=;;;;;;;;;;;;;;;;;::""
Cada gen es parte deuna secuencia
continua de DNA
11Inicio del gen Final del gen
III Un gen codifica a un solopolipeptido
Conceptos principaLes
• La hip6tesis de un gen : una enzima resume las basesde La geneiica moderna: que un gen es un fragmento
de DNA que codifica a una soLa cadena poLipeptidica.
• La mayorla de las mutaciones deterioran La funci6n deL
gen en el cual se producen.
CATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACAATGCGTATATTCCAcrCCATCCTAGTCAAOGAGGAGTGTTACG
GU f Cada cromosoma tiene una sola molecula larga deDNA dentro de La cual se encuentran las secuencias de genesindividuaLes.
Mediante el primer intento sistematico de relacionara los genes con las enzimas se demostr6 que cadaetapa de la ruta metabolica es catalizada par una solaenzima y que puede ser bloqueada por mutaciones enun gen diferente. Esto condujo ala hipotesis de un gen:
24 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas
una enzima. Cada paso metabolico es catalizado poruna enzima especffica cuya produccion es responsabilidad de un solo gen. Una mutacion en el gen altera laactividad de la proteina de la cual es responsable.
Para incluir a las proteinas formadas por mas delilla subunidad, es necesario modificar la hipotesis. Silas subunidades son todas iguales, la proteina es un homomultimero, y esta representada par un solo gen.Si las subunidades son diferentes, la proteina es un heteromultimero. Expresada como una regIa mas general aplicable a cualquier proteina homomultimerica,la hipotesis de un gen : una enzima se manifiesta conmayor precision como un gen : una cadena polipeptfdica.
Identificar que proteina representa a un gen enparticular puede ser tardado jLa mutacion que diolugar a los chfcharos rugosos murantes de Mendelno se identifico sino hasta 1990, como una alteracion que inactiva al gen que codifica a una enzimaramificadora del almidon!
Es importante recordar que un gen no producedirectamente una proteina. Como se mostro previamente en la Figura 1.2, un gen codifica a un RNA,que a su vez puede codificar a una proteina. La mayor parte de los genes codifica a las proteinas, peroalgunos codifican moleculas de RNA que no producen proteinas. Dichas moleculas de RNA pueden sercomponentes estructurales del aparato responsablede la sintesis de proteinas, 0 bien, regular la expresian genetica. El principio basico consiste en queel gen es una secuencia de DNA que especifica lasecuencia de un producto independiente. El proceso
. . . . ...Homocigoto ~ Heterocigoto de Homocigotode tipo silvestre tipo silvestre/mutante mutante
Ambos aielos Un alelo (dominante) Ninguno de losproducen produce una proteina alelos produceprotefnas activas activa proteinas
flOflO"''''r:J n.n.fllflOe>.
-""""""____ VI
t ttipo silvestre tipo silvestre mutante
tipo silvestre mutante mutante
!no. no. n. r> r:J----
Fenotipo Fenotipo Fenotiposilvestre silvestre mutante
FIGURA 2 2 Los genes codifican proteinas; la dominancia seexplica por las propiedades de las proteinas mutantes. Un alelorecesivo no contribuye al fenotipo debido a que no produce ninguna proteina (0 produce una proteina que no es funcional).
de la expresion de los genes puede terminar en unproducto que sera RNA 0 proteina.
Una mutacion es un evento aleatorio respeCto dela estructura del gen en el cual es muy probable quese dane, 0 incluso que se suprima, la funcion del gen.Casi todas las mutaciones que afectan el funcionamiento de un gen son recesivas: representan ausenciade funci6n, pues al gen mutante se Ie ha impedido producirsu protefna usual. En la I R 2 se ilustra 1a relacionentre alelos de tipo recesivo y alelos de tipo silvestre.Cuando un heterocigoto contiene un alelo de tiposilvestre y un alelo de tipo mutante, este ultimo essusceptible de regir la produccion de la enzima, y por10 tanto, es dominante. (Esto implica que elunicoalelo de tipo silvestre produce una cantidad adecuadade proteina. Cuando esto es falso, 1a menor cantidadproducida por un alelo, comparada con la de dosalelos, resulta en el fenotipo intermedio de un aleloparcialmente dominante en un heterocigoto.)
III Las mutaciones quese presentan en el mismo genno se pueden complementar
Conceptos principales
• Una mutaci6n en un gen afecta s6lo a la proteinacodificada por la copia mutante del gen y no a lasproteinas codificadas por algOn otro alelo.
• La incapacidad de dos mutaciones para complementarse(producir un fenotipo silvestre cuando se presentan enconfiguraci6n trans en un heterocigoto) significa queforman parte del mismo gen .
LComo determinamos si dos muraciones que provocan un fenotipo similar se encuentran en el mismogen? Si en e1 mapa estan muy cerca, pueden ser alelos. Pero tambien podrian representar mutacionesde dos genes diferentes cuyas proteinas estan implicadas en la misma funcion. La prueba de complementacion permite determinar si dos muracionesyacen en el mismo gen 0 en genes diferentes. Laprueba consiste en hacer un heterocigoto para las dosmutaciones (apareando a progenitores homocigoticos para cada muracion).
Si las mutaciones se encuentran en el mismogen, los genotipos progenitores pueden representarse como:
m] m 2-y-In] m2
El primer progenitor proporciona un alelo mutante m] y el segundo, un alelo m
2, por 10 tanto, el
heterocigoto tendra 1a constitucion:
2.3 Las mutaciones que se presenta n en el mismo gen no se pueden complementar 2S
MUTACIONES EN EL MISMO GEN
. . .
No se observa ningun gen de tipo silvestre, por 10tanto, el heterocigoto tiene un fenotipo mutante.
Si la mutacion yace en genes diferentes, los ge-notipos progenitores pueden representarse como:
m l + +m2-y-m1+ +m
2
Cada cromosoma tiene una copia tipo silvestrede un gen (representada por el signa mas) y unacopia mutante del otro, de modo que la constituciondel heterocigoto sera:
m1++m
2
en la cuallas dos progenitores han proporcionadouna copia de tipo silvestre de cada gen. El heterocigoto tiene el fenotipo silvestre, de modo que se diceque los dos genes se complementan.
La prueba de la complementacion se describemas ampliamente en la FI ? ". La basica consisteen la comparacion que se muestra en la parte superior de la figura. Si dos mutaciones se encuentranen el mismo gen, se observa una diferencia en losfenotipos de la configuracion trans y de la configuracion cis. La configuracion trans es mutante, pues cadaalelo tiene una mutacion (difereme). Sin embargo,la configuracion cis es de tipo silvestre, debido a queun alelo tiene dos mutaciones y el otro, ninguna.En la parte inferior de la figura se muestra que si lasdos mutaciones se encuentran en genes diferentes,
siempre se observara un fenotipo silvestre. Siemprehay un alelo de tipo silvestre y un alelo mutante decada gen, y la configuracion no tiene importancia.La incapacidad para complementar significa que dosmutaciones son parte de la misma unidad genetica.Se dice que las mutaciones que no se complementanforman parte del mismo grupo de complementacion. Otro termino utilizado para describir a la unidad definida porIa prueba de complememacion escistron, que significa 10 mismo que gen. Basicamente estos tres terminos describen a un fragmento deDNA que funciona como una unidad que dara lugara un RNA 0 un producto protefnico. Las propiedadesdel gen respecto de la complementacion se explicanpor el hecho de que este producto es una molecula(mica que se comporta como una unidad funcional.
• Las mutaciones recesivas son provocadas por perdidade funci6n del producto proteinico.
• Las mutaciones dominantes son resultado de unaganancia de funci6n.
• La evaluaci6n de la esencialidad de un gen requiere de una
mutaci6n nula (que elimine por completo su funci6n).
• Las mutaciones silenciosas no tienen ningun efectoporque el cambio de base no altera la secuencia ni
la cantidad de proteina, 0 porque el cambio de la
secuencia de la proteina no tiene ningun efecto .
• Las rnutaciones rezumantes (0 hipomorfas) afectan a lafunci6n del producto del gen, pero no se observan en
el fenotipo porque queda actividad suficiente.
Conceptos principales
lit Las mutaciones puedenprovocar perdida 0 gananciade funci6n
configuraci6n cisconfiguraci6n trans
R oJ El cistr6n se define mediante la prueba de complemen-taci6n. Los genes estan representados por espirales; los asteriscosrojos identifican a los sitios de mutaci6n.
Los diversos efectos posibles de las mutacionesen un gen se resumen en la r
Cuando un gen ha side identificado, en principiose puede !legar a conacer su funcion produciendoun organismo mutante que carezca completamentedel gen. Una mutacion que elimina por completo lafuncion de un gen,normalmente porque el gen hasido eliminado, se llama mutacion nula, y si el genes esencial, la mutacion nula es letal.
Para determinar el efecto del gen en el fenotipo, es fundamental caracterizar a un mutante nulo.Cuando una mutacion no afecta al fenotipo, siempre cabe la posibilidad de que se trate de una mutacion rezumante, es decir, se produce una cantidadsuficiente de producto activo para que cumpla consu funcion, aunque la actividad se reduce cuantitativamente 0 es cualitativamente diferente del tiposilvestre. Sin embargo, si una mutacion nula noafecta al fenotipo, se puede conduir con toda seguridad que la funcion del gen no es necesaria.
tipo silvestre
mutante 2
~~ mutantedoble
t tVVVV VVifV Un gen es de\1' I'",/V VVVV tipo silvestre
~ ~ Fenotipo silvestre
~ ~ tiposilvestremutante 2
tipo silvestre
mutante 1
mutante 1
MUTACIONES EN GENES DIFERENTES (configuraci6n trans)
~VVVVVVVV
~
Sin complementaci6nFenotipo mutante
Complementaci6n(fenotipo silvestre)
Una copia de cadagen es de tipo silvestre
26 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas
Concepto principal
• La existencia de aLeLos muLtiples permite que los heterocigotosrepresenten cuaLquier combinaci6n en pares de aLeLos.
Un locus puede tener numerososalelos mutantes diferentes
Si se produce una mutacion recesiva por cada cambioque impide la produccion de una protefna activa enun gen, debe haber gran numero de dichas mutaciones en cualquier gen. Numerosos remplazos de aminoacidos pueden cambiar la estructura de la proteina10 suficiente como para impedir su funcion.
Las diferentes variantes del mismo gen se llaman alelos multiples, y su existencia permite lacreacion de un heterocigoto entre alelos mutantes.La relacion entre estos alelos multiples asume diversas farmas.
En el caso mas sencillo, un gen de tipo silvestrecodifica a un producto proteinico funciona!. EI alelomutante, 0 los alelos mutantes, codifica(n) proteinas que no son funcionales.
Sin embargo, con frecuencia se presentan casosen que una serie de alelos mutantes tiene fenotiposdiferentes. Por ejemplo, la funcion de tipo silvestre dellocus blanco de la Drosophila melanogaster es necesariapara el desarrollo del color rojo normal de los ojos. EIlocus recibe su nombre segun el efecto de mutaciones(nulas) extremas, las cuales provocan que la moscatenga ojos blancos en homocigotos mutantes.
Para describir a los alelos mutantes y a los de tiposilvestre, el genotipo silvestre se indica mediante unsuperindice "mas" (+) despues del nombre del locus(w es el alelo silvestre para los ojos [rojos] de la D.melanogaster). En algunos casos se utiliza el simbolo+ para describir el alelo de tipo silvestre, y solo losalelos mutantes se indican con el nombre del locus.
Una forma completamente defectuosa del gen (0ausencia de fenotipo) suele indicarse mediante un superindice "menos" (-). Para poder distinguir entre unavariedad de alelos mutantes con efeetos diferentes,pueden utilizarse on'os superindices, como Wi 0 wa.
El alelo w es dominante respecto de cualquieraotro en los heterocigotos. Hay muchos aIelos mutantes diferentes; una muestra (pequefia) se ilustra enla
GURA 2 5. Si bien algunos alelos carecen de color deojos, muchos otros producen algllD color, de modoque cada uno de estos alelos mutantes representarauna mutacion diferente del gen, la cual no eliminapor completo su funcian, sino que deja una actividadresidual que produce un fenotipo caracteristico. Enun homocigoto, estos aielos son denominados por elcolor de los ojos. (La mayoria de los alelos wafectanla cantidad de pigmento del ojo. Los ejemplos de lafigura estan organizados [mas 0 menos] en ordendescendente de cantidad de color, pero otros, comoel w SP, afectan el patron en el cual es depositado.)
Cuando existen muchos alelos, un animal puede ser un heterocigoto que porte dos alelos mutantesdiferentes, y su fenotipo dependera de la naturalezade la actividad residual de cada alelo. En principio,la relacion entre dos alelos mutantes no difiere de laque se observa entre los alelos mutantes y los de
Una mutaci6n puntualpuede dafiar la funci6n
~Y/
!
•Una mutaci6n puntual puedecrear una nueva funci6n
WJW\.YAU~.,
Una mutaci6n nula noproduce protefnas
WJW\.'YAU
!
Una mutaci6n silenciosano afecta a la proteina
WJ\U\1lJ\U
!~
EI gen de tipo silvestre codifica a una protefna
'WA.YM7\JU~
~
FIGURA 2.' Las mutaciones que no afectan a la secuencia 0
a La funci6n de La proteina son siLenciosas, en tanto que lasmutaciones que eLiminan toda La actividad de la proteina sonnulas. Las mutaciones puntuales que provocan perdida de lafuncion son recesivas, a diferencia de las que provocan ganancia de la funcion, que son dominantes.
Las mutaciones nulas, u otras mutaciones queimpiden la funcion del gen (pero que no necesariamente la eliminan por completo) se denominanmutaciones de perdida de funcion (0 amorfas).Una mutacion de perdida de funcion es recesiva(como en el ejemplo de la Figura 2.2). En ocasiones,una mutacion tiene el efeeto opuesto y provoca queuna proteina adquiera una nueva funcion; dichocambio es conocido como mutacion de gananciade funcion, la cual es dominante.
No todas las mutaciones del DNA provocancambios detectables en el fenotipo; aquellas sin unefecto aparente se conocen como mutaciones silenciosas, las cuales pueden ser de dos tipos; unode eUos implica cambios de bases en el DNA queno provocan ningllD cambio en el aminoacido de laproteina correspondiente, en tanto que el segundo,cambia al aminoacido, perc el remplazo en la proteina no afecta a su actividad; a estas sustitucionesse les llama neutrales.
2.5 Un locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes 27
transferasa A
'-Yi\.W\."VJ\:.Y/gen A
Gal~1-R2 Delecion 2J. cambios de aminoacidos
FJ.1 antigeno 0
uca. gen B
'-'YA.YA.YlVUtransferasa B
Gala.1
. ~: ~ antigeno B ~al~1-R
iFuca.1
Alelo Fenotipo del homocigoto
w+ ojos rojos (fenotipo silvestre)Wbl sangre~h cerezawbf gamuzawh mielwe albaricoquewe eosinawi marfilWZ cascara de limon (amarillo limon)If'fP moteado, el color variaw1 blanco (sin color)
Ellocus w tiene una serie extensa de alelos cuyosfenotipos van del color de tipo silvestre (rojo) a la ausenciatotal de pigmento.
tipo silvestre: un alelo puede ser dominante, puedehaber dominancia parcial, 0 codominancia.
..................GaiNAca1
J,.
antfgenoA aa'~1-R2i
Fuca.1
t
III Un locus puede tener masde un alelo de tipo silvestre
Fenotipo
oABAB
Genotipo
00AOoAABOo BBAB
Actividad
NingunaN-Ac-gal transferasaGal transferasaGaIN-Ac-Gal-transferasa
Concepto principal
• Un locus puede tener una distribuci6n polim6rfica dealelos sin un alelo individual que pueda ser consideradocomo el unico de tipo silvestre.
No necesariamente hay un solo tipo de alelo silvestre en un locus especffico, por ejemplo, el controldel sistema del grupo sangufneo. La falta de funcion es representada por el tipo nulo, 0 grupo O. Noobstante, los alelos funcionales A y B proporcionanactividades codominantes entre sf y dominantesrespecto del grupo O. Las bases de esta relacion seilustran en la F G A 2 6.
El antfgeno 0 (0 H) se genera en todos los individuos. y consiste de un grupo carbohidrato particularque se agrega a las protefnas. Ellocus ABO codificaa una enzima galactosil-transferasa que agrega otrogrupo de azucar al antfgeno O. La especificidad deesta enzima determina el grupo sangufneo. EI alelo Ada lugar a una enzima que utiliza el cofactor UDP-Nacetilgalactosa y crea el antfgeno A. EI alelo B produce una enzima que utiliza el cofactor UDP-galactosay crea el antfgeno B. Las versiones A y B de la protefna transferasa difieren en matro aminoacidos quepresumiblemente afectan su reconocimiento del tipode cofactor. El alelo 0 tiene una mutacion (delecionpequefia) que elimina la actividad, de modo que enel antfgeno 0 no hay modificaciones.
Esto explica porque los alelos A y B son dominantes en los heterocigotos AO y BO: la actividad
28 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas
FIGURA 2.6 El locus del grupo sanguineo ABO codifica a lagalactosiltransferasa cuya especificidad determina el gruposanguineo.
transferasa correspondiente crea el antfgeno A 0 elB. Los alelos A y B son codominantes en los heterocigotos AB debido a que ambas actividades transferasa estan expresadas. EI homocigoto 00 es nuloy no tiene ninguna actividad, por 10 tanto, carecede ambos antfgenos.
Ni A ni B pueden ser considerados unicamentecomo de tipo siJvestre porque representan actividadesalternativas, mas que perdida 0 ganancia de funcion.Una situacion como esta, en la que hay multiples alelos funcionales en una poblacion, se describe comopolimorfismo (vease la seccion 4.3, Los genomasill.dividuales muestran una variacion extensa).
III La recombinaci6n ocurrepor intercambio fisico de DNA
Conceptos principales
• La recombinaci6n es resultado del entrecruzamiento
en los quiasmas e involucra a dos de las cuatrocromatidas.
• La recombinaci6n ocurre por rompimiento y reuni6n,que tienen lugar a traves de un intermediario de DNA
hibrido.
Recombinaci6n intermedia
Moleculas de DNA progenitor
. ...A BA B
a ba b
~AA
aa
::1 quiasma~s provocado porantrecruzamiento entre dos.e las cromatidas
Dos cromosomas siguen siendoos progenitores (AB y ab).-os cromosomas recombinantes ~~~~~~~~contienen material de cadaorogenitor y tienen nuevas ~ ~~~~~~~ombinaciones geneticas (Ab yaB).
_ bivalente:ontiene 4 cromatidas,2: de cada progenitor
r J A 2" La formaci6n del quiasma es responsable de la-roducci6n de recombinantes.
=-a recombinacion genetica describe la generacionde combinaciones nuevas de alelos en cada gene::-acion de organismos diploides. Las dos copias de(ada cromosoma pueden tener diferentes alelos enalgunos loci. Intercambiando las partes correspondientes entre los cromosomas. se pueden generarcromosomas recombinantes diferentes de los cromosomas progenitores.
La recombinacion resulta de un intercambio fiico de material cromosomico. fenomeno visible en
el entrecruzarniento que ocurre durante la meiosisdivision especializada por la que se producen las ce
luJas gerrninales haploides). La meiosis empieza conuna celula que ha duplicado sus cromosomas, de talforma que posee cuatro copias de cada uno. En lasprimeras etapas de la meiosis, esas cuatro copias estanfntimamente relacionadas (en sinapsis) en una estructura llamada bivalente. En esta etapa. cada unidadcromosornica se denomina cromatida. Los intercambios en pares de material ocurren entre cromaridas.
EI resultado visible de un evento de entrecruzarniento se denomina quiasma, y se Hustra a manerade diagrama en la u . Un quiasma es un sitioen el que dos de las cromatidas de un bivalente sehan rota en los puntos correspondientes. Los extremos rotos se han reunido de forma entrecruzada, generando nuevas cromatidas. Cada cromatida nuevaesta formada por material proveniente de una cromatida de un lado del punto de union y por materialproveniente de la otra cromatida en ellado opuesto.Las dos cromaridas recombinantes poseen estructurasrecfprocas. El evento se define como rotura y reunion. Su naturaleza explica porque un solo eventode recombinacion puede producir solo el 50% de recombinantes: cada evento de recombinacion involucra solo dos de las cuatro cromaridas asociadas.
Recombinantes
La recombinaci6n implica el apareamiento entre lascadenas complementarias de dos dOplex de DNA progenitores.
La complementariedad de las dos cadenas deDNA es esencial para el proceso de recombinacion.Cada una de las cromaridas que se muestran enla Figura 2.7 consiste en un larguisimo duplex deDNA. Para que estas se rompan y reconecten sinperdida de material. se requiere de un mecanismoque reconozca exactamente las posiciones correspondientes, 10 cual sucede gracias al apareamientocomplementario de bases.
La recombinacion implica un proceso en el cuallas cadenas individuales de la region de entrecruzamiento intercambian parejas. En la semuestra que este evento da lugar a un fragmentode DNA hibrido, en el cualla cadena individualde un duplex se aparea con su complemento proveniente del otro duplex. Por supuesto. el mecanismoinvolucra otras etapas (las cadenas deben rompersey resellarse) que se analizaran en detalle en el Capitulo 20. Sistemas de reparacion. pero la caracteristicacrucial que hace posible ]a recombinacion exacta esla complementariedad de las cadenas de DNA. Lafigura muestra solo algunas etapas de la reaccion.pero podemos observar que en ]a recombinacionintermedia se forma un fragmento de DNA hfbridocuando una sola cadena cruza de un duplex a otro.Cada recombinante esta formado por un duplex deDNA progenitor dellado izquierdo, el cual esta conectado por un fragmento de DNA hfbrido a] otroduplex progenitor dellado derecho. Cada duplex de
2.7 La recombinaci6n ocurre por intercambio fisico de DNA 29
DNA corresponde a una de las cromatidas implicadasen el proceso de recombinacion de la Figura 2.7.
La formacion del DNA hfbrido exige que las secuencias de los duplex recombinantes se encuentren10 suficientemente cerca como para lograr el apareamiento entre las cadenas complementarias. Si no haydiferencias entre los dos genomas progenitores enesta region, la formacion de DNA hfbrido sera perfecta. Sin embargo, la reaccion puede ser tolerada auncuando haya diferencias diminutas, en cuyo caso, elDNA hfbrido tiene puntos de apareamiento erroneo,en los cuales una base de una cadena confronta a unabase de la otra cadena que no es complementaria.La correccion de dichos errores de apareamiento esotra caracteristica de la recombinacion genetica (vease Capitulo 20, Sistemas de reparacion).
III El c6digo genetico se leeen tripletes
Conceptos principales
• El c6digo genetico se lee en tripletes de nucle6tidosdenominados codones.
• Los tripletes no estan superpuestos y se leen a partirde un punta fijo de inicio.
• Las mutaciones que insertan 0 eliminan basesindividuales provocan un cambio en los grupas detripletes despues del sitio de la mutaci6n.
• Las combinaciones de mutaciones que insertan 0
eliminan a tres bases en conjunto (0 en multiplosde tres) insertan 0 eliminan aminoacidos, pero nocambian la lectura de los tripletes mas alla del ultimositio de mutaci6n.
Cada gen representa una cadena proteinica especffica. El concepto de que cada protefna esta formadapar una serie de aminoacidos en particular, data de lacaracterizacion de Sanger de la insulina, de la decadade 1950. El descubrimiento de que un gen esta formado par DNA dio lugar a la interrogante de comouna secuencia de nucleotidos del DNA representa una secuencia de aminoacidos en las protefnas.
Una caracteristica clave de la estructura generaldel DNA es que es independiente de la secuencia particular de los nucleatidos que la componen. La secuenciade nucleotidos del DNA es importante no por suestructura per se, sino porque codifica a la secuenciade aminoacidos que constituye al polipeptido correspondiente. La relacion entre una secuencia deDNA y la secuencia de la protefna correspondientese denomina codigo genetico.
La estructura y la actividad enzimatica de lasproteinas se deben a su secuencia primaria de aminoacidos, que al ser determinada en cada una, elgen puede transportar toda la informacion necesaria para especificar una cadena polipeptidica aeti-
30 CAPITULO 2 Los genes cadifican proteinas
va. De esta manera, un solo tipo de estructura -elgen- es susceptible de representarse a sf mismo eninnumerables formas de polipeptidos.
En conjunto, los diversos productos proteinicosde una celula asumen las actividades catalfticas yestructurales responsables de establecer su fenotipo. Obviamente, ademas de las secuencias que codifican a las protefnas, el DNA tambien contieneciertas secuencias cuya funcion es ser reconocidaspor moleculas reguladoras, usualmente proteinas.En este caso, la funcion del DNA es determinadadirectamente por su secuencia, no a traves de uncodigo intermediario. Ambos tipos de region, losgenes expresados como protefnas y las secuenciasreconocidas como tales, constituyen la informaciongenetica.
El codigo genetico es descifrado por un mecanismo complejo que interpreta las secuencias de losacidos nucleicos, el cual es esencial si la informaciontransportada en el DNA tiene que tener algun significado. En una region dada, solo una de las dos cadenas de DNA codifica a una protefna, por 10 tanto,el codigo genetico se representa como una secuencia de bases (mas que como pares de bases).
El codigo genetico se lee en grupos de tres nucleotidos, cada uno de los cuales representa a unaminoacido; cada secuencia de tres nucleotidos sedenomina codon. Un gen incluye una serie de codones que se lee de forma secuencial desde un punto de partida de un extremo hasta un punto final, enel otro extremo. Escrita en la direccion convencional 5' a 3', la secuencia de nucleotidos de la cadenade DNA que codifica a la proteina corresponde a lasecuencia de aminoacidos de la proteina escrita determinal N hasta terminal C.
El codigo genetico se lee en tripletes no superpuestos a partir de un punto fijo de inicio:
• No superpuestos implica que cada codonesta formado par tres nucleotidos y que loscodones sucesivos estan representados portrinucleotidos sucesivos.
• El uso de un punta fijo de iniciacian significaque el ensamblaje de una proteina debe comenzar en un extremo y avanzar hacia elotro, de manera que las diferentes partesde la secuencia codificadora no puedan serlefdas de manera independiente.
La naturaleza del codigo pronostica que dos tipos demutaciones tendran efeetos cliJerentes. Si una secuencia en particular se lee de forma secuencial como:
UUU AAA GGG CCC (codones)aa1 aa2 aa3 aa4 (aminoacidos)
entonces una mutacion puntual afectara. solo a unaminoacido. Por ejemplo, la sustitucion de una Apor cualquier otra base (X) provoca que aa2 searemplazado por aa5:
Mutante doble C- ~:=:J GCU GCU AGC UGC UGC UCU GCU GCUrz:
A a la Ser Cys Cys Ser Ala Ala
Mutante triple C- C- C-:=:J GCU GCA UGC UGC AUG CAU GCU GCUC
Ala Ala Cys Cys Met His Ala Ala
UUU AAX GGG CCC
aal aa5 aa3 aa4
porque solo el segundo codon ha sufrido cambios.Sin embargo, una mutaci6n que inserta 0 elimina
una sola base cambiara a los grupos de tripletes de toda lasecuencia subsiguiente. Un cambio de este tipo se llama desplazantiento del marco de lectura. Unainsercion puede asumir la siguiente forma:
UUU AAX AGG GCC Caal aa5 aa6 aa7
Debido a que la nueva secuencia de tripleteses completamente diferente a la antigua, la secuenciacompleta de aminoclcidos de la protefna se modificaa partir del sitio de la mutacion, de modo que esprobable que la funcion de la protefna se pierda porcompleto. Las mutaciones de cambio del marco delectura son inducidas por las acridinas, compuestosque se unen al DNA y que distorsionan la estructura de la doble helice, provocando la incorporacionde bases adicionales 0 la omision de bases duranteel proceso de replicacion. Cada evento mutagenicoprovocado por una acridina resuIta en la adicion 0
eliminacion de un solo par de bases.Si se produce un mutante de acridina por, diga
mos, la adici6n de un nucleotido, este debe regresaral tipo silvestre por la delecion de dicho nucleotido.Sin embargo, la reversion tambien puede ser provocada por delecion de una base diferente en un sitiocercano al primero. Las combinaciones de dichas
Concepto principal
• En general, solo un marco de lectura es traducido, los OtTOSdos son bloqueados por senales frecuentes de terminacion.
mutaciones proporcionan evidencias reveladorasreferentes a la naturaleza del codigo genetico.
En la se ilustran las propiedades delas mutaciones de cambio del marco de lectura. Unainsercion 0 una delecion cambia la secuencia completa de la protefna despues del sitio de la mutacion,pero la combinacion de una insercion y una delecionhace que el codigo se lea de forma incorrecta soloentre los dos sitios de mutacion; la lectura correctase restablece despues del segundo sitio.
En 1961, mediante el analisis genetico de las mutaciones por acridina en la region rII del fago T6 sedemostro que todas las mutaciones podrian ser clasificadas en uno de dos grupos descritos como (+) 0
(-). Cada tipo de mutacion provoca por sf misma uncambio en el marco de lectura: el tipo (+) por adicionde una base y el tipo (-) por delecion de una base. Lascombinaciones de mutantes dobles de los tipos (++) Y(- -) siguen mostrando un comportamiento mutante, pero las combinaciones de los tipos (+ -) 0 (- +)
se suprimen una a la otra. En este caso, la segundamutacion se describe como supresora del cambioen el marco de lectura de la primera mutacion.(En el contexto de este trabajo, la palabra "supresOI"se utiliza en un sentido inusual porque la segundamutacion esta en el mismo gen que la primera.)
Estos resultados muestran que el codigo geneticodebe ser lefdo como una secuencia establecida pOI elpunto de iniciacion, de modo que las adiciones 0 lasdeleciones se compensan mutuamente, mientras quelas adiciones 0 las deleciones dobles siguen siendomutantes. De cualquier forma, estos hallazgos no revelan cuantos nucleotidos constituyen cada codon.
Cuando se construyen mutantes triples, solo lascombinaciones (+++) y (- - -) muestran el fenotipo silvestre, mientras que las otras siguen siendomutantes. Si se considera que tres adiciones 0 tresdeleciones corresponden respectivamente a la adicion 0 la omision global de un solo aminoacido, estoimplica que el codigo se lee en tripletes. Entre losdos sitios de mutacion hay una secuencia incorrectade aminoacidos, mientras que a cada lado de lossitios de mutacion las secuencias siguen siendo detipo silvestre, como se indica en la Figura 2.9.
III (ada secuencia tiene tresmarcos de lectura posibles
Secuencia mutanteSecuencia de tipo silvestre
Las mutaciones de cambia del marco de lecturamuestran que el codigo genetico se lee en tripletes desde unpunta fijo de inicio.
Si el codigo genetico se lee en tripletes no superpuestos, son tres las formas posibles de traducir cualquier
2.9 (ada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles 31
secuencia de nucleotidos en protefnas, dependiendodel punto de iniciacion; a dichas secuencias se lesllama marcos de lectura. Para la secuencia
ACGACGACGACGACGACG
los tres marcos de lectura posibles son
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACGCGACGACGACGACGACGACGAGAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC
Los genes procari6ticos soncoLineales can sus protelnas
Conceptos principales
• Un gen procari6tico es un fragmento constante de 3Nnucle6tidos que codifica a N aminoacidos.
• El gen, el RNAm y la protelna son todos colineales.
J Un marco de lectura abierto empieza con AUG y continuaen tripletes hasta un cod6n de terminaci6n. Los marcos de lecturabloqueados pueden ser interrumpidos con frecuencia por codones determinaci6n.
Un marco de lectura que consta exclusivamentede tripletes que representan a aminoacidos, se llamamarco de lectura abierto u 0 RF (open reading frame). Una secuencia que se traduce en una protefnatiene un marco de lectura que empieza con un codon de iniciacion especial (AUG) y que posteriormente se extiende a traves de una serie de tripletesque represeman a aminoacidos, hasta terminar enuno de los tres tipos de codones de terminacion(vease el Capftulo 7, El RNA mensajero).
Cuando un marco de lectura no puede ser traducido en protefna porque con frecuencia se preseman codones de terminacion, se dice que establoqueado. Si una secuencia esta bloqueada en lostres marcos de lectura, no puede tener la funcion decodificar a una protefna.
Cuando se obtiene la secuencia de una region deDNA de funcion desconocida, se analiza cada marcode leetura posible para determinar si esta abierto 0
bloqueado. Normalmente, no mas de uno de los tresmarcos de lectura posibles esta abierto en un solofragmento de DNA. En la r se muestra elejemplo de una secuencia que puede leerse en soloun marco de lectura debido a que los marcos de lectura alternativos estan bloqueados por codones determinacion frecuentes. Es poco probable que porcasualidad exista un marco de lectura largo y abierto; si no se tradujera en una protefna, no habrfa presion selectiva para evitar la acumulacion de codonesde terminacion, de modo que la identificacion de unmarco de lectura largo y abierto se considera comoevidencia en primera instancia de que la secuencia setraduce en proteina en dicho marco. Un ORF parael cual no se ha identificado un producto protefnicosuele denominarse marco de lectura no identificado(URF, unidentified reading frame).
EI segundo marco de lecturaesta bloqueado
EI tercer marco de lecturaesta bloqueado
Comparando la secuencia de nucleotidos de un gencon la secuencia de aminoacidos de una protefna,podemos determinar directamente si el gen y laprotefna son colineales; esto es, si la secuencia denucleotidos del gen corresponde exactamente a lasecuencia de aminoacidos de la protefna. En las bacterias y sus virus hay una equivalencia exacta, cadagen contiene un fragmento continuo de DNA cuyalongitud es directamente proporcional al numero deaminoacidos de la protefna que representa. Es necesario un gen de 3N pares de bases (bp, base pairs)para codificar una protefna de N aminoacidos, deacuerdo con el codigo genetico.
La equivalencia del gen bacteriano y su producto significa que un mapa ffsico de DNA corresponded exactamente a un mapa de aminoacidos de laprotefna. (,Que tan bien se acoplan estos mapas conel mapa de recombinacion?
El paralelismo del gen y la protefna se investigooriginalmente en el gen de la triptofano sintetasade E. coli. La distancia genetica se valoro a traves delporcentaje de recombinacion entre mutaciones, entanto que la distancia de la protefna se midio pormedio del numero de aminoacidos que separaban alos sitios de remplazo. En la l se comparanambos mapas. El orden de siete sitios de mutacion esel mismo que el orden de los sitios correspondienteS a los remplazos de aminoacidos, y las distanciasde recombinacion son relativamente similares a lasdistancias reales de la proteina. El mapa de recombinacion amplfa las distancias entre algunas mutaciones, pero por 10 demas, la distorsion del mapa derecombinacion es escasa, respecto del mapa fisico.
El mapa de recombinacion hace ver dos puntosgenerales acerca de la organizacion del gen. Mutaciones diferentes pueden provocar que un aminoacido de tipo silvestre sea remplazado por sustitutosdiferentes. Si dos de estas mutaciones no puedenrecombinarse, deben involucrar mutaciones puntuales diferentes en la misma posicion del DNA. Silas mutaciones pueden separarse en el mapa genetico, pero afectan al mismo aminoacido en el mapasuperior (las lineas comunicantes convergen en lafigura) , deben implicar a mutaciones puntuales enposiciones diferentes que afectan al mismo aminoacido debido a que la unidad de recombinacion ge-
32 CAPiTULO 2 Los genes codifican protelnas
.. .. ~ . . . ... . .. ~ ~ ... . .. - . .-. ~,
Conceptos principales
netica (en realidad 1 bp) es mas pequena que la unidad que codifica al aminoacido (en realidad 3 bp).
IGUR El mapa de recombinacion del gen de la tripto-fano sintetasa corresponde a la secuencia de aminoacidos dela proteina.
EI DNA esta formado par dos cadenas apareadas por medio de bases
cadena superior5' ATGCCGTIAGACCGTIAGCGGACCTGAC3' TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
tcadena inferior
Sfntesisde RNA
5'AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC3
EI RNA tiene la misma secuencia que la cadena superior de DNA;es complementaria a la cadena inferior de DNA
El RNA se sintetiza utilizando una cadena de DNAcomo molde para el apareamiento complementario de las bases.
mente, para sintetizar protefna (como se 0 bservaen detalle en el Capftulo 7, El RNA mensajero).
El RNA mensajero se sintetiza por el mismoproceso de apareamiento complementario de basesutilizado para replicar el DNA, con la importantediferencia de que corresponde solo a una cadena delDNA de doble helice. En la se muestraque la secuencia del RNAm es complementaria dela secuencia de una cadena de DNA y que es ictentica (excepto por el remplazo de T por U) ala otracadena de DNA. La forma convencional de escribirlas secuencias del DNA implica que la cadena dearriba vaya en direccion 5'~ 3', con la secuenciaigual a la del R A.
El proceso por el cual un gen da lugar a unaprotefna se llama expresion genica, que en lasbacterias consta de dos etapas. La primera etapaes la transcripcion, durante la cual se produceuna copia de RNAm de una cadena del DNA, entanto que la segunda es la traduccion del RNAmen una protefna. Mediante este proceso se lee entripletes la secuencia de un RNAm para originarla serie de aminoacidos que crea a la protefna correspondiente.
Un RNAm incluye a una secuencia de nucleotidos que corresponde ala secuencia de aminoacidos de la protefna; esta parte del acido nucleico seconoce como region codificadora. Sin embargo,el RNAm incluye secuencias adicionales en ambosextremos, las cuales no representan directamentea una protefna. La region 5' no traducida se llamalider, en tanto que a 1a region 3' no traducida se 1econoce como remolque.
El gen incluye la secuencia completa representada en el RNA mensajero. Ocasionalmente, lasmutaciones que impiden la funcion del gen se encuentran en las regiones adicionales no codificadoras, con 10 cual se confirma la perspectiva de quedichas regiones comprenden una parte legftima dela unidad genetica.
Las mutaciones puedenestar separadas, perc afectana la misma posicion
Glu Proteina
@@! @)
I II I
Ty.: r :: :QII II I~
: de tipo silvestre :: : :: ::I 111 I' IIt Mapa de a.miriOacido " 'e la 'rotina
1 : i I : I ~\
: ,': : ~: ~\:-Distancia entre ml.ltacion~s ---i\\I II' 'II 1\\
~Mapader~(;ombin "iO' de": '"
I II I III
'@111111V Proteina mutante Cis: II :: v
I I II, "
GI Ar :,
Mutaciones diferentesen la misma posicion
• Un gen procariotico se expresa por transcripcion enRNAm y posteriormente por traduccion del RNAm en
una proteina.
• En las eucariotas, un gen puede contener regionesinternas no representadas en la proteina.
• Las regiones internas son eliminadas del transcrito deRNA por el corte y empalme de este para dar origen a
un RNAm colineal respecto del producto proteinico.
• Cada RNAm esta formado par una region lider 5'no traducida, una region codificadora y una regionposterior 3' no traducida.
Al comparar un gen y una protefna se trata solocon la secuencia de DNA ubicada entre los puntoscorrespondientes a los extremos de la protefna. Sinembargo, un gen no se traduce directamente a unaprotefna, se expresa mediante la produccion de unRNA mensajero (RNAm, messenger RNA), que esun acido nucleico intermedio utilizado, efectiva-
fill Numerosos procesos sonnecesarios para expresar elproducto proteinico de un gen
2.11 Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteinico de un gen 33
RNAm
.. ~ ..Ex6N 1 Ex6N 2
~INTR6NI\) ¥/
!
RNAl
5' V. /\. 3'
f Ribosoma
\ (TradUCCion )
~
. ... .
DNA
CITOPLASMA
La expresi6n de un gen es un proceso que sucedeen multiples etapas.
NUCLEO
5' ~~INTR6NVV 3'
pre-RNAm
l1NTR6N r~ (--c-or-te-y-e-m-p-al--':'m-e)
5'~ ~
Protefna
.. -:. .
Transcripcion
Traduccion
RNA
-- EI ribosoma traduce al RNAm
DNA
Region Ifder ~ Remolque5'V V 3' RNA
I I I
La longitud del RNA define a la region del gen
~N~C Proteina
I I I
La proteina define a la region codlficadora
El gen puede ser mas largo que la secuencia quecodifica a la proteina.
En las bacterias, la transcripci6n y la traducci6n ocurrenen el mismo compartimiento.
En la se ilustra esta situacion, en lacual se considera que el gen comprende un fragmento continuo de DNA necesario para produciruna proteina en particular; incluye la secuenciacodificadora para dicha proteina, pero tambien secuencias a ambos lados de la region codificadora.
Una bacteria esta formada por un solo compartimiento, de modo que la transcripcion y la traduccion ocurren en el mismo lugar, como se Hustra enla . En las eucariotas, la transcripci6ntiene lugar en el nucleo, no obstante, el productode RNA debe ser transportado al citoplasma para sertraducido. En los genes mas simples de las eucariotas (igual que en las bacterias), el RNA transcritoes de hecho el RNAm. Sin embargo, para los genesmas complej os, el transcrito inmediato del gen esel pre-RNAm, que requiere de cierto procesamiento para generar al RNArn maduro. Las etapasbasicas de la expresion genica de una eucariota sebosquejan en la Este proceso resulta en
una separaci6n espacial entre la transcripci6n (en elnucleo) y la traduccion (en el citoplasma).
La etapa mas importante del procesarniento es elcorte y empalme del RNA. Numerasos genes de laseucariotas (y casi todos los de las eucariotas superiores) contienen regiones internas que no codifican proteinas. En el proceso de corte y empalme se eliminanestas regiones del pre-RNArn para generar un RNAcon un marco de lectura abierto y continuo (vease laFigura 3.1). Otras eventos procesadores que ocurrenen esta etapa implican la modificaci6n de los extremos5' y 3' del pre-RNAm (vease la Figura 7.16).
La traducci6n tiene lugar mediante un complejomecanismo que incluye tanto protefnas como componentes de RNA. La "maquina" que se encarga delproceso es el ribosoma, un gran complejo que incluyealgunas moleculas extensas de RNA (RNA ribos6mico,o RNAr) y numerosas proteinas pequefias. El procesopor el cual se reconoce que arninoacido correspondea un triplete de nucle6tidos en particular implica unRNA de transferencia intermedio (0 RNAt); hay cuando menos una especie de RNAt para cada aminoacido. Numerosas proteinas accesorias estan implicadas.La traducci6n se describe en el Capitulo 7, El RNA
34 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas
mensajero, pero considerese por ahora que los ribosomas son las grandes estructuras que se mueven a10 largo del RNAm en la Figura 2.14.
El punto impartante de esta etapa es que el proceso de la expresion genica implica al RNA no solocomo sustrato esencial, tambien como proveedorde componentes para el mecanismo. Los componentes RNAr y RNAt son codificados por genes ygenerados par el proceso de transcripcion (como elRNAm, excepto que no hay una etapa de traduccionsubsiguiente) .
fill Las protelnas actCtan en trans,pero los sitios deL DNA, en cis
Conceptos principales
• Todos los productos de los genes (RNA 0 proteinas)actuan en trans; pueden actuar en cualquier copia deun gen de la celula.
• Las mutaciones de actuacion en cis identificana las secuencias de DNA que son el objetivo dereconocimiento de los productos de actuacion en trans.No se expresan como RNA ni como proteinas, y afectansolo al fragmento contiguo de DNA.
Una etapa clave para la definicion del gen hle eldescubrimiento de que todas sus partes deben estarpresentes en un fragmento contiguo de DNA. En laterminologfa genetica, se dice que la configuracionde los sitios localizados en el mismo DNA esta en cis,mientras que de la configuracion de los localizadosen dos moleculas diferentes de DNA, se dice queesta en trans, de modo que dos mutaciones puedenpresentarse en cis (en el mismo DNA) 0 en trans (enmoleeulas diferentes de DNA). La prueba de complementacion recune a este concepto para determinar si dos mutaeiones estan en el mismo gen (veasela Figura 2.3 de la Seccion 2.3. Las mutaciones quese presentan en el mismo gen no se pueden complementar), y ahora podemos ampliar el concepto dela diferencia entre los efectos eis y trans de la definicion de la region codificadora de un gen a ladescripcion de la interaccion entre los elementosreguladores y un gen.
Supongamos que la capacidad de un gen paraser expresado depende de una protefna que se uneal DNA eerca de la region codificadora. En el ejemplo representado en la 1 u , 2 1 , el RNAm puedeser sintetizado solo cuando la protefna esta unida alDNA, pero sup6ngase que en la secuencia del DNAenla cual se une esta protefna ocune una mutaciony la protefna ya no reconoce al DNA: el DNA ya nopodrfa expresarse.
Par 10 tanto, un gen puede ser desaetivado tanto paruna mutaci6n en un sitio de control, como par una mutaci6nen una region codijicadora. Las mutaciones no pueden
~~"'~;;'-",Lasproteinas se unen a los sitiosi~~': _~' '" de control de actuacion en cis
"J Sifo:ae control Regi6n codificadora UNA
~Dos tipos de ! EI RNAsecuencias de DNA se sintetiza
RNA
Los sitos de control del DNA proporcionan sitiosde union para proteinas; las regiones codificadoras se expresana traves de la sintesis de RNA.
Ambos alelos sintetizan RNA en el tipo silvestre
La mutaci6n en el sitio de control afecta s610 al DNA contiguo
Mutaci6n
I
NO HAY SINTESIS DE RNA MEDIADA POR EL ALELO 1
La sintesis de RNA Icontinua a partir del alelo 2 ~
I Un sitio de actuacion en cis controla al DNAadyacente, perc no influye en el otro alelo.
distinguirse geneticamente parque ambos tienen lapropiedad de actuar solo en la secuencia del DNA delalelo individual en el cual oeunen, sus propiedadesson identicas en la prueba de complementacion, demodo que una mutacion en una region de controlse define como parte integrante del gen, de la mismaforma que una mutacion en la region codificadara.
La muestra que una deficiencia enel sitio de control afecta solo a la region codificadora ala eual estd eometada; no afecta la capacidad del afro alelo
2.12 Las proteinas actuan en trans, pero los sitios del DNA, en cis 35
NO HAY SiNTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 1
La protefna activa actua en ambos alelos
gen (0 cistron) se transcribe en un producto deRNA, el cual a su vez es traducido en una secuencia polipeptfdica si el gen codifica a una proteina.Se dice que un RNA 0 un producto protefnico deun gen son de actuacion en trans. Un gen se definemediante la prueba de complementacion como unaunidad de un fragmento individual de DNA. Se diceque un sitio del DNA que regula la actividad de ungen adyacente es de actuacion en cis.
Cuando un gen codifica a una proteina, la relacion entre la secuencia de DNA y la secuencia dela protefna depende del codigo genetico: Solo unade las dos cadenas de DNA codifica a una proteina.Un codon esta formado por tres nucleotidos querepresentan un solo aminoacido. Una secuenciacodificadora de DNA consiste en una serie de codones, los cuales son leidos desde un punta fijode inicio. En general, solo uno de los tres marcosde lectura posibles puede ser traducido en proteinas.
Un gen puede tener multiples alelos; los recesivos son provocados por mutaciones de perdida defuncion que interfieren con la funcion de la proteina. Un alelo nulo tiene perdida total de la funcion.Los alelos dominantes son provocados por mutaciones de ganancia de funcion que crean una nuevapropiedad en la protefna,
!t(fU
!
NO HAY SfNTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 2
Q-protefna mutante
La protefna mutante no puede unirse a ninguno de los alelos
Una mutaci6n de actuaci6n en trans de una proteinaafecta a Los dos aLeLos del gen que controla.
para expresarse. Una mutacion que actua exclusivamente afectando las propiedades de la secuencia contigua del DNA se denomina de actuacion en cis.
El comportamiento de la mutacion de actuacion en cis que se muestra en la Figura 2.17 se puede comparar con el resultado de una mutacion enel gen que codifica a la protefna reguladora. En la
se muestra que la ausencia de protefnareguladora evitara que ambos alelos se expresen; sedice que una mutacion de este tipo es de actuacionen trans.
Revirtiendo el argumento, se sabe que si unamutacion es de actuacion en trans, su efecto debera ser ejercido a traves de algun producto difusible(tipicamente una proteina) que actue en multiplesdianas en una celula. Sin embargo, si una mutaciones de actuacion en cis, su funcion afectara directamente a las propiedades del DNA contiguo, 10 cualsignifica que no se expresa en laforma de RNA 0 de unaproteina.
l1li ResumenUn cromosoma es un fragmento ininterrumpido deDNA duplex que contiene numerosos genes. Cada
Referencias
III EL c6digo genHico se Lee en tripLetes
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36 CAPITU LO 2 Los genes codifica n protei nas
El replic6n
ESQUEMA DEL CAPITULO JIntroducci6n
Los replicones pueden ser lineales 0 circulares• Una regi6n repLicada aparece como un ojo dentro deL DNA
no replicado• En el origen inicia una horquiLLa de replicaci6n y despues
se desplaza de forma secuenciaL por eL DNA.• La repLicaci6n es unidireccional cuando se crea una sola
horquilla de replicaci6n en un origen.• La replicaci6n es bidireccional cuando un origen crea dos
horquillas de repLicaci6n que se despLazan en direccionesopuestas.
Es posible elaborar el mapa de los origenes conautorradiografia y electroforesis• El desplazamiento de la horquilla de replicaci6n puede
detectarse por medio de autorradiograna utiLizando pulsosradioactivos.
• Las horquillas de replicaci6n crean estructuras en forma deYque aLteran La migraci6n electroforetica de los fragmentosde DNA.
(Regula la metilaci6n del origen a la iniciaci6n?• ode contiene 11 repeticiones ~:T~ que estan metiladas en
la adenina en ambas cadenas A• La repLicaci6n produce DNA hemimetilado, eL cuaL es
incapaz de iniciar la replicaci6n.• Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticiones
GATe sean metiladas de nuevo.CTAG,
Los ongenes pueden ser secuestrados despues dela replicaci6n• SeqAse une al DNA hemimetilado y es necesaria para el
retraso de la replicaci6n.• SeqA puede interactuar con DnaA.• Puesto que Los origenes estan hemimetilados, se unen a la
membrana celuLar y en ocasiones no estan a disposici6n delas metiLasas.
• La naturaLeza de la conexi6n entre el origen y La membranaaun no es clara.
(ada cromosoma eucari6tico contiene numerososreplicones• Los repLicones eucari6ticos tienen una longitud de 40 a
100 kb.• Un cromosoma se divide en numerosos replicones.• Los replicones individuaLes se activan en momentos
caracteristicos durante la fase S.• Los patrones de activaci6n regional sugieren que los
replicones cercanos entre Sl son activados al mismotiempo.
376
En las levaduras pueden aislarse los origenes :=replicaci6n• Los origenes de S. cerevisiae son secuencias cortas ri ,
A-T que tienen una secuencia esencial de 11 bp.• El ORC es un complejo de seis proteinas que se une a _
ARS.
El factor de competencia controla la replicaci:eucari6tica• El factor de competencia es indispensable para La in·:-.=
de La replicaci6n en cada origen.• Esta presente en elnucleo antes de la replicaci6n, p~-:
desactivado 0 destruido por la replicaci6n.• La iniciaci6n de otro ciclo de replicaci6n es posibLe~:
despues de que eL factor de competencia entra de nL:'nucleo despues de la mitosis.
El factor de competencia esta formado porprote1oas MCM• El ORC es un complejo de proteinas que esta asociac:
origenes de las levaduras durante todo eL ciclo celu!.=.-• Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza s6Lo ,,-• Cdc6 se une al ORC y permite la uni6n de las proteir,o.:
MCM.• Cuando la repLicaci6n se inicia, las proteinas Cdc6 y
MCM son desplazadas. La degradaci6n de Cdc6 impic~
reiniciaci6n.• Algunas proteinas MCM se encuentran en eL nucleo e
eL ciclo, pero otras pueden entrar s6Lo despues de lcmitosis.
Los lazos 0 mantienen a los origenesmitocondriales• Las mitocondrias utilizan diferentes secuencias de c-
para iniciar la replicaci6n de cada cadena del DNA. -• La replicaci6n de La cadena Hinicia en un Lazo D.• La repLicaci6n de la cadena Linicia cuando su orige
expuesto por el movimiento de La primera horquilLa :"replicaci6n.
Resumen
Introducci6n- ~ c€lula tiene un solo cromosoma (como en las=:iotas) 0 varios (como en las eucariotas), el ge~ completo debe ser replicado precisamente una
...:::. cada clivision celular LDe que manera se vincu::pisoclio de la replicacion con el cido celular?== utilizan dos conceptos generales para com- el estado de replicacion con la condicion del:elular:• La iniciaci6n de la replicaci6n del DNA obliga a
la cilula (procari6tica 0 eucari6tica) a experimentar una divisi6n posterior. Desde este punto devista, el numero de descenclientes que generauna celula esta determinado por una serie dedecisiones en cuanto a iniciar 0 no la replicacion del DNA. Esta se controla en la etapade la iniciacion. Una vez que la replicaci6n hacomenzado, continua hasta que se haya duplicadoelgenoma completo.
• Si la replicacion prosigue, no se puede permitir que ocuna la division consiguientehasta que la replicacion haya sido completada. De hecho, la conclusion de la replicacion puede desencadenar la division celular. Despues, los genomas duplicados sonsegregados en cada celula hija. La unidad desegregacion es el cromosoma.
:::n las procariotas, la iniciacion de la replicacionepisodio inclividual que involucra a un sitio uni
== el cromosoma bacteriano. El proceso de la clivi~ logra mediante el desarrollo de un tabique que
~:: e la pared celular y que divide a la celula en=:n las celulas eucarioticas, la iniciacion de la re
...2:ion se identifica pOI el cornienzo de la fase S, un_do prolongado durante el cual ocurre la smtesis
=_ 'A Yque comprende numerosos episodios indies de iniciacion. La division se logra por la reor
:....::acion de la celula en la mitosis. En este capitulo~ rdara la regulacion de la replicacion del DNA.
_ =:10 inicia un cido de replicacion? LQUe controla:-ogreso y como se se11aliza su terminacion?:::"<1 unidad de DNA en la que tiene lugar un solode replica cion se denomina replicon. Cada reII "se activa" una sola vez, solo una, en cada cidoar. El replicon se define por poseer los elementos
_ ntrol necesarios para la replicacion. Tiene un~en en el cual se inicia la replicacion. Asimismo,_ 'e tener un termino en el cual se detiene la re.:3.cion.
Cualquier secuencia adherida a un origen 0,
=' rminos mas precisos, no separada de un ori== por un termino, se replica como parte de ese
·con. El origen es un sitio de actuacion en cis,- az de afectar solo a la molecula de DNA en la" reside.
(La concepcion original del replicon [en las procariotas] 10 visualizaba como una unidad que poseiael origen y el gen que codifica la protefna reguladora. Sin embargo, en la actualidad, en los eromosomas eucarioticos, el termino "replicon" se aplicaen general para describir una unidad de replicacionque contiene un origen; las protemas reguladoras deactuacion en trans pueden ser codificadas en cualquier otra parte.)
El genoma de una celula procariotica constituyeun solo repJicon; por 10 tanto, las unidades de repJicacion y de segregacion coinciden. La iniciacion enun solo origen promueve la repJicacion del genomacompleto, una vez en cada division celular. Cadabacteria haploide contiene un solo eromosoma, par10 que este tipo de control de repJicacion se denomina de una sola copia.
Las bacterias pueden contener mas informaciongenetica en la forma de plasmidos. Un plasmido esun genoma aut6nomo de DNA circular que constituye unreplic6n independiente (vease la Figura 14.2). El replican de un pl<ismido puede ser controlado por unasola copia, 10 que significa que se replica una solavez cada vez que se replica el cromosoma bacteriano, 0 puede estar bajo control de copias multiples, cuando esta presente en un numero de copiasmayor que el cromosoma bacteriano. Cada fago 0
DNA de los virus tambien constituye un replicony, por 10 tanto, es capaz de iniciar numerosas vecesdurante un ciclo infeccioso. Quiza una mejor manera de considerar un replicon procariotico, por 10tanto, sea invertir la definicion: cualquier molecula deDNA que contiene un origen puede ser replicada de formaaut6noma en la dlula.
En la replicacion se observa una diferencia fundamental en la organizacion de los genomas bacterianos y eucarioticos. Cada cromosoma eucarioticocontiene un gran numero de replicones; pOI 10 tanto, la unidad de segregacion induye muchas unidades de replicacion. Esto agrega otra dimension alproblema del control: todos los replicones que seencuentran en un cromosoma deben ser activadosdurante un cido celular. Sin embargo, no se activande manera simultanea. Cada replicon debe ser activado en un periodo bastante prolongado y cada unodebe ser activado no mas de una vez en cada ciclo celular.
Alguna serral debe distinguir entre los repliconesreplicados y los no replicados para garantizar quelos replicones no se activen una segunda ocasion.Numerosos replicones son activados de manera independiente, por 10 que debe existir otra serral queindique el momenta en el cual se ha completado elproceso de la replicacion de todos los replicones.
Ahora se ha comenzado a reunir informacionsobre la construccion de los replicones individuales,perc todavia se tiene poca informacion sobre la re-
15.1 Introducci6n 377
- . . -,-
ORIGEN
Horquilla dereplicacicin----.
Horquilla de replicaci6n----.~~~J~DNA replicado
~~
Horquilla dereplicaci6n+--
DNAprogenitor
REPLICACION UNIDIRECCIONAL
FIGURA 1<; 2 Los replicones pueden ser unidireccionaL~
bidireccionales, segun La formaci6n de una 0 de dos horql2:"de replicaci6n en el origen.
Una molecula de DNA comprometida en la rep~
cacion tiene dos tipos de regiones. La FIGURA 1muestra que cuando se observa el DNA en rep·cacion mediante microscopia electronica, la regireplicada aparece como un ojo de replicaci'dentro del DNA no replica do. La region no re .cada consiste en el duplex progenitor; este se ab~
en la region replicada en donde se han formado 1dos duplex hijos.
El sitio donde tiene lugar la replica cion se dnomina horquilla de replicacion (en ocasior::tambien se Ie conoce como punto de crecimieto). Una horquilla de replicaci6n se desplaza de f017
secuencial pOl' el DNA desde su punta de inicia en el -gen. EI origen puede aprovecharse para come~la replicacion unidireccional 0 la replicacibidireccional. El tipo de episodio esta determinapor la formacion de una 0 de dos horquillas de rer_cacion en el origen. En la replicacion unidireccio una horquilla de replicacion abandona el origer;continua por el DNA. En la replicacion bidireccnal, se forman dos horquillas de replicacion; esta..alejan del origen en direcciones opuestas.
La aparicion del ojo de replicacion no discgue entre replica cion unidireccional y bidirecnal. Como se ilustra en la FIGURA 15 2, el ojo puerepresentar cualquiera de las dos estructuras. Sigenera por medio de replicacion unidireccional
REPLICACION BIDIRECCIONAL
DNA noreplicado
Ojo dereplicaci6n
Aspecto
Estructura molecular
DNA noreplicado
• Una regi6n repLicada aparece como un ojo dentro deL DNAno repLicado.
• En eL origen inicia una horquilla de replicaci6n y despuesse des plaza de forma secuencial por el DNA.
• La replicaci6n es unidireccional cuando se crea una solahorquilla de replicaci6n en un origen .
• La repLicaci6n es bidireccional cuando un origen crea doshorquillas de replicaci6n que se desplazan en direccionesopuestas.
Conceptos principaLes
FIGURA El DNA replicado se observa como un ojo dereplicaci6n flanqueado por DNA no replicado.
lacion que existe entre eUos. No se sabe si el patronde replicacion es el mismo en cada cido celular LSeutilizan siempre todos los origenes 0 algunos sonsilentes en algunas ocasiones? LLos origenes siempre se activan en el mismo orden? Si hay diferentestipos de origenes, Lque los distingue?
En contraste con los cromosomas nudeares, loscuales son controlados por una sola copia, el DNAde las mitocondrias y de los doroplastos puede serregulado mas como plasmidos que existen en copiasmultiples por bacteria. Hay numerosas copias de cadaDNA de los organelos por celula y el control de sureplicacion debe relacionarse con el cido celular.
En todos estos sistemas, la cuestion fundamental es definir las secuencias que funcionan comoorfgenes y determinar como son reconocidas porlas protefnas adecuadas del mecanisme de replicacion. Se comienza por considerar la construccionbasica de los replicones y las diversas formas queadquieren; despues de la consideracion del origen,se plantea la pregunta de como la replicacion del genoma se coordina con la division bacteriana y que seencarga de segregar los genomas a la bacteria hija.
1111 Los replicones pueden ser linealeso circulares
378 CAPITULO 15 El replic6n
A 15. .J Un ojo de replicaci6n forma una estructura El en- Acircular.
RA 1 El ojo de replicaci6n se agranda a medida que.:.: norquillas de replicaci6n prosiguen por el replic6n. N6tese
_= el "ojo" se hace mas grande que el segmento no replicado.-:: dos lados del ojo pueden definirse porque ambos tienen
isma longitud. Fotografia cortesja de Bernard Hirt, Swiss-~_'tute for Experimental Cancer Research (ISREC).
. ... .REPLICACI6N UNIDIRECCIONAL
1-
-<---.-to---->-REPLICACI6N BIDIRECCIONAL
-<------->-
La cantidad de horquillas de replicacion que hay enun ojo de replica cion puede determinarse de dosformas. La eleccion del metodo depende de que elDNA sea una molecula definida 0 una region noidentificada de un genoma celular.
Con una molecula lineal definida se puede utilizar microscopia electronica para medir la distanciaentre cada extremo del ojo y el extrema del D AYluego comparar las posiciones de los extremos delos ojos en las moleculas que tienen ojos de diferentes tamaiios. Si la replicacion es unidireccionaL solouno de los extremos se movera; el otro es el origenfijo. Si la replicacion es bidireccionaL ambos se desplazaran; el origen es el punto medio entre ellos.
Con regiones no definidas de genomas exten50S se pueden utilizar dos puIsos de radioactividadsucesivos para etiquetar el desplazamiento de lashorquillas de replicacion. Si un pulso tiene una etiqueta mas intensa que el otIO, pueden distinguirsepor las intensidades relativas del etiquetamiento.
Conceptos principales
r Pueden utilizarse diferentes densidades de eti-quetamiento radioactivo para distinguir entre la replicaci6nunidireccional y la replicaci6n bidireccional.
_ Eliquela de densidad pesada (incorporadaprimero)
- Eliqueta de densidad ligera (incorporada ensegundo lugar)
-- Sin etiqueta (invisible en la autorradiografia)
• El desplazamiento de la horquilla de replicaci6n puededetectarse por medio de autorradiografia utilizandopulsos radioactivos.
• Las horquillas de replicaci6n crean estructuras en formade Yque alteran la migraci6n electroforetica de losfragmentos de DNA.
1111 Es posible elaborar el mapade los orlgenes conautorradiografia yelectroforesis
Apariencia de laestructura e pormedio de microscopiaeleclr6nica
Estruclura dereplicaci6n e
:epresenta un origen fijo y una horquilla de'cacion movible. Si se genera por replicacion bi
-;: donal, el ojo representa un par de horquillas:eplicacion. En cualquier caso, el avance de lajcacion expande el ojo hasta que termina por
-:car todo el replicon.Cuando un replicon es circular, la presencia dejo forma la estructura e, la cual se muestra enJRA 1 oJ. Las etapas sucesivas de la replicacion
~NA circular del virus del polioma se yen a tra- e microscopia electronica en la
15.3 Es posible elaborar el mapa de los origenes con autorradiografia yelectroforesis 379
La primera dimensi6n separada por masa ----..
Antes de la replicacion, el sitio diana palind:mico es metilado en las adeninas de ambas eaden~
La replicacion inserta las bases normales (no m -
primera dimension que los separa por masa y euna segunda dimension en donde el movimien~es determinado sobre todo por la morfologfa. Ldiferentes tipos de moIeculas en replicacion sigu rutas caracterfsticas, medidas por su desviacion ':la linea que seguirfa una molecula lineal de DK.del doble de tamano.
Una simple estructura Y, en la cual una horqu'"se desplaza por un fragmento lineal, sigue una rucontinua. Cuando las tres ramas tienen una misIlongitud ocurre un punto de inflexion y la estrutura se desvfa mas del DNA lineal. Consideracionanalogas determinan las rutas de las estructuras _bles en forma de Y 0 de las burbujas. Una burb_ja asimetrica sigue una ruta interrumpida con rotura en el sitio donde la burbuja se convierte eestructura en forma de Ya medida que una horq .abandona el extremo.
Juntas, las diferentes tecnicas para describirDNA en replicacion muestran que los orfgenes "utilizan con mayor frecuencia para iniciar episodide replicacion bidireccional. A partir de este nivelresolucion, se debe avanzar ahora al nivel molec~para identificar las secuencias de actuacion enque forman el origen y los factores de actuaciontrans que 10 reconocen.
(Que caracterfstica de un origen bacteriano (0 p1=.mido) garantiza que sea utilizado para iniciar 1a :-plicacion solo una vez en cada cielo? (La inieiac:,se asocia a a1gun cambio que marca el origen de manera que un origen replieado pueda distingui:de un origen no replieado?
Algunas secuencias que se utilizan para e"proposito estan ineluidas en el origen. oriC con::
ne 11 copias de la secuencia g¢l~, la eual es -
diana de metilacion en la posicion N6 de la adeni;par la metilasa Dam. La reaccion se ilustra er:
lilt (Regula la metHaci6ndel origen la iniciaci6n?
Conceptos principales
• orie cantiene 11 repeticiones ~~1~ que estim metiladasen la adenina en ambas cadenas.
• La replicaci6n produce DNA hemimetilado, el cual esincapaz de iniciar la replicaci6n.
• Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticione.:~~1~ sean metiladas de nuevo.
Burbujaasimetrica
--0-
--0-<---L-
['J1 kb 1 kb
BurbujaY doble
>--< ---0-
>--< --0>-< -0>< c::>
Y simple
. . ... .:
, ; .; .I-
DNA DNAmetilado hemimetilado
MeGATC-CTAG
Gf'.JtTC Replicaci6n j Nletilasa DamCTAG "\Me
GATCCTAG-
Me
Estas pueden visualizarse por medio de autorradiograffa. La muestra que la replicacionunidireccional hace que a una etiqueta Ie siga la otraen un extrema del ojo. La replicacion bidireccionalproduce un patron (simetrico) en ambos extremosdel ojo. Este patron se observa por 10 general en losreplicones de los cromosomas eucarioticos.
Un metodo mas reciente para elaborar el mapade los orfgenes con mayor resolucion se vale delos efectos que tienen los cambios de la forma delDNA sobre la migracion electroforetica. La
ilustra la tecnica de mapeo bidimensional,en la cuallos fragmentos de restriccion del DNA enreplicacion son sometidos a electroforesis en una
La replicaci6n del DNA metilado origina DNAhemimetilado, el cual mantiene su estado en los sitios GATChasta que la metilasa Dam restaura la condici6n metilada porcompleto.
~~seengs~~~~xagera1C\la contribuci6n de
la forma de tres 2 kb ... kbdlmenslones 2
1 kb 1 kb
EI tamano delfragmento seduplica durantela replicaci6n
La posici6n del origen y el numero de horquillas en replicaci6n determinan la forma de un fragmenta de restricci6n en replicaci6n,la cual puede deducirse par su ruta electroforetica (linea continua). Lalinea punteada muestra la ruta del DNA lineal.
380 CAPITU LO 15 El replic6n
15.5 Los origenes pueden ser secuestrados despues de la replicaci6n 381
- as) en las cadenas hijas. Esto genera DNA heetilado, en el cual una cadena esta metilada
- tra no. Par 10 tanta, la replicacion conviertesitios diana Dam de metilados par completo a
-:::imetilados..:.Cual es la consecuencia de la replica cion? La~ idad que tiene un plasmido con base en oriC:-eplicarse en E. coli dam- depende de su esta-
e metilacion. 5i el plasmido esta meti]ado sete a una sola ronda de replicacion y despues
roductos hemimetilados se acumulan, como se.:ribe en ]a . Par 10 tanto, un arigen
- 'metilado no puede usarse para iniciar un cielo::-eplicacion.£:sto sugiere dos explicaciones: la iniciacion
=je requerir la metilacion completa de los sitios7 _3 Dam en el origen a puede ser inhibida par la-_ irnetilacion de estos sitios. La ultima posibilidad~:: e ser la correcta parque un origen de DNA no= ado puede funcionar de manera eficiente.
Asi, los orfgenes hemimetiJados no pueden ini- e nuevo hasta que la metilasa Dam los haya-~-formado en orfgenes metilados par completo.
:itios GATC localizados en el origen permanecen- imetilados -13 min despues de la replicacion.
c largo periodo no es habitual porque en los sitios-_-=-C tipicos en cualquier otro lugar del genoma,-.>metilacion comienza de inmediata «1.5 min)
es de la replicacion. Otra region actua como-:. el promotor del gen dnaA tambien muestra re
antes de que comience la remetilacion.;::1 promotor del gen dnaA estara reprimido
=:J.tras este hemimetilado, 10 cual reduce el nivelc a proteina DnaA. Par 10 tanto, eJ origen esta=:Le y la produccion de la proteina iniciadora cru
es reprimida durante este periodo.
Los orlgenes puedenser secuestrados despuesde la replicaci6n
I i:onceptos principales
SeqA se une al DNA hemimetilado y es necesaria para=1 retraso de la replicaci6n.SeqA puede interactuar con DnaA.Juesto que los origenes estan hemimetilados, senen a la membrana celular yen ocasiones no estan aisposici6n de las metilasas.
_a naturaleza de la conexi6n entre el origen y lamembrana aun no es clara.
-- que se debe el retraso de la remetilacion en oriC-n dnaA? La explicacion mas probable es que estas
-~ .ones son secuestradas en una forma en la cual"' inaccesibles a la metilasa Dam.
..•
~()'~Y.~1(}I~1l~j(i~\.'L'I\.1"/ Origen activo
Replicaci6n!•
\.~rA"fj\'L'I\.l(J';L)~rA,'H Origenes
\)(}'.':'L'\.i(}I\.)l''\JOl.~'I\.~''/ inactivos•
Metilasa Dam!•
\)(}\yj1\)fJ'YJI\)(J'~f\U Origen activo
S6lo los origenes metilados por completo puedeniniciar la replicaci6n; los origenes hijos hemimetilados no pueden utilizarse de nuevo hasta que hayan recuperado su estadode metilaci6n completa.
Un circuito encargado de controlar la reutilizacion de los orfgenes es identificado par mutacionesen el gen seqA. Los mutantes reducen el retraso de laremetilacion en oriCy en dnaA. Como resultado, inician la replicacion del DNA demasiado pronto, can10 que se acumula un numero excesivo de origenes.Esto sugiere que seqA forma parte de un circuito regulador negativo que impide que los arfgenes seanmetilados de nuevo. La proteina SeqA se une canmayor fuerza al DNA hemimctilado que al DNA metilado par completo. Puede iniciar la union cuandoel DNA es hemimetilado, momenta en que su presencia continua impide la formacion de un complejoabierto en el origen. SeqA no tiene especificidadpar la secuencia oriC y parece probable que esta seaconferida par la protefna DnaA. Esto explicaria lasinteracciones geneticas entre seqA y dnaA.
La hemimetilacion de las secuencias GATC delorigen es indispensable para su asociacion can lamembrana celular in vitro. El DNA oriC hemimetilado se une a las membranas, pero el DNA que estametilado par completo, no. Una posibilidad es que laasociacion a la membrana tenga que ver en el control de la actividad del origen. Esta funcion podrfaser independiente de cualquier funcion que tenga lamembrana en la segregacion (vease la Figura 17.4).La asociacion a la membrana podrfa impedir queocurriera la reiniciacion de manera prematura, deforma inctirecta par el secuestro de los origenes, adirecta par la inhibicion de la reaccion par parte dealgun componente en la membrana.
Las propiedades de la fraccion de la membranasugieren que ineluye componentes que regulan lareplica cion. Un inhibidor observado en esta fracci6ncompite can la proteina DnaA. Este inhibidor puede impectir la iniciacion de la replicacion solo si es
Un inhibidor unido a la membrana se adhiere alDNA hemimetilado en el origen y puede funcionar al impedirla union de DnaA. Es liberado cuando el DNA es metHado denuevo.
ciacion, perc que cuando se combinen logren =resultado esperado. Algunas mutaciones en el gednaA provocan replicacion asincronica. 10 cual sugiere que DnaA podrfa ser el "titulador" 0 el "rei ~
que mide el nllmero de orfgenes en relacion con :.:masa celulay. La sobreproduccion de DnaA da lugaa resultados conflictivos, los cuales pueden varidesde no tener ningun efecto hasta causar que ..::iniciacion suceda en una masa reducida.
Ha sido diffcil identificar los componentes pr-tefnicos que median la adhesion a la membrana. "L:indicio de que esta es una funcion de la prote' DnaA 10 constituye su respuesta a los fosfolfpid :Estos facilitan el intercambio de ATP con el ~~unido a la protefna DnaA. Se desconoce la funci'que tiene esto en el control de la actividad de Dn- (la cual requiere ATP). perc la reaccion implica ql:.:es probable que DnaA interactue con la membran=..Esto significarfa que mas de un episodio tiene q...::ver en la asociacion a la membrana. Quiza un or:gen hemimetilado este unido al inhibidor asocia 'a la membrana, pero cuando el origen se metilacompleto, el inhibidor es desplazado por la prote'~
DnaA asociada a la membrana.Si DnaA es el iniciador que desencadena un c
cIo de replicacion, el suceso principal serfa su a 'mulacion en el origen en un nivel crftico. No he.variaciones cfclicas en la expresion 0 en la conce::tracion global de la protefna DnaA, 10 cual sugieque los sucesos locales deben ser los responsablc:Para que sea activa en la iniciacion de la replicaci6=.DnaA debe encontrarse en su forma unida a ATP.::"':protefna DnaA tiene una actividad intrfnseca de~
que transforma el ATP en ADP. Esta actividad "intensifica la subunidad ~ de la polimerasa de Di -,III. Cuando la replicasa es incorporada al comple:de replicacion, esta interaccion ocasiona la hidrolis_del ATP unido a DnaA, 10 que desactiva la prote'DnaA e impide que comience otro ciclo de replicccion. Esta reaccion ha sido denominada RlDA (re-- latory inactivation ofDnaA, desactivacion regulad ::de DnaA). Es potenciada por una protefna llama""'Hda. Todavfa no se sabe que controla la cranolocr-de la reactivacion de la protefna DnaA.
Otro factor que controla la disponibilidad '.DnaA en el origen es la competencia por unirla :otros sitios del DNA. En particular, un locus denminado dat tiene una gran concentracion de sitide union a la protefna DnaA. Se Ie une unas ocveces mas DnaA que al origen. La delecion de .hace que la iniciacion ocurra con mayor frecuen '=Esto reduce de manera significativa la cantidad c:DnaA disponible para el origen, perc no se sabe coexactitud que funcion pueda tener en el control (:,la cronologfa de la iniciacion.
EI DNA es metiladode nuevo y Iibera alinhibidor
DnaA se une a oriC
EI inhibidor unido a lamembrana se adhiereal DNA hemimetilado
Cc
Me
Me"GATC NNNNNNN'CTAG NNNNNNN
Me
MeiGATC N~~lCTAG~
agregado antes que la protefna DnaA a un sistemain vitro. Esto sugiere el modelo que se muestra en la
, en el cual el inhibidor reconoce de manera especffica el DNA hemimetilado e impide quese una la protefna DnaA. Cuando el DNA es metilado de nuevo, el inhibidor es liberado y la pratefnaDnaA es libre de iniciar la replicacion. Si el inhibidor esta asociado a la membrana, es posible que laasociacion y la disociacion del DNA a la membranatengan que ver con el control de la replicacion.
La extension completa del sistema utilizadopara controlar la reiniciacion no es clara, pero esposible que participen numerosos mecanismos: elsecuestro ffsico del origen, el retraso de la remetilacion, la inhibicion de la union de la pratefna DnaAy la represion de la transcripcion del gen dnaA. Noes evidente cual de estos episodios ocasiona los demas, y si sus efectos en la iniciacion son directos 0
indirectos.Alm se debe resolver el tema central de cual
caracterfstica tiene el encargo fundamental de sincronizar los sucesos. Una posibilidad es que la adhesion a la membrana ocurre en la iniciacion y que seanecesario el ensamble de alguna estructura extensapara liberar el DNA. El periodo de secuestro pareceaumentar con la longitud del ciclo celular, 10 cualsugiere que refleja de manera indirecta el reloj quecontrola la reiniciacion.
Como unico integrante del mecanismo de replicacion indispensable solo en el origen, la protefnaDnaA ha atrafdo mucha atencion. Esta protefna esla diana de numerosos sistemas reguladores. Es posible que ninguno de estos sistemas sea suficientepor sf solo para controlar la frecuencia de la ini-
382 CAPITULO 15 El replicon
(ada cromosoma eucari6ticocontiene numerosos replicones Origen 1
~
.. . .. _. ~ . .
Origen 2
=':-,:=pios principales
-:5 replicones eucari6ticos tienen una longitud de 40 a_= kb._- cromosoma se divide en numerosos replicones._:- replicones individuales se activan en momentos:;acteristicos durante la fase S._=s patrones de activaci6n regional sugieren que los-=Jlicones cercanos entre 51 son activados al mismo=-:mpo.
-" celulas eucarioticas la replicaci6n del DNA..:. confinada a una parte del cido celular. La fase
ele durar unas cuantas horas en una celula eu-rica superior. La replicaci6n de la gran cantidad
=:>NA contenido en un cromosoma eucari6tico_QIa al dividirlo en numerosos replicones indivi
=·es. Solo algunos de estos replicones participan.3 replicacion en un momento dado de la fase S,arecer cada replicon es activado en un momen
:= ecffico durante la fase S, aunque los datos que-- -obre el tema no son decisivos.
El inicio de la fase S 10 seiiala la activaci6n de_rimeros replicones, En las pocas horas siguien!os episodios de iniciacion tienen lugar en otros
- Jcones de manera ordenada. Mucho de 10 que: be sobre las propiedades de los replicones in: uales proviene de estudios autorradiogrMicos
_~ recurren en general a los tipos de protocolos_-trados en la Figura 15.5 yen la Figura 15,6. Los
-_ :.icones cromosomicos suelen mostrar replicacion2ireccional.
LQue tan grande es el replic6n promedio yantos hay en el genoma7 Una dificultad para
=:cribir la unidad individual es que los replicones~'acentes pueden fusionarse y formar ojos repli-
- os extensos, como se ilustra en la II-=. metodologfa utilizada en general para distinguir=~re los replicones individuales y los ojos fusio=.dos consiste en utilizar fragmentos de DNA en- cuales puedan observarse numerosos replicones
_~vos, capturados al parecer en una etapa en la~al todos han iniciado casi al mismo tiempo, perc
,,-res de que se reunan las horquillas de las unida_=s adyacentes.
En grupos de replicones activos, el tamaiio pro-=.edio de la unidad se mide por la distancia que
y entre los orfgenes (es decir, entre los puntosedios de los replicones adyacentes). La velocidad
: n la cual se desplaza la horquilla de replicacionuede estimarse a partir de la distancia maxima que
=-_corren los rastros autorradiograficos durante un~eriodo determinado.
Longitud medida del repiic6n...-----., I
Replicones fusionados
Para medir el tamaiio del replic6n se necesita un fragmento de DNA en el cuallos replicones adyacentes esten activos.
Los replicones individuales de los genomas eucari6ticos son relativamente pequefios, por 10 general de -40 kb en las levaduras 0 en las moscas yde -100 kb en las celulas animales. Sin embargo,pueden variar mas de 10 veces en longitud dentrode un genoma. La velocidad de replicacion es de-2 000 bp/min, la cual es mucho menor que la deldesplazamiento de la horquilla de replicacion bacteriana (50 000 bp/min).
Por la velocidad de replicacion, es evidente queel genoma de un mamffero podrfa replicarse en cercade 1 h si todos los replicones funcionaran de manerasimultanea. Sin embargo, la fase S dura mas de 6 hen una celula somatica tfpica, 10 cual implica que nomas del 15 % de los replicones tienden a estar activos en un momenta dado, Hay casos excepcionales,como las divisiones embrionarias tempranas de losembriones de Drosophila, en donde la duracion de lafase S se comprime por el funcionamiento simultaneo de un gran numero de replicones,
LComo se seleccionan los orfgenes para la iniciacion en momentos distintos durante la fase S7 EnSaccharomyces cerevisiae, parece ser que esta predeterminado que los orfgenes se repliquen temprano,pero que las secuencias de actuacion en cis puedanhacer que los origenes ligados a ellas se repliquendespues.
Los datos disponibles sugieren que los replicones cromos6micos no tienen terminalesen lascuales las horquillas de replicacion interrumpan eldesplazamiento y (al parecer) se disocien del DNA.Parece mas probable que la horquilla de replicacioncontinue desde su origen hasta que encuentre una
15.6 (ada cromosoma eucari6tico contiene numerosos replicones 383
Las horquillas de replicaci6n se organizan enfocos dentro del nucleo. Las celulas fueron etiquetadas conBrdU. El segmento izquierdo de la figura se tifi6 con yoduro depropidio para identificar la masa de DNA. El derecho se tifi6 conUll anticuerpo contra BrdU para identificar el DNA en replicaci6n. Fotografia cortesia de Anthony D. Mills and Ron Laskey,Hutchinson/MRC Research Center, University of Cambridge.
horquilla que avance hacia ella desde el replicon adyacente. Ya se ha mencionado el posible problematopologico de unir el DNA que acaba de sintetizarseen la union de las harquillas de replicacion.
La predisposicion de los replicones vecinos aestar activos de manera simultanea podria explicarse por la presencia de controles "regionales", enlos cuales los grupos de replicones son iniciados demodo mas 0 menos coordinado, al contrario de unmecanismo en el cual los replicones individualesson activados uno par uno en areas dispersas delgenoma. Dos caracteristicas estructurales sugierenla posibilidad de una organizacion a gran escala.Regiones bastante extensas del cromosoma puedende£lnirse como "de replicacion temprana" 0 "de replicacion tardia", 10 cual implica que hay poca diseminacion de replicones que se activan en momentostempranos 0 tardfos. La visualizacion de las horquillas de replicacion par medio de etiquetamiento conprecursores de DNA identi£lca de 100 a 300 "focos"en vez de una tincion uniforme; es probable quecada foco que se muestra en la contenga >300 horquillas de replicacion. Los focos podrianrepresentar estructuras fijas a traves de las cualesdebe moverse el DNA en replica cion.
l1li En las levaduras puedenaislarse los origenesde replicaci6n
Conceptos principales
• Los origenes de S. cerevisiae son secuencias cortas ricasen A-T que tienen ulla secuencia esencial de 11 bp.
• El ORC es L11l complejo de seis proteinas que se une auna ARS.
384 CAPITULO 15 El replic6n
Cualquier segmento de DNA que tenga un origer:debe estar en condiciones de replicarse; par 10 tanto, aunque los plasmidos son muy poco frecuente~
en las eucariotas, puede ser posible construirlos p :medio de una manipulacion apropiada in vitro. EST_se ha logrado en las levaduras, aunque no en laeucariotas superiores.
Los mutantes de S. cerevisiae pueden ser "tran:formados" en su fenotipo silvestre con la adicion c.:DNA que transporte una copia silvestre del gen. ::.descubrimiento de los origenes de las levaduras tu lugar cuando se observo que algunos fragmentos G:DNA de las levaduras (cuando forman un circulson capaces de transformar las celulas defectuo ~
con mucha e£lciencia. Estos fragmentos puedenbrevivir en la celula en estado no integrado (au~.
nomo), es decir, como plasmidos autorreplicamc-Un fragmento transformante de alta frecuenc...
posee una secuencia que Ie da la capacidad de repcarse e£lcientemente en las levaduras. Este segme~se denomina ARS (autonomousZy replicating seque·:.secuencia de replicacion autonoma). Los elemer-~
ARS se derivan de origenes de replicacion.En los casos en los que los elementos ARS
han mapeado de manera sistematica en regio.ccromosomicas extensas, parece que solo algl!de ellos en realidad se aprovechan para inicia':replicacion. Los otros son silenciosos 0 quiza se ~
licen con poca frecuencia. Si es verdad que al -.origenes tienen probabilidades variables de ser _lizados, tampoco podria haber terminales £ljas e::::los replicones. En este caso, una region dada decromosoma podria ser replicada desde arigenes .:tintos en ciclos celulares diferentes.
Un elemento ARS esta formado por una re.:rica en A-T que contiene sitios discretos en 10 ;:les las mutaciones afectan el funcionamiemorigen. La composicion de bases, mas que la sec~
cia, puede ser importante en el resto de la re.La muestra un analisis sistematicmutaciones a todo 10 largo de un origen. EI :cionamiento del origen es inhibido por com._por mutaciones en una region "nuclear" de 1."denominada dominio A, la cual contiene un~
cuencia de consenso de 11 bp formada por per-:bases A·T. Esta secuencia de consenso (en ocas_denominada ACS, ARS consensus sequence, se ~
de consenso de la ARS) es la (mica homologialos elementos ARS conocidos.
Las mutaciones en tres elementos adya enumerados B1 a B3, disminuyenla funcion degen. Un arigen puede funcionar de manera =
con dos elementos B cualesquiera, siempre y c =
haya un elemento A funcional. (Las copias :_fectas del consenso nuclear, que suelen conf r=
en las posiciones 9111, se ubican cerca de, 0 =-
..
Complejo deposreplicaci6n
VR.
ORC
ORC
ORC
Fase S
Fase G1 MCMtardfa
/A~
Fase G2
/AYA.YA.VAYJ: ,
Fase G1 temprana
fA-YAYA"VA.YJ., t
Cdc6..0IIII(. -.····
Despues de la replicaci6n, el factor de competencia:que se encuentra en el nLicleo es inactivo; el factorde competencia del citoplasma no puede entrar alnLicleo
DYAYlt')./A
~~
.IfiYA-~~
.- .
La disoluci6n de la membrana nuclear durante lamitosis permite que el factor de competencia seasocie al material nuclear
:"ntes de la replicaci6n, el nLicleo contiene factor decompetencia activo
La divisi6n celular genera nLicleos hijos competentespara respaldar la replicaci6n
15.14 El factor de competencia que se encuentra en- - Jcleo es desactivado despues de la replicaci6n. Un nuevo-~tecimiento de factor de competencia puede entrar s6lo
- .:oldo se rompe la membrana nuclear en la mitosis.
__erdese que el aRC es un complejo de 400 kD__e se une a la ARS de S. cerevisiae (vease la seccion';.. En las levaduras pueden aislarse los orfgenes~ replicacion). El origen (ARS) esta formado por- secuencia de consenso A y por t-res elementos
::- vease la Figura 15.12). El aRC de seis protei-:::25 (de las cuales todas son codificadas por genes-:.::nciales) se une a la secuencia A y al elemento:::.yacente B1. Se necesita ATP para la union. pero~-:e no es hidrolizado hasta alguna etapa posterior.2.-- :actor de transcripcion ABFl se une al elemento~ 3; esto ayuda a la iniciacion. pero son los sucesos__e tienen lugar en los elementos A y B1 los que en=~dad provocan la iniciacion. La mayor parte de
::. orfgenes estan ubicados en las regiones que seo:::.cuentran entre los genes. 10 cual indica que quizaeo. importante para que la estructura de la cromati
- = local este en una conclicion no transcrita.La caracterfstica sobresaliente es que el aRC
-=rmanece unido al origen en todo el cido celu=-. No obstante. los cambios ocurren en el patron
-= proteccion del DNA como resultado de la union
1 Las proteinas del origen controlan la suscep-tibilidad a la iniciaci6n.
de otras protefnas al complejo ORC-origen. La~ i resume el cido de los sucesos que tienen
lugar en el origen.Al final del cido celular. el aRC esta unido a A
B1 Ygenera un patron de proteccion in vivo similaral que se observa cuando se une al DNA libre invitro. En terminos basicos. la region que atraviesaA-B 1 esta protegida contra la DNAasa. pero hay unsitio hipersensible en el centro de B1.
Durante G1 este patron cambia. mas notablemente por la perclida del sitio hipersensible. Esto sedebe a la union de la protefna Cdc6 al aRc. En laslevaduras. Cdc6 es una protefna muy inestable. conuna vida media de menos de 5 min. Se sintetiza durante G1 Ysuele unirse al aRC entre la salida de lamitosis y la etapa G1 tardfa. Su rapida degradacionsignifica que no hay protefna disponible despues enel cido. En las celulas de los mamlferos. se controlade manera distinta; esta fosforilada durante la faseS y como resultado es exportada desde el nudeo.La protefna Cdc6 proporciona la conexion entre elaRC y un complejo de protefnas que participa enla competencia y en la iniciacion. Cdc6 tiene actividad ATPasa indispensable para que respalde lainiciacion.
15.9 El factor de competencia esta formado por proteinas MCM 387
Ciertos mutantes de levaduras nos permiten conocer el sistema que controla la disponibilidad delfactor de competencia. Las mutaciones que se presentan en el factor de competencia pueden impedirla iniciacion de la replicacion. Asf es como las mutaciones actuan en las protefnas de mantenimientodel minicromosoma (minichromosome maintenance.MCM) 2, 3 Y 5. Las mutaciones que ocunen en elsistema que desactiva el factor de competencia despues del inicio de la replicacion deben permitir laacumulacion de cantidades excesivas de DNA. porque la presencia continua de factor de competenciapermite que suceda la replicacion. Dichas mutaciones se observan en los genes que codifican los componentes del sistema de ubiquitinacion encargadode la degradacion de ciertas protefnas. Esto sugiereque el factor de competencia puede ser destruidodespues del inicio del cicio de replicacion.
Las protefnas MCM2, 3 Y 5 son necesarias parala replicacion y entran al nu.cleo solo durante la mitosis. En las celulas animales se encuentran homologos, en donde MCM3 esta unida al material eromosomico antes de la replicacion, pero es liberadadespues de la replicacion. El complejo MCM2, 3, 5de la celula animal permanece en elnucleo duranteel ciclo celular, 10 cual sugiere que puede ser uncomponente del factor de competencia. Otro componente, capaz de entrar solo en la mitosis, puederequerirse para que el complejo MCM2, 3, 5 se asocie al material cromosomico.
En las levaduras, la presencia de Cdc6 en elarigen permite que las protefnas MCM se unan alcomplejo. Su presencia es indispensable para queocuna la iniciacion en el origen. En consecuencia,el origen entra a la fase S como un complejo deprerreplicaci6n, el cual contiene el aRC y las protefnas Cdc6 y MCM. Cuando ocurre la iniciacion,Cdc6 y MCM son desplazadas y el origen regresaal estado de complejo de posreplicaci6n, el cualcontiene solo el aRc. La protefna Cdc6 es degradada con rapidez durante la fase S; pOl' 10 tanto,no esta disponible para respaldar la recarga de lasprotefnas MCM y, en consecuencia, el origen nopuede ser utilizado para un segundo cido de iniciacion durante la fase S.
Si Cdc6 esta disponible para unirse al origendurante la fase G2 (par expresion ectopica), las protefnas MCM no se unen hasta la siguiente fase G1,10 cual sugiere que hay un mecanismo secundarioque garantiza que se asocien a los orfgenes solo enel momenta adecuado. Esta podrfa ser otra parte delcontrol de la competencia. Al menos en S. cerevisiae,este control no parece ejercerse en el nivel de laentrada al nucleo, pero esta puede ser una diferencia entre las levaduras y las celulas animales. Lasprotefnas MCM2-7 constituyen un complejo de seis
388 CAPITULO 15 El replic6n
miembros en forma de anillo alrededor del D -.Algunas de las protefnas del aRC tienen similiLdes con las protefnas de replicacion que cargan ;:DNA con la polimerasa de DNA. Es posible q;"el aRC utilice la hidrolisis de ATP para cargar DNA con el anillo MCM. En los extractos de XeI:pus, la replicacion puede iniciarse si el aRC es el'nado despues de que ha cargado las protefnas Cdy MCM. Esto muestra que la funcion principal ;:aRC es identificar el origen a las protefnas Cdc6MCM que controlan la iniciacion y la competenc::.=
Las protefnas MCM son indispensables parelongacion y para la iniciacion, y continuan func' nando en la horquilla de replicacion. Su particip=cion exacta en la elongacion no es clara, pero~posibilidad es que contribuyan a la actividad dehelicasa que desenrolla el DNA. Otra posibilidad :que actuen como una defensa avanzada que aen la cromatina para permitir que una helicasa -tue en el DNA.
lED Los lazos Dmantienenlos orlgenes mitocondriales
Conceptos principales
• las mitocondrias utilizan diferentes secuencias de origen para iniciar la replicaci6n de cada cadena del DNA.
• la replicaci6n de la cadena Hinicia en un laza D.
• la replicaci6n de la cadena l inicia cuanda su arigenqueda expuesto par el mavimiento de la primeraharquilla de replicaci6n.
Los arfgenes de los replicones en los cromosoIE..eucarioticos y procari6ticos son estructuras estcLcas: estan formadas por secuencias de DNA que ('reconocidas en su forma duplex y son utilizad=.para iniciar la replicacion en el momenta adecuadLa iniciacion requiere la separacion de las caden=del DNA y el comienzo de la sfntesis bidirecc: nal del DNA. En las mitocondrias se observa ~
organizacion diferente.La replicacion comienza en un origen especmc
localizado en el DNA duplex circular. Sin embargen un inicio solo una de las dos cadenas proge toras (la cadena H en el DNA mitocondrial de :mamfferos) sirve como molde para ]a sfntesis de r
cadena nueva. La sfntesis continua solo una distil::cia corta y desplaza a la cadena compafiera orig~(L), la cual permanece como cadena individwcomo se i]ustra en la - r. ~!> 6. La condicion -:esta region da origen a su nombre, laza de despla: miento, 0 lazo D.
Las polimerasas de DNA no pueden iniciarsfntesis, sino que requieren un extremo 3' con a
Conceptos principales
El episodio fundamental en el control de la r rcacion es la actuacion del ORC en el origen. -:
• El ORC es un complejo de proteinas que esta asociadoa los origenes de las levaduras durante todo el ciclocelular.
• Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza s6lo eG1.
• Cdc6 se une al ORC y permite la uni6n de las proteina5MCM.
• Cuando la replicaci6n se inicia, las proteinas Cdc6 yMCM son desplazadas. La degradaci6n de Cdc6 impidela reiniciaci6n.
• Algunas proteinas MCM se encuentran en el nOcleodurante el ciclo, pero otras pueden entrar s6lo despuEc:de la mitosis.
Figura 1.12). Si en el ovocito se bloquea la slntesisde protefnas, la membrana alrededor del materialinyectado permanece intacta y el DNA no puedereplicarse de nuevo. No obstante, en presencia desfntesis protefnica, la membrana nuclear se rompdel mismo modo como 10 harfa en una division celular normaL y en este caso pueden ocurrir ciclOSsubsiguientes de replicacion. El mismo resultadpuede lograrse con agentes que permeabilicen 1membrana nuclear. Esto sugiere que el nucleo contiene una protefna (0 protefnas) indispensable pare:.la replica cion que se consume de alguna manerpor un. ciclo de replicacion, por 10 que aunque haye:.mas proteina en el citoplasma del ovocito, esta salepuede entrar al nucleo si la membrana nuclear erompe. En principio el sistema puede ser lievadeaLll1 mas lejos si se desarrolla in vitro un extractque respalde la replicacion nuclear y permita asf eOaislamiento de los componentes del extracto y l~
identificacion de los factores relevantes.La F GU 'I) 14 explica el control de la reinicic.
cion al proponer que esta protefna es un factor decompetencia. Esta presente en elnucleo antes de Ii.replicacion. Un ciclo de replicacion desactiva 0 de truye el factor, y no puede ocurrir otro ciclO has-=.que se proporcione mas factor. El factor 10calizaGen el citoplasma puede acceder al material nucleiCsolo en la mitosis subsiguieme cuando se rompa :=.envoltura nuclear. Este sistema regulador cumpldos propositos. AI eliminar un componente necesar:despues de la replicacion, impide que ocuna mas c::un ciclo de replicacion. Tambien constituye un lazde retroalimentacion que hace que la iniciacion de:=.replicacion dependa del paso por la division celuk
lED El factor de competencia est::formado por protelnas MCM
HL
HH HL
densidad.....
LL
EI DNA en el nucleoliene una densidadligera
EI segundo cicio dereplicaci6n generaDNA pesado y DNAhibrido
La replicaci6nsemiconservadoragenera DNA dedensidad hibrida
EI DNA se replica enpresencia de precursorespesados
Permeabilizaci6n de laenvollura nuclear
Inyecci6n del nucleo al ovocito
>1 cicio de replicaci6n requiere factores citoplasmico~
por la presencia de un represor que impida la replicacion repetida en los orfgenes que han sido utilizados.Las preguntas cruciales con respecto a la naturalezade este sistema regulador son: ccomo determina elsistema si un origen particular ha sido replicado? ycque componentes protefnicos intervienen?
Se ha conocido un poco la naturaleza de loscomponentes protelnicos al utilizar un sistema enel cual un DNA sustrato experimenta un solo ciclode replicacion. Los ovocitos de Xenopus tienen todoslos componentes necesarios para replicar el DNA(en las primera s horas posteriores a la fertilizacionrealizan 11 ciclos de division sin la expresion de genes nuevos) y pueden replicar el DNA en un nucleoque es inyectado al ovocito. La r resumelas caracterfsticas de este sistema.
Cuando un espermatozoide 0 nucleo en interfase es inyectado a un ovocito, su DNA se replicasolo una vez (este episodio puede rastrearse conuna etiqueta de densidad, del mismo modo que enel experimento original en el que se definio la replicacion semiconservadora, mostrado antes en la
Un nucleo inyectado en un ovocito de Xenopus puede replicarse s6lo una vez a menos que la membrananuclear sea permeabilizada para permitir ciclos subsiguientesde replicaci6n.
386 CAPITULO 15 El replic6n
IIIIJ Resumen
seccion 16.4, Los drculos rodantes producen multfmeros de un replicon).
. - . . • I
Origen de la cadena L
Inicio de la sintesis de RNA
I La conclusion 0genera un circulo .duplex
l
CSe sellan las separaciones deo···.
. las cadenas nuevas
. .
La conclusion de la cadena L nueva Iibera los genomas hijos
I \
C- La conclusion EI genoma 0genera un liberado escirculo duplex parclalmente
- repllcado.
l
Cuando la cadenadesplazada pasa alorigen en la cadena L,inicia la sintesis de lanueva cadena H
o-E'DNA" ,'o\,\i,.,o
La sintesis de una cadena IL nueva crea un lazo D al 'tdesplazar a la cadena CD~progenltora
EI lazo 0 se expande
--.~
l
Cadena L
El cromosoma completo se replica una vez en cadacielo de division celular. La iniciacion de la repli·cacion obliga a la celula a experimentar un ci.elode division; la conclusion de la replicacion puededesencadenar el proceso de division en sf. El eromosoma bacteriano esta formado por un solo replicon, perc un cromosoma eucariotico se divide
El Lazo D mantiene una abertura en eL DNA mitocondrial de los mamiferos, La cuaL separa los origenes para Lareplicaci6n de cada cadena.
'ad cebadora (vease la seccion 18.8, La actividad::' adora es necesaria para comenzar la sfntesis de
__ -A). La replicacion en el origen de la cadena H- inicia cuando la polimerasa de R JA transcribe::: cebador. Los extremos 3' son generados en el_ ador por medio de una endonueleasa que di-
'e el hfbrido de DNA-R! A en numerosos sitios'cretos. La endonueleasa es especffica para la es:.Ictura triple formada por el hfbrido de DNA-RNA
-as la cadena individual de DKA desplazada. Des'es, la polimerasa de DNA extiende el extremo 3'interior del DNA.
En las mitocondrias de los mamfferos se encuen~::l un solo lazo D en forma de una abertura de 500
600 bases. La cadena corta que mantiene ellazo_ es inestable y se voltea; a menudo es degradada y
tetizada de nuevo para mantener la abertura del:iplex en este sitio. Algunas moleculas de DNA micondrial poseen numerosos lazos D, 10 cual refleja
.: uso de mllltipies orfgenes. El mismo mecanisme:~ emplea en el DNA de los eloroplastos, en donde
y dos lazos D (en las plantas superi.ores).Para replicar el DNA mitocondrial de los ma·
Heros, la cadena corta localizada en el lazo D se:-xtiende. La region desplazada de la cadena L ori~:nal se alarga y amplfa el lazo D. Esta expansion: ntinua hasta llegar a unos dos tercios del trayectouededor del drculo. La replicacion de esta region:,xpone un origen en la cadena L desplazada. La_fmesis de una cadena H inicia en este sitio, el cual_- utilizado por una primasa especial que sintetiza. RNA corto. Despues, el RNA es extendido por la
limerasa de DNA y avanza alrededor del moldeie la cadena individual L desplazada en la direccionpuesta a la sfntesis de la cadena L.
Como resultado del rezago en su inicio, la sfn:esis de la cadena H habra avanzado solo un tercio
el trayecto alrededor del drculo cuando la sfntesis":e la cadena L finalice. Esto libera un cfrculo dllplex: mpleto y un drculo hendido, el cual permaneceparcialmente en forma de cadena individual hasta:;,ue la sfntesis de la cadena H coneluye. Por ultimo,.as cadenas nuevas se sellan para formar estructuras_'1tactas en terrninos covalentes.
La existencia de los lazos D da lugar a un princiio general: Un origen puede ser una secuencia de DNA
.ale sirve para iniciar la sintesis de DNA utilizando una::1dena como molde. La abertura del duplex no siemre conduce a la iniciacion de la replica cion en latra cadena. En el caso de la replicacion del DNA
:nitocondrial, los orfgenes para replicar las cadenascomplementarias se encuentran en localizacionesdiferentes. Los orfgenes que facilitan la replicacion de solo una cadena tambien se encuentran enla forma de replicacion del drculo rodante (vease la
15.11 Resumen 389
en numerosos replicones que funcionan durante elprolongado periodo de la fase S. El problema de replicar los extremos de un replicon lineal se resuelveen una variedad de formas, con mayor frecuencia alconvertir el replicon en una forma circular. Algunosvirus tienen proteinas especiales que reconocen losextremos. Los cromosomas eucarioticos confrontaneste problema en sus replicones terminales.
EI orlgen minimo de E. coli esta formado por-245 bp e inicia la replicacion de forma bidireccional. Cualquier molecula de DNA con esta secuenciapuede replicarse en E. coli. Dos horquillas de replicacion abandonan el origen y se desplazan alrededordel cromosoma, al parecer hasta que se encuentran,aunque se han identificado las secuencias ter que harfan que las horquillas terminaran despues de encontrarse. Las unidades de transcripcion estan organizadas de tal manera que la transcripcion prosigue casisiempre en la misma direccion que la replicacion.
La replicacion eucariotica es al menos un ordende magnitud mas lenta que la replicacion bacteriana. Los orfgenes facilitan la replicacion bidireccionaly tal vez se utilicen en un orden predeterminadodurante la fase S. Los orfgenes de S. cerevisiae tienenuna secuencia nuclear de consenso formada por 11pares de bases, en su mayor parte A-T.
Despues de la division celular, los nucleos de lascelulas eucarioticas tienen un factor de competenciaindispensable para iniciar la replica cion. Su destruccion despues de la iniciacion de la replicacion impide que ocurran cielos de replicacion posteriores enlas levaduras. El factor de competencia no puede serimportado al interior del nueleo desde el citoplasmay puede ser remplazado solo cuando la membrananuclear se rompe durante la mitosis.
En las levaduras, el origen es reconocido por lasprotefnas del ORC, las cuales permanecen unidasdurante el ciclo celular en las levaduras. La protefnaCdc6 esta disponible s610 en la fase S. En las levaduras es sintetizada durante la fase S y se degradacan rapidez. En las celulas animales se sintetiza demanera continua, pero es exportada desde el nucleodurante la fase S. La presencia de Cdc6 permite quelas protefnas MCM se unan al origen. Las protefnasMCM son indispensables para la iniciacion. La accion de las protefnas Cdc6 y MCM constituyen lafuncion de competencia.
Referencias
l1li Introduccion
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390 CAPITULO 15 El replicon
IIIJ Los replicones pueden ser lineales 0 circulares
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IIiII Es posible elaborar el mapa de los origenescon autorradiografia y electroforesis
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III!II Cada cromosoma eucar;otico contiene numerososreplicones
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1m En las Levaduras pueden aisLarse Los origenesde repLicacion
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Referencias 391
Retrovirus yretroposones
ESQUEMA DEL CAPITULO J
550
Introducci6n
El cielo vital de los retrovirus comprende sucesossimilares a la transposici6n• Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA de
cadena unica.• Un provirus integrado es una secuencia de DNA de cadena
doble.• Un retrovirus genera un provirus mediante transcripci6n
inversa deL genoma retrovirico.
Los genes retroviricos codifican poliproteinas• Un retrovirus caracteristico tiene tres genes: gag, pol y env.• Las proteinas Gag y PoL se traducen a partir de un producto
de transcripci6n de longitud completa del genoma.• La traducci6n de PoL requiere un cambio de marco por eL
ribosoma.• Env se traduce a partir de un RNAm individual que se
genera por fragmentaci6n.• Cada uno de los tres productos proteinicos es procesado
por proteasas para dar origen a multiples proteinas.
El DNA virieo se genera por transcripci6n inversa• Se repite una secuencia corta (R) en cada extrema deL RNA
virico, de manera que los extremos 5' y 3' corresponden aR-U5 y U3-R, respectivamente.
• La transcriptasa inversa inicia la sintesis cuando un RNAtcebador se une a un sitio distante de 100 a 200 bases delextremo 5'.
• Cuando La enzima alcanza eL extremo, Las bases 5'terminaLes deL RNA se fragmentan, 10 que expone eLextremo 3' del producto DNA.
• Los pares de bases expuestos del extremo 3' se aparean conel extrema 3' de otro genoma de RNA.
• La sintesis continua y genera un producto donde lasregiones 5' y 3' se repiten, Lo que da a cada extremo Laestructura U3-R-U5.
• Ocurren episodios similares de cambio de cadenas cuandola transcriptasa inversa utiliza el producto DNA paragenerar una cadena complementaria.
• El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanisme deselecci6n de copias de la recombinaci6n.
El DNA virico se integra al cromosoma• La organizaci6n del DNA provirico en un cromosoma
es la misma que en un transpos6n, donde el proviruses flanqueado por repeticiones directas cortas de unasecuencia en el sitio diana.
• EL DNA lineal se inserta en forma directa en eL cromosomadeL hospedador gracias a La acci6n de la enzima integrasaretrovi ri ca.
• Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extreLa secuencia retrovirica durante la reacci6n de integ
Los retrovirus pueden hacer transducci6n desecuencias celulares• Los retrovirus en proceso de transformaci6n se gene
un suceso de recombinaci6n donde una secuencia dlcelular sustituye a una parte del RNA retrovirico.
Los elementos Ty de las levaduras se asemejlos retrovirus• Los transposones Ty tienen una organizaci6n similar
los retrovi rus end6genos.• Los transposones Ty son retroposones con actividad
transcriptasa inversa que reaLizan transposici6n a trun intermediario de RNA.
Muchos elementos susceptibles de transposiresiden en Drosophila melanogaster• Copia es un retropos6n abundante en D. melanogast
Los retroposones son de tres elases• Los retroposones de La superfamilia virica son transl
que se desplazan a traves de un RNA que no constitparticula infecciosa.
• Algunos retroposones se asemejan de manera directretrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tiene
• Se pueden encontrar otros elementos que fueron geipor un episodio de transposici6n mediada por RNA,por si mismos no codifican enzimas que puedan cat,transposici6n.
• Los transposones y retroposones constituyen casi Ladel genoma humano.
La familia Alu tiene muchos miembrosmuy dispersos• Una parte importante deL DNA repetitivo en genoma
mamifero esta constituida por repeticiones de una sfamilia, organizadas como transposones y derivadasproductos de transcripci6n de la polimerasa III de R
Los seudogenes procesados se originaron cosustratos para la transposici6n• Un seudogen procesado se deriva de una secuencia
RNAm por transcripci6n inversa.
Las LIN ES utilizan una endonueleasa para gEun extremo con actividad cebadora• Las LINES no tienen LTR y para cebar La transcripci6
inversa requieren que eL retropos6n codifique unaendonucleasa que genere una hendidura.
Resumen
RNA
RNA
·······..................•
·••" .····INTRACELULAR
EXTRACELULAR 't
ru " En Los cidos reproductivos de Los retrovirus y Losretroposones se aLterna la transcripci6n inversa de RNA a DNAcon La transcripci6n de DNA a RNA. S6Lo Los retrovirus puedengenerar particulas infectantes. Los retroposones se confinan aun cido intracelular.
..
• Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA decadena unica.
• Un provirus integrado es una secuencia de DNA decadena doble.
• Un retrovirus genera un provirus mediante transcripci6ninversa deL genoma retrovirico.
••.......•............•· .·I··················
'of
Conceptos principaLes
Los retrovirus tienen genomas de RNA de cadenaunica que se replican gracias a un intermediario deDNA de doble cadena. El cicio vital de un virus comprende una etapa obligatoria en la que se insertaDNA de doble cadena en el genoma del hospedadorpor un episodio similar a la transposicion y que genera repeticiones directas cortas de DNA diana.
La importancia de esta reaccion rebasa la perpetuacion del virus. Algunas de sus consecuenciasson que:
• Una secuencia retrovfrica integrada en lalfnea germinativa se mantiene dentro delgenoma celular como provirus end6geno.Al igual que un bacteriofago Iisogenico, unprovirus actua como parte del material genetico del organismo.
ED El cida vital de los retroviruscamprende sucesas similaresa la transpasici6nLa transposicion que comprende un intermediario
obligatorio de RNA es una propiedad exclusiva delas eucariotas y proviene de la capacidad de los retrovirus de insertar copias de DNA (provirus) deun genoma virico RNA en los cromosomas de unaelula hospedadora. Algunos transposones eucario
ticos se relacionan con provirus retrovfricos en suorganizacion general y experimentan transposiciona traves de intermediarios de RNA. Como clase, eslOS elementos se llaman retroposones (0 a vecesretrotransposones) .
Los retroposones mas sencillos no tienen actividad de transposicion, pero presentan secuenciasque los elementos activos reconocen como sustratospara la transposicion. Por 10 tanto, los elementosque usan una transposicion independiente de RNAvan desde los retrovirus mismos (que tienen capacidad para infectar con libertad celulas hospedadoras), hasta secuencias con transposicion a traves deRNA, y hasta aquellos que por sf mismos no tienenla capacidad de transposicion. Comparten con todosos transposones la caracterfstica diagnostica de ge-erar repeticiones cortas directas de D A diana en
el sitio de una insercion.Incluso en genomas donde no se han detecta
o los transposones activos se encuentran vestigiose episodios antiguos de transposicion en forma de
repeticiones diana directas que flanquean secuencias repetitivas dispersas. Las caracterfsticas de estassecuencias a veces comprenden una secuencia deRNA como progenitora de la secuencia geonomicaDNA), 10 que sugiere que el RNA debe haberse
convertido en una copia de DNA duplex que se inserto en el genoma por un suceso similar a la trans
osicion.Como cualquier otro cicio de reproduccion, el
e un retrovirus 0 retroposon es continuo; es arbirrario considerar como "inicio" el punto donde se. terrumpe. No obstante, la manera de ver estoselementos es parciaL por la forma en que suelenobservarse (FIGURA 22.~).
Los retrovirus se consideraron primero partfculas vfricas infecciosas capaces de realizar transmision entre celulas y por ello se cree que el ciciointracelular (que comprende un DNA duplex) esun medio de reproduccion de virus RNA. Los retroposones se descubrieron como componentes delgenoma, y las formas de RNA se han definido en sumayor parte por sus funciones como RNAm. As!,los autores consideran a los retroposones como secuencias genomicas (de DNA duplex) que puedenrealizar transposicion dentro de un genoma; no migran entre celulas.
III Introducci6n
22.2 El cido vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposici6n 55:
LTR LTRDNA lineal ~rJ
~ Integraci6n
I !ranscripci6ntlnversa
ifili Los genes retrovlricoscodifican poliprotelnas
rentes, pero relacionados, es posible que genere pa:tfculas vfricas heterocigotas que portan un genoII::.-'.de cada tipo. La diploidia puede ser importante pacpermitir al virus adquirir secuencias celulares. Lc-,enzimas transcriptasa inversa e integrasa se tra .:>
portan con el genoma dentro de la partfcula vfricc.
RNAVV'
FIGURA 22.2 El cido vital retrovirico procede por transcripci6n inversa del genoma del RNA en DNA duplex, que se insertaen el genoma del hospedador para ser transcrito en RNA.
• En ocasiones se recombinan secuencias celulares con la secuencia retrovfrica y despues se transportan juntas; estas secuenciaspueden insertarse en el genoma como secuencias duplex en nuevas localizaciones.
• Las secuencias celulares que experimentan transposicion por un retrovirus puedencambiar las propiedades de una celula cuando se infecta can el virus.
Las particularidades del cido de vida de los retrovirus se ilustran en la FIGURA 22.2. Los pasos cruciales son que el RNA vfrico se convierte en DNA,el DNA se integra al genoma del hospedador, y despues, el provirus de DNA de transcribe en RNA.
La enzima encargada de generar la copia inicialde DNA a partir del RNA es la transcriptasa inversa. La enzima convierte el RNA en una cadenaduplex lineal de DNA en el citoplasma de la celulainfectada. El DNA tambien se convierte en formascirculares, pero estas no parecen involucradas enla replicacion.
El DNA lineal se abre camino hacia el nudeo.Una 0 mas copias de DNA se integran al genoma delhospedador. Una sola enzima, lJamada integrasa,se encarga de la integracion. El proyjrus es transcrito por la maquinaria del hospedador para producirRNA vfrico, que sirve como RNAm y como genomas para empaquetamiento dentro de viriones. Laintegracion es una parte normal del cido vital, indispensable para la transcripcion.
Dos copias del genoma RNA se empaquetan encada virion, 10 que hace a la particula vfrica individual eficazmente diploide. Cuando una celula esinfectada de manera simultanea por dos virus dife-
Conceptos principales
• Las proteinas Gag y Pol se traducen a partir de unproducto de transcripci6n de longitud completa delgenoma.
• La traducci6n de Pol requiere un cambio de marco porel ribosoma.
• Env se traduce a partir de un RNAm individual que segenera par fragmentaci6n.
• Cada uno de los tres productos proteinicos esprocesado par proteasas para dar origen a proteinasmultiples.
• Un retrovirus caracteristico tiene tres genes: gag, polenv.
Una secuencia retrovfrica usual contiene tres 0 cuatro "genes". (En este cantex to el termino genes s'usa para identificar regiones codificantes, cada u c.de las cuales en realidad da origen a multiples protefnas por reacciones de procesamiento.) Un gen rna retrovfrico habitual con tres genes se organiuen la secuencia gag-pol-env, como se indica en 1FIGURA 22.3.
El RNArn retrovfrico tiene una estructura co vencional; presenta una cubierta en el extrema 5'~
esta poliadenilado en el extrema 3'. Se represent.:.en dos RNArn. Se traduce la longitud total de RNpara dar lugar a las poliprotefnas Gag y Pol. EI pr ducto Gag se traduce mediante la lectura desde e:codon de iniciacion hasta el primer codon de ter·minacion. Este ultimo debe ser pasado por alto pareque Pol se exprese.
Diferentes virus utili zan mecanismos diverso,para avanzar y dejar atras al codon de terminacio.gag, conforme a la relacion entre los marcos delectura gag y pol. Cuando gag y pol se continuan, Iesupresion por un glutamil-RNAt que reconoce e:codon de terminacion permite La generacion de une.sola protefna. Cuando gag y pol estan en diferente~
marcos de lectura, tiene lugar un cambio de marcribosomico que genera una sola protefna. Por 10 general, la leetura completa es - 5% eficaz, de maneraque la protefna Gag supera por casi 20 tantos a laprotefna Gag-Pol.
vv
~ Transcripci6n
RNAV\r
552 CAPiTULO 22 Retrovirus y retroposones
· .. . ~ ."...Genoma virico
-1800-2900
170-1260
I-cpilio1/--F::;m:;::::r U3 .-/
10-80
J81~-1~0'-·US' gag·
-2000
Cada gen genera varios productos proteinicos
Supresi6n 0 cambio ,Ide marco en el procesamiento...extremo de gag
........._-==-==--=.,.,=== - ......EI empalme produce Traducci6n IRNA subgen6mico ...Traducci6n ~
procesamiento~
Procesamiento!Gag
PolQ
Envo
MA = matriz (entre la nucleocapside y la envoltura virica)CA = capside (principal componente estructural)NC = nucleocapside (que empaqueta el dfmero de RNA)
PR = proteasa (escinde Gag-Pol y Env)RT =transcriptasa inversa (sintetiza DNA)IN = integrasa (integra el provirus DNA al genoma)
SU = protefna de superficie (las espigas sobre el viri6ninteractuan con el hospedador)
TM =transmembrana (media la fusi6n virus-hospedador)
FIGURA 22.3 Los genes de los retrovirus se expresan como poliprotejnas, que son procesadas haciaproductos individuales.
La poliproteina Env se expresa par otros medias: el empalme genera un mensajero subgen6mico,mas carta, que se traduce en el producto Env.
El gen gag da origen a los componentes proteirucos del centro nucleoprotefnico del virion. El genpol codifica funciones encargadas de la sfntesis y recombinacion de acidos nucleicos. El gen env codificacomponentes de la envoltura de la partfcula, quetambien secuestra componentes de la membranacitoplasmica de la celula.
Los productos Gag, Gag-Pol y Env son poliprotefnas fragmentadas por una proteasa para liberarlas protefnas individuales que se encuentran en losviriones maduros. La actividad de proteasa es codificada por el virus en diversas formas: puede serparte de Gag 0 Pol y a veces adquiere la forma de unmarco de lectura independiente adicional.
La produccion de una partfcula retrovfrica comprende el empaquetamiento del RNA en el centro,su rodeo por proteinas de la capside y la extraccionpor presion de un segmento de membrana de lacelula del hospedador. En la FIGURA 22.4 se muestrala liberacion de partfculas infecciosas por ese me ..dio. El proceso se revierte durante la infeccion: unvirus infecta una nueva celula al fusionarse con sumembrana plasmatica y luego liberar el contenidodel virion.
FIGURA 22.<1 Los retrovirus (VIH) experimentan gemaci6n desde la membrana plasmatica de una celula infectada. Fotos porcortesia de Matthew A. Gonda, Ph.D., Chief Executive Officer,International Medical Innovations, Inc.
22.3 Los genes retroviricos codifican poliproteinas 553
Conceptos principales
F GI 2.. " El RNA retrovirico termina en repeticiones directas (R); elDNA lineallibre termina en LTR y el provirus concluye en LTR, acortadoscada uno por un par de bases.
fill El DNA VlrlCa se generapar transcripci6n inversa
duplex. Tiene una actividad de polimerasa que.permite sintetizar un DNA duplex a partir del prducto de transcripcion inversa de una sola cau:,na del RNA. La segunda cadena de DNA en es- o
estructura duplex se denomina cadena de D1'_positiva. Como adyuvante indispensable de es:.:actividad, la enzima tiene una actividad de RNA-'~
H, que puede degradar la porcion RNA del hili '.:RNA-DNA. Todas las transcriptasas inversas rerr-·vfricas comparten similitudes considerables de >secuencias de aminoacidos y se pueden reconoc::secuencias homologas en algunos otros retrop05-·nes.
En la FIGURA 22.5 se comparan las estructuras :.~
las formas de DNA del virus con el RNA. El R:-.vfrico tiene repeticiones directas en sus extrem :Esos segmentos R varfan de lOa 80 nucleotidos ediferentes cepas de virus. La secuencia del extrec.::5' del virus es R-D5 y la secuencia en el extrem ~
es U3-R. Los segmentos R se usan durante la conY~sian de la forma de RNA a la de DNA para gener=..:las repeticiones directas mas extensas que se obs~
van en el DNA lineal (FIGURA 22 6 Y FIGURA 22.7). :::...acortamiento de 2 bp en cada extrema de la forr:::: 0
integrada es consecuencia del mecanismo de integEcion (vease la Figura 22.9).
Al igual que con otras polimerasas de DNA. -0
transcriptasa inversa requiere un cebador. El cebc:.dar natural es el RNAt. Hay un RNAt del hospe ."dor, sin carga, en el virion. Se aparea una secueD 'de 18 bases en el extrema 3' del RNAt con las ( rrespondientes en un sitio que se encuentra a 10C :.200 bases de distancia del extremo 5' de una de .~
moleculas de RNA vfrico. El RNAt puede tambiaparear sus bases con un sitio cercano al extre 5' del otro RNA vfrico, 10 que ayuda a la formaci'·de un dfmero entre los RNA vfricos.
He aquf un dilema: la transcriptasa inversa iL.:.cia la sfntesis del DNA en un sitio apenas 100 a 2C =bases en sentido descendente respecto del extre5'. LComo puede generarse el DNA que represe :~
el genoma intacto de RNA? (Esta es una variac~
extrema del problema general en la replicacion ""los extremos de cualquier acido nucleico lineal; ve=.se la seccion 16.2, Los extremos del DNA lineal sc;:un problema para la replicacion.)
La sfntesis in vitro avanza hasta el final y genera una secuencia de DNA breve llamada DK_-.de detencion fuerte-negativo. Esta molecula no :encuentra in vivo porque la sfntesis continua por:"::reaccion ilustrada en la Figura 22.6. La transcripta.=inversa cambia de moldes y se lleva al DNA nade .'con ella a un nuevo molde. Este es el primero '::dos saltos entre moldes.
En esta reaccion, la region R en el extrema ::del molde de RNA es degradada por la activid".::.
ILTR
U3 RU5-,
U5 ha perdido 2 bp
U3 R-1Q-80~-=':';'---
-1800 I170-1260
pol
pol
. ... . . .
-2900
eol
RNAvfrico
Forma lineal del DNA vfrico
-2000
gag
Forma de DNA vfrico integrado
U3 RU5 gag- -,
ILTR
250-1400 bp
Los retrovirus se denominan virus de cadenapositiva porque el propio RNA vfrico codifica losproduetos proteinicos. Como su nombre 10 indica,la transcriptasa inversa se encarga de convertir elgenoma (cadena RNA positiva) en una cadena complementaria de DNA que se denornina cadena deDNA negativa. La transcriptasa inversa tambiencataliza etapas posteriores de la produccion del DNA
• Se repite una secuencia corta (R) en cada extremo delRNA virico, de manera que los extremos 5' y 3' seanR-U5 y U3-R, respectivamente.
• La transcriptasa inversa inicia la sintesis cuando unRNAt cebador se une a un sitio distante de 100 a 200bases del extremo 5'.
• Cuando la enzima alcanza el extremo, las bases 5'terminales del RNA se fragmentan, lo que expone elextremo 3' del producto DNA.
• Los pares de bases expuestos del extremo 3' se apareancon el extremo 3' de otro genoma de RNA.
• La sintesis continua y genera un producto donde lasregiones 5'y 3' se repiten, lo que da a cada extremo laestructura U3-R-U5.
• Ocurren episodios simi lares de cambio de cadenascuando la transcriptasa inversa utiliza el producto DNApara generar una cadena complementaria.
• El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanisme deselecci6n de copias de la recombinaci6n.
10-80 -':RU5
T80-100
Repetici6n de 4-6 bpdel DNA diana
. .~ . .
U3 ha perdido 2 bp
_----.-.1Hospedado U3 RU gag
554 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
. .. .. ~ .
EI retrovirus provee la cadena positiva de RNA
R U5 • U3 Fl.5'· ~ I - '3'
5'
5'3'
5'
5'3'
5'
3'
5'
3'
.... LTR.....
m:rmrrmrrm1l············,U········
5'.LUConcluye la sfntesis del DNA decadena negativa
3' I I I "'TtFlr"FrrFlr""tIFFr""rrFFu"'r""rRn5'~·
....LTR~
5e degrada el RNA y quedan fragmentos Iresiduales para cebar la sfntesis de DNA .-
3'
Se retira el RNAI cebador3'
5'Concluye la sintesis de la cadenapositiva de DNA
3' 'rrrrrrrrrrrrrrrrr
Se sintetiza la cadena positiva dedetenci6n fuerte del DNA
~~ .~EI DNA de cadena positiva se transfiereal otro extrema de la cadena negativa ~en el segundo saito
3' ",.""",'FFlF"""'C'F'FI__rrtfrr.rrrmrrrn
3'
!
!
Se degrada la regi6n 5'terminal de la cadena )?de RNA
3'e~t~:~oo- 5' :!ol;;.~~IJJi!!:![J;i:!!Jj:!!!E~!:!E:!:I!:!U~f:!:Mi!:·!.!U!:!l~l~.3'
EI RNAt cebador hibridiza al sitiode uni6n sobre el RNAretrovirico ~
R U5&. U3 R5' . -, IiLIilLliUiULJ1l1.W 3'
La transcriptasa inversa inicia la sfntesis del DNA
de cadena negativa lr !• Cadena negativa'
3' .5' ruurn
IuL, I La slntesis de la cadena positiva de DNA requiereun segunda salta.
FIGURA 22.6 Se genera la cadena DNA negativa por media delcambia de molde durante la transcripcion inversa.
de RNAasa H de la transcriptasa inversa. Su retiropermite que la region R en el extrema 3' realiceapareamiento de bases con el DNA recien sintetizado. La transcripcion inversa continua despues porla region U3 hacia el cuerpo del RNA.
El origen de la region R que se aparea con elDNA de detencion fuerte-negativo puede estar enel extrema 3' de la misma molecula de RNA (apareamiento intramolecular), 0 el extrema 3' de unamolecula diferente de RNA (apareamiento intermolecular). Se usa el cambio a un molde diferente deRNA en la figura porque hay datos de que la secuencia del RNAt cebador no se hereda en un cidode vida del retroposon. (Si ocurriese apareamientointramolecular, se esperarfa que la secuencia se heredara porque ofrecerfa la {mica fuente para la secuencia de union del cebador en el siguiente cido.El apareamiento intermolecular permite que otroRNA retrovfrico provea esta secuencia.)
El resultado del cambio y la extension es la adicion de un segmento U3 al extrema 5'. El segmento de secuencia U3-R-U5 se denomina repetici6nterminallarga (LTR) porque una serie similar deepisodios afiade un segmento U5 al extrema 3' y dalugar a la misma estructura de U5-R-U3. Su longitud varfa de 250 a 1400 bp (vease la Figura 22.5).
Ahora se necesita generar la cadena de DNApositiva y la LTR en el otro extremo. La reaccion semuestra en la Figura 22.7. La transcriptasa inversaceba la sfntesis de la cadena positiva de DNA a partir de un fragmento de RNA que queda despues dedegradar la molecula original de RNA. Se generauna cadena de DNA de detencion fuerte-positivocuando la enzima alcanza el extrema del molde.Este DNA se transfiere entonces al otro extremo deuna cadena negativa, donde tal vez se libere graciasa una reaccion de desplazamiento cuando ocurrauna segunda ronda de sfntesis de DNA a partir deun fragmento cebador en ubicacion mas alta (a suizquierda en la figura). Se hace uso de la regionR para el apareamiento con el extrema 3' de unacadena de DNA negativa. Este DNA de doble cadena requiere entonces conduir ambas cadenas paragenerar una LTR duplex en cada extremo.
22.4 El DNA virica se genera par transcripci6n inversa 555
nismo para la recombinacion en general. Es p :::probable que se emplee en sistemas celulares, pcconstituye una base COmlIn para la recombinac.::durante la infeccion por virus RNA, incluso aql.:.;:lIos que se replican de manera exclusiva a traves-;:formas RNA, como los de la poliomielitis.
El cambio de cadenas ocune con cierta frecue::::cia durante cada ciclo de transcripcion inversa, :::decir, ademas de la reaccion de transferencia q:..;:es forzada en el final de la cadena del molde. :::.principio se ilustra en la FIGURA 22.8, si bien no ::sabe mucho del mecanismo. Ocune transcripci6=inversa in vivo en un complejo de ribonucleoprotc-·nas, donde la cadena molde de RNA se une a co ponentes del virion, incluida la principal prote~de la capside. En el caso del VIR, la adicion de es-..=:proteina (NCp7) a un sistema in vitro causa recomb:nacion. El decto es probablemente indirecto: NCp·afecta la estructura del molde de RNA, 10 que a s-_vez altera la posibilidad de que la transcriptasa ir:.versa cambie de una cadena molde a otra.
3'
, ..
La enzima se une a Iun nuevo molde t
5" -
5'.u..u..r..r '
. .. ".. "
La enzima se disocia Idel molde t
5,~~~~m!1~
Se reinicia la Itranscripci6n tinversa
La transcriptasa inversasintetiza la cadena de DNA
5'_-====-"",-~",~=-=-_3'
FIGURA 22.8 La recombinaci6n con selecci6n de copias tienelugar cuando la transcriptasa inversa libera su molde y reiniciala slntesis de DNA utilizando uno nuevo. Es probable que latransferencia entre las cadenas del molde ocurran de maneradirecta, pero aqui se muestra en pasos independientes parailustrar el proceso.
Ell El DNA virieo se integraal eromosoma
Conceptos principales
Cada panlcula retrovirica pona dos genomasde RNA. Esto hace posible que ocuna la recombinacion durante un ciclo vital virico. En principia,esto pudiese presentarse durante la sintesis de lascadenas negativa, positiva, 0 de ambas.
• El apareamiento intermolecular que semuestra en la Figura 22.6 permite que ocurra una recombinacion entre secuencias delos dos moldes sucesivos de RNA cuandose sintetiza la cadena de DNA negativa. Larecombinacion retrovirica es en su mayorparte debida a la transferencia de cadenasen esa etapa, cuando se traslada la cadenanaciente de DNA de un molde de RNA aotro durante la transcripcion inversa.
• Se puede sintetizar DNA de cadena positiva de manera discontinua en una reaccionque comprende varias iniciaciones internas.Puede haber tambien transferencia de cadenas durante esta reaccion, perc es menosfrecuente.
La caracteristica comLin de ambos episodios esque la recombinacion es consecuencia de un cambiode molde durante el acto de la sintesis de DNA. Istees un ejemplo general de un mecanismo de la recombinacion lIamado selecci6n de capia. Durantemuchos anos se considero como un posible meca-
• La organizaci6n del DNA provirico en un cromosoma esla misma que en un transpos6n, donde el provirus esflanqueado por repeticiones directas cortas de unasecuencia en el sitio diana.
• El DNA lineal se inserta en forma directa en elcromosoma del hospedador gracias a la acci6n de laenzima integrasa retrovirica.
• Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extremode la secuencia retrovirica durante la reacci6n deintegraci6n.
La arganizacion del provirus integrado se asemejaa la del DNA lineal. Las LTR en cada extremo delprovirus son identicas. EI extrema 3' de U5 consta de una repeticion corta invertida con relacional extrema 5' de U3, de manera que la LTR mismatermina en repeticiones cortas invertidas. El DNAprovfrico integrado es como un transposon: la secuencia provirica termina en repeticiones invertidas y flanqueada par repeticiones cortas directas delDNA diana.
Se genera el provirus cuando se inserta de manera directa un DNA lineal a un sitio diana. (Ademas del DNA lineal hay formas circulares de lassecuencias vfricas.) Una tiene dos secuencias LTRadyacentes generadas por la union de los extremoslineales. La otra tiene solo una LTR, al parecer generada por un episodio de recombinacion y que enrealidad constituye la mayor parte de los drculos.
556 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
-
Durante mucho tiempo parecio que el cfrculo podrfa ser una integracion intermedia (por analogiacon la integraci6n del DNA A; hoy se sabe que seusa la forma lineal para la integracion) .
La integracion del DNA lineal es catalizada parun producto virico unico, la integrasa, que actua enel DNA lineal retrovfrico y el DNA diana. La reaccion se ilustra en la FIGURA 22.9.
Los extremos del DNA virico son importantes.Par ejemplo, las mutaciones en los extremos de lostransposones impiden la integracion. La caracteristica mas conservada es la presencia de una secuenciadel dinucleotido CA cerca del extremo de cada repeticion invertida. La integrasa une los extremos delDNA lineal en un complejo ribonucleoproteinico ydespues convierte los extremos romos en otros enrecesion por el retiro de bases mas alIa del CA quese conserva. En general esto implica la perdida dedos bases.
Se eligen sitios diana en forma aleatoria conrespecto a la secuencia. La integrasa hace cortes escalonados en un sitio diana. En el ejemplo de laFigura 22.9 los cartes estan separados por 4 bp. Lalongitud de una repeticion diana depende del virusparticular; puede ser de 4, 5 0 6 bp. Al parecer se
etermina por la geometria de la reaccion de la in:egrasa con el DNA diana.
Los extremos 5' generados por la fragmentacion del DNA diana presentan union covalente con-os extremos 3' en recesion del DNA virico. En ese~unto ambos extremos del DNA vfrico se unen par
na cadena al DNA diana. La region de una sola caena es reparada par enzimas de la celula del hos
pedador, y durante esta reaccion se retiran las dosJases que protruyen en cada extrema 5' del DNA1rico. El resultado es que el DNA virico integradoha perdido 2 bp en cada LTR; esto corresponde a_a perdida de 2 bp desde el extremo izquierdo delU3 terminal y a la perdida de 2 pb desde el extre:no derecho del U5 3' terminal. Hay una repeticioni:aracterlstica corta directa del DNA diana en cadaextrema de un genoma retrovfrico integrado.
El DNA virico se integra al genoma del hospeda-or en sitios seleccionados en forma aleatoria. Una
-Bula infectada recibe de una a 10 copias del provi:us. (Un virus infeccioso entra al citoplasma, por supuesto, pero la forma de DNA se integra al genoma::'n el nucleo.) Los retrovirus pueden replicarse solo en.::elulas proliferantes porque el ingreso al nucleo re.:J.uiere que la celula pase por la mitosis, cuando el~enoma virico logra el acceso al material nuclear.
La region U3 de cada LTR porta un promotor.::::1 promotor en la LTR izquierda se encarga del inijo de la transcripcion del provirus. Recuerdese que~e requiere la generacion del DNA provfrico para'lbicar una secuencia de U3 en la LTR izquierda;
A ,... • ~.. ......
1. La integrasa genera dos ex1remos 2. La integrasa genera extremos3' con retraso de dos bases en LTR escalonados en el DNA diana
3. La integrasa vincula los extremos 3'can retraso de LTA a los ex1remos 5'escalonados de la diana
I~UPA 22 9 La integrasa es la (Jniea proteina viriea neeesariapara la reaeei6n de integraei6n, donde eada LTR pierde 2 bp yse inserta entre repetieiones de 4 bp del DNA diana.
por 10 tanto, se observa que el promotor es, de hecho, generado par la conversion del RNA en DNAduplex.
A veces (tal vez con muy poca frecuencia), elpromotor en la LTR derecha facilita la transcripcionde las secuencias del hospedador cercanas al ciclode integracion. La LTR tambien !leva un reforzadar(una secuencia que activa a los promotores vecinos), que puede actuar sobre las secuencias celulary vfrica. Tal vez a la integracion de un retrovirus sedeba que una celula hospedadora pase a un estadotumorigenico cuando se activan ciertos tipos de genes en esta forma. i-Se pueden escindir del genomalos provirus integrados? Podria ocurrir recombinacion homologa entre las LTR de un provirus; hayLTR solitarias presentes en algunos genomas celulares que podrian constituir vestigios de un episodiode escision,
Hasta ahora se han analizado los retrovirus enterminos del cicIo infectante, donde se necesita integracion para la produccion de mas copias de RNA.No obstante, cuando un DNA virico se integra ala linea germinativa se convierte en un "provirusendogeno" originado en el organismo. Los virus endogenos por 10 general no se expresan, pero en ocasiones son activados por episodios externos, comouna infeccion con otro virus.
22.5 El DNA virieo se integra al eromosoma 557
cias celulares en la forma ilustrada en la FIGL
2 .1J. Parte de la secuencia virica ha sido sustituipor el gen v-onc. La sintesis de proteinas genera - =Gag-v-One en lugar de las proteinas usuales Gc.:Pol y Env. El virus resultante presenta un defet:to de la replicacion; no puede mantener un cicinfectante por si mismo. Sin embargo, puede pe:-petuarse en compania de un virus auxiliar, q'~:
proporeiona las funeiones virieas faltantes.Las siglas Onc constituyen una abreviatura ~:
oncogenesis, la eapaeidad de transformar eelul::..eultivadas de manera que se liberen de la regulaei habitual del crecimiento y sea posible su divisi'-:inestrieta. Los genes onc virico y celular pueden .~.
causa de la aparicion de eelulas tumorigenieas.Un gen v-onc confiere a un virus la eapaeidad'::
transformar un cierto tipo de celula hospedador::..Los loci con secueneias homologas que se eneue-·tran en el genoma del hospedadar corresponder: ~
genes c-onc. i.. Como adquieren los retrovirus gen::onc? Una caracteristiea reveladora es la discrepCL:'cia en las estructuras de los genes c-onc y v-onc. Lgenes c-onc por 10 general son interrumpidos por i-
trones, en tanto los v-onc no son interrumpidos. E5:.sugiere que los genes v-onc se ariginan de capias .::.:los genes c-onc empalmadas al RNA.
En la HGLP 2 11 se ilustra un modelo para :.=formacion de los virus en transformacion. Un cttrovirus presenta integracion eerca de un gen c-c"Tiene lugar una delecion que origina fusion del p~'.virus al gen c-onc; la transeripcion genera enton(~
un RNA unido que eontiene secueneias virieas cun extremo y secuencias eelulares onc en el OL~El empalme retira los intrones de las partes viri~
y celular del RNA. El RNA tiene las senales apepiadas para el empaquetamiento dentro del viric=se generaran viriones si la celula tambien cantic:otra copia intaeta del provirus. En este punto, 315'de las partfculas vfricas diploides puede eontener =RNA fusionado y un RNA vfrico.
Una reeombinacion entre estas secuencias '.drfa generar el genoma de transformacion, don.::.:hay repetieiones viricas en ambos extremos. (Gcne eon freeuencia alta la reeombinacion par \::..rios medios durante el eielo infectante retroviricNo se sabe nada aeerca de sus requerimientos .::.:homologia en los sustratos, pero se supone que reaccion no homologa entre un genoma viricc la parte eelular del RNA fusionado proeede por~
mismos meeanismos que se eneargan de la reco=.binaeion viriea.)
Las earacteristieas eomunes de todas las ela :::de retrovirus sugieren que pueden derivarse de '_ancestro unieo. Los elementos de las seeuencias 'insereion (IS) primordiales podrian haber rodea.::.a un gen de polimerasa de acido nueleico del he
I Transcripci6n det otro provirus
Empaquetado en el viri6n
/l Empalme
Recombinaci6n del RNAl
Concepto principal
• Los retrovirus transformantes se generan par unepisodio de recombinaci6n donde una secuencia deRNA celular sustituye parte del RNA retrovirico.
Transcripci6n a partir dellprovirus can deJeci6n t
Los virus en transformaci6n can replicaci6ndefectuosa presentan sustituci6n de una secuencia celular paruna parte de la secuencia virica. El virus defectuoso puedereplicarse can la ayuda de un virus auxiliar que realiza lasfunciones naturales.
Virus auxiliarRU5.:9~9':~.~~·--:.-:-=0"1=-=~':;:;;;;;;;;;-;'U3~""R
I Las proternas del" virus auxiliar
M ~~pueden lograr·····la replicaci6n delvirus defectuoso
ED Los retrovirus pueden hacertransducci6n de secuenciascelulares
Virus defectuosoRU5 'gag ~~~~~~~~U3~RR~.
. . .....
Una informacion interesante acerca del cielo vitalvirico surge de la aparicion de virus de transduccion, que son variantes que han adquirido secuen-
..--- Provirus I ( gen e-one .......
LTR gag pol env LTR Ex6n Intr6n Ex6nW'A.~:wr'l.~~~~~~~gMj
DELECION
Se pueden generar genes can replicaci6n defectuosamediante la integraci6n y deleci6n de un genoma virico para obtenerun producto de transcripci6n celular-virica unido, que se empaquetacon un genoma normal de RNA. Se necesita recombinaci6n no hom6logapara generar el genoma de transformaci6n can replicaci6n defectuosa.
558 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
pedador; la unidad resultante tendrfa la forma deLTR-pol-LTR, que pudiese evolucionar hacia un virus infectante por la adquisicion de habilidades mascomplejas para manipular sustratos tanto de DNAcomo de RNA, incluida la incorporacion de genescuyos productos permitieran el empaquetamientodel RNA. Otras funciones, como la transformacionde genes, podrian incorporarse despues. (No haymotivo para suponer que el mecanismo involucradoen la adquisicion de funciones celulares sea exc1usivo de los genes one; no obstante, es posible que losvirus que portan estos genes tengan una ventajaselectiva debido a su efeeto estimulador del crecimiento celular.)
III Los elementos Tyde las levaduras se asemejana los retrovirus
Conceptos pr;nc;pales
• Los transposones Ty tienen una organizaci6n similar ala de los retrovirus end6genos.
• Los transposones Ty son retroposones con act;v;dadde transcriptasa inversa que realizan transposici6n atraves de un intermediario de RNA.
Los elementos Ty constituyen una familia de secuencias repetitivas dispersas de DNA que se encuentran en sitios diversos de cepas disimiles delevaduras. Las siglas Ty corresponden a una abreviatura de "transposones de levadura" (del ingles,transposon yeast, Ty). Un episodio de transposicionda origen a un vestigio caracterfstico: 5 bp del DNAdiana se repiten a cada lado del elemento Ty insertado. Los elementos Ty son retroposones querealizan la transposicion por el mismo mecanismoque los retrovirus. La frecuencia de la transposicionTy es menor que la de gran parte de los transposonesbacterianos, -10-7-10-8 •
Hay mucha divergencia entre los distintos elementos Ty. Casi todos entran en una de dos clasesprincipales llamadas Ty1 Y Ty917. Tienen la mismaorganizacion general ilustrada en la T "lJ , ....
Cada elemento tiene 6.3 kb de longitud; los liltimos330 bp en cada extrema constituyen repeticionesdirectas llamadas 8. Cada uno de los elementos Tyde cada tipo tiene muchos cambios respecto del prototipo de su clase, como las sustituciones, inserciones y deleciones de pares de bases. Hay - 30 copiasdel tipo Ty1 Y-6 del tipo Ty917 en un genoma caracteristico de levadura. Ademas, hay -100 elementosdelta independientes llamados 8 solo.
Las secuencias delta tambien muestran muchaheterogeneidad, si bien es posible que las dos repe-
~----=~---:~==;;.....I) lyA lyS
--- RNA de 5.7 kb ----l.~
---RNA de 5.0 kb-.
Proteina TyA
Cambio de marco
2 12 Los elementos Ty terminan en repeticionesdirectas cortas y se transcriben en dos RNA superpuestos. Tienen dos marcos de lectura con secuencias relacionadas con losgenes retroviricos gag y pol.
ticiones de un elemento individual Ty sean identicas,o al menDs con una relacion muy cercana. Las secuencias delta vinculadas con elementos Ty muestranmayor conservacion de secuencias de los elementosdelta solo, 10 que sugiere que el reconocimiento de lasrepeticiones participa en la transposicion.
El elemento Ty se transcribe en dos especies deRNA poli(Aj+, que constituyen >5% del RNAm totalde una celula haploide de levadura. Ambas especiesinician en el interior de un promotor en el elemento8 en el extremo izquierdo. Uno termina despues de5 kb; el otro 10 hace despues de 5.7 kb, dentro de lasecuencia 8 en el extrema derecho.
La secuencia del elemento Ty tiene dos marcosde lectura abiertos que se expresan en la mismadireccion, pero se leen en fases diferentes y se superponen por 13 aminoacidos. La secuencia de TyAhace pensar que codifica una proteina de union alDNA. La secuencia de TyB contiene regiones conhomologfas con las secuencias transcriptasa inversa,proteasa e integrasa de los retrovirus.
La organizacion y las funciones de TyA y TyBson analogas de la conducta de las funciones gag ypol retrovfricas. Los marcos de lectura TyA y TyB seexpresan en dos formas. La protefna TyA representael marco de lectura TyA y termina en su extremo.Sin embargo, el marco de lectura TyB se expresa solocomo parte de una proteina de union, donde la region TyA se fusiona con la region TyB gracias a unepisodio especifico de cambio de marco, que permitepasar por alto el codon de terminacion. (Esto es analogo a la traduccion de gag-pol en los retrovirus.)
La recombinacion entre elementos Ty pareceocurrir en salvas; cuando se deteeta un episodiohay una mayor probabilidad de encontrar otros.
22.7 Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus 559
Se marca una unidad delta
Elemento Ty de inicio
EI promotor precede al elemento; se agregael intr6n
La transposicion da como resultado la aparicion -multiples copias del transposon en el genoma delevadura, pero todas las copias carecen del intr6,
Se conoce solo una forma de retirar intrones: e:empalme de RNA 10 que hace pensar que la tra- .posicion tiene lugar por el mismo mecanismo _-.en los retrovirus. EI elemento Ty se transcribe a:...::RNA que es reconocido por el aparato de desdob:c::miento. Una transcriptasa inversa reconoce el R.: -_desdoblado y regenera una copia de DNA duplex:
La analogfa con los retrovirus continua toda- mas. EI elemento Ty original tiene una diferenc.::de secuencia entre sus dos elementos delta. Sin e-bargo, los elementos donde ocunio transposiciL poseen secuencias delta identicas, que se derivan c.~
delta 5' del elemento original. Si se considera a .secuencia delta exactamente como una LTR, CO-
sistente en las regiones U3-R-U5, el RNA de Tr ~=
extiende de una region R a otra. Asf como se mue>tra para los retrovirus en las Figuras 22.3 a 22.6. ~
regenera la LTR completa cuando se agrega un i.-=al extremo 3' y un U3 al extremo 5'.
La transposici6n es controlada por genes de-·no del elemento Ty. El promotor GAL utilizado PeL':'controlar la transcripcion del elemento Ty marca C
es inducible: se activa con la adicion de galactosa. - =
induccion del promotor tiene dos efectos. Es neccsario activar la transposici6n del elemento marcac.y esta tambien aumenta la frecuencia de transpo~
cion de los demas elementos Ty en el cromoso =de la levadura, 10 que implica que los productos -~
elemento Ty pueden actuar en conformacion tTC.'
sobre otros elementos (en realidad sobre sus RNEl elemento Ty no da origen a partfculas infe.:.
ciosas, pero se acumulan partfculas similares a virc:(del ingles virus-like particles, VLP) en el interior c=las celulas donde se ha inducido la transposici6Las partlculas, que se pueden observar en la FIGL22.14, contienen RNA de longitud completa, D1\_-.de doble cadena, actividad de transcriptasa inver~~
y un producto TyB con actividad de integrasa. :::..producto TyA es fragmentado como un precurs :gag para producir las protefnas centrales madura.idel VLP. Esto aumenta todavfa mas la analogfa entre:el transpos6n Ty y los retrovirus. En resumen, t
elemento Ty actua como un retrovirus que perillsu gen env y, por tanto, no puede empaquetar bie:::.su genoma.
No todos los elementos Ty de cualquier genorP-~
de levadura estan activos: la mayor parte de ellos h::perdido la capacidad de transposicion (y son anilogos a provirus endogenos inertes). No obstanteestos elementos "muertos" conservan las repetici nes delta y, en consecuencia, proveen dianas par::la transposicion en respuesta a las protefnas sinte·tizadas por un elemento activo.
·.-
Intr6n
~*
Promotor
Sustituci6n de bases
I*~
Los elementos con transposici6n tienendeltas notorias, sin intr6n
Hay conversion genetica entre elementos Ty en diferentes localizaciones, con el resultado de que unoes "sustituido" por la secuencia del otro.
Los elementos Ty pueden escindirse medianterecombinacion homologa entre las secuencias deltade repeticion directa. Es posible que el gran numerode elementos 8 solo constituya un vestigio de dichosepisodios. Una escision de esta naturaleza puedeasociarse a la reversion de una mutacion causadapor la insercion de Ty; el grado de reversion puededepender de las secuencias delta exactas que quedaron atras.
Es una paradoja que ambos elementos deltatengan la misma secuencia y, no obstante, un promotor esta activo en el delta de un extremo y unterminador esta activo en el delta del otro extremo.(Se encuentra una caracterfstica similar en otroselementos susceptibles de transposicion, incluidoslos retrovirus.)
Los elementos Ty son retroposones caracterfstieos, ya que realizan transposicion a traves de unintermediario de RNA. En la FIGuRA 22 13 se incluyeun esquema ingenioso que permite detectar esteepisodio. Se inserto un intron en un elemento paragenerar una secuencia Ty exclusiva. Esta secuenciase coloco bajo el control de un promotor GAL en unplasmido y se introdujo en las celulas de levaduras.
f v A 2". 3 Un elemento Ty unico sometido a procesos deingenieria para contener un intr6n, experimenta transposici6npara formar capias que carecen del intr6n. Las copias pose enrepeticianes terminales identicas, que se generan desde unode los extremos del elemento Ty original.
560 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
FIGURA 22.14 Los elementos Ty generan particulas similares avirus. Reproducida de J. Mol. BioI., vol. 292, AL-Khayat H. A.,et al., Yeast Ty retrotransposons... , pp. 65-73. Copyright 1999,con autorizaci6n de Elsevier. Foto por cortesia del Dr. Hind A.AL-Khayat Imperial College London, United Kingdom.
III Muchos elementos susceptiblesde transposici6n residenen Drosophila melanogaster
Concepto principal
• [apia es un retropos6n abundante en Drosophilamelanogaster.
La presencia de elementos susceptibles de transposicion en D. melanagaster se dedujo por primera vezdespues de observaciones analogas a aquellas conque se identificaron las primeras secuencias de insercion en E. cali. Se encuentran mutaciones inestablesque revierten al tipo silvestre por deleci6n, 0 quegeneran deleciones del material de los flancos conun punta terminal en el sitio de origen de la mutacion. Son causadas por varios tipos de secuenciassusceptibles de transposicion, que se ilustran en laFIGURA 22 15. Estas secuencias incluyen al retroposon capia, la familia FB y los elementos P analizadosantes en la seccion 21.14, Participacion de los elementos susceptibles de transposicion en la disgenesiade hfbridos.
La familia mejor descrita de retroposones escapia. Su nombre refleja la presencia de un grannumero de secuencias relacionadas muy de cercaque codifican abundantes RNAm. La familia capiase toma como paradigma para varios otros tipos deelementos con secuencias que no tienen relacion,pero cuya estructura y conducta general parecensimilares.
EI numero de reproducciones del elemento ca9ia depende de 1a cepa de 1a mosca; por 10 general esde entre 20 y 60. Los integrantes de la familia estan
Repeticiones directas
~~20-60 capias
Repeticianes invertidas
Repeticiones invertidas largas
-----~_.._..FB
-30 capias
Repeticiones invertidas cortas
r----~ 2900 bp _
P ~oa -50 capias
HGURA 22 lS Tres tipos de elementos de transposici6n en D.melanogaster tienen diferentes estructuras.
bastante dispersos. Las localizaciones de los elementos capia muestran un espectro diferente (si bien consuperposicion) en cada cepa de D. melanagaster.
Estas diferencias han surgido durante periodosevolutivos. Las comparaciones de cepas que hantenido divergencia en fechas recientes (durante losultimos 40 afios) como resultado de su propagacionen ellaboratorio revelan pocos cambios. No se puede calcu1ar e1 ritmo del cambio, pero la naturalezade los sucesos subyacentes queda de manifiesto porel resultado de las celulas que crecen en cultivo. EInumero de elementos capia por genoma aumentade manera sustanciaL hasta el triple. Los elementosadicionales representan inserciones de secuenciascapia en sitios nuevos. La adaptacion al cultivo en alguna forma desconocida aumenta de manera transitoria la tasa de transposicion dentro de los lfmitesde 10-3 a 10-4 episodios por generacion.
EI elemento capia tiene -5 000 bp de longitud,con repeticiones directas terminales identicas de 276bp. Cada una de las repeticiones directas termina enrepeticiones invertidas relacionadas. Una repeticiondirecta de 5 bp de DNA diana se genera en el sitiode insercion. La divergencia entre cada uno de losintegrantes de la familia capia es pequefia, de <5%;las variantes suelen contener pequefias deleciones.Todas estas caracterfsticas son comunes a otras familias sirnilares a copia, si bien sus miembros individuales muestran mayor divergencia.
La identidad de las dos repeticiones directas decada elemento capia indica gue interactLlan parapermitir sucesos de correccion 0 que ambas son generadas a partir de una de las repeticiones directasde un elemento progenitor durante la transposicion.
22.8 Muchos elementos susceptibles de transposici6n residen en Drosophila melanogaster 561
Como en el caso similar de los elementos Ty, estohace pensar en una relacion con los retrovirus.
Los elementos capia en el genoma siempre estanintactos; no se han detectado copias individuales delas repeticiones terminales (aunque seria de esperarque se generasen si la recombinacion produjese delecion del material interpuesto). En ocasiones se encuentran elementos capia en forma de DNA circularlibre; al igual que los circulos de DNA retrovirico, suforma mas prolongada tiene dos repeticiones terminales y la mas corta tiene solo una. Se han comunicado particulas que contienen RNA de capia.
La secuencia capia contiene un solo marco delectura largo de 4227 bp. Hay homologias entrepartes del marco de leetura abierta de capia y lassecuencias gag y pal de los retrovirus. Es notablela ausencia de las homologias de alguna relacioncon secuencias retroviricas env indispensables parala envoltura del virus, 10 que significa que es pocoprobable que capia pueda generar particulas similares a virus.
Los productos de transcripcion capia se encuentran como RNAm poli(A», que representa productos de transcripcion de longitud total y parcial. LosRNAm tienen un extremo 5' COmLll1 derivado dela iniciacion a la mitad de una de las repeticionesterminales. Se producen varias proteinas, tal vezgracias a episodios como el empalme de RNA y lafragmentacion de poliprotefnas.
No se cuenta con pruebas directas del modo detransposicion de copia; como resultado, hay tantassimilitudes can la organizacion retrovirica que parece inevitable que copia tenga un origen relacionadocon los retrovirus. Es dificil decir cuantas funcionesretroviricas posee capia. Se sabe, por supuesto, queefectua transposicion, pero (como en el caso de loselementos Ty) no hay pruebas de que tenga algunacapacidad infecciosa.
.. .- . ~ -
ED Los retroposonesson de tres clases
Conceptos principales
• Los retroposones de la superfamilia virica sontransposones que se desplazan a traves de un RNA que
no constituye una particula infecciosa.
• Algunos retroposones se asemejan de manera directa aretrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tienen
LTR.
• Se pueden encontrar otros elementos que fuerongenerados por un episodio de transposici6n mediada
por RNA, perc por si mismos no codifican enzimas que
puedan catalizar la transposici6n.
• Los transposones y retroposones constituyen casi la
mitad del genoma humano.
Se define a los retroposones por su uso de mecan':.::mos de transposicion que comprenden la transcIi;cion inversa de RNA en DNA. Se conocen tres cla c..de retroposones, incluidos en la FIr. I 2.16:
• Los rniembros de la superfanlilia virica G
difican actividades de transcriptasa invers-.:.integrasa, 0 ambas. Al igual que otros retr,-,posones, se reproducen de la misma manEra que los retrovirus, pero difieren de ell,:'_porque no pasan por una forma infecci xindependiente. Se describen mejor en Ie_elementos Ty y capia de levaduras y mosc:zs
• Las secuencias repetidas largas dispers~_
(LINES) tambien tienen actividad de tra.r.:scriptasa inversa (y pueden, por tanto, cor.siderarse como constitutivas de miembrc_mas distantes de la superfamilia viricapero carecen de LTR y usan un mecallisdiferente al de los retrovirus para cebar ~reaccion de transcriptasa inversa. Proviene::.
.. .. ~ ... . ;. :
Superiamilia virica LINES Superiamilia no virica
Tipos frecuentes Ty (5. cerevisiae)copia (0. melanogaster)
Terminaciones
Repeticiones endianasActividadesenzimaticas
Organizacion
Repeticiones terminaleslargas4-6 bp
Transcriptasa inversa,integrasa, 0 ambas
Puede contener intrones(retirados en el RNAmsubgenomico)
L1 (humano)81,82 ID, 84(raton)
Sin repeticiones
7-21 bp
Transcriptasa inversao endonucleasa
Uno 0 dos ORFininterrumpidos
SINES (mamiferos)Seudogenes deproductos de transcripcionde pol IIISin repeticiones
7-21 bp
Ninguna (0 ninguna quecodifique productos detransposones)Sin intrones
I • Los retroposones pueden dividirse en las superfamilias viricas, que son similaresa retrovirus 0 LINES, y superfamilias no viricas, que no ejercen funciones de codificaci6n.
562 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
int
LTRORF
pol
gag
gagLTR
Ty • TyA
CopiaLTR
LINES - -[_.,~O_R_F_1.a-_....==..;.O~R-=-F-_2--,
Homologfa con
Retrovirus
Los retroposones que se relacionan muy de cerca con los retrovirus tienen una organizaci6n similar, pero lasLINES comparten s6lo la actividad de transcriptasa inversa.
secuencias relativamente cortas relacionadas entresf (constituidas por el DNA con repeticion moderadadescritas en la seccion 4.6, Genomas eucarioticosque contienen secuencias de DNA repetitivas y norepetitivas. Las LINES incluyen secuencias dispersaslargas y las SINES, secuencias dispersas cortas. (Sedescriben como secuencias dispersas 0 repeticiones dispersas, por su presencia comun y distribucion generalizada).
Las plantas contienen otro tipo de elementomovil pequeno llamado MITE (que correspondea un elemento invertido de transposicion repetidaen rniniatura). Tales elementos terminan en repeticiones invertidas, tienen una secuencia diana de2 0 3 bp, no presentan secuencias de codificacion ytienen de 200 a 500 bp de longitud. Hay al menDsnueve de tales familias (por ejemplo) en el genomadel anoz. A menu do se encuentran en regiones queflanquean genes que codifican proteinas. No tienenrelacion con SINES 0 LINES.
Las LINES y SINES constituyen una parte significativa del DNA repetitivo de los genomas animales.En muchos genomas eucarioticos elevados ocupan-50% del DNA total. En la se resume ladistribucion de los diferentes tipos de transposones,que constituyen casi la mitad del genoma humano.Excepto por las SINES, que casi siempre carecen defuncion, los otros tipos de elementos estan constituidos por representantes funcionales y otros quehan sufrido deleciones que eliminaron parte de losmarcos de lectura que codifican las proteinas necesarias para la transposicion. Los porcentajes relativos de estes tipos de transposones son, en general,similares en el genoma de raton.
Una LINES comun en genomas de mamiferosse denomina Ll. EI miembro usual tiene - 6500bp Y termina en un segmento rico en A. Los dosmarcos de lectura abierta de un elemento de longitud total se denominan ORFI y ORF2. El nlimero
de productos de transcripcion de la polimerasa II de RNA. Una muy escasa parte de loselementos en el genoma tiene funcion completa y puede efectuar transposicion de manera autonoma; otras presentan mutacionesy por ella solo pueden hacer transposicioncomo resultado de un elemento autonomoque actua en configuracion trans.
• Los miembros de la superfamilia no virica se identifican par caracteristicas externase internas que sugieren que provienen desecuencias de RNA. Sin embargo, en estoscasos solo se puede especular acerca de comose genera una copia de DNA. Se supone queeran diana de un episodio de transposicionpor un sistema enzimatico codificado en otrositio, 0 sea, siempre carecieron de autonomia.Se ariginaron en praductos de transcripcioncelular. No codifican proteinas con funciones de transposicion. El componente masprominente de esta familia recibe el nombre de secuencias repetidas dispersas cortas(SINES). Estos componentes se derivan deproductos de transcripcion de la polimerasaIII de RNA.
La muestra las relaciones de orga-~zacion y secuencia de los elementos que codifican.a transcriptasa inversa. Al igual que los retrovirus,os retroposones que contienen LTR se puedenlasificar por grupos de acuerdo con el numero de
marcos de lectura independiente para gag, pol e int yel orden de los genes. A pesar de esas diferencias su~erficiales de organizacion, la caracteristica comunes la presencia de actividades de transcriptasa inver·a e integrasa. Los elementos LINES de mamiferosomunes tienen dos marcos de lectura; uno codifica
wa proteina de union de acido nucleico y la otra laactividad de transcriptasa inversa y endonucleasa.
Los elementos que contienen LTR pueden va!iar de retrovirus integrados a retroposones que han
erdido la capacidad de generar partlculas infeccio-as. Los genomas de levadura y mosca tienen ele~entos Ty y copia que no pueden generar particulas:nfecciosas. Los genomas de mamifero contienen:etrovirus endogenos que, cuando estan activos,
ueden generar particulas infecciosas. EI genomade raton tiene varios retrovirus endogenos activos
ue son capaces de generar particulas que propaganinfecciones horizontales. Por contraste, casi todos.05 retrovirus endogenos perdieron su actividad
ace casi 50 millones de aiios en ellinaje humane:' el genoma tiene hoy en su mayor parte restos:nactivos de los retrovirus endogenos.
Las LINES y SINES constituyen una parte imortante del genoma animal. En un principio se
definieron por la existencia de un gran numero de
22.9 Los retroposones son de tres clases 563
.. .Elemento Organizaci6n Longilud (Kb) Genoma humano
Numero Fracci6n
<0,3 1 500 000
~ :. Transposasa ~ 2-3 300 000
Retrovirus /retropos6n
LINES (aut6nomo). p, ej, L1
SINES (no aut6nomo), p, ej,. Alu
Transpos6n de DNA
• ,gag pol '~'mi!iii1[i
ORF1 "7p'ol) - .1-11 450 000
6-8 850 000
8%
17%
15%
3%
FTr.LJ A 27. 18 Cuatro tipos de elementos de transposici6n constituyen casi la mitad del genomahumano.
de elementos de longitud total suele ser pequeno(-50) y el resto de las copias son truncas. Se pue·den encontrar productos de transcripcion. Como 10indica su presencia en el DNA repetitivo, la familiaLINES muestra variacion de secuencias entre miembros individuales. Sin embargo, los integrantes dela familia dentro de una especie son relativamentehomogeneos en comparacion con la variacion ob·servada entre dos especies. Ll es ellmico miembrode la familia LI.I\TES que ha estado activo en los linajes de raton 0 humano. Parece haber permanecidomuy activo en el raton, pero ha declinado en ellinaje humano.
Solo ha habido una SINES activa en el linajehumano, el elemento comun Alu. El genoma deraton tiene una contraparte de este elemento, B1, Ytambien otros SINES (B2, ill, B4) que han presenta·do actividad. El Alu humano y el SINES BIde ratontal vez provengan del RNA 7SL (vease la seccion22.10, La familia Alu tiene muchos miembros muydispersos). El otro SINES de raton parece haberseoriginado de un producto de transcripcion inversade RNAt. Es probable que la transposicion de SThTESse deba a que un elemento activo Ll las reconocecomo sustratos.
fDD La familia Alu tiene muchosmiembros muy dispersos
Concepto principal
• Una parte importante del DNA repetitivo en genomasde mamiferos consta de repeticiones de una solafamilia, organizadas como transposones y derivadas deproductos de transcripci6n de la polimerasa III de RNA.
Las SINES mas notorias incluyen miembros de unasola familia, Su breve longitud y alto grado de repeticion las hacen comparables al DNA de secuenciassimples (satelitej, excepto que los miembros individuales de la familia estan dispersos en el genomaen lugar de confinados a grupos seriados. De nuevo,
564 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
hay similitud significativa entre los miembro;;una especie en comparacion con la variacion eespecies.
En el genoma humano, una gran parte del~,
moderadamente repetitivo se encuentra cornecuencias de - 300 bp que estan entremezcladas :DNA no repetitivo. Al menos la mitad del marcdoble desnaturalizado es fragmentado por la ede restriccion AluI en un solo sitio localizado 17:adelante en la secuencia. Las secuencias fragn::=tadas pertenecen todas a una sola familia con ..=.como familia Alu, de acuerdo con los medi :identificacion. Hay - 300 000 miembros en e: ~.
noma haploide (equivalentes a un miembro .:kb de DNA). Las secuencias individuales Alu tie- _dispersion amplia. Hay una familia de secuer:relacionadas presente en el raton (donde los 50:miembros se denominan familia B1) en el cn ':.zchino (donde se llama familia equivalente All;en otros mamiferos.
Cada uno de los miembros de la familia .'_tiene relacion mas que ser identicos. La familia :::._mana parece haberse originado por una duplica . en serie de 130 bp con una secuencia no relacio ~'
de 31 bp insertados en la mitad derecha del dimeLas dos repeticiones a veces se denominan "rn:-izquierda" y "mitad derecha" de la secuencia ,~_
Cada integrante de la familia Alu tiene una ide:-dad promedio de 87% con la secuencia de conse=.:La unidad de repeticion BIde raton tiene 13C :0
de longitud y corresponde a un monomero deunidad humana. Tiene homologfa de 70 a 80% .la secuencia humana.
La secuencia Alu tiene relacion con el RNA -; =un componente de la partkula de reconocimientC' senal (vease la seccion 10.9, La SRP interactua :el receptor SRP). El RNA 7SL corresponde a la Ill:::':'izquierda de una secuencia Alu con una inserc en medio. Asl, las 90 bases terminales 5' del ~. ,7SL son homologas con el extremo izquierdAlu, las 160 bases centrales del RNA 7SL no tie;:homologfa con Alu y las 40 bases terminales 3'
RNAm
RNA nuclear
RNA de 7SL son homologas con el extrema derechode Alu. EI RNA 7SL es codificado por genes que lapolimerasa III de RNA transcribe de manera activa.Es posible que estos genes (u otros relacionados conellos) den origen a las secuencias inactivas Alu.
Los miembros de la familia Alu se asemejan atransposones porque estan flanqueados por repeticiones directas cortas. Muestran, no obstante, lacuriosa caracterfstica de que las longitudes de repeticion son diferentes para cada miembro de lafamilia. Se derivan de productos de transcripcionde la polimerasa III de RNA y, como resultado, esposible que cada miembro porte promotores activosinternos.
Se ha encontrado una diversidad de propiedades de la familia Alu, y su ubicuidad ha originadomuchos indicios respecto de su funcion. No obstante, aun no es posible discernir su fundon real.
Al menos algunos miembros de la familia Alupueden transcribirse en RNA independientes. En elcriceto chino algunos (aunque no todos) miembrosde la familia equivalente a Alu parecen tener transcripcion in vivo. Se encuentran unidades de transcripcion de ese tipo en la vecindad de otras unidades detranscripcion.
Los miembros de la familia Alu pueden incluirse dentro de unidades de transcripcion de genes estructurales, segun se observa por su presencia en elRNA nuclear largo. La presencia de copias multiplesde la secuencia Alu en una sola molecula nuclearpuede generar la estruetura secundaria. De hecho,la presencia de miembros de la familia Alu en formade repeticiones invertidas se encarga de la mayorparte de la estructura secundaria que se encuentraen el RNA nuclear de los mamfferos.
filii Los seudogenes procesadosse originaron como sustratospara ta transposici6n
Concepto principal
• Un seudogen procesado proviene de una secuencia deRNAm por transcripci6n inversa.
Cuando una secuencia generada por transcripcioninversa de un RNAm se inserta en el genoma, sepuede reconocer su relacion con el gen a partir delcual se transcribio el RNAm. Tal secuencia se denomina seudogen procesado para reflejar el hechode que se proceso a partir del RNA y es inactivo.En la FIGURA 22.19 se comparan las caracterfsticasespedficas de un seudogen procesado con las delgen original y el RNAm. La figura muestra todas las
..Ex6n 1 Intr6n Ex6n 2 Intr6n Ex6n 3
~~e~rumPidO~O\J'J\.~~ ~
l~AAAAAAAAEI extrema 5' corresponde EI extrema 3' tienecon el RNAm un segmento A-T
Seudogen ~~YJ\.IO\.W\.W\.~~~~'f1~~«h\procesado I - Tira continua de exones ...... I
Repetici6n corta directa Repetici6n carta directadel DNA diana del DNA diana
FIGURA 22.19 Pueden surgir seudogenes por transcripci6n inversa apartir del RNA para formar DNA duplex, que se integran al genoma.
caracterfsticas diagnosticas impartantes, de las quesolo algunas se encuentran en cualquier ejemploindividual. Cualquier producto de transcripcionde la polimerasa II de RNA pudiese, en principio,dar origen a tal seudogen y hay muchos ejemplosque incluyen los seudogenes procesados de globina, que fueron los primeros en descubrirse (veasela seecion 3.11, Los seudogenes son callejones sinsalida de la evolucion).
El seudogen puede inieiarse en el punto equivalente al extrema 5' del RNA, circunstancia queserfa de esperar solo si el DNA se hubiese ariginadodel RNA. Varios seudogenes constan de secuenciasexanicas unidas de manera precisa; no se conocenmecanismos para reconocer intrones en el DNA, por10 que esta circunstancia constituye un argumento a favor de una etapa mediada pOl' el RNA. EIseudogen puede terminal' en un segmento corto depares de bases A-T al parecer derivadas de la colapoli(A) del RNA. A cada lado del seudogen hay unarepeticion corta directa que parece haberse generado por un episodio similar a la transposicion. Losseudogenes procesados residen en localizaciones norelacionadas con sus sitios de origen supuestos.
Los seudogenes procesados no portan ningunainformacion que pudiera servir para respaldar unsuceso de transposicion (0 llevar a cabo la transcripcion inversa precedente del RNA). Esto hace pensarque el RNA era sustrato para otro sistema y codificado par un retroposon. De hecho, parece que loselementos LINES activos proveen gran parte de laactividad de transcriptasa inversa y que se encarganno solo de su propia transposicion, sino tambien deactuar sobre las SINES y generar seudogenes procesados.
22.11 Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposici6n 565
...
Inserci6n deuna copiade un DNAen un sitionuevo
CITOSOL ~
CI:::) ...~
EI DNA",,,,,p,~n. de 3'·OHEIRNAesel~
molde ~
~/-"RlIN,nA
~
_/~EI DNA sustituye~ Ial RNA t
Se crea un intr6npor recombinacion ...;=~~~~~~~~
La hendidura proporcionaun extrema de cebaci6n
~l" f • Se transcribe una LINES hacia un RNA que ;:traduce en proteinas que se ensamblan en un complejo eel RNA. El complejo se transloca al nucleo, donde inserta U~
copia de DNA en el genoma.
:G ~ 2 2' La retrotransposici6n de elementos diferente.=a LTR ocurre por formaci6n de una hendidura en La diana c el fin de proveer un cebador para la sintesis de DNAc sobre molde de RNA. Las puntas de flecha indican extremos 3'.
Los elementos de LINES y algunos otros no terminanen las LTR caracteristicas de los elementos retrovlricas. Esto lleva a la interrogante: (. Como se cebala transcripcion inversa? No comprende la reaccioncomun donde el cebador de RNAm se aparea conel LTR (vease la Figura 22.6). Los marcos de lecturaabierta en estos elementos carecen de muchas de lasfunciones retroviricas, como dominios de proteasao integrasa, pero par 10 general tienen secuenciassimilares a la transcriptasa inversa y codifican unaactividad de endonucleasa. En la LINES LI humana,ORFI es una proteina unida a DNA y ORF2 tieneactividades tanto de transcriptasa inversa como deendonucleasa; ambos productos son indispensablespara la transposicion.
La Fl RA 22 2 muestra como estas actividadessostienen la transposicion. Se hace una hendiduraen el sitio diana del DNA pOl' actividad de una endonucleasa codificada pOl' el retroposon. El productoRNA del elemento se vincula con la proteina unidaen la hendidura. La hendidura provee un extremo 3'-OH que ceba la sintesis de DNAc sobre elmolde de RNA. Se requiere un segundo episodiode escision para abrir la otra cadena de DNA, y elhlbrido RNA/DNA se vincula con el otro extremo dela hendidura en esta etapa, 0 despues de que se haconvertido en una cadena doble de DNA. Algunosintrones moviles utilizan un mecanismo semejante(vease la Figura 27 .12 ).
Cuando se originan elementos a partir de latranscripcion de la polimerasa II de RNA, las secuencias genomicas son necesariamente inactivas:carecen del promotor que se encontraba en un sitioascendente respecto del punto de arigen inicial detranscripcion. Estos suelen poseer las caracteristicasde un producto de transcripcion maduro, par 10 quese denominan seudogenes procesados.
Uno de los motivos pOl' 10 que los elementos deLINES son tan eficaces radica en su metodo de propagacion. Cuando se traduce un RNAm de LINES,los productos proteinicos muestran una preferenciacis para unirse al RNAm a partir del cual se tradujeron. La ) muestra que el complejo de
• Las LINES no tienen LTR y para cebar la transcripci6ninversa requieren que el retropos6n codifique unaendonucleasa que genere una hendidura.
Concepto principal
ED Las LIN ES utilizanuna endanucleasa para generarun extrema can actividadcebadara
566 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
NUCLEO
~Yj\.¥1\.(l~.Transpos6n
~
CITOSOL
~co
GURA 22 "" Un transpos6n se transcribe hacia un RNA que,e traduce en proteinas que se desplazan de manera indepen-iente hacia el nucleo, donde actuan sobre cualquier par de-epeticiones invertidas con la misma secuencia que en el trans-::os6n original.
~ibonueleoprotefnas se traslada entonces al nueleo,donde las protefnas insertan una copia del DNA enel genoma. La transcripcion inversa a menudo noavanza par completo hasta el finaL de modo que lacopia es inactiva. Sin embargo, hay posibilidades deinsercion de una copia activa parque las protefnasactuan sobre un producto de transcripcion del elemento activo original.
En contraste, las protefnas producidas por lostransposones de DNA deben importarse al nueleodespues de su sfntesis en el citoplasma, pero nocuentan con metodos para distinguir entre transposones de longitud completa y transposones inactivos con delecion. La :G' 2 muestra que enlugar de distinguir estos dos tipos de transposones,las protefnas reconoceran de manera indiscriminadacualquier elemento par virtud de las repeticionesque marcan sus extremos. Esto disminuye muchosu posibilidad de actuar sobre un elemento de longitud completa en contraposicion a uno que ha tenido delecion. La consecuencia es que los elementosinactivos se acumulan y, en un momenta dado, lafamilia desaparece porque una transposasa tienepocas posibilidades de hallar una diana que sea untransposon por completo funcional.
<'.Estan ocurriendo en la actualidad sucesos detransposicion en estos genomas, 0 solo se observanvestigios en sistemas antiguos? Esto varfa con la especie. Hay solo unos cuantos transposones activosen la actualidad en el genoma humano pero, encontraste, se conocen varios transposones activosen el genoma de raton. Esto explica el hecho deque las mutaciones espontaneas causadas par inserciones de LINES se presentan con una tasa de
-3% en el raton, pero de solo 0.1 % en el hombre. Parece haber de -lOa 50 elementos activos deLINES en el genoma humano. Se pueden sefialaralgunas enfermedades humanas como resultado dela transposicion de LI a los genes y otras derivadasde episodios no equivalentes de entrecruzamiento,donde participan copias repetidas de LI. Un sistemamodelo en el que ocurre la transposicion de LINESen celulas de cultivo hfstico hace pensar que unsuceso de transposicion puede introducir varios tipos de dafio colateraL asf como la insercion en unnuevo sitio; el dafio comprende reestructuracionesy deleciones cromosomicas. Dichos sucesos podrfanconsiderarse como agentes del cambio genetico. Nilos transposones de DNA ni los retroposones cuasi retrovfricos parecen haber tenido actividad en elgenoma humano durante 40 a 50 millones de afios,pero se encuentran ejemplos activos de ambos enel raton.
Notese que para que las transposiciones persistan deben presentarse en la Unea germinativa. Alparecer, episodios sirnilares tienen lugar en celulassomaticas, pero estas no sobreviven mas de una generacion.
flII ResumenLa transcripcion inversa es el mecanismo unificadorde la reproduccion de retrovirus y perpetuacion deretroposones. El cielo de cada tipo de elemento esen principio similar, aunque los retrovirus suelenconsiderarse desde la perspectiva de la forma vfricalibre (RNAm), en tanto los retroposones se consideran desde el punto de vista de la forma genomica(DNA doble).
Los retrovirus tienen genomas de RNA de cadena unica que se replican mediante un intermediariode DNA de doble cadena. Un retrovirus individualcontiene dos copias de su genoma. El genoma contiene los genes gag, pol y env, que se traducen en poliprotefnas, cada una de ellas fragmentada en protefnas funcionales mas pequefias. Los componentesGag y Env se encargan del empaquetamiento delRNA y la generacion del virion; los componentesPol participan en la sfntesis de acidos nueleicos.
La transcriptasa inversa es el principal componente de Pol y se encarga de la sfntesis de una copiade DNA (cadena negativa) del RNA vfrico (cadenapositiva). El producto de DNA es mas largo que elmolde de RNA; mediante el cambio de moldes, latranscriptasa inversa copia desde la secuencia de 3'de RNA hasta el extrema 5' del DNA y desde lasecuencia 5' del RNA hasta el extremo 3' del DNA,10 que genera las LTR caracterfsticas (repeticionesterminales largas) del DNA. Ocurre un cambio simi-
22.13 Resumen 567
lar de moldes cuando se sintetiza la cadena positivadel DNA utilizando la cadena negativa como molde.EI DNA doble lineal se inserta en el genoma de unhospedador gracias a la participacion de la enzimaintegrasa. La transcripcion del DNA integrado desdeun promotor en la LTR izquierda genera mas copiasde la secuencia de RNA.
Los cambios de molde durante la sfntesis deacidos nueleicos permiten que ocuna la recombinacion por seleccion de copias. Durante un cieloinfeccioso, un retrovirus puede intercambiar partede su secuencia habitual por una secuencia celular.EI virus resultante suele tener defectos de replicacion, pero puede perpetuarse durante la evolucionde una infeccion conjunta con un virus auxiliar.Muchos de los virus defectuosos han adquirido unaversion RNA (v-onc) de un gen celular (c-onc). La secuencia onc puede ser de cualquiera de varios genescuya expresion en la forma v-onc hace que la ((~lula
se transforme hacia un fenotipo tumorigenico.EI episodio de integracion genera repeticiones
diana (como transposones que se desplazan a travesdel DNA). Por 10 tanto, un provirus insertado poseeterminaciones directas repetidas de LTR, flanqueadas por repeticiones cortas de DNA diana. Los genomas de mamfferos y aves tienen provirus endogenos(inactivos) con dichas estructuras. Se han encontrado otros elementos con esa organizacion en unadiversidad de genomas, de manera mas notoria enS. cerevisiae yD. melanogaster. Los elementos Ty de laslevaduras y los elementos de copia de las moscas tienen secuencias de codificacion con homologfa conla transcriptasa inversa y se desplazan a traves deuna forma de RNA. Pueden generar partfculas quesimulan virus pero no tienen capacidad infectante.Las secuencias LINES de los genomas de mamiferosse retiran aun mas de los retrovirus, pero conservan diferentes similitudes que sugieren un origencomun. UtiLizan un tipo diferente de aetividad cebadora para iniciar la accion de la transcriptasa inversa, donde una actividad de endonueleasa vinculadacon la transcriptasa inversa forma una hendiduraque provee un extrema 3'-OH para la sfntesis decebacion sobre un molde de RNA. La frecuenciade transposiciones de LINES aumenta porque susproductos proteinicos tienen actividad en cis; se vinculan con el RNAm del que fueron traducidas paraformar un complejo ribonueleoprotefnico que setransporta al nueleo.
Los miembros de otra elase de retroposonescuentan con todos los puntos calientes de la transposicion a traves de RNA, pero no tienen secuencias de codificacion (0 al menos ninguna que simulefunciones retrovfricas). Pueden haberse originadocomo pasajeros en un episodio de transposicion se-
568 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones
mejante a la retrovfrica, donde un RNA fue dianade una transcriptasa inversa. Los seudogenes procesados surgen POl' dichos episodios. Una familia particularmente notoria que parece haberse originadopOl' un suceso de procesamiento es la familia Alu.Algunos RNAsn, incluido el RNAsn 7SL (un componente de SRP) tienen relacion con esta familia.
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