Extracción de ADN

BIOQ. JOSÉ RODRÍGUEZ T.

Objetivos

• Extraer el material genético (ADN) de células de guineo, cebolla y/o fresas.

• Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades quίmico-fίsicas del ADN

Solución amortiguadora o “buffer”

• 6 mL de detergente líquido de fregar

• 5 g de sal de mesa• 44 mL de agua

destilada• Una pizca de

ablandador de carne

Preparación de la solución

Mida 6 mL del detergente en una probeta de 10 mL. Vierta en un beaker de 100 mL.

Mida 44 mL de agua destilada. Vierta en el “beaker” de 100 mL que ya contiene el detergente. Evite la formación de burbujas.

Finalmente, aňada 5g de sal de mesa y el ablandador de carne. Mezcle bien.

Procedimiento

•Remueva la cáscara de un pedazo de guineo de una pulgada.

•Eche el guineo en una bolsa plástica con cierre de seguridad. Cierre la bolsa.

•Macere el guineo (puede ser con la mano) hasta obtener una consistencia bien blanda.

•Puede realizar el mismo procedimiento con la fresa y la cebolla (licuarla o cortarla).

Continuación: Procedimiento

Añada los 50 mL de la solución amortiguadora. Cierre bien. Evite la formación de burbujas. ¿Por qué?

Con cuidado, coloque la bolsa en posición horizontal sobre papel toalla. Asegúrese que el macerado de guineo esté cubierto con la solución amortiguadora. Espere 5 minutos.

¿Por qué el macerado debe estar cubierto por la solución amortiguadora?

¿Por qué debe esperarse 5 minutos?

Continuación: Procedimiento Mientras esperan que

transcurran los cinco minutos, presenten posibles contestaciones a las siguientes preguntas:

¿Cuál es la función del detergente? Los detergentes son muy buenos para

eliminar grasas. En este caso, esas grasas son los lípidos que componen a las membranas celular y de los diferentes organelos: el cloroplasto, la mitocondria, el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico, así como el núcleo. Este paso nos permite lisar a las células, es decir, romperlas para liberar su contenido: proteínas, ácidos nucleicos y diferentes metabolitos.

¿Cuál es la función del ablandador de carne?

Al lisar a las células se libera una gran cantidad de proteínas, algunas de estas proteínas tienen como función degradar al ADN de patógenos como son las bacterias y los virus. Si no detenemos a estas proteínas (conocidas como nucleasas) nuestro ADN será degradado. Para evitarlo agregamos el ablandador de carnes, el cual contiene proteasas, es decir, proteínas especializadas en la degradación de otras proteínas. En los ablandadores de carnes usualmente encontramos papaína, la cual se extrae de la papaya. Otras fuentes de proteasas que puedes usar en vez del ablandador de carnes son: jugo de piña, solución limpiadora de lentes de contacto, y jugo de papaya.

¿Cuál es la función de la sal?

Cada hebra de ADN está cargada de manera negativa y como sabemos, las cargas iguales se repelen. Para minimizar esta repulsión electrostática agregaremos una pizca de sal. La sal está compuesta de átomos con carga positiva (el sodio) y negativa (el cloro). Los iones positivos serán atraídos por las cargas negativas del ADN y “apantallaran” a estas cargas, como resultado, la repulsión entre las hebras de ADN disminuye.

Coloque el paño sobre el vaso plástico y filtre el macerado de guineo. Luego, descarte el paño con el macerado. ¿Por qué hay que filtrar?

Utilice la regla para marcar dos tubos de ensayo a una distancia de 1” y de 2” desde abajo hacia arriba.

Aňada a cada tubo de ensayo un volumen del filtrado hasta que llegue a la marca de 1”.

Continuación: Procedimiento

Añada al tubo de ensayo un volumen de alcohol etílico 70%-90% frío hasta llegar a la marca de 2”.

Sin mezclar, coloque el tubo de ensayo en una gradilla o en un vaso plástico. Espere por 5 minutos.

Continuación: Procedimiento

Inserte en el tubo de ensayo una varilla de cristal o removedor de café para remover el ADN de la capa superior del alcohol. Coloque el ADN en otro tubo de ensayo.

Continuación: Procedimiento

Preguntas de análisis y discusión

¿Cuál, piensas tú, es la función del detergente en la solución amortiguadora?

Cuando el detergente entra en contacto con la célula, captura los lípidos y las proteínas.

¿Cuál es la función de la sal en la solución amortiguadora?

¿Cuál es la función del alcohol etílico?El objetivo aquí es crear dos fases: en la parte inferior tendremos una fase del color de nuestra fruta, y en la parte superior una fase transparente (alcohol). El ADN es soluble en agua, pero se precipita en soluciones no polares. El alcohol y la sal nos ayudaran a sacar al ADN del jugo de las frutas. Es importante que no mezcles las fases.