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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Departamento de Química Orgánica, Inorgánica y Bioquímica. ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD METABÓLICA DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO EN RATA WISTAR. EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO, LA RESTRICCIÓN CALÓRICA Y EL TRATAMIENTO ICV CON LEPTINA. Alejandro Fernández Briones. Junio, 2013 Tutores: Dr. Antonio Andrés Hueva. Dra. Nilda Gallardo Alpizar.

Tesis fernández briones

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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Departamento de Química Orgánica, Inorgánica y Bioquímica.

ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD METABÓLICA

DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO EN RATA

WISTAR. EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO, LA

RESTRICCIÓN CALÓRICA Y EL TRATAMIENTO

ICV CON LEPTINA.

Alejandro Fernández Briones.

Junio, 2013

Tutores: Dr. Antonio Andrés Hueva.

Dra. Nilda Gallardo Alpizar.

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AGRADECIMIENTOS.

Esta tesis va dedicada a todas aquellas personas que la han hecho posible, esta

es la única parte de la tesis donde me puedo tomar la licencia de no ser políticamente

correcto, aunque intenteré serlo en la medida de lo posible.

En primer lugar, quiero agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Nilda

Gallardo y el Dr. Antonio Andrés, su empeño y esfuerzo en que este trabajo salga hacia

delante. Siempre los recordaré con cariño, por la confianza que ambos han depositado

en mi persona durante todo éste tiempo y por la cantidad de cosas que he aprendido

de ellos. No solo del trabajo, también de la vida.

Como no, a mis compañeros del laboratorio, a los cuales aprecio, y a los que

siempre recordaré con cariño.

A mis amigos, con los que he compartido tantas y tantas cosas que no podría

quedarme con ninguna en concreto. Sé que siempre estarán ahí para lo bueno y para

lo malo.

A mi familia, ya que durante el transcurso de estos años, han sucedido

demasiados acontecimientos negativos, como la perdida de varios familiares muy

cercanos a los que echo mucho de menos, un accidente de coche en el que casi pierdo

la vida, además de un sinfín de adversidades que no habría podido superar de no

haber tenido el apoyo incondicional por parte de mi familia en especial de mi padre

por ser capaz de templarme los nervios en los momentos difíciles, y de mi madre que

contra todo pronóstico consiguió hacer de mi un hombre de provecho.

Quiero hacer una mención especial a mi hermano, la persona con la que más

tiempo he pasado en mi vida, con el que siempre discuto hasta el punto de mandarnos

a la mierda casi a diario, pero al que siempre echo en falta cuando necesito

desahogarme, y sé que siempre estará ahí para lo que necesite.

Como no quiero extenderme mucho más, simplemente gracias a todos.

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INDICE DE CONTENIDOS

1-INTRODUCCIÓN. ...................................................................................... 1

1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2. ..................... 1

1.2- El tejido adiposo. ............................................................................. 3

1.2.1- El tejido adiposo blanco. ............................................................ 4

1.3- Fisiología del tejido adiposo. ............................................................ 5

1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo. .................. 5

1.3.2- La Gota Lipídica. ......................................................................... 7

1.3.3- Lipólisis....................................................................................... 8

1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino. ..................................... 12

1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα). ....................................... 14

1.4.2- IL-6. .......................................................................................... 15

1.4.3- PPARγ. ...................................................................................... 16

1.4.4- Resistina. .................................................................................. 17

1.4.5- Adiponectina. ........................................................................... 18

1.4.6- Leptina. .................................................................................... 19

1.4.7- Transmisión de la señal de leptina. .......................................... 21

1.4.8- Secreción de leptina por el TAB. ............................................... 23

1.5- Insulina. .......................................................................................... 24

1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina. ..................................... 24

1.6- Interacción leptina-insulina. ........................................................... 25

1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la

sensibilidad a la insulina. .................................................................... 26

1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de

funcionalidad. .................................................................................... 27

1.9- Restricción calórica. Efectos beneficiosos de la dieta. .................... 29

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1.10- Hipótesis y objetivos. ................................................................... 31

2- MATERIALES Y MÉTODOS. .................................................................... 33

2.1- Materiales. ..................................................................................... 33

2.2- Modelos de experimentación. ........................................................ 33

2.2.1- Modelo animal de envejecimiento. .......................................... 33

2.2.2- Modelo animal de restricción calórica. ..................................... 34

2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos. ...................................... 35

2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación. .......................................................... 35

2.5- Ensayo de Liposisis. ........................................................................ 36

2.5.1- Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e INS. .................... 36

2.6- Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular

(ICV) con Leptina. .................................................................................. 37

2.6.1- Test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal. ........................ 40

2.6.2- Tratamiento “in vivo” con insulina. .......................................... 40

2.6.3- Denervación del tejido adiposo. ............................................... 40

2.6.4- Ensayo ex vivo de captura de glucosa (2DOG). ......................... 41

2.7- Determinación de Metabolitos y Hormonas en suero. ................... 42

2.8- Extracción de ARN. ......................................................................... 42

2.9- Transcripción inversa. .................................................................... 43

2.10- Real-time PCR. .............................................................................. 44

2.11- Fraccionamiento subcelular del tejido adiposo blanco.

Obtención de extracto total, membrana plasmática,

membrana interna, gota lipídica y citosol. ......................................... 45

2.11.1- Extracto total y fracciones subcelulares. ................................ 45

2.11.2- Gota lipídica. .......................................................................... 45

2.12- Determinación de la concentración de proteínas. ........................ 48

2.12.1- Mediante el método Bradford. ............................................... 48

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2.12.2- Mediante el método Lowri. .................................................... 48

2.13- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGC-SDS),

e Inmuno detección de proteínas mediante Western Blot. ................ 48

2.14- Caracterización de fracciones subcelulares. ................................. 49

2.15- Tratamiento de datos y procesamiento estadístico. ..................... 52

3- RESULTADOS. ....................................................................................... 53

3.1- Ensayo de sobrecarga oral de grasas. ............................................. 54

3.2.- Ensayo ayuno-realimentación. ...................................................... 59

3.2.1-Lipolisis ex vivo. Efecto del envejecimiento y la

restricción calórica. ......................................................................... 60

3.2.2- Estudio de la lipolisis del tejido adiposo visceral.

Efectos del isoproterenol y la insulina. ............................................ 67

3.2.3- Estudio del estado de activación de la enzima HSL

en tejido adiposo. Efectos de isoproterenol y la insulina. ............... 70

3.2.4- Efectos del isoproterenol y la insulina sobre los

niveles proteicos de ATGL, AQ7 y perilipina en los explantes

de tejido adiposo. ........................................................................... 71

3.2.5- Estudio del estado de activación de la enzima AMPK

en tejido adiposo. Efectos del envejecimiento y la restricción

nutricional. Efectos de isoproterenol y la insulina. .......................... 72

3.2.6- Estudio de los cambios en la localización subcelular

de proteínas durante la lipolisis. Efectos del envejecimiento y la

restricción calórica. ......................................................................... 75

3.2.7- Estudio de la vía lipogénica. Capacidad de síntesis de

novo de ácidos grasos y de captura de lípidos por el tejido

adiposo para la síntesis de TAG. ...................................................... 83

3.3- Efectos de la infusión ICV de leptina en el metabolismo

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del tejido adiposo blanco en ratas de 3 meses de edad. Papel

del SNA en la transmisión de la señal de la leptina. ............................ 89

3.3.1- La leptina a través del SNA regula la funcionalidad

del TAB y la sensibilidad a la insulina. Resultados del test

de tolerancia a glucosa. ................................................................... 90

3.3.2- Resultados de los ensayos de captura de glucosa

en respuesta a insulina por el TAB. ................................................. 91

3.3.3- Regulación de la expresión génica en el TAB por el SNA. ......... 93

3.3.4- Modificación de la capacidad lipogénica del tejido

adiposo blanco por la leptina a través del SNA. .............................. 94

3.3.5- Incremento del tono simpático y de la capacidad

lipolítica del tejido adiposo blanco por la leptina. ........................... 96

4- DISCUSIÓN ........................................................................................... 99

5- CONCLUSIONES. ................................................................................. 117

6- BIBLIOGRAFÏA. .................................................................................... 121

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INDICE DE TABLAS.

Tablas de la Introducción.

Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB. ..... 13

Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con

funciones endocrinas / paracrinas / autocrinas . ................................... 14

Tablas de Materiales y Metodos.

Tabla 3. Sondas utilizadas de los genes sometidos a estudio. .................. 45

Tabla 4. Anticuerpos utilizados en el estudio. .......................................... 51

Tablas de Resultados.

Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del

tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.

Tabla 5. Características biológicas de los animales................................... 53

Tabla 6. Área bajo la curva. ...................................................................... 57

Tabla 7. Niveles de mRNA de la enzima LPL y de la proteína

relacionada con el receptor de LDL (LPR-1) en tejido adiposo

de animales de 3, 8 y 24 meses de edad. .............................................. 58

Tabla 8. Niveles de Glicerol, NEFA y TAG en suero. .................................. 59

Page 10: Tesis fernández briones

Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido

adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.

Tabla 9. Niveles de leptina en suero tras el tratamiento icv con leptina. . 90

Tabla 10. Estudio de expresión de genes relacionados con

el tono simpático del tejido adiposo. .................................................... 94

Tabla 11. Estudio de expresión de genes relacionados con la

síntesis de glicerol-3p y de TAG en el tejido adiposo. ............................ 94

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INDICE DE FIGURAS.

Figuras de la introducción.

Figura 1. Estructura del Isoproterenol. ..................................................... 10

Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. ..................................... 11

Figura 3. Señalización de leptina. ............................................................. 22

Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal

de la insulina . ....................................................................................... 25

Figuras de materiales y métodos.

Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad

alimentadas ad libitum. ......................................................................... 34

Figura 6. Modelo experimental utilizado en este trabajo. ........................ 36

Figura 7. Esquema de la distribución de las muestras en la placa. ........... 37

Figura 8. Representación esquemática de la implantación de las

minibombas osmóticas. ........................................................................ 39

Figura 9. Coordenadas del ventrículo lateral en el estereotáxico.

VL – ventrículo lateral. .......................................................................... 39

Figura 10. Imagen de la denervación quirúrgica. ...................................... 41

Figura 11. Representación esquemática del protocolo de

centrifugación diferencial utilizada para aislar las distintas

fracciones de membrana, la gota lipídica y el citoplasma

celular a partir del TAB. ......................................................................... 47

Figura 12. Western-blot representativo de la presencia de marcadores

en fracciones subcelulares de tejido adiposo blanco epididimal. .......... 50

Page 12: Tesis fernández briones

Figura 13. Western-blot representativo de la presencia de

marcadores en fracciones subcelulares de cada condición

de tejido adiposo blanco epididimal. ..................................................... 50

Figuras de Resultados.

Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del

tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.

Figura 14. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de

TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 8 meses de edad

alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,

tras una sobrecarga oral de grasa. ........................................................ 54

Figura 15. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de

TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 24 meses de edad

alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,

tras una sobrecarga oral de grasa. ........................................................ 55

Figura 16. Área bajo la curva .................................................................... 56

Figura 17. Medida de la liberación de NEFA y glicerol al medio

de incubación. ....................................................................................... 61

Figura 18. Medida de la expresión génica de las hormonas HSL

y ATGL y del transportador de glicerol AQ7 en condición basal. ........... 63

Figura 19. Niveles totales de proteína de AQ7, ATGL y Perilipina

en extracto total de tejido adiposo visceral. .......................................... 65

Figura 20. Niveles totales de proteína y de las especies fosforiladas

de la enzima HSL en extracto total de tejido adiposo visceral. .............. 66

Page 13: Tesis fernández briones

Figura 21. Medidas de glicerol en los medios de los explantes

en estado basal. .................................................................................... 68

Figura 22. Medidas de lactato en los medios de los explantes

en estado basal. .................................................................................... 69

Figura 23. Representación de los cambios en la activación de

la enzima HSL . ...................................................................................... 70

Figura 24. Niveles de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total

de los explantes. ................................................................................... 72

Figura 25. Niveles basales de expresión proteica de las especies

fosforiladas y de la masa de AMPK. ....................................................... 73

Figura 26. Representación de los cambios en la activación de la

enzima AMPK. ....................................................................................... 74

Figura 27A. Traslocación de la ATGL......................................................... 76

Figura 27B. Niveles de expresión proteica de ATGL en condición basal. .. 76

Figura 28A. Traslocación de la HSL.. ......................................................... 77

Figura 28B. Niveles de expresión proteica de HSL en condición basal. ..... 78

Figura 29A. Traslocación de la P-565-HSL. ................................................ 79

Figura 29B. Niveles de expresión proteica de la especie fosforilada

inactiva de HSL en condición basal. ....................................................... 79

Figura 30A. Traslocación de la Perilipina. ................................................. 80

Figura 30B. Niveles de expresión proteica de Perilipina en

condición basal. .................................................................................... 81

Figura 31A. Traslocación de la Acuoporina 7. ........................................... 82

Figura 31B. Niveles de expresión proteica en membrana plasmática

y membrana interna de AQ7 en condición basal. .................................. 82

Figura 32. Niveles basales de mRNA de CHERBP y PPARγ......................... 83

Page 14: Tesis fernández briones

Figura 33. Niveles basales de mRNA de ACC y FAS en tejido

adiposo visceral. .................................................................................... 84

Figura 34. Niveles proteicos de la enzima ACC y de la forma

fosforilada en serina, p-ACC en tejido adiposo visceral. ........................ 85

Figura 35. Niveles basales de mRNA de CD36, Glut4, LPL y LRP-1. ........... 86

Figura 36. Niveles expresión génica y proteica LPL en condición basal. ... 88

Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido

adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.

Figura 37. Se muestran los resultados de un western-blot

representativo de STAT3. ...................................................................... 90

Figura 38. Resultados del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal..... 91

Figura 39. Efectos de la leptina sobre la capacidad lipogénica

del tejido adiposo. ................................................................................. 92

Figura 40. Cambios en el peso de TAP y de los niveles de

norepinefrina con la denervación.......................................................... 93

Figura 41. Niveles proteicos de LPL en extracto total tras

el tratamiento ICV con leptina............................................................... 95

Figura 42. Niveles de expresión génica y proteica de ATGL

tras el tratamiento ICV con leptina. ....................................................... 96

Figura 43. Niveles proteicos de HSL en extracto total de tejido

adiposo tras el tratamiento ICV con leptina. ......................................... 97

Page 15: Tesis fernández briones

Abreviaturas.

AC Adenilato ciclasa.

ACS Acil-CoA sintasa.

ACC Acetil-CoA carboxilasa.

ACTH Hormona corticotrófica.

AG Ácidos grasos.

AGL Ácidos grasos libres.

AGPR Proteína relacionada con agouti.

AKT RAC-beta serine/threonine-protein kinase.

AL Ad-libitum.

AMPc Adenosinmonofosfato cíclico.

AMPK Proteína quinasa activada por monofosfato de adenina.

Apo CII Apolipoproteína CII.

aP2 Proteína activadora 2.

AQ7 Acuoporina 7.

AR Receptor adrenérgico.

ARC Nucleo arcuato del hipotálamo.

ATGL Triglicérido lipasa.

AUC Área bajo la curva.

BSA Albumina de suero bobina.

CART Transcrito regulado por cocaína.

CD36 Proteína de diferenciación 36.

ChREBP Carbohydrate-reponse-element-binding.

CREB Factor de transcripción de la proteína de respuesta a AMPc .

CYT Citoplasma celular.

DNA Ácido desoxirribonucleico.

Page 16: Tesis fernández briones

DNAc Ácido desoxirribonucleico complementario

DNL Lipogénesis de novo.

DTT Dithiothreitol.

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético.

EGTA Ácido etilenglicol (aminoetil éter) tetraacético.

FAS Sintetasa de ácidos grasos.

FIRKO Fat-specific insulin receptor knockout mice.

FR Restricción calórica.

GH Hormona de crecimiento.

Gi Proteína G inhibitoria.

GL Gota lipídica.

GLUT1 Transportador de glucosa 1.

GLUT4 Transportador de glucosa 4.

GPDH Glicerol 3 fosfato deshidrogenasa.

Gs Proteína G estimulatoria.

G3P Glicerol 3 fosfato.

HDL Lipoproteínas de alta densidad.

HOMA Indicador de control de la homeostasis de la glucosa.

HSL Lipasa hormona sensible.

ICV Intra cerebro ventricular.

IGF-1 Factor de crecimiento de insulina-1.

IL-6 Interleuquiina 6.

INS Insulina.

IR Receptor de la insulina.

IRS Substrato del receptor de insulina.

ISO Isoproterenol.

Page 17: Tesis fernández briones

JAK2 Tirosina-quinasas de la familia Janus.

KRH Krebs-Ringer-Hepes.

KRP Krebs-Ringer-fosfato.

LCR Líquido cefaloraquideo.

LDL Lipoproteínas de baja densidad.

LPL Lipasa lipoproteína.

LPR-1 LDL receptor protein related-1.

MAG Mono acil-gliceridos.

MGL Monoglicérido lipasa.

MI Membrana interna.

MP Membrana plasmática.

MSH Hormona melanocito estimulante.

mRNA Ácido ribonucléico mensajero.

mTOR Diana de rapamicina.

NA Noradrenalina.

NaN3 Azida sódica.

NE Norepinefrina.

NEFA Ácidos grasos libres.

NPY Neuropeptido Y.

NTC Membranas de nitrocelulosa.

P Perilipina.

PBS Buffer Fosfato Salino.

PCR Reacción en cadena de la polimerasa.

PDE Fosfodiesterasa.

PDHc Complejo de la piruvato deshidrogenasa.

PD3B Fosfodiesterasa 3B.

Page 18: Tesis fernández briones

PEPCK Fosfoenol-piruvato-carboxi-quinasa.

PGC-1α Coactivador de la transcripción 1α.

PI3K Fosfoinositol-3- kinasa.

PKA Proteína quinasa A.

PMSF Fenil-metil-sulfonil-fluoruro.

POMC Pro-opiomelacortina.

PPARγ Activador de la proliferación peroxisomal γ.

PTP1B Fosfotirosina fosfatasa 1B.

PVN Núcleo paraventricular del hipotálamo.

QM Quilomicrones.

RNA Ácido ribonucléico.

rpm Revoluciones por minuto.

RT Transcriptara reversa.

SDS Dodecilsulfato sódico.

SEM Desviación estándar de la media.

Ser Serina.

SNA Sistema nervioso autónomo.

SNC Sistema nervioso central.

SNS Sistema nervioso simpatico.

SIRT1 Sirtuinas.

SOCS-3 Supresor de la señalización por citoquinas.

SOG Sobrecarga oral de grasas.

SREBP-1c Proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c.

STAT3 El transductor de señal y activador de la transcripción 3.

S6K Proteína ribosomal S6 quinasa.

TAB Tejido adiposo blanco.

Page 19: Tesis fernández briones

TAE Tejido adiposo epididimal.

TAG Triacilgliceridos.

TAM Tejido adiposo marrón.

TAP Tejido adiposo perirrenal.

TG-LP Triglicéridos provenientes de los lípidos.

TG-QM Triglicéridos provenientes de los quilomicrones.

TAG-VLDL Triglicéridos provenientes de los lípidos de muy baja densidad.

Thr Treonina.

TNFα Factor de necrosis tumoral.

TSH Hormona estimulante de la tiroides.

Tyr Tirosina.

Tween 20 Monooleato de Polioxietileno Sorbitan.

TZDs Tiazolidinedionas.

T2DM Diabetes mellitus tipo 2.

UI Unidades internacionales.

VMH Región del hipotálamo ventromedial.

VL Ventrículo lateral.

VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad.

2DOG 3H-2-desoxiglucosa

Page 20: Tesis fernández briones

.

Page 21: Tesis fernández briones

INTRODUCCIÓN

Page 22: Tesis fernández briones
Page 23: Tesis fernández briones

Introducción

1

1-INTRODUCCIÓN.

Estado de la cuestión.

1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2.

La masa del tejido adiposo está regulada por un equilibrio dinámico entre la

ingesta diaria y el gasto energético. La ruptura de este balance conlleva obesidad, una

enfermedad multifactorial que involucra un incremento en la masa del tejido adiposo.

Factores como la urbanización y la dieta desequilibrada, asociado con la

susceptibilidad genética han permitido que emerja el fenotipo obeso.

Además de los problemas físicos derivados del exceso de peso, la obesidad se

asocia con frecuencia a otras enfermedades crónicas y trastornos metabólicos como la

diabetes tipo 2, hipertensión arterial, dislipemias, enfermedades cardiovasculares,

resistencia a insulina y otras alteraciones que contribuyen al desarrollo de la

morbilidad. La Organización Mundial de la Salud considera que la prevalencia del

sobrepeso y de la obesidad ha alcanzado en muchas regiones proporciones epidémicas

((Wild y col., 2004).

La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina más común y es una de las

causas principales de mortalidad en las sociedades desarrolladas. Esta enfermedad

puede ser de 2 tipos, en función de su origen.

La diabetes tipo I representa menos del 10 % de los casos y, generalmente, se

diagnostíca en la infancia. Se caracteriza por elevados niveles de glucosa en sangre

debido a que el organismo no produce o produce poca insulina. En estos casos se

necesitan inyecciones diarias de insulina para sobrevivir.

La diabetes tipo II corresponde aproximadamente al 90% de todos los casos de

diabetes y, generalmente, se presenta en la edad adulta. Es una condición patológica

en la que existe resistencia a la acción de la insulina, con lo cual el metabolismo de

carbohidratos y lípidos no es regulado de manera adecuada por dicha hormona. Esta

patología se caracteriza por hiperglucemia, hiperlipidemia e hipoinsulinemia. En estas

condiciones, el organismo llega a necesitar del aporte de grandes cantidades de

insulina exógena (Saltiel AR, 2001).

Page 24: Tesis fernández briones

Introducción

2

La diabetes tipo II es una enfermedad multifactorial con raíces poligénicas, así

como de naturaleza ambiental, ya que influye de forma importante, la dieta y una vida

sedentaria (Fujimoto WY, 2000). Sin embargo, desde hace décadas, existe un consenso

general en cuanto a la aparición de la Diabetes tipo II, la cual se debe al desarrollo

previo de resistencia a la insulina, que es un estado fisiológico en el que los tejidos

diana de esta hormona presentan una respuesta disminuida ante un estímulo

insulínico normal (Kahn CR, 1978).

Entre los mecanismos responsables de la resistencia a la insulina se han

descrito alteraciones de la expresión génica, de la distribución subcelular y del estado

de fosforilación de diferentes proteínas de la vía de transducción de señales de la

insulina, como por ejemplo: los sustratos del receptor de insulina, la PI3K (Saltiel AR,

2001), la AKT o el GLUT4 (Shepherd PR y col., 1999). Sin embargo, la obesidad es el

principal factor adquirido responsable de la disminución de la sensibilidad a la insulina

(Lewis G y col., 2002).

En este contexto, el tejido adiposo es reconocido actualmente como un tejido

clave en el desarrollo de la resistencia global a la insulina (Arner, 2003; Bays y col,

2008). Además de su función como depósito de energía y principal proveedor de

ácidos grasos para su utilización por otros tejidos, el tejido adiposo es un importante

órgano endocrino, liberando a la circulación péptidos semejantes a hormonas que

afectan al metabolismo sistémico y a la propia célula adiposa. Desde una perspectiva

“adipocéntrica” se postula que la expansión del tejido adiposo constituye un nexo

importante entre obesidad y resistencia a insulina (Virtue y Puig, 2010). En esta

dirección se ha propuesto que: un exceso del combustible energético almacenado que

sobrepasa la capacidad oxidativa/almacenamiento, sumado a la alteración de la

producción de citoquinas por los adipocitos y macrófagos residentes, más, el aumento

del estrés oxidativo y la inflamación crónica, entre otros, contribuiría a la

desregulación funcional del tejido adiposo (Medina-Gomez y col., 2007). En su

conjunto los aspectos mencionados convierten al tejido adiposo en un tejido clave en

el estudio de las bases moleculares de la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus

tipo II.

Page 25: Tesis fernández briones

Introducción

3

Se estima que la prevalencia de la diabetes a nivel mundial será del 4.4% en el

año 2030, de modo que la epidemia de la diabetes continuará y para 2030 habrá en el

mundo 366 millones de diabéticos. Estas cifras continuarán incrementándose siempre

que se mantenga o incremente la prevalencia de obesidad (Wild y col, 2004).

1.2- El tejido adiposo.

Tradicionalmente, el tejido adiposo había sido considerado como un tejido

pasivo, destinado a ser exclusivamente un almacén energético. Sin embargo, en el año

1987 se identificó como uno de los principales tejidos implicados en el metabolismo de

hormonas esteroideas (Siiteri PK, 1987) y en la producción y secreción de adipsina, un

factor cuya expresión está marcadamente disminuida en situación de obesidad de

roedores (Flier JS y col, 1987).

Años más tarde, en 1994 la identificación y caracterización de la leptina, estableció al

tejido adiposo como un autentico órgano endocrino (Zhang Y y col., 1994). En los

últimos años, se ha confirmado que el tejido adiposo secreta numerosos péptidos

bioactivos y proteínas, llamadas colectivamente adipoquinas (Kershaw EE y col., 2004;

Guerre-Millo M.J, 2002), que pueden actuar tanto a nivel local (autocrino/paracrino) y

sistémico (endocrino) (Kershaw EE y col., 2004), como a nivel del sistema nervioso

central (Ahima RS y col., 2006). Estos factores desempeñan un papel muy importante

por su influencia sobre una amplia variedad de procesos fisiológicos, la mayoría de

ellos relacionados con la homeostasis de la glucosa y la regulación del balance

energético. Algunas adipoquinas como la leptina y la resistina, intervienen junto con la

insulina, en el control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad

a la insulina del organismo.

El preocupante aumento de la obesidad y las complicaciones derivadas de ésta,

como la diabetes mellitus y la enfermedad cardiovascular, ha incrementado

notablemente la necesidad de profundizar en el estudio del tejido adiposo, su

metabolismo y las consecuencias de la alteración de su actividad metabólica,

endocrina e inmunológica (Bays y col, 2008).

Page 26: Tesis fernández briones

Introducción

4

En mamíferos, existen dos tipos de tejido adiposo: el tejido adiposo blanco

(TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM) (Cinti, 2001). Ambos tienen capacidad de

metabolizar y almacenar lípidos, pero presentan claras diferencias en cuanto a su

morfología, distribución, expresión génica, características del proteoma así como de su

función (Pulido y col, 2012). El tejido adiposo blanco es el órgano específico que

almacena la energía sobrante en forma de grasa; mientras que el tejido adiposo

marrón, tiene una función fisiológicamente opuesta: permite la disipación de energía

en forma de calor. Nuestra investigación se ha centrado en el estudio del TAB, por lo

tanto, dirigiremos nuestra atención hacia la descripción del mismo.

1.2.1- El tejido adiposo blanco.

En mamíferos, el TAB se encuentra extensamente distribuido en el organismo,

principalmente a escala dérmica, subcutánea, mediastínica, perigonadal, perirrenal, y

retroperitoneal (Cinti, 2001). Una vez que el tejido adiposo está completamente

formado, los adipocitos representan entre uno y dos tercios del mismo. El resto del

tejido adiposo está constituido por células sanguíneas, células endoteliales, pericitos, y

precursores de adipocitos con distintos grados de diferenciación, aunque también

pueden encontrarse preadipocitos (células intersticiales o vacías de lípidos) y células

mesenquimales, probablemente diferenciadas (las cuales poseen pequeñas gotas de

lípidos) (Hauner y col., 1989). Los adipocitos que son las células principales de este

tejido provienen de células mesenquimales indiferenciadas. En su origen presentan

pequeñas inclusiones lipídicas que al hacerse mayores y más numerosas, confluyen en

una única gota lipídica que ocupa casi todo el citoplasma.

Como se ha mencionado, el TAB es el mayor reservorio de energía, de

componentes de membrana y probablemente de moléculas señalizadoras de

naturaleza lipídica del organismo. Participa en el control de la homeostasis lipídica,

almacenando la energía sobrante en forma de triacilglicéridos y liberando ácidos

grasos libres y glicerol cuando el gasto energético excede la ingesta de energía. Todo

ello está regulado por los sistemas nervioso y endocrino.

Page 27: Tesis fernández briones

Introducción

5

La liberación de ácidos grasos no esterificados a la circulación sanguínea en

momentos de demanda energética, continúa siendo la principal función del tejido

adiposo y la forma en que se regula la movilización de los lípidos almacenados en la

gota lipídica es un tema difícil de estudiar, que requiere de mucha investigación por la

estrecha relación que existe entre los niveles circulantes de ácidos grasos y la diabetes

tipo 2 (Birnbaum MJ, 2003).

1.3- Fisiología del tejido adiposo.

Cuando se incrementa la ingesta alimentaria y/o disminuye el gasto de energía,

el exceso de ésta se deposita de manera eficiente en el tejido adiposo en forma de

triglicéridos neutros. Sin embargo, cuando la alimentación es escasa y/o se

incrementan los requerimientos energéticos, las reservas de lípidos son liberadas para

proporcionar combustible energético en forma de ácidos grasos y de glicerol para la

síntesis de glucosa por otros tejidos.

Los triglicéridos provenientes de la dieta (exógenos) ingresan a la circulación

plasmática desde la linfa en la forma de quilomicrones. Por su parte, el hígado sintetiza

y secreta la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), la cual transporta los

triglicéridos endógenos sintetizados desde el hígado hasta los tejidos extrahepáticos.

1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo.

La enzima lipoproteína lipasa (LPL) es una enzima multifuncional, que juega un

papel clave en la distribución de los ácidos grasos de los triglicéridos de las

lipoproteínas plasmáticas hacia los tejidos periféricos (Wang y col., 2009).

Presente en el endotelio capilar de los tejidos extrahepáticos, entre ellos el

tejido adiposo blanco, cataliza la hidrólisis de los triglicéridos de las lipoproteínas ricas

en triglicéridos (VLDL y quilomicrones). Estas lipoproteínas se unen a la enzima a través

de la apolipoproteína CII (Apo CII) y como resultado de la actividad de la LPL se libera

progresivamente ácidos grasos libres (AGL) y glicerol. Los AGL pueden difundir a través

Page 28: Tesis fernández briones

Introducción

6

de la membrana plasmática o entrar a la célula adiposa a través de transportadores del

tipo CD36 y moverse al interior de la misma unidos a la proteína aP2. Luego, por acción

de la acetil-CoA sintasa son transformados en el acil derivado, acil-CoA. Los acil-CoA

son principalmente reesterificados con moléculas de glicerol-3P y almacenados

nuevamente como triglicéridos, mientras que el glicerol queda en la sangre y es

captado principalmente por las células hepáticas. En estas condiciones, los ácidos

grasos que no entran a los tejidos, se unen a la albúmina para su circulación por el

organismo.

Ahora bien, la captura de AGL, su activación y su esterificación al glicerol-3P

para formar TAG en el tejido adiposo, es un proceso que requiere en paralelo de la

captura de glucosa estimulada por la insulina y su transformación en glicerol-3P. En el

estado basal, cuando la glucemia es baja, la glucosa entra al adipocito a través del

transportador de membrana GLUT1, sin embargo, en situación de elevada glucemia y

en respuesta a la insulina, la glucosa es transportada preferentemente por el

transportador de membrana GLUT4. Una vez en el citoplasma, puede ser transformada

en dihidroxiacetona-P, la cual originará la molécula de glicerol-3P.

Una fracción de la glucosa capturada es metabolizada hasta piruvato. El

piruvato puede formar lactato en el citosol, o ingresar a la mitocondria y por

descarboxilación oxidativa irreversible (a través del complejo de la piruvato

deshidrogenasa – PDHc) se transforma en acetil-CoA. Los átomos de carbono del

acetil-CoA pueden sufrir una oxidación completa a CO2, con la consecuente liberación

de energía y formación de ATP.

En el tejido adiposo funcional, un exceso de glucosa estimula la síntesis de novo

de ácidos grasos, esto implica la salida de acetil-CoA de la mitocondria. La forma de

extraer acetato de la mitocondria es en forma de citrato, el producto de la

condensación de acetil-CoA y oxalacetato. En el citosol, el citrato es desdoblado a

oxalacetato y acetil-CoA. El acetil-CoA es transformado a malonil-CoA por carboxilación

irreversible catalizada por la acetil-CoA carboxilasa (ACC). Luego, el malonil-CoA sufre

un proceso de elongación catalizado por el complejo de la sintetasa de ácidos grasos

(FAS) para formar acil-CoA. A partir de este y de glicerol-3-P se sintetizan triglicéridos

que pasan a formar parte del reservorio de triglicéridos del tejido. En esta vía

Page 29: Tesis fernández briones

Introducción

7

metabólica intervienen las enzimas glicerol-3-P aciltransferasa, ácido lisofosfatídico acil

transferasa y diacil-glicerol acil transferasa, esta última enzima es clave en el control de

este proceso (Proscura e Ignatieva, 2002).

La enzima LPL juega un papel fundamental en el almacenamiento de AG y de

colesterol en los adipocitos en forma de TAG y ésteres de colesterol que son lípidos

neutros. La esterificación dependerá del suministro de glicerol-3P generado a partir de

la glucolisis y de la captura de los AG. La entrada de AG al tejido adiposo depende del

gradiente de concentración. De modo que cuando aumenta la velocidad de

esterificación, aumenta la entrada de AG a la célula y la hidrólisis de los TG de las

lipoproteínas, catalizada por la LPL. Estos procesos están favorecidos en respuesta a la

insulina.

1.3.2- La Gota Lipídica.

La síntesis de la mayoría de los lípidos neutros como los TAG y los ésteres de

colesterol se realiza en el retículo endoplásmico y rápidamente estos lípidos se

depositan en un tipo especial de organelo llamado gota lipídica, presente en todas las

células (eucariotas) o en las partículas de lipoproteínas en células especializadas como

los hepatocitos y cardiomiocitos. Se piensa que la gota lipídica se forma a partir del

retículo endoplásmico por un mecanismo que aún no está descrito. Debido a la

dificultad que comporta el trabajo con lípidos, los estudios relacionados con los

mecanismos que modulan la actividad de la gota lipídica son escasos, sin embargo

tienen gran repercusión debido a su relación con la obesidad, la diabetes, el cáncer y la

neurodegeneración (Zechner y col, 2012).

Actualmente se acepta que la síntesis de lípidos neutros es suficiente para crear

una película que los cubre y concentra en una gota lipídica, a esta película se van

añadiendo fosfolípidos tomados a partir de la membrana del retículo endoplásmico

hasta formar una verdadera cubierta. También se propone la intervención necesaria de

las aciltransferasas en el proceso de formación, definición y orientación de la gota

lipídica en la membrana del retículo endoplásmico (Sturley y Hussain, 2012).

Page 30: Tesis fernández briones

Introducción

8

1.3.3- Lipólisis.

En los mamíferos, la adaptación exitosa al estado de ayuno y de inanición

depende en gran medida de la movilización regulada de los ácidos grasos almacenados

en forma de triglicéridos en la gota lipídica del tejido adiposo blanco, proceso conocido

como lipólisis. Por lo tanto se define la lipolisis como la parte catabólica del ciclo de los

ácidos grasos. La regulación de la lipolisis es compleja y depende de las necesidades de

energía, de los niveles circulantes de hormonas, de la modificación covalente de las

enzimas lipolíticas y de la compartimentación subcelular de estas enzimas. Las

alteraciones de los mecanismos de regulación de la lipolisis tienen gran impacto en la

homeostasis de energía y la señalización celular (Birnbaum MJ, 2003; Zechner y col,

2012).

Los adipocitos contienen tres enzimas responsables de escindir los triglicéridos

en glicerol y ácidos grasos, la triglicérido lipasa (ATGL), la lipasa sensible a hormonas

(HSL) y la monoglicérido lipasa (MGL)). El primer paso en la degradación de los

triglicéridos está catalizado por la ATGL, que convierte los TAG en DAG. La HSL es

responsible de la hidrólisis de los DAG a MAG y la MGL de la hidrólisis de los MAG. En

el tejido adiposo la lipólisis se produce fundamentalmente por la acción de las enzimas

ATGL y HSL (Zechner y col, 2012).

Los ácidos grasos liberados pueden abandonar la célula y ser transportados por

la sangre unidos a la albúmina para ser utilizados por tejidos no adiposos (hígado,

músculo esquelético, cardiaco, etc) oxidándose o reesterificándose según las

condiciones nutricionales (Figura 1). Por otra parte, el glicerol generado tras la

degradación metabólica de los triglicéridos es transportado a través de la membrana

plasmática por medio, fundamentalmente, del canal de glicerol acuoporina 7 (AQP7).

(MacDougald y Burant, 2005).

La ATGL juega un papel fundamental en la regulación de la lipólisis basal. Se

conoce que tanto los agonistas de los receptores nucleares PPAR, el ayuno y los

glucocorticoides aumentan la expresión del gen de ATGL, mientras que la alimentación

Page 31: Tesis fernández briones

Introducción

9

y la insulina la disminuyen. A diferencia de la HSL, los b-adrenérgicos regulan su

actividad de forma indirecta, a través del reclutamiento del coactivador CGI-58

(Zechner y col, 2012).

Sin embargo, la regulación de la actividad de la HSL depende fuertemente, de

los niveles intracelulares de cAMP y la actividad de la enzima PKA. En condiciones de

elevada demanda energética, la activación de los receptores β adrenérgicos en la

superficie de los adipocitos y de la proteína G estimulatoria (Gs) lleva a la generación

de AMPc, por activación de la enzima de membrana adenilil ciclasa. El AMPc activa la

proteína quinasa A (PKA), una serina-treonina quinasa que activa mediante

fosforilaciones de diferentes residuos de serina a la HSL. Al contrario, la estimulación

del receptor α2-adrenérgico promueve la inhibición de la adenilil ciclasa por medio de

la proteína G inhibitoria (Gi), reduciendo el contenido intracelular de AMPc e

inhibiendo la lipólisis (Lafontan y Berlan, 1995).

La HSL fosforilada y activa se mueve desde el citosol hacia la superficie de la

gota lipidica de la célula adiposa. La fosforilación de proteínas de la familia de las

perilipinas localizadas en la superficie de la gota lipidica, es también necesaria antes de

que la HSL pueda catalizar la hidrólisis de los triglicéridos. Las perilipinas no

fosforiladas crean una barrera entre la HSL y los lípidos, que evita la lipólisis, mientras

que la fosforilación de las perilipinas por la PKA permite a la HSL acceder a la superficie

de la gota lipidica. La acción de la HSL sobre los triglicéridos presenta especificidad por

los ésteres unidos en posición 1 y 3 del glicerol (Yeaman, 1990). En la regulación

postraduccional de la HSL intervienen también otras enzimas entre las que se

encuentra la AMPK (Zechner y col, 2012).

La hidrólisis de los monoglicéridos remanentes para dar glicerol y un ácido

graso, ocurre por la acción de la monoglicéridolipasa (MGL), que no se encuentra bajo

control hormonal y cuya abundancia en la célula es suficiente para evitar la

acumulación de productos intermediarios de la lipólisis (Horowitz, 2003).

Page 32: Tesis fernández briones

Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de

triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,

corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante

del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las

hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c

inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la

degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos

dependientes de la insulina, la fosfoinositol

fosforilación a la PDE (Langin y col., 1996).

Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios

vivo de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la

adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores

metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como

se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su

función metabólica modificando los niveles intracelular

PKA, y por consiguiente la de la HSL.

Figura 1. Estructura del Isoproterenol.

Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una

disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expr

que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por

estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis

Introducción

10

Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de

triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,

corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante

del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las

hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c

inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la

degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos

dependientes de la insulina, la fosfoinositol-3- kinasa (PI3-K), que activa por

osforilación a la PDE (Langin y col., 1996).

Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios

de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la

adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores adrenérgicos, por lo que a efectos

metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como

se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su

función metabólica modificando los niveles intracelulares de cAMP, la actividad de la

PKA, y por consiguiente la de la HSL.

Estructura del Isoproterenol.

Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una

disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expresión de HSL, por lo

que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por

estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis

Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de

triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón, hormona

corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante

del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las

hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil ciclasa

inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la

degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos

K), que activa por

Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios in vitro o ex

de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la

adrenérgicos, por lo que a efectos

metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como

se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su

es de cAMP, la actividad de la

Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una

esión de HSL, por lo

que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por

estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis

Page 33: Tesis fernández briones

Introducción

11

basal (Langin y col, 2005; Jocken y col, 2007). Por otra parte, la lipolisis estimulada por

catecolaminas es superior en el tejido adiposo visceral en comparación con el tejido

adiposo subcutáneo, así como la liberación de ácidos grasos libres y de glicerol a la

sangre portal, de modo que la lipolisis mediada por catecolaminas afecta directamente

al contenido de glucosa y de grasa del hígado, promoviendo el desarrollo de

dislipemias, hiperglucemia y resistencia a la insulina (Bays y col, 2008).

Dadas sus funciones, no es de sorprender que el tejido adiposo esté

exquisitamente diseñado para responder a los cambios agudos de las señales

nutricionales. En realidad, a nivel molecular y bioquímico, los adipocitos están

equipados con la maquinaria necesaria para responder a la estimulación hormonal, por

ejemplo, el adipocito es sensible a la insulina, la cual estimula la captación de glucosa y

la lipogénesis e inhibe la lipólisis y además está sujeto a la regulación adrenérgica que

estimula la lipólisis (Sethi y Vidal-Puig, 2007).

Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. En la figura se muestran las principales vías

metabólicas de los lípidos y de la glucosa en el tejido adiposo. Además se señalan algunas

enzimas, transportadores y receptores importantes de estas vías metabólicas. AC: adenilil

ciclasa, ACS: acil-CoA sintasa, ACC: acetil-CoA carboxilasa, AGL: ácido graso libre, cAMP:

monofosfato de adenosina cíclico, AR: receptor adrenérgico, FAS: sintasa de ácidos grasos,

G3P: glicerol 3 fosfato, HSL: lipasa hormona sensible, IR: receptor de la insulina, IRS: substrato

del receptor de insulina, LPL: lipoproteína lipasa, MGL: monoglicérido lipasa, PDE:

fosfodiesterasa, PI3K: fosfatidilinositol 3- quinasa, PKA, proteína quinasa A, P: perilipina, AQP7:

acuoporina 7 (Modificado de Sethi y Vidal- Puig, 2007).

Page 34: Tesis fernández briones

Introducción

12

1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino.

El tejido adiposo actúa como un órgano endocrino liberador de hormonas,

produciendo numerosas sustancias, llamadas adipocitoquinas, que incluyen varias

citoquinas, hormonas y factores de crecimiento. Han sido identificados más de 100 de

estos factores secretados. A través de estas sustancias, el tejido adiposo, no solo

influye sobre la propia biología adipocitaria sino también sobre la regulación de la

homeostasis energética, la sensibilidad insulínica, el metabolismo de lípidos y

carbohidratos, el crecimiento celular, la inflamación y el desarrollo de cáncer (Havel,

2004, Bays y col, 2008).

Hoy en día se considera que el TAB es un órgano muy dinámico con funciones

pleiotrópicas. En la tabla 1 se muestran ejemplos de receptores expresados por el TAB,

mientras que en la tabla 2 se enumeran algunas adipocitoquinas expresadas y

secretadas por este tejido como: la adipsina (Cook y col, 1985), el factor de necrosis

tumoral (TNFα) (Hotamisligil y col., 1995), la leptina (Friedman, 2000), la resistina

(Steppan y col., 2001b) y la adiponectina (Hu y col., 1996; Maeda y col., 1996; Nakano y

col., 1996; Keys y col., 1972).

Algunas pueden regular funciones como la reproducción, la función

cardiovascular y la inmunidad. La secreción de estas citoquinas por el TAB está

regulada entre otros factores por el ayuno, la ingesta y la obesidad (Hamilton y col.,

1995; Hotamilligil y col., 1995; Lefebvre y col., 1998). De esta manera, el adipocito se

ha convertido en el integrador central del programa metabólico del organismo y está

completamente establecido, que la función endocrina del adipocito ejerce una

influencia directa sobre otros órganos clave, como el cerebro, el hígado o los músculos

esqueléticos.

Page 35: Tesis fernández briones

Introducción

13

Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB (Bays y col, 2008.

Revisión)

.

Receptores de membrana para hormonas Insulina (lipogénico / antilipolítico)

Glucagón (lipolítico)

GH

TSH

Receptores de hormonas nucleares y otros

receptores nucleares

Glucocorticoides

Andrógenos

Estrógenos

Hormona tiroidea

PPAR, PPAR /, PPARγ

Receptor de adipoquinas y citoquinas Leptina

Adiponectina

IL-6

TNFα

Receptores de catecolaminas β1,β2,β3 (lipolíticos)

α1,α2 (antilipolíticos)

Receptores de factores de crecimiento y

otros receptores

FGF, EGF, IGF, …

Cannabinoides, melanocortinas, NPY

Lipoproteínas

Page 36: Tesis fernández briones

Introducción

14

Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con funciones

endocrinas / paracrinas / autocrinas (Bays y col, 2008. Revisión).

Adipoquinas y Citoquinas Leptina

TNFα

IL-6

Proteínas relacionadas con el sistema

inmunitario

MCP-1

Proteínas implicadas en el sistema

fibrinolitico

PAI-1

Factor tisular

Proteínas del complemento y relacionadas Adipsina

Adiponectina

Lípidos y proteínas del metabolismo y

transporte de lipidos

LPL

Apolipoproteina E

Otras Resistina

A continuación haremos una breve descripción de algunas de las más

importantes adipocitoquinas secretadas por el TAB. Como la segunda parte de esta

tesis está relacionada con los efectos de la leptina, ésta será analizada con más detalle.

1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα).

EL TNFα es una citoquina identificada inicialmente en macrófagos y linfocitos

en respuesta a un estimulo inflamatorio. Dentro del tejido adiposo, TNFα se expresa

en adipocitos y células estromales vasculares (Fain y col., 2004). Se sintetiza como una

proteína transmembrana de 26 kDa que sufre la degradación por una

metaloproteinasa que libera a la circulación la molécula soluble de TNF- α de 17 kDa

(Kriegler y col., 1988).

Los adipocitos aislados y diferenciados son capaces de producir TNF-α y aunque

el tejido adiposo está compuesto de una variedad de tipos celulares incluyendo

adipocitos, células del estroma, células del sistema inmune y células endoteliales

Page 37: Tesis fernández briones

Introducción

15

vasculares, todas capaces de producir citoquinas, los adipocitos son la fuente

predominante de TNF-α (Ruan y col., 2003).

Aunque inicialmente se sospechó que TNF- podría estar jugando un papel

importante en la caquexia, hoy se sabe que está implicado en la patogénesis de la

obesidad y la resistencia a la insulina (Fernández-Real y Ricart, 2003; Ruan y Lodish,

2003). La expresión del TNFα de TAB está aumentada en ratones y humanos obesos y

se correlaciona positivamente con la adiposidad y la resistencia a insulina (Ruan y

Lodish, 2003; Hotamisligil y col., 1993; Hotamisligil, 2003). Sus acciones en tejido

adiposo incluyen la represión de genes involucrados en la captación y el

almacenamiento de AGL y glucosa y de genes implicados en la adipogenesis como

PPARγ y el cambio en la expresión de otras adipocitoquinas como leptina, adiponectina

e IL-6 (Ruan y col., 2002). Por otro lado, TNFα deteriora la señalización de insulina

mediante la alteración del estado de fosforilacion de IRS-1 y 2 (Hotamisligil, 2003).

Estos efectos pueden producirse de forma directa e indirectamente a través del

aumento de AGL (Ruan y Lodish, 2003). El modelo de deficiencia de TNFα en ratón

presenta mejor insulinemia, mejor tolerancia a la glucosa y protección para el

desarrollo de la obesidad y la resistencia a la insulina cuando se administra una dieta

rica en grasas (Uysal y col., 1997; Ventre y col., 1997).

1.4.2- IL-6.

La IL-6 es una citoquina proinflamatoria, de la cual se estima que un tercio de

sus valores circulantes provienen del TAB, correlacionándose con el IMC (Fruhberck y

col., 2001; Fernández-Real y Ricart, 2003). Sin embargo, la mayor parte de la IL-6

derivada del tejido adiposo proviene de las células de la fracción del estroma vascular

(Galic y col., 2010). Los valores circulantes de IL-6 están incrementados en individuos

obesos, aspecto que podría estar mediado por el TNFα, ya que se ha demostrado su

capacidad de estimular la expresión de IL-6 en adipocitos (Fruhbeck y col., 2001). En

humanos, los valores circulantes de IL-6 se han correlacionado positivamente con

resistencia a la insulina, fenómeno al cual podría contribuir, ya que la IL-6 incrementa

la concentración de FFA circulantes e inhibe la actividad de la LPL (Bastard y col.,

Page 38: Tesis fernández briones

Introducción

16

2000). Los niveles plasmáticos de IL-6 se encuentran elevados en obesidad y RI

(Mohamed-Ali y col., 1997; Bastard y col., 2000; Vozarova y col., 2001). Según

Frühbeck y col., (2001) la leptina induce la expresión de IL-6 en los adipocitos. Por otra

parte se ha descrito que la IL-6 inhibe la producción de adiponectina (Yu y Ginsberg,

2005), adipoquina asociada al incremento de sensibilidad a la insulina. Sin embargo, el

papel de IL-6 en la resistencia a la insulin, la obesidad y la inflamación no se conoce del

todo. Otros estudios la implican tanto en procesos que promueven la inflamación

como en procesos resolutorios de la inflamación (Allen T.L. y col., 2010). Los resultados

publicados por (Sadagursky M y col., 2009) (Tabla 3) postulan que la IL-6 incrementa

las acciones de la leptina.

1.4.3- PPARγ.

Es un miembro de la familia de receptores nucleares activados por

proliferadores de peroxisomas que se expresan fundamentalmente en TA y

macrófagos. Su función es clave en la regulación transcripcional de la adipogénesis.

Agonistas de PPAR-γ como las TZDs (tiazolidinedionas), promueven la diferenciación de

los adipocitos y mejoran la sensibilidad a la insulina en modelos animales de diabetes

tipo II, así como en pacientes con diabetes tipo II (Olefsky, 2000).

Las vías de señalización mediadas por TNFα y PPAR γ son mutuamente

antagónicas. Se plantea que la activación de PPAR γ puede atenuar los efectos

metabólicos negativos de TNFα tanto “in vitro” como “in vivo” (Szalkowki y col.,

1995;Milles y col., 1997; Souza y col.,1998).

También cabe destacar que PPARγ estimula la captación de los ácidos grasos, a

través del aumento de la proteína transportadora de ácidos grasos, de la LPL, de la acil-

CoA sintasa, y la esterificación de los triglicéridos en una acción concertada con otro

factor de transcripción SREBP-1c que regula la lipogénesis para el llenado de las gotas

lipídicas (Evans y col., 2004).

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Introducción

17

1.4.4- Resistina.

La resistina es una proteína de 94 aminoácidos que se describió inicialmente en

el adipocito maduro de roedores (Steppan y col., 2001b). En humanos la resistina

circulante proviene fundamentalmente de los macrófagos, células del sistema inmune.

En roedores, la resistina produce resistencia a la insulina y aumenta la producción

hepática de glucosa. Sin embargo, la contribución de la hiperresistinemia al desarrollo

de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, continúa siendo objeto de una gran

controversia. Según estudios iniciales, las concentraciones de resistina están

aumentadas en modelos de obesidad inducida o genética (Steppan y col., 2001a)

mientras que la neutralización de la misma empleando anticuerpos específicos contra

resistina, disminuía la hiperglucemia y mejoraba la resistencia a la insulina en estos

modelos.

En humanos las discrepancias son aún mayores, aunque se ha demostrado

correlación entre los niveles circulantes de resistina y el peso corporal, la adiposidad o

la resistencia a la insulina (Janke y col., 2002; Savage y col., 2001).

Diferentes factores afectan la síntesis de resistina en roedores, entre los que se

encuentran la edad y el estado nutricional así como la localización anatómica del tejido

adiposo. En la rata Wistar, la expresión de resistina por el tejido adiposo epididimal

disminuye con el envejecimiento. Por otra parte, la restricción calórica moderada,

disminuye la expresión de resistina por el tejido adiposo visceral así como los niveles

circulantes de esta adipoquina, solo en animales jóvenes y maduros (Fernández y col,

2009).

Con el objetivo de profundizar en las funciones de las resistinas humana y de

roedores se crearon ratones deficientes en resistina derivada del tejido adiposo, pero

que producían resistina humana de forma similar a como la producen en humanos los

macrófagos (ratones transgénicos humanizados). Cuando estos animales son

alimentados con dieta alta en grasa desarrollan rápidamente inflamación en el tejido

adiposo, a la par que aumenta la lipolisis y los niveles séricos de AGL. La inflamación

del tejido adiposo se desencadena a partir del incremento en MCP-1 dependiente de

resistina. Con el tiempo, estos animales acumulan lípidos en el músculo (incluyendo

Page 40: Tesis fernández briones

Introducción

18

DAG) y desarrollan resistencia a la insulina en este tejido relacionada con el aumento

de la fosforilación en serina del IRS-1. Estos resultados demostraron que tanto la

resistina de roedores como la humana exacerba la inflamación del tejido adiposo y

genera resistencia a insulina en músculo esquelético (Qatanani M y col, 2009).

1.4.5- Adiponectina.

La adiponectina es una proteína de 30 kDa producida abundantemente por el

tejido adiposo que sufre numerosas modificaciones postraduccionales (Maeda y col.,

1996; Scherer y col., 1995). A diferencia de la resistina, la adiponectina disminuye la

producción hepática de glucosa. Además, la expresión de adiponectina se encuentra

disminuida en todos los procesos relacionados con estados de inflamación y resistencia

a la insulina, como en la obesidad, la diabetes mellitus y la enfermedad coronaria

(Hotta y col., 2000; Weyer y col., 2001; Adamczak y col., 2003; Kishida y col., 2003). De

modo que es la única adipoquina con efectos saludables sobre diferentes tipos de

células y tejidos, efectos que generalmente se asocian al aumento de actividad de la

enzima AMPK (Yamauchi y col, 2002).

Los niveles de adiponectina aumentan cuando la sensibilidad a la insulina

mejora, ya sea por la disminución del peso corporal o por tratamientos con drogas

sensibilizadoras de la insulina (Chandran y col., 2003; Diez e Iglesias, 2003). Los ratones

deficientes en adiponectina desarrollan de forma prematura intolerancia a la glucosa y

resistencia a la insulina inducida por dieta muestran, elevados valores de FFA séricos y

una incrementada proliferación de células del músculo liso vascular en respuesta al

daño tisular (Kubota y col., 2002; Maeda y col., 2002). Por otra parte, la

sobreexpresión de adiponectina en ratones conduce a una mejora en la sensibilidad a

la insulina, la tolerancia a la glucosa y los niveles séricos de FFA (Combs y col., 2004).

Se plantea que numerosos fármacos con efectos hipolipémicos como los ácidos

grasos omega 3, las estatinas y fibratos así como la niacina, que mejoran el pérfil

lipídico del organismo, no afectan la liberación de TNF, resistina o leptina, sin

embargo, incrementan la producción de adiponectina por el tejido adiposo (Wanders y

col, 2010).

Page 41: Tesis fernández briones

Introducción

19

1.4.6- Leptina.

La leptina es una hormona peptídica de 16 kDa y no presenta modificaciones

post-traduccionales (Halaas y col., 1995). Esta hormona codificada por el gen ob, es

producida y secretada por los adipocitos y en menor medida se ha detectado en la

placenta, donde estimula el crecimiento y la sobrevivencia de los trofoblastos

(Masuzaki y col., 1997; Gambino y col, 2012), en la mucosa gástrica, donde potencia la

respuesta vagal aferente frente a la distensión gástrica (Bado y col., 1998; Kentish y

col, 2013) y en el músculo esquelético (Wang y col., 1998).

La secreción de leptina por los adipocitos tiene lugar en proporción directa a la

masa de tejido adiposo y al estado nutricional (Frederich y col., 1995). La síntesis y

secreción de leptina está regulada por una compleja red de señales neuroendocrinas y

endocrinas que reflejan el estado fisiológico del organismo. Los niveles circulantes de

leptina están asociados con la masa del tejido adiposo y también reflejan cambios

inmediatos en el estado nutricional ya que disminuyen, poco después del comienzo del

ayuno (Becker y col., 1995). En condiciones normales, sus niveles plasmáticos

aumentan en casos de balance energético positivo, es decir, cuando la ingesta y la

absorción de nutrientes exceden el gasto energético global. De esta forma, se

comporta como un marcador del estado de las reservas del organismo. La impresión

inicial después de su descubrimiento en 1994, fue que la leptina (del griego leptos,

delgado) era una señal dirigida al cerebro para inhibir la ingesta de alimentos y

disminuir el peso corporal (Zhang y col., 1994). Este concepto fue impulsado en parte

por la observación de que los seres humanos y roedores que carecen de leptina

funcional manifiestan un apetito exagerado y obesidad.

La leptina limita el depósito graso en el tejido adiposo protegiendo de la

lipotoxicidad (Unger, 2002; Kahn y col., 2005). Estimula la oxidación de los ácidos

grasos (Muoio y col., 1997; Minokoshi y col., 2002) y la captación de glucosa por los

músculos esqueléticos (Haque y col., 1999; Kamohara y col., 1997). Estos efectos

metabólicos de la leptina se encuentran en parte mediados por la activación del eje

hipotálamo-sistema nervioso simpático (Buettner y col., 2008; Minokoshi y col., 2002).

Muchos de estos efectos metabólicos tienen lugar demasiado rápido para ser atribuido

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Introducción

20

a los cambios transcripcionales (señalización JAK-STAT) e involucran la activación de la

señalización de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) como fue descrito en el

músculo y el hígado por Kahn y col., (2005).

La leptina puede tener efectos autocrinos y paracrinos en el metabolismo del

adipocito (Fruhbeck y col., 1997): la incubación de adipocitos de ratón con leptina

estimula la lipólisis de los triglicéridos intracelulares, dicho efecto no fue observado en

ratones db/db carentes de receptores de leptina y la sobreexpresión de leptina en

adipocitos reduce la expresión de la acetil-CoA carboxilasa. La leptina también reduce

la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c

(SREBP1c) en tejido adiposo, lo que contribuye a inhibir la lipogénesis en este tejido

(Yu y Ginsberg, 2005).

Aunque la leptina regula, a través del SNC, una multitud de funciones

fisiológicas como la ingesta y el balance energético (Friedman y col., 1998), la función

inmune y reproductiva (Lord y col., 1998; Hileman y col., 2000), la hematopoyesis

(Margetic y col., 2002) la homeostasis de la glucosa (Friedman y Halaas, 1998), cabe

destacar sus efectos antilipogénicos (Gallardo y col, 2007; Warne y col, 2011),

antidiabéticos tanto en diabetes tipo I como tipo II y que éstos efectos son

independientes de la regulación del peso corporal y la ingestión de alimentos (Coppari

y Bjørbæk, 2012).

La observación fundamental que permitió relacionar la leptina con los procesos

de regulación del peso corporal proviene de estudios realizados con ratones ob/ob, en

los cuales la falta de leptina funcional provoca hiperfagia, obesidad y una disminución

de la tasa metabólica. Por otra parte la administración de leptina es capaz de revertir

las alteraciones causadas por la ausencia de esta hormona (Zhang y col., 1994; Rentsch

y col., 1995; Maury y Brichard, 2010). Sin embargo, la noción de la leptina como una

hormona anti-obesidad fue puesta en duda debido a que la obesidad se asocia

típicamente con niveles altos de leptina y resistencia a la leptina (Ahima, 2008). Se

conoce que humanos obesos y diversos modelos animales de obesidad inducida y

genética (excepto el modelo ob/ob) presentan hiperleptinemia, condición indicativa de

Page 43: Tesis fernández briones

Introducción

21

resistencia a esta hormona que se normaliza tras la pérdida de peso (Maffei y col.,

1995).

Se han propuesto varios mecanismos que intentan explicar la resistencia

central a la leptina como son los defectos en el sistema de acceso de la leptina al

sistema nervioso central dado que el transporte a través la barrera hematoencefalica

es saturable. Defectos en la expresión del receptor largo de leptina Ob-Rb en el

hipotálamo y/o de la señalización mediada por el receptor, que incluye el aumento en

niveles de SOCS-3. Defectos en los circuitos neuronales que regulan el balance

energético. Estrés crónico del retículo e inflamación a nivel de los núcleos

hipotalámicos (El Haschimi y col., 2000; Morris y Rui, 2009; Ozcan y col, 2009; Zachary

y col, 2010; Olofsson y col, 2013). No obstante, se ha propuesto utilizar el término

resistencia selectiva a la leptina cuando se analizan ciertos desórdenes metabólicos

como la obesidad y la diabetes, debido a que la resistencia no afecta por igual a todas

las células, a todos los órganos diana o a todas las vías de señalización en las que está

implicada esta hormona ( Könner y Brüning JC, 2012).

1.4.7- Transmisión de la señal de leptina.

La leptina al igual que la insulina regula el peso corporal y el metabolismo a

través de circuitos neuronales. La leptina ejerce sus acciones biológicas uniéndose a

sus receptores. El gen db, que codifica para el receptor de leptina (ObR), se aisló por

primera vez en el plexo coroideo de ratón (Tartaglia y col., 1995). Los receptores de

leptina pertenecen a la superfamilia de receptores de citoquina clase 1. El splicing

alternativo del gen db da origen a las 6 isoformas de los receptores: la forma soluble

Ob-Re, la cual carece de dominio citoplasmático; cuatro formas con dominios

citoplasmáticos cortos (Ob-Ra, Ob-Rc, Ob-Rd y Ob-Rf), y la forma Ob-Rb, la cual se

encuentra en casi todos los tejidos y podría ser la única forma capaz de transducir la

señal de la leptina al menos en el SNC (Friedman y Hass, 1998; Lago y col., 2007).

La leptina controla el balance energético y el peso corporal porque regula la

actividad neuronal en el hipotálamo, estas acciones implican fundamentalmente la vía

Page 44: Tesis fernández briones

Introducción

22

JAK/STAT. La unión de la leptina a su receptor (Ob-Rb), conduce a la autofosforilación

de la quinasa citosólica JAK2 y a la fosforilación de STAT3 mediada por JAK2 (Figura 3).

La activación de STAT3 regula la transcripción de neuropéptidos como POMC, CART,

AgRP y NPY. Esta vía es importante para las funciones anti-obesidad de la leptina, es la

vía de regulación de la homeostasis de energía. La activación de STAT3, a su vez,

incrementa la expresión del inhibidor de la señalización por citoquinas SOCS3

(Frühbeck, 2006; Olofsson, 2013).

La leptina también actúa a través de la vía PI3K-AKT en determinados núcleos

hipotalámicos (Figura 3). Se sugiere que esta vía es la que contribuye a regular la

homeostasis de la glucosa y la sensibilidad a la insulina de todo el organismo. Así, esta

vía media las acciones antiesteatóticas de la leptina sobre el tejido adiposo inhibiendo

la lipogénesis en tejido adiposo blanco en respuesta a leptina (Bates SH y col., 2003;

Bates SH y col nature 2003; Ernst MB y col., 2009; Morris DL y col., 2009).

Figura 3. Señalización de leptina.

Page 45: Tesis fernández briones

Introducción

23

Por otra parte, el sistema nervioso, además de ser un blanco de acción para la

leptina, constituye el medio para la transmisión de la señal de ésta a tejidos periféricos

claves en la regulación del metabolismo energético (German y col, 2011; Morton y

Schwartz MW, 2011). Sin embargo las vías neurales que soportan las acciones

indirectas de la leptina sobre los tejidos periféricos no se han descrito completamente.

1.4.8- Secreción de leptina por el TAB.

Se ha observado que la expresión y secreción de leptina por el TAB, está

modulada por numerosos factores, por ejemplo: se incrementa por la insulina, por

glucocorticoides, por el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), estrógenos; y disminuye

con la actividad β-adrenérgica, andrógenos y agonistas del receptor activador de la

proliferación peroxisomal γ (PPAR-γ) (Vettor y col., 2005; Margetic y col., 2002).

La respuesta de la insulina a la ingesta es el principal mediador de los cambios

en la producción de leptina observadas durante el ayuno/restricción de energía y

realimentación y de la variación diurna de los niveles circulantes de leptina (Havel,

2001). Trabajos realizados en adipocitos aislados y estudios clínicos en seres humanos

apoyan la idea de que la insulina aumenta indirectamente la producción de leptina, a

través de sus efectos estimulatorios del metabolismo oxidativo de la glucosa en

adipocitos (Havel, 2004). Por su parte la leptina, a través de los circuitos del sistema

nervioso autónomo y actuando directamente sobre las células beta del páncreas,

disminuye la secreción de insulina (Covey y col, 2006).

Por el contrario, el ayuno disminuye la secreción de leptina por el tejido

adiposo. La disminución de la leptina se produce con rapidez en respuesta al ayuno y

provoca cambios profundos en el balance energético y hormonal a través del

hipotálamo. Niveles bajos de leptina inducen sobrealimentación y suprimen el gasto de

energía, la liberación de las hormonas tiroideas y reproductivas y la inmunidad. Las

adaptaciones metabólicas mediadas por los bajos niveles leptina pueden haber

evolucionado como una protección contra la carencia de alimentos, al limitar el uso de

energía y mejorar su almacenamiento (Ahima, 2008).

Page 46: Tesis fernández briones

Introducción

24

1.5- Insulina.

La insulina es una hormona polipeptídica sintetizada y secretada por las células

β del páncreas. En los mamíferos la insulina es una de las hormonas que regula la

homeostasis de glucosa en la sangre. Los principales tejidos sobre los que la insulina

ejerce su acción son: el hígado, el musculo esquelético y cardíaco y el tejido adiposo,

además de las células alfa del páncreas y otras.

En cuanto al metabolismo energético del tejido adiposo, la insulina secretada

tras la ingesta estimula la captura de glucosa por el tejido adiposo, así como de los

ácidos grasos de los TAG a partir de los quilomicrones circulantes. El metabolismo de la

glucosa provee el esqueleto carbonado al que se unen los AG para formar los TAG. Por

otro lado, esta hormona suprime la liberación de los AG por el tejido adiposo, ya que

bloquea la activación de la lipasa sensible a hormona en dicho tejido. Del mismo modo,

la insulina bloquea en el hígado la exportación de TAG en forma de VLDL a la sangre

(Frayn KN, 2002).

1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina.

La insulina estimula la captación, utilización y almacenamiento de

carbohidratos, lípidos y proteínas de la sangre por los tejidos periféricos, inhibiendo a

la vez el catabolismo de estas biomoléculas. La insulina ejerce sus efectos fisiológicos a

través de la unión a su receptor específico en la membrana plasmática de las células

diana. Esta unión provoca la autofosforilación del receptor de insulina, así como la

fosforilación de moléculas efectoras, interacciones proteína-proteína, proteína-lípidos

y cambios en la localización subcelular de una serie de sustratos y efectores

intracelulares que el receptor utiliza para transmitir la señal al interior celular. Un

esquema de las principales vías mediadas por la insulina se recoge en la Figura 4.

Durante la acción de la insulina la vía IR-AKT2 media los efectos sobre la

captura de glucosa, la conversión de glucosa en ácidos grasos y la síntesis de TAG. La

acción prolongada de la insulina produce resistencia a la hormona a través de la

degradación del sustrato IRS-1, de esta forma muchos inductores de resistencia a la

insulina activan quinasas del IRS-1. Entre las quinasas que fosforilan en serina al IRS-1

Page 47: Tesis fernández briones

Introducción

25

se encuentra mTOR. Muchos estudios indican que mTOR integra las señales de

factores de crecimiento, hormonas, nutrientes y estado energético celular para regular

el crecimiento y la sobrevivencia de la célula. La activación crónica de la vía de mTOR,

ya sea por nutrientes o por tratamiento prolongado con insulina produce resistencia a

la insulina por degradación de IRS-1.

Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal de la insulina (Saltiel AR y col.,

2001).

1.6- Interacción leptina-insulina.

La leptina, junto con la insulina, forma parte de las señales que regulan, a

través del SNC, la ingesta y la oxidación tanto de los glúcidos como de las grasas en los

diferentes tejidos periféricos, existiendo mecanismos fisiológicos que regulan los

niveles de ambas hormonas. En este sentido, se ha propuesto la existencia de un eje

adipo-insular, por el cual la insulina estimula la expresión de la leptina en el TAB, la

cual, a su vez disminuye los niveles y la secreción de insulina por el páncreas, así como

los niveles de glucosa plasmáticos en el estado post-absortivo en ratas normales, lo

cual se traduce en un aumento de la sensibilidad a insulina (Kieffer TJ y col., 2000).

Page 48: Tesis fernández briones

Introducción

26

El efecto de la leptina sobre la sensibilidad a insulina es específico de tejido, ya

que aunque en sóleo, diafragma, corazón y tejido adiposo marrón se produce un

incremento del transporte de glucosa estimulado por insulina, en el tejido adiposo

blanco el efecto de la leptina es el contrario (Cusin I y col., 1998). En algunos tejidos

ambas hormonas cooperan, en otros actúan de manera independiente y en otros

pueden tener efectos antagónicos. Las vías de señalización de leptina e insulina están

interconectadas a varios niveles como son el IR, los IRS, la PI3-K, la MAPK, el STAT-3, la

fosforilasa a, la PTP1B, la PD3B, SOCS-3. (Kraus D y col., 2002; Szanto I y col., 2000; Kim

JB y col., 1998; Kim YB y col., 2000; Aiston S y col., 1999; Zobolotny J y col., 2002; Zhao

AZ y col., 2002; Krebs DL y col., 2003).

La asociación entre leptina e insulina se ha estudiado también en modelos

animales que presentan obesidad. En estos animales se ha observado que los niveles

de leptina en sangre no son los responsables de la inducción de la resistencia a la

insulina, sino que la causa más probable sería la disminución de la señalización de

leptina a nivel central (Lin J y col., 2003), por lo que la resistencia a leptina también

conduce a un estado de resistencia central a insulina. En la mayoría de los casos de

obesidad humana y en roedores concurren tanto la resistencia a insulina como la

resistencia a leptina.

1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad a la

insulina.

Numerosas evidencias indican que el SNC es un regulador clave de la

homeostasis de la glucosa y que la señalización de insulina y de leptina en el

hipotálamo juega un papel fundamental en el control a través del SNA, de la

homeostasis de glucosa y en el desarrollo de resistencia a insulina. Por esta razón los

estudios acerca de la contribución de la leptina al metabolismo energético han

adquirido gran importancia en las investigaciones sobre resistencia a insulina y

diabetes mellitus tipo 2. El hipotálamo ajusta el tono del SNA a las condiciones

externas, a las necesidades de energía, modulando el funcionamiento del páncreas, el

hígado, el tejido adiposo, el sistema cardiopulmonar etc. Estudios encaminados a

dilucidar las vías de regulación por el SNA del TAB visceral indican que áreas

Page 49: Tesis fernández briones

Introducción

27

hipotalámicas como el arcuato envían proyecciones simpáticas sobre el TAB y que esta

inervación simpática es la iniciadora de la lipólisis, proceso regulado en parte por el

sistema de melanocortinas (Bates SH y col., 2005; Marino JS y col., 2011).

Además, la leptina tiene acciones en otras áreas cerebrales como la corteza y zonas

límbicas y en los tejidos periféricos (células α y β del páncreas, hígado y células del

sistema inmunológico), sin embargo, la acción de la leptina en el cerebro y, en

particular, el hipotálamo es la mejor caracterizada en lo que respecta a la homeostasis

de la energía (Badman y Flier, 2007; Morris y col., 2009; Olofsson y col., 2013).

1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de funcionalidad.

El ciclo de la vida, desde el mismo momento de la concepción de cualquier

organismo vivo, se caracteriza por el desarrollo de una serie de capacidades y

funciones hasta alcanzar la madurez (definida esta como la adquisición de la capacidad

reproductiva) para posteriormente, sufrir una degradación progresiva de la capacidad

fisiológica y funcional que conduce al incremento de la susceptibilidad y vulnerabilidad

a la enfermedad y culmina con la muerte del organismo.

En 1991, Fairwather definió “envejecer” como el conjunto de procesos que

contribuyen a incrementar progresivamente la tasa de mortalidad específica para la

edad en una población que vive en condiciones ideales para la supervivencia. No tiene

una causalidad única y no es ni una enfermedad, ni un error evolutivo.

No existe una teoría global que explique el concepto de envejecimiento, puesto

que el desarrollo del mismo varía en función de los diferentes organismos, tejidos y

células, y se manifiesta a todos los niveles de organización de los mismos. En

mamíferos, existen numerosas evidencias que sugieren, al menos, la existencia de

cinco características comunes al envejecimiento, sea cual sea el nivel de organización.

(Bruce y Troen, 2003).

Así con la edad se producen:

1. Incremento de la mortalidad a partir de la madurez.

2. Cambios en la composición bioquímica de los tejidos.

Page 50: Tesis fernández briones

Introducción

28

3. Disminución progresiva de la capacidad fisiológica.

4. Reducción de la habilidad de adaptación a los estimulos medioambientales.

5. Incremento de la susceptibilidad y vulnerabilidad a contraer enfermedades.

Los mecanismos moleculares sobre el desarrollo del envejecimiento aun no han

sido completamente esclarecidos y existe una gran controversia sobre los mismos

debido a la complejidad del problema en cuestión. Para los investigadores del campo,

el desarrollo del envejecimiento continua siendo un enigma, A pesar de esto, parece

clara la implicación de, al menos, cuatro grandes procesos fisiológicos en el desarrollo

del envejecimiento de un individuo: capacidad metabólica, respuesta a situaciones de

estrés, desregulación genética, y estabilidad génica. (Jazwinski, 2000). A partir de la

finalización del proceso de desarrollo del individuo, la inestabilidad génica influenciada

por el efecto de los factores ambientales, tanto intrínsecos como extrínsecos, induciría

una progresiva degradación de las funciones celulares debido a una acumulación de

errores que no pueden ser subsanados por los mecanismos de reparación,

disminuyendo la viabilidad y, en ultimo termino, ocasionando la muerte del individuo

(Jazwinski, 1996).

A lo largo de la historia se han desarrollado múltiples teorías para tratar de

explicar el por qué del envejecimiento, pero ninguna de ellas ha sido, hasta la

actualidad, capaz de dar respuesta a todas las preguntas formuladas. El estrés

oxidativo, la glicosilación de proteínas, y la pérdida de telómeros de los cromosomas,

son fenómenos implicados en la alteración y degeneración de las funciones vitales de

cualquier organismo (Leslie, 2001), pero la teoría más sorprendente es la que sugiere

la existencia de un sistema conservado de regulación del ciclo vital.

Estudios en los organismos comúnmente utilizados como modelos de

envejecimiento (C.elegance, D.melanogaster, S.cerevisae, M.musculus), han

comenzado a descubrir importantes genes y vías de señalización que parecen regular

el ritmo del envejecimiento, y que han sido notablemente conservados durante la

evolución. Estos estudios presentan la ventaja de poder utilizar aproximaciones

genéticas para la búsqueda directa de mutaciones que modifican el ciclo vital,

haciendo posible la identificación de los mecanismos implicados de una manera

Page 51: Tesis fernández briones

Introducción

29

independiente a cualquier otro modelo preconcebido sobre el envejecimiento

(revisión de Guarante y Kenyon, 2000).

Además de la expresión o represión de genes, el sistema de regulación del

envejecimiento incluye el control de los estados denominados “inactivos”, en los

cuales el organismo pospone su reproducción en respuesta a condiciones

medioambientales adversas. Un aspecto muy llamativo en este sentido ha sido

descubrir que las vías de señalización celular medadas por insulina y el IGF-1 están

directamente implicadas en la regulación del envejecimiento en C.elegans,

D.melanogaster y S.cerevisae (Kenyon, 2001), y cabe la posibilidad de que este sistema

también sea operativo en mamíferos (Clancy y col., 2001; Tatar y col., 2001).

Desde el punto de vista de esta ultima teoría, el envejecimiento sería un

proceso metabólico más y, por tanto, puede ser regulado. En esta línea, algunos

científicos están pensando en el envejecimiento como una enfermedad, por lo que

están buscando su cura, y mientras esto sucede, la población sigue envejeciendo día a

día, y en 2050 se estima que al menos 1 de cada 5 personas superará los 60 años de

edad, por lo que las enfermedades asociadas con el envejecimiento cobraran si cabe

una mayor importancia en la investigación.

1.9- Restricción calórica. Efectos beneficiosos de la dieta.

Existen numerosos estudios sobre la restricción calórica (RC) y sus efectos.

Desde hace más de 70 años se sabe que la RC retarda el envejecimiento y por lo tanto,

incrementa el tiempo de vida (McCay et al., 1935). La RC se refiere a un régimen

dietario entre un 30-50% menor en calorías que el consumo de un animal control, sin

llegar a desnutrición. Dietas bajas en calorías han provocado un aumento en la

esperanza de vida media, así como una disminución de las enfermedades propias del

envejecimiento en una amplia variedad de organismos entre los que se incluyen las

levaduras (Saccharomyces cerevisiae) (Cortés-Rojo y col., 2007), el gusano

(Caenorhabditis elegans), la mosca (Drosophila melanogaster), roedores (ratas y

ratones) y primates (Weindruch, 1996; Koubova y Guarente,2003).

Page 52: Tesis fernández briones

Introducción

30

Se han propuesto diversos mecanismos para explicar este fenómeno: el retardo

del crecimiento, la disminución de la apoptosis, la reducción del daño oxidativo, la

alteración en la utilización de la glucosa, cambios en la expresión de genes, la mejora

de la respuesta al estrés. Ciertas evidencias sugieren que la RC ocasiona importantes

respuestas metabólicas en el proceso de envejecimiento por medio de sistemas tanto

intracelulares como extracelulares de transducción de señales que afectan a

numerosos órganos y sistemas fisiológicos. En algunos tejidos la RC produce un

incremento del metabolismo, de la resistencia al daño oxidativo y al estrés térmico

(Sohal, 2002).

La RC ocasiona, a nivel general, una disminución del peso corporal con respecto

a los animales control. En cuanto a nivel genético, la RC eleva los niveles de SIRT1

(sirtuinas) en mamíferos y estos niveles se reducen por la insulina. Las sirtuinas

producen cambios metabólicos que afectan a las células beta del páncreas y de esta

forma se inhibe la síntesis y liberación de insulina al plasma. En el sistema neuro-

endocrino la SIRT1 inhibe la síntesis y liberación de la hormona de crecimiento (GH)

por la hipófisis y del factor de crecimiento de insulina-1 (IGF-1), finalmente a nivel del

tejido adiposo blanco se inhibe la acción de la leptina y se incrementa la acción de la

adiponectina (Bordone y Guarente, 2005).

Utilizando roedores como modelos de RC, modelos genéticos de ratones y

ratones knockout para el receptor IGF-1 en el tejido adiposo (fat-specific insulin

receptor knockout mice, FIRKO) se ha visto que la reducción de los niveles plasmáticos

de insulina y/o IGF-1 o la reducción de la señalización insulina/IGF-1 se correlaciona

con incrementos en la longevidad y el retraso del envejecimiento (Richardson et al.,

2004).

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HIPÓTESIS

Y

OBJETIVOS

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Hipótesis y objetivos

31

1.10- Hipótesis y objetivos.

Conociendo que el envejecimiento en la rata Wistar no produce alteraciones de la

glucemia y la insulinemia en ayunas. Sin embargo, estos animales incrementan la

adiposidad con la edad, presentan esteatosis hepática y dislipemia en ayunas y

exhiben alteraciones de la sensibilidad global a la insulina y central a la leptina y la

insulina, se decidió profundizar en este trabajo, en aspectos relacionados con las

alteraciones de la funcionalidad del tejido adiposo visceral en este modelo de

envejecimiento, teniendo en cuenta que los mecanismos específicos que generan

dislipemias, resistencia a la insulina y diabetes no están del todo esclarecidos.

Para ello nos planteamos la siguiente hipótesis de trabajo.

Con el envejecimiento aumenta de forma moderada la masa de tejido adiposo blanco

visceral y se modifican sus actividades metabólicas para ajustarse a las condiciones

fisiológicas del organismo envejecido. Las alteraciones de la funcionalidad estarán

relacionadas con cambios en la actividad lipogénica y lipolítica del tejido, cambios en la

composición y metabolismo de la gota lipídica y disminución del control

neuroendocrino del metabolismo adipocitario. Que la señalización hipotalámica de la

leptina tiene una fuerte implicación en el sistema neuroendocrino de control del

metabolismo adipocitario, pudiendo ser la resistencia a la leptina y la insulina

adaptaciones metabólicas, que propician un incremento moderado de la masa adiposa

y como consecuencia de ello se depositan lípidos en otros tejidos y el estado de

hiperlipemia es permanente, en ayunas y en estado postprandial. Que a pesar de estas

alteraciones los animales envejecidos mantienen la homeostasis de glucosa y el estado

prediabético. Que la restricción nutricional sigue siendo un buen recurso para frenar

los desórdenes del metabolismo energético.

Page 56: Tesis fernández briones

Hipótesis y objetivos

32

Para responder a nuestra hipótesis de trabajo desarrollamos el estudio del estado de

funcionalidad del tejido adiposo visceral se desarrolló en seis direcciones:

1.- Desarrollar un ensayo de infusión oral de grasa y analizar los cambios en la

respuesta de la rata Wistar a la administración de un bolo de grasa. Efectos de la edad

y la restricción nutricional.

2.- Estudiar la capacidad del tejido adiposo visceral de absorber la grasa circulante y

almacenarla en forma de TAG en estado de ayunas y en estado de alimentación:

Capacidad lipogénica y de síntesis de TAG. Efectos de la edad y la restricción

nutricional.

3.- Estudiar la capacidad del tejido adiposo visceral de hidrolizar los TAG y liberar NEFA

y glicerol: estudio de la lipolisis en estado de alta demanda energética (ayuno

prolongado) y en respuesta a agonistas de beta-adrenérgicos. Efectos de la edad y la

restricción nutricional.

4.- Analizar la capacidad de respuesta del tejido adiposo a la insulina: Estudio de los

efectos anti-lipolíticos de la insulina dependiendo del estado de ayuno o de

alimentación. Efectos de la edad y la restricción nutricional.

5.- Estudiar los niveles de proteínas relacionadas con los procesos que tienen lugar en

la superficie de la gota lipídica, la formación de la gota lipídica y la hidrólisis de los

lípidos almacenados en la gota lipídica en los estados de ayuno y de alimentación.

6.- Demostrar en animales jóvenes, la capacidad de la leptina de regular a través del

Sistema Nervioso Autónomo, el metabolismo de los lípidos del tejido adiposo visceral y

la sensibilidad global a la insulina.

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MATERIALES

Y

MÉTODOS

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Materiales y métodos

33

2- MATERIALES Y MÉTODOS.

2.1- Materiales.

Todos los reactivos y productos utilizados en este trabajo son de grado analítico

y han sido suministrados por distintas casas comerciales. Se han empleado además

otros productos más específicos cuya procedencia se indica en el texto.

2.2- Modelos de experimentación.

Como modelo de experimentación se utilizaron ratas macho de la raza Wistar

albinas procedentes del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” de la

Universidad Autónoma de Madrid (CBMSO-UAM); los animales fueron mantenidos con

ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas, una humedad relativa entorno al 50%, una

temperatura de 20-25ºC, y acceso libre a la comida y al agua.

Los procedimientos experimentales realizados estaban aprobados por el comité

de bioética de la UCLM, y el tratamiento de los animales se llevó a cabo de acuerdo

con las leyes de la Unión Europea y con las pautas dictadas por el Instituto Nacional de

la Salud, con respecto al uso de animales de experimentación reduciendo al mínimo

tanto el número de animales como el sufrimiento de los mismos.

En este estudio se han utilizado diferentes condiciones experimentales, las

cuales se proceden a desarrollar a continuación.

2.2.1- Modelo animal de envejecimiento.

En este trabajo continuamos con el estudio del envejecimiento en la rata

Wistar. Estos estudios se realizan en ratas machos de 3, 8 y 24 meses de edad. Se

considera que el control del experimento es la rata madura de 3 meses de edad (3m), y

para el análisis de los cambios asociados a la edad se emplean animales de 8 (8m) y 24

meses (24m). Esta raza se ha elegido como modelo porque su proceso de

envejecimiento presenta ciertas características similares a las del humano. Con la edad

aumenta la adiposidad y el peso corporal, aunque se mantienen los niveles de

normoglucosa y normoinsulinemia en ayunas (Escriva y col, 1997; Escriva y col, 2007).

Page 60: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

34

Se sabe que los animales de 8 meses de edad tienen resistencia a insulina en tejido

adiposo pero no en músculo esquelético, mientras que las ratas de 24 meses de edad

muestran resistencia a la insulina del tejido adiposo y ciertos músculos esqueléticos y

un mayor nivel de resistencia global a la hormona (Escriva y col, 2007). Además se ha

demostrado que las ratas de 8 y 24 meses de edad son hiperleptinémicas y presentan

diferente grado de resistencia a las acciones hipotalámicas de la leptina y la insulina.

(Carrascosa y col, 2011).

Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad alimentadas ad libitum.

2.2.2- Modelo animal de restricción calórica.

Durante más de 20 años, se ha empleado la restricción calorica en este modelo

de envejecimiento, para determinar si los cambios observados en la sensibilidad a

insulina o leptina con la edad son consecuencia exclusiva de las variaciones en la

adiposidad, o si están causados por otros mecanismos asociados al envejecimiento. En

este tipo de régimen los animales en restricción calorica (FR), ingieren un 80% de las

calorias que ingieren sus congéneres de la misma edad y alimentados ad-libitum (AL)

dando como resultado una diferencia de peso entorno a un 15% inferior en la rata FR

con respecto al que tendría la rata de la misma edad alimentada ad libitum (AL). Este

tipo de restricción calórica seria equiparable a una dieta hipocalórica saludable en

humanos. Los animales sometidos a restricción calórica (denominados en este trabajo

FR, por las siglas inglesas food-restriction), poseen niveles inferiores de adiposidad

visceral que sus congeneres de la misma edad pero alimentadas ad-libitum (AL) y

similares a los de las ratas controles de 3 meses (Escriva y col, 1997; Escriva y col,

2007). La restricción se lleva a cabo en animales de 5 y 21 meses de edad durante un

Page 61: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

35

período total de tres meses hasta alcanzar las edades de 8 y 24 meses,

respectivamente. Utilizando este modelo de restricción calórica moderada se ha

comprobado que la resistencia a la insulina en la rata Wistar, puede revertirse en ratas

de 8 meses, pero no en ratas de 24 meses de edad (Escrivá y col, 2007).

2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos.

De experimentos in vivo (sobrecarga oral de glucosa) realizados en el modelo

experimental descrito en el apartado 2.2.1.1 , se conoce que las ratas de 8 y 24 meses

de edad requieren mayor concentración de insulina para normalizar los niveles de

glucosa en sangre. El incremento en la secreción de insulina es fruto de la resistencia

periférica a la hormona que desarrollan estos animales.

En este trabajo se ha decidido realizar un test in vivo de sobrecarga oral de

lípidos. Este ensayo se llevó a cabo con la finalidad de conocer la capacidad de

respuesta de la rata Wistar a una sobrecarga oral de grasas en función de la edad y del

estado nutricional.

El test se realizó 5 grupos de ratas ayunadas 16 horas: 3m AL, 8m AL, 8m FR,

24m AL y 24 m FR. Durante el ensayo se administró oralmente un bolo de aceite de

oliva (0.1 ml/100 gr peso corporal). La sangre fue sustraída de la vena de la cola de la

rata a distintos tiempos: 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 y 240 minutos, y se empleó en la

determinación de los niveles de la hormona insulina y de los siguientes metabolitos:

La concentración de glucosa en sangre se determinó utilizando el analizador

Accutrend Glucose Analyser (Roche), la concentración de triglicéridos en sangre se

determinó utilizando el analizador Accutrend tryglicerides Analyser (Roche), Los TAG,

los NEFA se midieron mediante un kit específico (Wako). Mientras que los niveles de

insulina en suero se midieron mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).

2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación.

Se realizó con el objetivo de estudiar la adaptación del TAB a los estados de

ayuno-realimentación en diferentes edades. Se llevó a cabo en ratas Wistar macho de

3, 8 y 24 meses de edad alimentadas ad libitum o sometidas a restricción calórica,

Page 62: Tesis fernández briones

utilizando animales de 3 meses AL como control (3m AL, 8m AL, 8m FR, 24m AL y 24m

FR). Los animales fueron sometidos a un ayuno prolongado de 36 horas, tras el cual,

parte de los animales de cada grupo fueron sac

animales fueron sometidos a una realimentación de 30minutos (R30) o 180 minutos

(R180), con acceso libre a la comida, tras la cual fueron sacrificados (Figura

sacrificio de los animales se realizó por decap

Figura 6. Modelo experimental utilizado en este trabajo. El ensayo se realizó en animales de 3,

8 y 24 meses de edad, alimentados

calórica (FR). Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 36 horas para ser

sacrificados inmediatamente después (grupo Ayuno), o tras una realimentación de 30 min

(grupo RE 30 min) o de 3 horas (grupo RE

2.5- Ensayo de Liposisis.

Los estudios de capacidad lipolítica basal y mediada por hormonas del tejido

adiposo, se realizaron en explant

regulada por hormonas se realizaron incubaciones en presencia de isoproterenol (un

agonista de receptores β-

insulina, la cual inhibe la lipolisis.

2.5.1- Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e

Este estudio se llevó a cabo en los explantes de tejido adiposo

Las muestras se colocaron en placas de cultivo con 1 ml de medio KRP a pH=7,4 (120

mM NaCl; 4,75 mM KCl; 1,2 mM MgSO

2mM Glucosa durante 3 hora, 37 ºC , en cabina de CO

distribulleron en 3 condiciones experimentales, la primera incubada con medio KRP, la

segunda incubada con medio

3 meses

Ad libitum

Ayuno 30 minutos

180 minutos

libitum

Ayuno minutos

Materiales y métodos

36

utilizando animales de 3 meses AL como control (3m AL, 8m AL, 8m FR, 24m AL y 24m

FR). Los animales fueron sometidos a un ayuno prolongado de 36 horas, tras el cual,

parte de los animales de cada grupo fueron sacrificados (grupo ayuno), y el resto de los

animales fueron sometidos a una realimentación de 30minutos (R30) o 180 minutos

(R180), con acceso libre a la comida, tras la cual fueron sacrificados (Figura

sacrificio de los animales se realizó por decapitación tras la administración de

Modelo experimental utilizado en este trabajo. El ensayo se realizó en animales de 3,

8 y 24 meses de edad, alimentados ad libitum (AL) o sometidos previamente a restricción

calórica (FR). Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 36 horas para ser

sacrificados inmediatamente después (grupo Ayuno), o tras una realimentación de 30 min

(grupo RE 30 min) o de 3 horas (grupo RE 3 h). En total, se generaron 15 grupos de animales.

Los estudios de capacidad lipolítica basal y mediada por hormonas del tejido

adiposo, se realizaron en explantes de tejido adiposo (ex vivo). Para estudiar la lipolisis

a por hormonas se realizaron incubaciones en presencia de isoproterenol (un

-adrenérgicos), el cual activa la lipolisis, y en presencia de

insulina, la cual inhibe la lipolisis.

Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e INS.

Este estudio se llevó a cabo en los explantes de tejido adiposo epididimal

as muestras se colocaron en placas de cultivo con 1 ml de medio KRP a pH=7,4 (120

mM NaCl; 4,75 mM KCl; 1,2 mM MgSO4; 10 mM Na2HPO4) 1,2 mM CaCl

Glucosa durante 3 hora, 37 ºC , en cabina de CO2, sin agitación.

distribulleron en 3 condiciones experimentales, la primera incubada con medio KRP, la

segunda incubada con medio KRP al que se le a adiccionado Isoproterenol 1µM, y la

Ratas wistar

8 meses

Ad libitum

30 minutos

180 minutos

FR

Ayuno 30 minutos

180 minutos

24 meses

Ad libitum

Ayuno 30 minutos

180 minutos

utilizando animales de 3 meses AL como control (3m AL, 8m AL, 8m FR, 24m AL y 24m

FR). Los animales fueron sometidos a un ayuno prolongado de 36 horas, tras el cual,

rificados (grupo ayuno), y el resto de los

animales fueron sometidos a una realimentación de 30minutos (R30) o 180 minutos

(R180), con acceso libre a la comida, tras la cual fueron sacrificados (Figura 6). El

itación tras la administración de CO2.

Modelo experimental utilizado en este trabajo. El ensayo se realizó en animales de 3,

(AL) o sometidos previamente a restricción

calórica (FR). Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 36 horas para ser

sacrificados inmediatamente después (grupo Ayuno), o tras una realimentación de 30 min

3 h). En total, se generaron 15 grupos de animales.

Los estudios de capacidad lipolítica basal y mediada por hormonas del tejido

Para estudiar la lipolisis

a por hormonas se realizaron incubaciones en presencia de isoproterenol (un

adrenérgicos), el cual activa la lipolisis, y en presencia de

epididimal (100mg).

as muestras se colocaron en placas de cultivo con 1 ml de medio KRP a pH=7,4 (120

) 1,2 mM CaCl2; 1% BSA;

, sin agitación. Las muestras se

distribulleron en 3 condiciones experimentales, la primera incubada con medio KRP, la

soproterenol 1µM, y la

24 meses

FR

Ayuno 30 minutos

180 minutos

Page 63: Tesis fernández briones

tercera condición la cual fue incubada con medio KRP al cual se le adiccionó 1µM de

Isoproterenol y 1µM de Insulina.

recogieron los explantes y los medios de incubación

su posterior utilización (Figura

Figura 7. Podemos observar un esquema de la distribución de las muestras en la placa,

teniendo en cuenta que este ensayo se realiza por triplicado.

2.6- Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular (ICV) con

Este estudio se realizó en ratas de 3 meses de edad, que corresponde con el

comienzo de la etapa adulta del animal. Para estudiar los efectos metabolicos de la

leptina a nivel central, se llevó a cabo la implantación vía intracerebroventricular (

(Halaas y col, 1997) de mini

USA) cargadas con leptina específica de rata (Sigma), para liberar 0.2

o suero salino (PBS), las bombas se mantuvieron a 37ºC y en condiciones est

hasta su implantación. La dosis de leptina empleada en este estudio es 100 veces

superior a lo concentración fisiológica en el líquido cefalorraquídeo (LCR) según Wang

y col., (1999). Las bombas tienen capacidad para mantener el tratamiento durante

días. A los animales controles se les infundió suero salino (SS).

Materiales y métodos

37

la cual fue incubada con medio KRP al cual se le adiccionó 1µM de

Isoproterenol y 1µM de Insulina. Una vez terminado este proceso de incubación, s

los explantes y los medios de incubación por separado y se congelaron para

r utilización (Figura 7).

Podemos observar un esquema de la distribución de las muestras en la placa,

teniendo en cuenta que este ensayo se realiza por triplicado.

Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular (ICV) con

Este estudio se realizó en ratas de 3 meses de edad, que corresponde con el

comienzo de la etapa adulta del animal. Para estudiar los efectos metabolicos de la

leptina a nivel central, se llevó a cabo la implantación vía intracerebroventricular (

(Halaas y col, 1997) de mini-bombas osmóticas (Alzet, modelo 2001, Palo Alto, Calif.

USA) cargadas con leptina específica de rata (Sigma), para liberar 0.2 μg de leptina/d

o suero salino (PBS), las bombas se mantuvieron a 37ºC y en condiciones est

hasta su implantación. La dosis de leptina empleada en este estudio es 100 veces

superior a lo concentración fisiológica en el líquido cefalorraquídeo (LCR) según Wang

y col., (1999). Las bombas tienen capacidad para mantener el tratamiento durante

días. A los animales controles se les infundió suero salino (SS).

la cual fue incubada con medio KRP al cual se le adiccionó 1µM de

ado este proceso de incubación, se

por separado y se congelaron para

Podemos observar un esquema de la distribución de las muestras en la placa,

Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular (ICV) con Leptina.

Este estudio se realizó en ratas de 3 meses de edad, que corresponde con el

comienzo de la etapa adulta del animal. Para estudiar los efectos metabolicos de la

leptina a nivel central, se llevó a cabo la implantación vía intracerebroventricular (i.c.v.)

bombas osmóticas (Alzet, modelo 2001, Palo Alto, Calif.

μg de leptina/día

o suero salino (PBS), las bombas se mantuvieron a 37ºC y en condiciones estériles

hasta su implantación. La dosis de leptina empleada en este estudio es 100 veces

superior a lo concentración fisiológica en el líquido cefalorraquídeo (LCR) según Wang

y col., (1999). Las bombas tienen capacidad para mantener el tratamiento durante 7

Page 64: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

38

Las ratas fueron ayunadas 12 horas antes de la cirugía estereotáxica y

anestesiadas mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de anestésico de

ketamina (PARKE-DAVIS), valium (Diazepam, Roche) y atropina (Braun) (50, 4 y 0,2

mg/Kg de peso, respectivamente). Una vez anestesiado se colocó el animal en un

estereotáxico (koft Instruments Tujunga, CA USA) y se realizó una incisión sobre la piel,

desde la zona anterior de los ojos hasta el principio de la musculatura del cuello,

quedando el cráneo perfectamente fijado en los planos horizontales y verticales, se

separó la piel que recubre el cráneo y se sujetó a ambos lados mediante pinzas

hemostáticas, esto permitió la localización del punto Bregma, empleado como punto

de referencia (Figura 8). Este punto corresponde a la unión de las suturas sagital y

coronal en la superficie del cráneo, permitiéndo calcular las coordenadas

extereotáxicas correspondientes, de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson para

ratas Wistar (Paxinos y Watson, 1986).

Posteriormente se realizó una perforación unilateral del hueso craneal,

empleando un taladro dental [en las coordenadas (-0.8 anterior,+1.6 lateral) con

respecto del bregma, y a una profundidad de 3,4 mm por debajo de la línea interaural]

(Figura 9) y se implantó una cánula (4x0.36, longitud x diámetro en mm) que queda

conectada a la mini-bomba de leptina o suero salino. Se fijó la canula con cemento

dental (KETAC CEM radiopaque. Glass Ionomer Cement, ESPE) y la mini-bomba se

colocó por debajo de la piel, en la región interescapular, en un espacio creado

mecánicamente con una pinza. La herida en el cuero cabelludo fue suturada con

grapas quirúrgicas (Autoclip Wound Clips, #427631, Becton Dickinson, USA). El empleo

de las minibombas osmóticas permite la liberación continuada de leptina o salino al

SNC durante 7 días, con un flujo prácticamente constante, sin conexiones externas, sin

restricción del movimiento ni manipulación frecuente de los animales.

En estas coordenadas, la mini-bomba libera su contenido en el LCR del

ventrículo lateral, que conecta directamente con el hipotálamo, el cual, entre otras

funciones, regula la homeostasis de todo el organismo. Las ratas implantadas con mini-

bombas de leptina (n=6) y de suero salino (n=6) fueron alimentadas ad libitum. Un

tercer grupo de ratas también recibió tratamiento con suero salino, pero recibió la

misma cantidad de alimento que el consumido por los animales tratados con leptina

Page 65: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

39

(pair-fed), con el objetivo de determinar aquellos efectos de la leptina que son

independientes de sus propiedades anorexígenas. Este grupo constituye el verdadero

control del experimento.

Figura 8. Representación esquemática de la implantación de las minibombas osmóticas. La

cánula conectada a una minibomba osmótica cargada con leptina o salino, se implanta a través

de una perforación unilateral en el ventrículo lateral, de manera que su contenido se infunde

en el líquido cefalo-raquídeo (representado de color azul en el esquema del corte sagital del

cerebro) que comunica todo el sistema de ventrículos cerebral.

Figura 9. Coordenadas del ventrículo lateral en el estereotáxico. VL – ventrículo lateral. (Tomado

de Paxinos y Watson, 1997).

Page 66: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

40

2.6.1- Test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

Este experimento se realizó en los animales tratados con leptina o suero salino,

transcurrida una semana de la operación ICV. El ensayo se realizó con el objetivo de

estudiar los efectos de la infusión central de leptina sobre la sensibilidad global a la

insulina.

El test se realizó en ratas ayunadas (16 horas) de los 3 grupos de ensayo

SS/PF/Lep, mediante la inyección intraperitoneal de un bolo de glucosa (2g/Kg de

peso) a partir de una solución concentrada de glucosa, y extrayendo sangre de la vena

de la cola de la rata a distintos tiempos (0, 15, 30, 60 y 120 minutos), para medir la

variación de glucosa mediante un Glucosímetro (Accuntrend Glucose Analizer) y de

insulina en sangre mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).

2.6.2- Tratamiento “in vivo” con insulina.

El tratamiento con insulina se realizó en los tres grupos de animales SS/PF/Lep.,

al cabo de los 7 días de la infusión de leptina o suero salino. Para ello cada grupo se

dividió en dos y se les administró insulina (1UI/100g) o suero salino respectivamente, a

través de la vena safena. Los grupos experimentales quedaron agrupados de la

siguiente forma: SS-insulina, SS+insulina, PF-insulina, PF+insulina, LEP-insulina,

LEP+insulina. Al cabo de 30 minutos, los animales fueron sacrificados mediante

decapitación, se recolectó la sangre y se diseccionaron y pesaron los tejidos adiposos

epididimal (TAE) y perirrenal (TAP) y otros tejidos de interés. Todas las muestras se

congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a -70ºC hasta su uso.

2.6.3- Denervación del tejido adiposo.

La operación de denervación se realizó en las ratas Wistar de 3 meses de edad

dos semanas antes de realizar la operación ICV, este periodo de espera fue utilizado

para que los animales se recuperasen totalmente de la operación.

Para poder confirmar, que los efectos producidos por la leptina sobre el tejido

adiposo blanco se deben a la acción central de la hormona, se procedió a la

denervación quirurgica del sistema nervioso autónomo del tejido adiposo perirrenal

Page 67: Tesis fernández briones

(Figura 10). De esta forma se denervó el paquete correspondiente al lado izquierdo del

animal, con lo que así podríamos tener un paquete denervado y el otro paquete

inervado, que funcionaría como control de la denervación.

Para demostrar la eficiencia de la denervación quirúrgica y la implicación del

sistema nervioso autónomo en las acciones de la leptina, se pesaron los paquetes de

tejido adiposo perirrenal inervado y denervado y se determinó en extractos totales de

ambos paquetes el contenido total del neurotransmisor norepinefrina mediante un

ensayo ELISA (Demeditec Diagnostic GmH, Kiel, Germany).

Figura 10. Imagen de la denervación quirurgica.

F. del Lab. Buijs).

2.6.4- Ensayo ex vivo de captura de glucosa (2DOG).

Los ensayos de captura de glucosa se realizaron en explantes o secciones de

(≈20mg) de tejido adiposo perirrenal de los animales sometidos a estudio. Este ensayo

se realizó en explantes de los animales con infusión de leptina

explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía

estereotáxica.

Materiales y métodos

41

). De esta forma se denervó el paquete correspondiente al lado izquierdo del

animal, con lo que así podríamos tener un paquete denervado y el otro paquete

inervado, que funcionaría como control de la denervación.

ar la eficiencia de la denervación quirúrgica y la implicación del

sistema nervioso autónomo en las acciones de la leptina, se pesaron los paquetes de

tejido adiposo perirrenal inervado y denervado y se determinó en extractos totales de

ontenido total del neurotransmisor norepinefrina mediante un

ensayo ELISA (Demeditec Diagnostic GmH, Kiel, Germany).

Imagen de la denervación quirurgica. Endocrinology 2006, 147: 1140

de captura de glucosa (2DOG).

Los ensayos de captura de glucosa se realizaron en explantes o secciones de

≈20mg) de tejido adiposo perirrenal de los animales sometidos a estudio. Este ensayo

se realizó en explantes de los animales con infusión de leptina o salino vía ICV y en

explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía

). De esta forma se denervó el paquete correspondiente al lado izquierdo del

animal, con lo que así podríamos tener un paquete denervado y el otro paquete

ar la eficiencia de la denervación quirúrgica y la implicación del

sistema nervioso autónomo en las acciones de la leptina, se pesaron los paquetes de

tejido adiposo perirrenal inervado y denervado y se determinó en extractos totales de

ontenido total del neurotransmisor norepinefrina mediante un

2006, 147: 1140 – 1147 (Keier,

Los ensayos de captura de glucosa se realizaron en explantes o secciones de

≈20mg) de tejido adiposo perirrenal de los animales sometidos a estudio. Este ensayo

o salino vía ICV y en

explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía

Page 68: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

42

Para estudiar la captura de glucosa se empleó 2 desoxiglucosa (0,2 mM) y como

trazador 2μCi/ml de 3H-2-desoxiglucosa. En todos los casos, el medio de incubación

empleado fue el siguiente: medio KRH (Krebs-Ringer Hepes) pH=7.4 suplementado con

1,2mM CaCl2 y 2% BSA y mantenido a 37ºC.

Los explantes de los animales con infusión de leptina o suero salino vía ICV, se

incubaron en ausencia o presencia de 80 nM insulina durante 10 minutos, a 37 ºC.

Los explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía

estereotáxica, se incubaron en primer lugar, durante 2 horas, en ausencia o presencia

de 30ng de resistina y posteriormente, durante 10 minutos en ausencia o presencia de

80 nM insulina, siempre a 37 ºC.

Transcurrido el tiempo de incubación, se contó la radioactividad en un

Contador Beckman de centelleo líquido.

2.7- Determinación de Metabolitos y Hormonas en suero.

En todos los ensayos realizados, las muestras de sangre extraídas, se dejaron

coagular 30 minutos, aproximadamente, a temperatura ambiente y se centrifugaron

en microfuga a 2000g durante 15 minutos. En el suero se determinaron, con el empleo

de kits específicos las concentraciones de TAG mediante el kit Triglyceride LiquiColor

(Stanbio, Cat. No. 2201), AG libres mediante el kit NEFA C (Wako), el Glicerol, mediante

un kit especifico (Cayman), el Lactato mediante el analizador Accutrend Lactate

Analyser (Roche), la insulina en sangre mediante un ELISA específico de rata, y la

norepinefrina mediante un ensayo ELISA (Demeditec Diagnostic GmH, Kiel, Germany).

En todas las determinaciones se siguió el protocolo recomendado por el fabricante y se

emplearon 3 réplicas por muestra. La determinación de glucosa se realizó utilizando el

analizador Accutrend Glucose Analyser (Roche). Los niveles de insulina, de leptina y de

resistina se midieron mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).

2.8- Extracción de ARN.

Para la extracción del RNA total el método empleado se basó en la diferente

solubilidad de las distintas biomoléculas (RNA, DNA, proteínas, lípidos) en disolventes

Page 69: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

43

orgánicos (fenol y cloroformo). Para la misma se ha utilizado el método del trizol

(invitrogen).

Se parte de no más de 100mg y no menos de 40mg de tejido adiposo para obtener un

buen rendimiento y cantidad suficiente de RNA para realizar las medidas posteriores.

Este tejido se homogeniza con 1ml de Trizol, mediante la utilización de un Potter-

Dounce, realizando 10 pases con el pistillo A y 10 pases con el pistillo B. Una vez, que

se ha realizado este proceso, para permitir una disociación completa de los complejos

núcleo-proteicos se deja el homogeneizado en reposo a temperatura ambiente

durante 5 minutos, posteriormente se añaden 200µl de cloroformo, agitando

vigorosamente en un vortex durante 5 segundos, y dejando reposar la mezcla durante

4 minutos. A continuación se centrifuga a 12.000g durante 15 minutos, en frio (4ºC).

Una vez concluido este proceso, se transfiere la fase acuosa a un tubo limpio, al cual

añadiremos 500µl de isopropanol, (el isopropanol disminuye la polaridad del medio e

insolubiliza el RNA) incubándolo 10 minutos a temperatura ambiente para favorecer la

precipitación, y centrifugando después a 12.000g durante 10 minutos en frio (4ºC). El

pellet resultante se lava añadiendo 1ml de etanol al 75% y se centrifuga a 7.500g

durante 5 minutos. El segundo pellet resultante, se deja secar durante varias horas,

procediendo a su posterior resuspensión en 50µl de H2O libre de ARNasas.

Posteriormente se cuantifica la concentración de RNA en un espectofotómetro

(Synergy HT, BioTec), basándonos en la propiedad que tienen las bases nitrogenadas

de absorber luz a 260 nm. Se calcula la relación de absorbancias A260/A280 que da

idea del nivel pureza del RNA cuyo valor optimo es de 2, el cual disminuirá

significativamente con la contaminación por proteínas o fenol.

2.9- Transcripción inversa.

La retrotranscripción es el proceso por el cual a partir de RNA podemos obtener DNAc

(DNA complementario al RNA). El DNAc es mucho más estable que el RNA y por lo

tanto permite un manejo más cómodo y seguro de la muestra.

Page 70: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

44

Para la síntesis del DNA complementario se parte de 3 µg de RNA, el cual, fue

tratado con DNasaI libre de RNasas (2U/µg de RNA) (Roche)30 min a 37ºC, en

presencia de RNasin (4U/µg) (Promega) y DTT 8 mM, para eliminar la posible

contaminación con DNA. Seguidamente se incubó 5 min a 95ºC para desnaturalizar la

DNasaI, y se procedió a la copia del mRNA a cDNA (Sambrook y col., 1989). Se

emplearon 4U/µL de transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia murina de

Moloney (M-MLV) (Gibco BRL) en 20 µL de tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM pH

8.3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM), 1 mM de cada dNTP, 50 nM de p(dN)6 (Boheringer

Mannheim) y el resto de los componentes del tratamiento previo con la DNasaI. Se

incubó 1h a 37ºC y luego se inactivó la RT a 95ºC, 5 min. El cDNA así generado se

guardó a –20ºC hasta su posterior uso.

2.10- Real-time PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy utilizada en

biología molecular. Se denomina RT-PCR cuando se parte de DNA obtenido a partir de

mRNA mediante retrotranscripción. En 1993, Higuchi y colaboradores describieron lo

que hoy en día se conoce como PCR a tiempo real (real-time PCR).

El DNA complementario obtenido se utilizó para realizar una cuantificación

relativa de los niveles de mRNA de los genes de interés. Mediante la reaccion en

cadena de la polimerasa a tiempo real (real-time PCR) según el protocolo facilitado por

TaqMan usando sus sondas específicas para cada gen (Pre-Developed TaqMan Assay

Reagents, PE Applied Biosystem). Se utilizó el RNA ribosomal 18S como control

endógeno para estandarizar la cantidad de DNA complementario incluido en cada

muestra. Estos experimentos se llevaron a cabo empleando un termociclador ABI

PRISM 7500 FAST Sequence Detection System y su software correspondiente (PE

Applied Biosystem, Foster City, CA). Mediante el método ∆∆Ct se calcularon las

diferencias relativas de expresión de los genes en cuestión entre los distintos grupos

de animales. En la siguiente tabla (Tabla 3) se especifican las sondas utilizadas:

Page 71: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

45

Tabla 3. Sondas utilizadas de los genes sometidos a estudio.

Gen Ensayo Taqman-MGB Casa Comercial

ACC Rn00573474_m1 Applied Biosystems

AQ 7 Rn00576331_m1 Applied Biosystems

ATGL Rn01478869_m1 Applied Biosystems

CHERBP Rn00591943_a1 Applied Biosystems

FAS Rn00685720_m1 Applied Biosystems

GDPH Rn00573596_m1 Applied Biosystems

Glut4 Rn00562597_m1 Applied Biosystems

HSL Rn00689222_m1 Applied Biosystems

LRP-1 Rn01503901_m1 Applied Biosystems

LPL Rn00561482_m1 Applied Biosystems

CD36 Rn00580728_m1 Applied Biosystems

PEPCK Rn01529014_m1 Applied Biosystems

PGC -1α Rn00580241_m1 Applied Biosystems

PPARγ Rn00565707_m1 Applied Biosystems

Resistina Rn00584229_m1 Applied Biosystems

SOCS-3 Rn00585674_s1 Applied Biosystems

TNFα Rn99999017_m1 Applied Biosystems

18S rRNA VIC 4319413E Invitrogen

Page 72: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

46

2.11- Fraccionamiento subcelular del tejido adiposo blanco. Obtención de extracto

total, membrana plasmática, membrana interna, gota lipidica y citosol.

2.11.1- Extracto total y fracciones subcelulares.

El tejido adiposo congelado se troceó y homogeneizó en tampón de

homogeneización (0.1 M sacarosa, 50 mM HEPES pH 7.4), 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 50

mM Na-pirofosfato, 5 mM NaN3, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 mM Na3VO4, 10 µg/mL

leupeptina, 10 µg/mL aprotinina y 1 µg/mL pepstatina. Se empleó un homogeneizador

manual Dounce de vidrio-vidrio, realizando 10 pases con el pistilo A y 10 con el B,

obteniendo el “homogenado total”. Este se centrifugó 5 minutos a 800g y se guardó

una alícuota de “extracto total” (sobrenadante). El resto del sobrenadante se

centrifugó 20 minutos a 11.500 rpm, obteniendo en el pellet la fracción de membrana

plasmática cruda (MP cruda) (Massague y Czech, 1982) la cual se purificó sobre un

colchón de 35% sacarosa (10mM TRIS-HCL, 1mM EDTA y 35% sacarosa), y se centrifugó

a 29.000rpm durante una hora,para obtener la “MP” purificada en la interfase la cual

se guardó a -80ºC. El sobrenadante de esta última centrifugación corresponde al

citoplasma celular (CYT) (Simpson y col., 1983).

Para la obtención de la fracción de membrana interna (MI) se centrifugó a

45000rpm, durante 45 minutos, a 4ºC el sobrenadante correspondiente a la

centrifugación del “extracto total” que se comentó en el párrafo anterior. En el pellet

se recogió la MI la cual se resuspendió en 50µl de tampón de homogenización y se

guardo a -80ºC, y el sobrenadante que corresponde a la fracción citosólica se guardo a

-80ºC. Todo el fraccionamiento celular se llevó a cabo en baño de hielo (Figura 11).

2.11.2- Gota lipídica.

En este trabajo hemos abordado el estudio de la gota lipídica (GL). Para obtenerla,

se extrajo la grasa de la primera centrifugación del homogenado total a 800g, la cual se

colocó en tubo limpio y se incubó en tampón de homogeneización especifico para la

extracción de la gota lipídica (0.1 M sacarosa, 50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 2 mM

EGTA, 50 mM Na-pirofosfato, 5 mM NaN3, 20 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 10 µg/mL

leupeptina, 10 µg/mL aprotinina y 1 µg/mL pepstatina, 2% SDS) en una relación p/v de

Page 73: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

47

1 ml de tampón por cada gramo de grasa. Se agitó vigorosamente en un vortex 10

segundos, repitiendo este proceso 3 veces. A continuación se dejó incubar a 37ºC con

agitación suave durante 30 minutos, en un baño atemperado a 37ºC. Tras esta

incubación, se procedió a sonicar las muestras durante 3 minutos, y se volvió a agitar

vigorosamente en un vortex, durante 10 segundos, tras lo cual, se centrifugó a 800g

durante 5 minutos, extrayendo el infranadente que constituye la fracción GL, el cual se

guardó a -80ºC para posteriores análisis.

Figura 11. Representación esquemática del protocolo de centrifugación diferencial utilizada para aislar

las distintas fracciones de membrana, la gota lipídica y el citoplasma celular a partir del TAB.

Page 74: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

48

2.12- Determinación de la concentración de proteínas.

Para determinar la concentración de proteínas, se utilizaron 2 métodos de

cuantificación de proteínas, ya que el SDS interfiere con la reacción de Bradford dando

valores erróneos.

2.12.1- Mediante el método Bradford.

Se cuantificó el contenido en proteínas de extracto total, MP, MI, y citosol por

el método de Bradford (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976) (reactivo de BIO-

RAD Protein Assay, BIO-RAD) usando albúmina de suero bovino (BSA) como proteína

patrón y efectuando la lectura en espectrofotómetro Synergy HT (BioTek) a 595 nm.

2.12.2- Mediante el método Lowri.

Se cuantificó el contenido en proteínas de la gota lipidica por el método de

Lowry (Lowry,1951; Methods of Enzymology Vol III, 448) usando albúmina de suero

bovino (BSA) como proteína patrón y efectuando la lectura en espectrofotómetro

Synergy HT (BioTek) a 750 nm. añadiendo a esta curva el mismo porcentaje de urea y

SDS que presentan las diluciones de las muestras en las que se midió la absorbancia.

2.13- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGC-SDS), e Inmuno detección de

proteínas mediante Western Blot.

Las muestras con igual cantidad de proteínas, se resuspendieron en tampón de

Laemmli (62mM Tris-HCL pH=6.8, 10% Glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 2% SDS y

0.001% azul de bromofenol) y se hirvieron durante 5 minutos a 100 ºC. Las muestras

destinadas al estudio del GLUT4 no se trataron ni con β-mercaptoetanol ni con calor,

puesto que el anticuerpo primario utilizado en su detección sólo presenta afinidad por

la proteína sin desnaturalizar. Todas las muestras se sometieron a electroforesis, en

geles de poliacrilamida/SDS del 7,5% o 10% en función del tamaño de poro que

necesitásemos, en tampón de electroforesis (25 mM Tris, 192 mM glicina pH 8.3, 0.1 %

SDS). Utilizando marcadores de peso molecular (10, 15, 25, 30, 35,50, 75, 105,160 y

250 kDa) (BIO-RAD 161-0374).

Page 75: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

49

Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (NTC) empleando

un sistema de transferencia semiseca y sus kits específicos (iBlot Gel Transfer Stacks

Nitrocellulose, Invitrogen). Una vez realizada la transferencia, se bloqueó la NTC con

leche desnatada al 5% durante 30 minutos, y se realizaron 3 lavados de 10 minutos con

tampón PBS-Tw20. A continuación las membranas se incubaron con el anticuerpo

primario correspondiente durante toda la noche a 4ºC. Tras la incubación de la NTC

con el anticuerpo primario, se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada una, y se

incubaron con el anticuerpo secundario especifico durante 30 minutos a temperatura

ambiente. Se lavaron nuevamente (3 lavados de 5 minutos cada uno) y se revelaron.

Los inmunocomplejos formados se detectaron por quimioluminiscencia usando kits de

detección por un sistema ECL (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ). Las bandas

se visualizaron y cuantificaron en un densitómetro G:Box Chemi (Syngene, UK)

utilizando el software suministrado con el equipo (GeneSnap y GeneTools). Como

controles de carga se emplearon beta-actina (extracto total) y Na+-K+-ATPasa

(marcador de membrana cruda total). En la siguiente tabla (Tabla 4) se resumen los

anticuerpos utilizados.

2.14- Caracterización de fracciones subcelulares.

Para establecer la pureza de las fracciones subcelulares aisladas (Lei y col.,

2004) se llevó a cabo la inmunodetección de proteínas que nos sirven como

marcadores por localizarse en las fracciones de membrana de interés (Figura 12). Así,

se utilizaron los anticuerpos específicos para descartar contaminaciones cruzadas

entre GL, CYT, MI y MP. El marcador especifico de MP es la Na+/K+-ATPasa, el marcador

especifico de MI es la GM130 el de GL es la perilipina, y el de la fracción citosólica es la

GW182.

Page 76: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

50

Figura 12. Western-blot representativo de la presencia de marcadores en fracciones

subcelulares de tejido adiposo blanco epididimal. Se utilizaron 30 µg de proteína de las

distintas fracciones subcelulares. Media ± SEM de 3-6 animales de cada condición, en el caso

de la Na+/K+-ATPasa, el tampón carecía de β-mercaptoetanol y no se hirvieron las muestras,

para evitar la formación de agregados de proteínas.

Como control de carga para las diferentes medidas de western-blot realizadas

en este estudio, se midieron en todas las condiciones que se han estudiado las

proteínas específicas de cada extracto (Figura 13).

Figura 13. Western-blot representativo de la presencia de marcadores en fracciones

subcelulares de cada condición de tejido adiposo blanco epididimal. Se utilizaron 30 µg de

proteína de las distintas fracciones subcelulares. Media ± SEM de 3-6 animales de cada

condición.

Page 77: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

51

Tabla 4. Anticuerpos utilizados en el estudio.

Anticuerpo

primario

Dilución

de uso

Casa comercial Anticuerpo

secundario

Dilución de

uso

Casa

comercial

P-S1101-IRS-1 1:1000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad

P-S307-IRS-1 1:1000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad

IRS-1 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-STAT-3 1:1000 Cell signaling GAM-PO 1:2000 Bio-Rad

STAT-3 1:1000 Santa Cruz GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

SCOS-3 1:5000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

Resistina 1:5000 Chemicon GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

β-actina 1:5000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad

AQ 7 1:200 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad

ATGL 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

LPL 1:200 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-ser565 HSL 1:200 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-ser563 HSL 1:200 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

HSL 1 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-ACC 1 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

ACC 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-ser133 CREB 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

CREB 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-Tre172 AMPK 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

P-ser(485,491)

AMPK

1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

AMPKα1+α2 1:500 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

PERILIPINA 1 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

PPARγ 2 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad

Na+-K+-ATPasa 1:500 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad

GM130 1:5000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad

GAR-PO: Goat anti-rabbit conjugated to horseradish peroxidase. GAM-PO: Goat anti-mouse conjugated to

horseradish peroxidase.

Page 78: Tesis fernández briones

Materiales y métodos

52

2.15- Tratamiento de datos y procesamiento estadístico.

Los datos cuantitativos se presentan como el valor medio ± SEM. La

significatividad de las diferencias entre las medias se determinó mediante análisis

Anova seguido de test Tukey. Se consideraron estadísticamente significativas las

diferencias con un valor de probabilidad p<0,05. Para este tratamiento estadístico, se

utilizó el programa GraphPad Prism versión 3.03 para Windows (GraphPad Software).

En casos específicos se compararon los datos mediante un test t-student. Se considero

estadísticamente significativas las diferencias con un valor de probabilidad p<0,05.

Page 79: Tesis fernández briones

RESULTADOS

Page 80: Tesis fernández briones
Page 81: Tesis fernández briones

Resultados

53

3- RESULTADOS.

Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del tejido adiposo

blanco durante el envejecimiento:

3.1.- Resultados de la sobrecarga oral de grasas.

3.2.- Ensayo ayuno-realimentación. Resultados de los estudios de lipolisis.

Características biológicas y bioquímicas de los animales sometidos a estudio.

Como se describió en el apartado de materiales y Métodos, en estos estudios

se emplearon ratas machos de la raza Wistar de 3, 8 y 24 meses de edad, alimentadas

ad limitum o sometidas a restricción nutricional. En la tabla 1 se muestran las

características generales de estos animales. Los resultados expuestos en la tabla 5,

confirman que en los animales con pleno acceso a la comida (ad libitum), se produce

un aumento de peso corporal con el envejecimiento así como una tendencia a

acumular grasa, como vemos reflejado en el aumento del tejido adiposo blanco

visceral. Por otra parte, la acumulación de grasa y el peso corporal, se reduce

drásticamente con la restricción calórica, que supuso la ingestión de un 20% menos de

alimento. Se corrobora además que el envejecimiento en la rata Wistar no conduce a

alteraciones apreciables de la glucemia y la insulinemia en ayunas.

Tabla 5. Características biológicas de los animales.

EDAD 3m AL 8m AL 8m R 24m AL 24m R

Peso corporall (g) 329±7a 435±7b 381± 6** 554± 24c 477± 16**

Peso tejido adiposo visceral (TAE+TAP) (mg)

9,9±2a 17.2±1b 10,3±2** 26.7±2b 16.4±2**

Glucosa en suero (mmol/L)

6,5±0,1a 7,1±0,3a 7,9±0,06a 6,9±0,3a 6,7±0,5a

Glicerol en suero (mmol/L)

3,3±0,4a 5,1±0,5a 3,9±0,1a 4,2±0,4a 3,2±0,5a

NEFA (mmol/L) 1,0±0,04a 1,3±0,1a 0,9±0,1a 1,0±0,03a 0,9±0,06a

Insulina en suero (ng/mL)

2.6±0.6a 2.3±0.1a 3.8±0,1a 3.08±1a 2.8±0,1a

Los resultados constituyen la media ± SEM de 9-16 ratas por tratamiento. Anova seguido de

test Tukey. Símbolos diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

Page 82: Tesis fernández briones

Resultados

54

Los datos de la tabla 5 reflejan además, que tras 16 horas de ayuno, los valores

de glicerol y NEFA en sangre aunque tienden a incrementarse a los 8 meses con

respecto a los observados a los 3 meses de edad, pero, en un principio, la lipolisis basal

(sin capacidad de distinción entre paquetes adiposos), no cambia significativamente

con la edad.

3.1- Ensayo de sobrecarga oral de grasas.

Este experimento se realizó in vivo, inoculando aceite a los animales por vía oral (0.1

ml / 100 g peso corporal). Se llevó a cabo en los 5 grupos de animales y se utilizaron entre 6 y

10 animales por grupo. Las medidas se realizaron en sangre extraída de la vena de la cola.. Los

resultados más importantes se recogen en las figuras 14 y 15.

Figura 14. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de TAG, NEFA, glucosa e insulina

de animales de 8 meses de edad alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,

tras una sobrecarga oral de grasa. Los datos corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por

tratamiento (**p<0.05).

0 100 200 3000

250

500

3m 8mAL

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

deTA

G (

mg/

dl)

0 100 200 3000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

deN

EFA

(m

mol

/L)

0 100 200 3000

100

200

300

3m 8mAL

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

degl

ucos

a (m

g/dl

)

0 50 100 150 2000

1

2

3

4

5

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

dein

sulin

(ng

/ml)

Page 83: Tesis fernández briones

Resultados

55

Figura 15. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de TAG, NEFA, glucosa e insulina

de animales de 24 meses de edad alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,

tras una sobrecarga oral de grasa. Los datos corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por

tratamiento (**p<0.05).

0 100 200 3000

250

500

3m 24mAL

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

deTA

G (

mg/

dl)

0 50 100 150 2000

5

10

15

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

dein

sulin

a (n

g/m

l)

0 100 200 3000

100

200

300

24mAL3m

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

degl

ucos

a (m

g/dl

)

0 100 200 3000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (min)

Niv

eles

circ

ulan

tes

deN

EFA

(m

mol

/L)

Page 84: Tesis fernández briones

Resultados

56

Figura 16. Área bajo la curva expresada como mg/min/ml-1 correspondiente a los cambios en

los niveles de TAG, NEFA, glucosa e insulina, respectivamente, de los animales de 3, 8 y 24

meses de edad (AL), durante el ensayo de sobrecarga oral de grasa.. Los cálculos se realizaron

con el programa GraphPad Prism versión 3.03 para Windows (GraphPad Software). Los datos

corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por tratamiento. Anova seguido de test Tukey.

Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).

Como podemos observar en las Figuras 14 y 15, las ratas de 8 y 24 meses de

edad parten de niveles elevados de TAG en sangre en ayunas, en comparación con las

de 3 meses de edad. La infusión de un bolo de grasa incrementó los niveles de TAG y

de NEFA en estos animales en el estado postprandial. Estos niveles continuaron

aumentando hasta los 180 minutos después de la carga oral de grasas, a partir de ese

momento, comenzaron a disminuir sin llegar a alcanzar los niveles basales a los 240

minutos (4 horas), momento que se puede considerar como el final de un estado

postabsortivo, teniendo en cuenta que la insulina ya ha alcanzado los niveles basales.

Glucosa

3m 8m 24m0

10000

20000

30000

40000

a ab

Áre

a ba

jo c

urva

(mg/

min

/ml

-1)

TAG

3m 8m 24m0

25000

50000

75000

100000

a

b

c

Áre

a ba

jo c

urva

(mg/

min

/ml

-1)

NEFA

3m 8m 24m0

100

200

300

400

500

aa

b

Áre

a ba

jo c

urva

(mg/

min

/ml

-1)

Insulina

3m 8m 24m0

500

1000

1500

a a

rea

bajo

cur

va

(mg/

min

/ml

-1)

Page 85: Tesis fernández briones

Resultados

57

Las figuras 14 y 15 demuestran que los animales de 24 meses de edad,

necesitan incrementar, de forma significativa, los niveles de insulina circulantes, para

mantener la normoglucemia, no obstante, al final del ensayo, se observa un

incremento notable de la glucemia provocado, probablemente, por un aumento de la

producción hepática de glucosa y una disminución de la captura de glucosa por los

tejidos sensibles a insulina, mediada por el exceso de disponibilidad de ácidos grasos.

Cuando se analizan las áreas bajo las curvas, se observa que ya a los 8 meses de

edad, los animales disponen de altos valores de NEFA durante el ensayo, pero

mantienen la normoinsulinemia y la normoglucemia, altos niveles de NEFA, se han

relacionado habitualmente con el desarrollo de resistencia a la insulina

fundamentalmente en hígado, músculos esqueléticos y páncreas (Randle y col, 1963;

Varman S, 2010).

Este ensayo de sobrecarga de grasas, se realizó también en animales de 8 y 24

meses de edad en restricción nutricional. En la tabla 6, se indican los valores de las

áreas bajo las curvas de TAG, NEFA, glucosa e insulina respectivamente, con el objetivo

de conocer los efectos de la restricción nutricional.

Tabla 6. Área bajo la curva (mg/ml/min-1) de los niveles de TAG, NEFA, glucosa e insulina

respectivamente. Efectos de la restricción nutricional.

Los datos corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por tratamiento. Tets t´student

(**p<0.05).

Edad 8m Al 8m R 24m Al 24m R

TRIGLICERIDOS 63693±1617 40913±1027** 70974±570 39025±6463**

NEFA 356±15 263±7** 306±7 278±9

GLUCOSA 30304±581 34935±518 32816±510 27430±724**

INSULINA 354±47 496±76 1087±38 1025±40

Page 86: Tesis fernández briones

Resultados

58

Como se muestra en la tabla 6, la restricción nutricional temprana acerca el

perfil de lípidos al observado en los animales de 3 meses de edad. Es interesante

destacar que en los animales de 24m R, alcanzan al final del ensayo los valores basales

de la glucemia, pero no los de la insulinemia.

Los datos globales del ensayo de sobrecarga oral de grasas demuestran que con

el envejecimiento se desarrolla intolerancia a las grasas, que como resultado se

producen incrementos de los lípidos en sangre, fundamentalmente,

hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia (datos no mostrados), que puede deberse a

un metabolismo alterado de las lipoproteínas plasmáticas. Como el objeto de estudio

de esta tesis es el tejido adiposo visceral, se decidió analizar los niveles de expresión

de dos proteínas estrechamente vinculadas con la retirada de lípidos de la sangre por

el tejido adiposo, la LPL y la proteína relacionada con el receptor de LDL.

Tabla 7. Niveles de mRNA de la enzima LPL y de la proteína relacionada con el receptor

de LDL (LPR-1) en tejido adiposo de animales de 3, 8 y 24 meses de edad.

Genes 3m 8mAL 8mR 24mAL 24mR

LPL 1.0±0.01a 1.18±0.1a 1.06±0.03a 2.05±0.09b 1.16±0.1a

LRP-1 1.0±0.02a 0.79±0.02b 0.81±0.05b 0.83±0.02b 1.24±0.03c

Los datos corresponden a la media ± SEM de 8-10 ratas por tratamiento. Anova

seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).

Los resultados de la tabla 7 indican que la expresión de LPL está incrementada

al doble en el tejido adiposo de ratas de 24 meses, este dato es también un indicador

de disminución de tono simpático de este tejido. Sin embargo, a partir de los 8 meses

de edad disminuyen los niveles del transcripto de LPR-1. Como para la captura de los

ácidos grasos y de los TAG y ésteres de colesterol de las lipoproteínas plasmáticas es

importante la participación conjunta de la enzima LPL y de los receptores LPR-1 (LDL

receptor protein related-1), estos resultados reflejan una disfunción del tejido adiposo

visceral, en relación con el aclaramiento de las lipoproteínas plasmáticas.

Page 87: Tesis fernández briones

Resultados

59

ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DEL TEJIDO ADIPOSO

3.2.- Ensayo ayuno-realimentación.

El envejecimiento es un proceso que implica la pérdida progresiva de la

capacidad de adaptación a diferentes estados de estrés celular. En esta sección del

trabajo abordamos el efecto del envejecimiento sobre la capacidad del tejido adiposo

visceral de responder a una situación de ayuno prolongado (36h) y al cambio al estado

de alimentación. Para iniciar el estudio analizamos los niveles de TAG, NEFA y glicerol

en sangre de las ratas de 3, 8 y 24 meses de edad (AL y FR) sometidas a estudio.

Los resultados de la tabla 8 no reflejan diferencias significativas en los niveles

circulantes de NEFA y glicerol con el envejecimiento, aunque los valores superiores de

NEFA se observan a los 8 meses de edad. Sin embargo, la restricción calórica produce

un aumento significativo de NEFA en los animales de 24 meses de edad. Por otra parte,

los resultados del experimento indican que los niveles de TAG son significativamente

superiores en las ratas de 24 meses respecto a los valores observados en ratas de 3 y 8

meses ayunadas. Es importante tener en cuenta que en estas condiciones los TAG

detectados son los TAG-VLDL.

Tabla 8. Niveles de Glicerol, NEFA y TAG en suero.

EDAD 3m AL 8m AL 8m R 24m AL 24m R

Glicerol en suero (mM) 4.22±0.11a 3.15±0.28a 2.29±0.28 4.20±0.86a 3.78±0.37

NEFA en suero (mM) 0.62±0.18a 0.72±0.07a 0.69±0.17a 0.63±0.14a 1.34±0.5*

TAG en suero (mM) 0.47±0.06a 0.31±0.04a 0.29±0.11b 0.75±0.10c 0.25±0.04b

Los resultados constituyen la media ± SEM de 9-16 ratas por tratamiento. Anova seguido de

test Tukey. Símbolos diferentes indican diferencias significativas entre animales de diferente

edad (p<0.05). Test t´student * p<0.05

Page 88: Tesis fernández briones

Resultados

60

Estudio de la lipolisis basal del tejido adiposo en el tránsito ayuno-alimentación.

3.2.1-Lipolisis ex vivo. Efecto del envejecimiento y la restricción calórica.

Como ya hemos avanzado en la introducción, la lipólisis del tejido adiposo, es el

proceso de degradación de los triglicéridos almacenados en este tejido, los cuales son

hidrolizados hasta ácidos grasos y glicerol. En esta parte del trabajo se analizó

inicialmente la lipolisis basal, en explantes (100 mg) de tejido adiposo blanco, a través

de la determinación (después de 3 horas de incubación) de la liberación de glicerol y

NEFA al medio de incubación de los explantes. Como la lipolisis y la reesterificación son

procesos que están relacionados entre sí (Van Harmelen y col, 1999; Wan y col, 2013),

se determinó el cociente NEFA / glicerol, un indicador de la capacidad de recaptura de

NEFA por el tejido adiposo y de la reesterificación a TAG.

Además, se midió en muestras de tejido adiposo (100 mg), los niveles de mRNA y de

proteína de las enzimas ATGL y HSL, ya que juegan un importante papel en este

proceso, fundamentalmente la enzima ATGL que es la limitante de la lipolisis basal, así

como los del canal de glicerol AQ7. Se prestó especial énfasis en la obtención de

secciones de 100 mg de tejido para todos los estudios relacionados con la lipolisis y los

niveles de proteínas y enzimas involucradas en este proceso.

Como podemos observar en las Figuras 17 Y 18, después de un ayuno de 36

horas, los niveles de glicerol y NEFA liberados al medio de incubación, así como de

expresión de las hormonas HSL y ATGL, disminuyen a los 24 meses de edad con

respecto a los observados a los 3 y a los 8 meses de edad, lo que indica una

disminución de la capacidad lipolítica basal del tejido adiposo de los animales de 24

meses de edad en las condiciones de ayuno estudiadas. La restricción calórica

temprana (8mFR) y tardía (24mFR) incrementó significativamente la liberación de

glicerol respecto a la observada en los animales alimentados ad libitum.

Page 89: Tesis fernández briones

Resultados

61

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0

5

10

15

20

b

a

bGlic

erol

libe

rado

(mm

oles

/g te

jido/

h)

*

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0

5

10

15

20

b

a

bNE

FA li

bera

do(m

mol

es/g

tejid

o/h)

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0

1

2

a

b

a

*

NE

FA /

Glic

erol

Figura 17. Medida de la liberación de NEFA y glicerol al medio de incubación (3 horas) de los

explantes (100 mg) de tejido adiposo después del ayuno de 36 horas y determinación del

cociente NEFA / glicerol en cada caso. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-

4 animales de cada condición, ensayados por triplicado. Anova seguido de test Tukey. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

En la figura 17 se observa una disminución significativa en la liberación de

NEFA y glicerol por los explantes de tejido adiposo de animales de 8 y 24 meses de

edad con respecto a animales de 3 meses de edad, estos resultados indican que la

velocidad de liberación de estos metabolitos por el tejido adiposo visceral, disminuye

con el envejecimiento. Además, el aumento significativo del cociente NEFA / glicerol

observado en la figura 17, para los explantes de animales de 24 meses de edad,

confirma la reducción de la capacidad lipolítica y también de la capacidad de

reesterificación del tejido adiposo visceral con el envejecimiento cuando los animales

se someten a un ayuno de 36 horas, superior al normal. En cambio, la restricción

calórica temprana (8mFR) incrementa notablemente ambos procesos, por lo que se

corrobora que este tipo de intervención mejora la funcionalidad del tejido adiposo

visceral.

Page 90: Tesis fernández briones

Resultados

62

La realimentación durante 30 minutos y 3 horas, no produjo cambios en los

niveles de NEFA liberados al medio respecto a los valores observados en ayunas, sin

embargo si se observó una tendencia a la disminución paulatina (no significativa) de

los niveles de glicerol liberados al medio de incubación (datos no mostrados).

La figura 18 muestra los niveles de mRNA de ATGL, HSL y AQ7 en el tejido

adiposo de los animales estudiados durante el ayuno de 36 horas y la transición ayuno-

realimentación. Inicialmente se observa que la abundancia de los transcriptos de HSL y

ATGL, presenta, aproximadamente el mismo patrón de variación con el

envejecimiento, incrementándose a los 8 meses y disminuyendo a los 24 meses de

edad, siendo el cambio de HSL más notable y significativo y que se correlaciona,

además, con los niveles de NEFA en el plasma de los animales (tabla 8). Se corrobora

que cuando se incrementa la resistencia a la insulina disminuye la expresión de estas

enzimas y que el aumento de adiposidad sumado al envejecimiento disminuye la

expresión de las principales enzimas lipolíticas en el tejido adiposo. Por otra parte se

observa que la expresión de AQ7 se incrementa con la edad.

Además en esta figura se aprecia que el tejido adiposo de animales de 24

meses no tiene igual respuesta frente a la transición ayuno-alimentación, que el tejido

adiposo de animales de 3 y 8 meses de edad. De hecho, la expresión de HSL no se

modifica y la de ATGL y AQ7 continúa disminuyendo, lo se puede interpretar como una

disfunción del tejido o una disminución del tono simpático del tejido adiposo en las

ratas de 24 meses de edad. La restricción calórica temprana tiende a disminuir la

expresión de los 3 genes estudiados y generar un perfil de expresión similar al

observado a los 3 meses de edad.

Si consideramos la disminución de la expresión de ATGL y AQ7 a las 3 horas de

iniciada la realimentación en ratas de 24 meses, podría favorecer la capacidad de

esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo de estos animales, al disponer de

glicerol en el tejido durante más tiempo. En esta situación particular, podría activarse

la expresión génica de la enzima glicerol quinasa, como se ha descrito por otros

autores (Frasson y col, 2012).

Page 91: Tesis fernández briones

Resultados

63

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

HS

L en

TA

E

a

a

a

b

b

ab

ac

c

ac

ac

ac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

AT

GL

en T

AE

aa

bb

bba

bab

c

ac

ac

ac

ac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

0.5

1.0

1.5

a

ca

ab

ab

ac

cac a

c

a

bb

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

AQ

7 en

TA

E

Figura 18. Medida de la expresión génica de las hormonas HSL y ATGL y del transportador de

glicerol AQ7 en condición basal. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-

4 animales de cada condición, ensayados por triplicado. Anova seguido de test Tukey. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b=

envejecimiento; c= restricción calórica.

A continuación, se determinaron los niveles de las proteínas HSL, ATGL y AQ7

en el tejido adiposo visceral, así como el estado de activación de la enzima HSL.

La figura 19A demuestra que los niveles proteicos de la enzima ATGL, limitante

de la lipolisis basal, están reducidos significativamente con el envejecimiento en las

condiciones estudiadas (ayuno 36 horas). Estos resultados se corresponden con la

disminuida capacidad lipolítica y de reesterificación mostrada por el tejido adiposo de

ratas envejecidas en la figura 14. También se observa que la restricción calórica

incrementa los niveles de ATGL. Cuando se analizó el efecto de la realimentación

(figura 19B), se observó una disminución paulatina de los niveles de ATGL en los 3

grupos de animales alimentados AL.

Page 92: Tesis fernández briones

Resultados

64

En la figura 20A, vemos que los niveles proteicos de AQ7, al igual que los de

mRNA (figura 18), se incrementan con el envejecimiento. En relación con los niveles de

perilipina, una proteína que interviene en la formación de la gota lipídica y en el

metabolismo de los lípidos neutros contenidos en este compartimento, los resultados

indican que los niveles de perilipina son superiores en el tejido adiposo de animales de

24 meses con respecto a los de 8 meses de edad, probablemente debido a que en los

primeros se ha reducido menos el tamaño de la gota lipídica.

La restricción calórica temprana modifica los niveles de AQ7, en cambio se

observa un contenido menor de perilipina tanto cuando se lleva a cabo en etapas

tempranas como tardías de la vida. Por otra parte, la realimentación no produjo

modificaciones importantes de los niveles de AQ7 y perilipina (datos no mostrados).

La HSL es la enzima limitante de la lipolisis mediada por catecolaminas. La

figura 20A, muestra que con el envejecimiento (24 meses de edad) disminuye la masa

de HSL, además de la de ATGL. Por otra parte, se conoce que la fosforilación en serina

563 (mediada por PKA), activa a la HSL, mientras que la fosforilación en serina 565

(mediada por AMPK), impide la activación de la HSL por la PKA. Al analizar la relación

entre las formas activada y no activada, se observa una disminución significativa del

estado de activación de esta enzima, con el envejecimiento. La restricción calórica

incrementa la forma activada de HSL en el estado de ayuno.

La realimentación, como indica la figura 20B, produce un descenso gradual del

estado de activación (p-ser-563 / p-ser-565) de la HSL en animales de 3 meses de edad

y en los sometidos a restricción calórica temprana (8mFR).

Page 93: Tesis fernández briones

Resultados

65

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

ATGL AQ7 Perilipina0

1

2

33mAL 8mAL 8mFR24m AL 24mFR

Niv

eles

de

prot

eína

y d

eac

tivac

ión

de H

SL

b bc

c

b

cc cb

0.0

0.5

1.0

1.53mAL

a

bcA

TGL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

Ay Re30 Re1800.00

0.05

0.10

0.15

a

Ay Re30 Re180

8m AL

ATG

L(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

a

a

0.075

0.100

0.125

0.150a

a

a

Ay Re30 Re180

24m AL

ATG

L(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

a

b

c

Ay Re30 Re180

8m FR

ATG

L(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

a

b

Ay Re30 Re180

24m FR

a

ATG

L(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

Figura 19. Niveles totales de proteína de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total de tejido

adiposo visceral. A) Niveles en ayuno de 36 horas. Efectos del envejecimiento y de la

restricción calórica. B) Efectos de la realimentación en los niveles de ATGL. Los resultados

mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por

duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a=

ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

A

B

Page 94: Tesis fernández briones

Resultados

66

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

HSL total p-ser-563-HSL p-ser-565-HSL p-ser-563 / p-ser-565 HSL0.0

0.5

1.0

1.5 3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

b

c

c

bb

c

c

bb

b

b

c

c

Niv

eles

de

prot

eína

y d

eac

tivac

ión

de H

SL

0.0

0.5

1.0

1.53mAL

Ay Re30 Re180

P-5

63H

SL/

P-5

65H

SL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

b

c

a

0.2

0.3

0.4 8mAL

P-5

63H

SL/

P-5

65H

SL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

Ay Re30 Re180

a a

b

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ay Re30 Re180

24mAL

P-5

63H

SL/

P-5

65H

SL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

a

a

b

0.0

0.5

1.0

1.5

Ay Re30 Re180

8mFR

P-5

63H

SL/

P-5

65H

SL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

a

b b

0.00

0.25

0.50

0.75

Ay Re30 Re180

24mFR

P-5

63H

SL/

P-5

65H

SL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

a a

b

Figura 20. Niveles totales de proteína y de las especies fosforiladas de la enzima HSL en extracto total de tejido adiposo visceral. A) Niveles en estado de ayuno de 36 horas. Efectos del envejecimiento y de la restricción calórica. B) Efectos de la realimentación en el estado de activación de HSL. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas

entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

A

B

Page 95: Tesis fernández briones

Resultados

67

3.2.2- Estudio de la lipolisis del tejido adiposo visceral. Efectos del isoproterenol y la

insulina.

Los resultados que se muestran a continuación, corresponden al estudio en

explantes (100 mg) de tejido adiposo visceral, de los efectos del isoproterenol y la

insulina sobre la lipolisis, para analizar la capacidad del tejido adiposo de respuesta a

los agonistas de β-adernérgicos y de respuesta a las acciones antilipolíticas de la

insulina. El estudio se centró en el análisis de la liberación de glicerol al medio de

incubación (3 horas incubación), teniendo en cuenta que es la medida más efectiva de

la lipolisis cuando se estudia en secciones de tejido adiposo.

Los resultados de este ensayo se presentan en la Figura 21. En esta figura se

demuestra que los explantes de tejido adiposo de animales de 8 y 24 meses de edad

AL y FR, muestran una pobre respuesta a las acciones lipolíticas del ISO, a diferencia de

los explantes de ratas de 3 meses de edad, en los que se incrementa notablemente la

liberación de glicerol al medio en las tres condiciones estudiadas, ayuno, 30 minutos y

3 horas de realimentación, predominando las acciones lipolíticas del ISO a las acciones

antilipolíticas de la insulina.

En esta figura 21, también se observa que en los explantes de ratas de 24

meses de edad predominan los efectos antilipolíticos de la insulina a los efectos del

isoproterenol.

Además de las medidas de glicerol, también se realizaron medidas de lactato en

los medios de incubación de los explantes, y como podemos observar en la Figura 22,

la liberación de lactato al medio, como reflejo de la capacidad del tejido de

metabolizar la glucosa, depende de la edad y de la situación fisiológica. El ISO detiene

la liberación de lactato y la insulina revierte los efectos del ISO e incrementa la

transformación de glucosa en lactato en explantes de ratas de 3 meses de edad

ayunadas o después de 3 horas de ser alimentadas.

Page 96: Tesis fernández briones

Resultados

68

Ayuno

3mAL 8mAl 24mAl 8mR 24mR0

50

100

150

aa

ab a

a a aa

Glic

erol

(%

)

Realimentación 30 min

3mAL 8mAl 24mAl 8mR 24mR0

50

100

150

aa

a a

Glic

erol

(%

)

b

b b

Realimentación 3horas

3mAL 8mAl 24mAl 8mR 24mR0

50

100

150

aa

ab

a a a

Glid

erol

(%

)

ab

ab

ab

Figura 21. Medidas de glicerol en los medios de los explantes en estado basal, tratados con

isoproterenol y tratados con isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados

corresponden al estudio de 3-4 animales de cada condición, ensayados por triplicado,

expresados en % de estimulación sobre el basal. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Los explantes de ratas de 24 meses de edad no muestran variaciones en la

liberación de lactato en respuesta a insulina cuando provienen de animales en estado

postprandial. Se confirma con estos resultados que el tejido adiposo de ratas

envejecidas no responde adecuadamente a los efectos de la insulina de estimular la

oxidación de la glucosa, al menos a lactato.

Page 97: Tesis fernández briones

Resultados

69

Ayuno

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

50

100

150

a

a

ba

a

b b

ab

c

c

ac

ac

ac

ac

Lact

ato

(%)

Realimentación 30 Minutos

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

50

100

150

a

a

b

a

b

c

ab

ab

Lact

ato

(%)

Realimentación 3 horas

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

50

100

150

a

b

cab

ac

bb

c ac

ca

Lact

ato

(%)

Figura 22. Medidas de lactato en los medios de los explantes en estado basal, tratados con

isoproterenol y tratados con isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados

corresponden al estudio de 3-4 animales de cada condición, ensayados por triplicado,

expresados en % de estimulación sobre el basal. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Por otra parte, se consideró relevante estudiar la capacidad de estimulación de

la enzima HSL por isoproterenol en los explantes de tejido adiposo con el

envejecimiento y la restricción calórica.

Page 98: Tesis fernández briones

Resultados

70

3.2.3- Estudio del estado de activación de la enzima HSL en tejido adiposo. Efectos de

isoproterenol y la insulina.

En la figura 23 se muestran las variaciones en el estado de activación de la

enzima HSL (p-ser-563-HSL / p-ser-565-HSL) que produce el tratamiento con

isoproterenol y el tratamiento con ISO más insulina de los explantes. En la figura se

observa que solo los explantes de tejido adiposo visceral correspondientes a animales

de 3 meses de edad reflejan lo esperado, incremento de activación de HSL por

isoproterenol y disminución de activación de HSL por ISO más insulina.

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

100

200

300

a

Act

ivac

ión

de H

SL

(% s

obre

bas

al)

Figura 23. Representación de los cambios en la activación de la enzima HSL (cociente p-ser-

563 / p-ser-565) en los explantes (30mg de extracto total) durante el ensayo de lipolisis. Se

consideró como 100% la condición basal. Todos los resultados mostrados corresponden al

estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican

diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c=

restricción calórica.

Page 99: Tesis fernández briones

Resultados

71

La disminución del estado de activación de HSL se debe fundamentalmente al

incremento en la fosforilación en serina 565-HSL. Este residuo es fosforilado por la

enzima AMPK, la cual se activa en situaciones de estrés energético y oxidativo.

3.2.4- Efectos del isoproterenol y la insulina sobre los niveles proteicos de ATGL, AQ7

y perilipina en los explantes de tejido adiposo.

La figura 24 refleja el resultado de las modificaciones que produce el

tratamiento con isoproterenol en los niveles totales de AQ7, ATGL y perilipina. Los

resultados más notables muestran que el isoproterenol incrementa el contenido

proteico de ATGL mientras que ISO más insulina los disminuye, en los explantes de

animales de 3, 8 y 24 meses de edad, alimentados ad limitum y bajo restricción

calórica.

Los efectos sobre los niveles de perilipina son totalmente opuestos. El

isoproterenol disminuye mientras que ISO más insulina incrementa generalmente los

niveles de perilipina. En el caso de la AQ7 las modificaciones solo se observan en

animales de avanzada edad o bajo restricción calórica.

Page 100: Tesis fernández briones

Resultados

72

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

b b b

b

ab

ab

c c c

ac

ac

ac

AQ

7(3

0µ g

de

extr

acto

tota

l)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

a a

ab b

ab

c

c

ac

ac

ac

ATG

L(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

a a

b bb b b b

c

cac

ac

ac

ac

PE

RIL

IPIN

A

Figura 24. Niveles de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total de los explantes de tejido

adiposo visceral en condición basal (B), tratados con isoproterenol (ISO), y tratados con

isoproterenol e insulina (ISO+Ins). Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6

animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

3.2.5- Estudio del estado de activación de la enzima AMPK en tejido adiposo. Efectos

del envejecimiento y la restricción nutricional. Efectos de isoproterenol y la insulina.

A continuación se estudiaron los cambios en el estado de activación de la AMPK

por ser un importante sensor energético y regulador clave del metabolismo en todos

los tejidos. El estrés nutricional y energético (altos niveles de AMP), estimula la

Page 101: Tesis fernández briones

Resultados

73

fosforilación en la treonina 172 y la activación de la AMPK. Por otra parte, se sugiere

que la fosforilación en residuos de serina disminuye el estado de activación de la

AMPK.

En la figura 25 se observa que el contenido de AMPK aumenta con el

envejecimiento y disminuye con la restricción calórica. Sin embargo, el estado de

activación de esta enzima (cociente p-thr-172-AMPK / p-ser-485,491-AMPK) es mayor

en el tejido adiposo de ratas de 3 meses de edad en ayuno de 36 horas. De hecho lo

que se observa en la figura 25, es un incremento significativo de la forma no activada

de AMPK (p-ser-485,491) con el envejecimiento y la restricción calórica que podría

relacionarse con un mecanismo de protección a largo plazo contra el exceso de

lipolisis, de oxidación de ácidos grasos y de incremento del estrés oxidativo.

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

AMPK total P-thr AMPK P-ser AMPK P-thr/P-serAMPK0

1

2

3

4

5

b bc b b

b

cc

c

c

c

b

b b

3 m A L 8 m A L 2 4 m A L 8 m F R 2 4 m F R

Niv

eles

de

prot

eina

y d

e

activ

ació

n de

AM

PK

Figura 25. Niveles basales de expresión proteica de las especies fosforiladas y de la masa de

AMPK. Efectos del envejecimiento y de la restricción calorica. Todos los resultados mostrados

corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b=

envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 102: Tesis fernández briones

Resultados

74

Por otra parte la activación de la lipolisis en explantes, por isoproterenol,

incrementa de forma significativa la forma activada de la AMPK (figura 26) en el tejido

adiposo de las ratas de 3, 8 y 24 meses de edad y el tratamiento con insulina la

aumenta de manera significativa en ratas de 3 meses de edad. Se sugiere que la

activación de AMPK por catecolaminas podría promover a largo plazo la inactivación,

por fosforilación en residuos de serina, de la enzima HSL en las ratas viejas, de modo

que con el envejecimiento disminuye el contenido proteico de HSL y estaría

fundamentalmente en estado de menor activación, de esta forma se ve limitada la

lipolisis en animales en los que ha disminuido significativamente la masa magra

(Escrivá, 2007).

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

100

200

300

a

a

a a

a

aa

a a

Act

ivac

ión

de A

MP

K(%

sob

re e

l bas

al)

Figura 26. Representación de los cambios en la activación de la enzima AMPK (cociente p-thr-

172-AMPK / p-ser-485,491) en los explantes (30mg de extracto total) durante el ensayo de

lipolisis. Se consideró como 100% la condición basal. Todos los resultados mostrados

corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b=

envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 103: Tesis fernández briones

Resultados

75

Teniendo en cuenta que la lipolisis es la movilización de los lípidos almacenados

en la gota lipídica del tejido adiposo blanco y que este proceso supone la activación de

enzimas lipolíticas así como la correcta localización subcelular de las proteínas

implicadas, se procedió a estudiar los niveles de ATGL, HSL, perilipina y AQ7 en

diferentes fracciones subcelulares obtenidas a partir de un extracto total del tejido

adiposo y del fraccionamiento de los explantes que fueron incubados con ISO y con ISO

más insulina. El siguiente apartado refleja el efecto del envejecimiento sobre los

movimientos de proteínas hacia la gota lipídica o desde la gota lipídica hacia el citosol

en el tejido adiposo visceral de ratas Wistar de 3, 8 y 24 meses de edad.

3.2.6- Estudio de los cambios en la localización subcelular de proteínas durante la

lipolisis. Efectos del envejecimiento y la restricción calórica.

Las proteínas y enzimas relacionadas con la hidrólisis de los lípidos neutros se

asocian físicamente a la gota lipídica en todos los mamíferos, tres de estas proteínas

son la ATGL que cataliza el primer evento en la hidrólisis de los TAG, la perilipina que

forma la cubierta de la gota lipídica y la HSL que cataliza la hidrólisis de los DAG

(Sturley S y Hussain MM, 2012).

En las figuras 27-31, se presentan en la parte superior, los resultados del

fraccionamiento subcelular de secciones de 100 mg de tejido adiposo y en la parte

inferior, los resultados del fraccionamiento subcelular de los explantes (100 mg),

incubados durante 3 horas con el medio de incubación, medio más ISO y medio más

ISO más insulina.

Los resultados que se presentan en la figura 27(A,B) indican que en el tejido

adiposo de ratas de 3 meses de edad, la ATGL se encuentra distribuída entre la gota

lipídica y el citosol. Con el envejecimiento disminuye el contenido total y se localiza

mayoritariamente en el citosol. En todos los animales estudiados, tras la lipolisis

inducida por isoproterenol, la ATGL se desplaza, pasando a encontrarse

mayoritariamente en la gota lipídica.

Page 104: Tesis fernández briones

Resultados

76

Figura 27A. En esta figura se puede observar cómo se trasloca la ATGL del citosol a la gota

lipídica tras la lipolisis.

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

0.5

1.0

1.5

ATG

L(3

0µg

de

gota

lipí

dica

)

b bb

b

ab

ab

c

c

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

0.5

1.0

1.5

ATG

L(3

0µg

de c

itoso

l)

b

ab

ab

ab

ab

b

cc

c

ac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

0.5

1.0

1.5

a

b b bb b

b

c c cc c a

c

ATG

L(3

0µg

de g

ota

lipíd

ica)

Figura 27B. Niveles de expresión proteica de ATGL en condición basal (transición Ayuno

realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los

resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados

por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 105: Tesis fernández briones

Resultados

77

Las figuras 28 y 29 (A,B) muestran la localización basal y el movimiento de la

HSL y de la forma fosforilada en serina 565 de HSL. Como podemos ver, en el tejido

adiposo de los animales sometidos a estudio, la HSL se distribuye entre el citosol y la

gota lipídica (figura 28A). Sin embargo, la estimulación de la lipolisis, promueve en

general, el movimiento de HSL hacia la gota lipídica (figura 28B). Por otra parte, hay

que destacar que la forma fosforilada en serina 565 de HSL solo se encuentra en el

citosol en el tejido adiposo figura (29A) y se mueve a la gota lipídica cuando se

exponen los explantes al medio de incubación y al medio más ISO y más ISO e

insulina(figura 29B). Igualmente, se observa el aumento de esta forma menos activa de

HSL, en la gota lipídica con el envejecimiento, lo que limitaría la movilización de los

depósitos grasos en el tejido adiposo visceral de estos animales.

Figura 28A. En esta figura se puede observar cómo la masa de HSL se mantiene repartida

equitativamente entre la gota lipidica y el citosol, tanto antes como después de la incubación.

Page 106: Tesis fernández briones

Resultados

78

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

HS

L(3

0µµ µµ g

de

gota

lipí

dica

)ab

c

ac

ab

c

ac

ac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

b b

ab

ab

a a cac

ac

ac

HS

L(3

0µ g

de

cito

sol)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

10.0ab

ab

bab

ab

c c c cc

c

HS

L(3

0µ g

de

gota

lipí

dica

)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

HS

L(3

0µ g

de

cito

sol)

a b b ab

b b bc c

a ac

Figura 28B. Niveles de expresión proteica de HSL en condición basal (transición Ayuno

realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los

resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados

por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 107: Tesis fernández briones

Resultados

79

Figura 29A. En esta figura se puede observar cómo se trasloca la forma inactiva de la HSL del

citosol a la gota lipídica tras la lipolisis.

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

4

P-5

65H

SL/

HS

L(3

0µg

de c

itoso

l)

a a

a

b

b bb

cc c

ac a

c

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

4

a

a b b ab

bcc c

c ac

ac

P-5

65H

SL/

HS

L(3

0µ g

de

gota

lipí

dica

)

Figura 29B. Niveles de expresión proteica de la especie fosforilada inactiva de HSL en condición

basal (transición Ayuno realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con

isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6

animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Finalmente, en relación con la gota lipídica y la lipolisis, estudiamos los

movimientos de la perilipina y como indican las figuras 30 (A,B), la perilipina se localiza

en la gota lipídica del tejido adiposo de todos los animales sometidos a estudio. No

obstante, tras la lipólisis, parte de esta proteína se mueve de la gota lipídica al citosol,

Page 108: Tesis fernández briones

Resultados

80

fundamentalmente en explantes de ratas de 3 meses de edad y de ratas sometidas a

restricción calórica, facilitando el acceso a las enzimas lipolíticas. En los explantes de

todos los animales alimentados ad limitum, la presencia de insulina incrementa de

nuevo el contenido de perilipina en la gota lipídica.

Figura 30A. En esta figura se puede observar cómo se trasloca la perilipina de la gota lipídica al

citosol tras la lipolisis, aunque sigue estando mayoritariamente en la gota lipídica.

Page 109: Tesis fernández briones

Resultados

81

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

4

5

Per

ilipi

na(3

0µg

de g

ota

lipíd

ica)

ab

ab a

b

ab c c a

cac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

4

5

Per

ilipi

na(3

0µg

de c

itoso

l)

a

a

ab

ab

b

b

c c

c

a

ac

ac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

a

a

bb ba

bab

c c c ac

ac

Per

ilipi

na(3

0µg

de g

ota

lipíd

ica)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

b a c aac

ac

ac

Per

ilipi

na(3

0µg

de c

itoso

l)

Figura 30B. Niveles de expresión proteica de Perilipina en condición basal (transición Ayuno

realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los

resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados

por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

A continuación, estudiamos los cambios en la localización subcelular de la AQ7

con el envejecimiento y la situación nutricional. En las figuras 31 (A,B) se observa que

esta isoforma de acuaporina se localiza en el tejido adiposo de todos los animales

estudiados, fundamentalmente, en las membranas internas y en menor proporción en

la membrana plasmática. La estimulación de la lipolisis en los explantes, induce la

salida de esta proteína a la membrana plasmática, aunque en las ratas viejas sigue

observándose mayor contenido de AQ7 en la MI.

Page 110: Tesis fernández briones

Resultados

82

Figura 31A. En esta figura se puede observar cómo no se produce ninguna traslocación de la

AQ7 entra las distintas membranas.

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

a

b

b

ab

ab

ab

ab a

c c

ac

ac

AQ

7(3

0µg

de m

embr

ana

plas

mat

ica)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

a

ab

bb

c

ac

ac

ac

AQ

7(3

0µ g

de

mem

bran

ain

tern

a)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

b b ab

b

ab a

bc cc

ac

ac

AQ

7(3

0µg

de m

embr

ana

plas

mat

ica)

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

ab b

ab b b

ab c

cac

ac

AQ

7(3

0µg

de

mem

bran

a in

tern

a)

Figura 31B. Niveles de expresión proteica en membrana plasmática y membrana interna de AQ7 en condición basal (transición Ayuno realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican

diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 111: Tesis fernández briones

Resultados

83

3.2.7- Estudio de la vía lipogénica. Capacidad de síntesis de novo de ácidos grasos y

de captura de lípidos por el tejido adiposo para la síntesis de TAG.

Se ha descrito en la literatura que la transformación de glucosa en ácidos

grasos está disminuida en el tejido adiposo de ratas Wistar con el envejecimiento

(Escrivá, 2007). En esta tesis hemos determinado los niveles de los transcriptos del

factor de transcripción ChREBP, relacionado con la síntesis de ácidos grasos y del

receptor nuclear PPARγ, relacionado con la adipogénesis y la lipogénesis en el tejido

adiposo. Los resultados que se muestran en la figura 32 indican que la expresión

génica de estos factores disminuye con la edad, y aumenta con la restricción calórica

ya sea temprana o tardía.

Por otra parte, se observa que la expresión de ChREBP varía en función de la

situación nutricional ya que disminuye al inicio de la realimentación pero se

incrementa significativamente transcurridas 3 horas del inicio de la realimentación, de

manera que prepara al tejido para la asimilación del exceso de nutrientes en las

siguientes etapas de alimentación. El caso más relevante es el de 24 meses FR.

En el caso de PPARγ, se observa una tendencia al incremento de expresión a los

8 meses y a la disminución de la expresión a los 24 meses de edad.

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

a

a

bb b

ab

ab

ab

c

cc

a

ac

ac

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

CH

ER

BP

en

TA

E

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

4

5

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

PP

AR

γ en

TA

E

a a

b

ab

ab

ac

c

ac

c

ac

Figura 32. Niveles basales de mRNA de CHERBP y PPARγ en tejido adiposo visceral. Efectos del

envejecimiento y el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de

3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 112: Tesis fernández briones

Resultados

84

A continuación se analizó la expresión de dos genes que están regulados por

ChREBP: ACC y FAS. Nuestros resultados (Figura 33) indican que los niveles de mRNA

de estas enzimas que son clave para la síntesis de novo de ácidos grasos, disminuyen

con el envejecimiento, y aumentan con la restricción calórica.

Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de ACC así como su estado de

fosforilación, teniendo en cuenta que el estado de activación de esta enzima (no

fosforilado) regula fuertemente la síntesis de novo de ácidos grasos. Nuestros

resultados de la figura 34 indican, que los niveles proteicos de ACC disminuyen

drásticamente con el envejecimiento y que la restricción calórica temprana produce un

incremento de éstos en estado de alimentación. También vemos que la ACC está

fundamentalmente en forma inactiva (p-ACC) en el tejido adiposo de ratas de 24

meses de edad (Figura 34).

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

0.5

1.0

1.5

aa

aab b

b bba

b

cc a

c

ac

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

FA

S e

n T

AE

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

0.5

1.0

1.5

aa a

a a

ac

c c

b bb

b b

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

AC

C e

n T

AE

Figura 33. Niveles basales de mRNA de ACC y FAS en tejido adiposo visceral. Efectos del

envejecimiento y el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de

3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 113: Tesis fernández briones

Resultados

85

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24mFR

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24mFR

bc

Niv

eles

de

p-A

CC

/ A

CC

(uni

dade

s ar

bitr

aria

s)

0 1 2 3 40.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4 3m AL

P-A

CC

/AC

C(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

aa

a

0 1 2 3 40.9

1.0

1.1

1.2

1.3

a

a

a

8m AL

P-A

CC

/AC

C(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

0 1 2 3 41.25

1.50

1.75

2.00

2.25a

24m AL

P-A

CC

/AC

C(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

b

c

0 1 2 3 41.25

1.50

1.75

2.00

a

a

b

8m FR

P-A

CC

/AC

C(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

0 1 2 3 41.50

1.75

2.00

2.25

a

a

a

24m FR

P-A

CC

/AC

C(3

0µg

de e

xtra

cto

tota

l)

Figura 34. Niveles proteicos de la enzima ACC y de la forma fosforilada en serina, p-ACC en tejido adiposo visceral. Efectos del envejecimiento y el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por

duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

B

A

Page 114: Tesis fernández briones

Resultados

86

Finalmente se analizaron los niveles de expresión génica y proteica de proteínas

involucradas en la captura de glucosa, ácidos grasos y lípidos de las lipoproteínas,

teniendo en cuenta no solo el envejecimiento sino también el estado de alimentación.

En primer lugar, la figura 35 indica que después de 36 horas de ayuno no se

aprecian cambios significativos en los niveles de mRNA de los transportadores de

ácidos grasos y de glucosa CD36 y Glut4, con el envejecimiento. Sin embargo, los

niveles se incrementan significativamente con la restricción calórica tardía (Figura 36).

Por otra parte el tránsito ayuno-alimentación produce a los 3 y 8 meses de edad un

cambio significativo en la expresión de ambos transportadores en el tejido adiposo que

no se observa a los 24 meses de edad.

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

a a

b

cab a

bb

c

aca

ac

a

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

CD

36 e

n T

AE

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0

2.5

5.0

7.5

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

Glu

t4 e

n TA

E

a

ab b

c

c

ac

ac

ac

3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0

1

2

3

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

Ade

LP

L en

TA

E

ab

ab

bab

ab

ac

ac

ac

cc

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0.0

0.5

1.0

1.5

a

a a

ab

ac

ac

ac

b b b ab

Niv

eles

rela

tivos

de

mR

NA

de

LRP

-1 e

n T

AE

c

Figura 35. Niveles basales de mRNA de CD36, Glut4, LPL y LRP-1. Efectos del envejecimiento y

el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de

cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas

entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

Page 115: Tesis fernández briones

Resultados

87

Por otra parte y aunque al inicio de este trabajo se analizaron los cambios con

el envejecimiento de la enzima LPL y del receptor de lipoproteínas LRP-1 (Tabla 7), en

la figura 35 se observa que el tránsito ayuno-alimentación disminuye la expresión de

LPL pero aumenta significativamente la de LRP-1 en el tejido adiposo de ratas de 24

meses de edad, indicando una forma alternativa de capturar los lípidos provenientes

de la dieta que podría relacionarse con mayor re-esterificación solo en condiciones de

alta glucosa y/o nutrientes en sangre.

Por otra parte la figura 36 muestra los niveles proteicos de la enzima LPL. La LPL

está presente en el endotelio capilar del tejido adiposo y cataliza la hidrólisis de los

TAG de las lipoproteínas VLDL y quilomicrones. Nuestros resultados indican que la

lipoproteína lipasa (LPL) a nivel de expresión génica aumenta con el envejecimiento y

disminuye con la restricción calórica y la realimentación a 30 minutos (tabla 7, figura

35). Sin embargo, en cuanto a nivel de expresión proteica, ocurre lo contrario,

disminuye significativamente a los 24 meses de edad y aumenta con la restricción

calórica. Por último, en las 3 edades estudiadas se observa que 3 horas después de

iniciada la realimentación, aumentan los niveles proteicos de la LPL, indicando que la

acumulación de grasas en el tejido adiposo, en general, es un proceso que se activa en

un momento determinado para ser eficiente en estados postprandiales posteriores en

el tiempo.

Page 116: Tesis fernández briones

Resultados

88

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR

AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R

3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0

1

23mAL 8mAL 24mFR24mAL 8mFR

b

b

c

Niv

eles

de

prot

eina

de

LPL

0 1 2 3 40.0

0.5

1.0

1.53m AL

LPL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

a

b

c

0 1 2 3 40.0

0.5

1.0

1.5

a

b

c

8m AL

LPL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

0 1 2 3 40.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

a

24m ALLPL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

a

a

0 1 2 3 40.00

0.25

0.50

0.75

1.00 a

b

a

8m FR

LPL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

0 1 2 3 40

1

2

a

b

c

24m FR

LPL

(30µ

g de

ext

ract

o to

tal)

Figura 36. Niveles expresión génica y proteica LPL en condición basal, y niveles de expresión

proteica de LPL en condición basal, tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e

insulina. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición,

ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos

(p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.

B

A

Page 117: Tesis fernández briones

Resultados

89

Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido adiposo

blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.

Teniendo en cuenta la importancia de la inervación del tejido adiposo blanco

para su correcta funcionalidad, en este capítulo abordamos los efectos de la infusión

ICV de leptina sobre la capacidad lipogénica y lipolítica del TAB.

Características biológicas de los animales.

Entre los efectos mejor descritos de la leptina está la reducción de la ingesta de

alimentos y del peso corporal. Los resultados de este experimento demuestraron que

en las ratas Wistar de 3 meses de edad con infusión central de leptina se produce una

disminución significativa de la ingestión de alimentos y del peso corporal así como de

los niveles de insulina en sangre con respecto al grupo PF (Gallardo y col, 2007;

Bonzón-Kulichenko y col, 2009, 2011). A continuación se abordará los efectos de la

leptina sobre la funcionalidad del tejido adiposo blanco.

3.3- Efectos de la infusión ICV de leptina en el metabolismo del tejido adiposo blanco

en ratas de 3 meses de edad. Papel del SNA en la transmisión de la señal de la

leptina.

Un aspecto importante de este trabajo consistió en demostrar que los efectos

de la infusión ICV de leptina sobre el metabolismo del tejido adiposo se producen de

forma indirecta, vía sistema nervioso autónomo y no se producen de forma directa (vía

receptor de la leptina en el TAB). Para ello llevamos a cabo 2 controles:

Tras la infusión icv de leptina, los niveles de leptina en el suero de los animales

tratados no se ven modificados (Tabla 9), lo que implica que los efectos observados

tras la realización de los experimentos con la hormona se deben a la actuación de la

hormona a través de los circuitos hipotalámicos y del sistema nervioso autónomo.

Page 118: Tesis fernández briones

Resultados

90

Tabla 9. Niveles de leptina en suero de los animales tras el tratamiento icv con leptina.

TRATAMIENTO SS PF Lep

Leptina en suero (ng/mL) 5.9 ± 0.5 a 5.4 ± 1

a 5.2 ± 0.8

a

Los resultados constituyen la media ± SEM de 6 – 10 ratas por tratamiento. Anova seguido de

test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

En segundo lugar, utilizamos como control, la medida en extractos de TAB del

estado de activación de STAT-3, el cual es un factor de transcripción, que se fosforila

en residuos de tirosina en respuesta a la activación del receptor de leptina. Como

podemos observar en la Figura 37, la fosforilación en tirosina de STAT3 en el tejido

adiposo no se modifica tras el tratamiento ICV con leptina, lo que constituye otro

indicio de que los efectos de la leptina que se observan en este tejido se producen a

través del sistema nervioso central y no por las acciones directas de la leptina sobre

sus receptores en el tejido adiposo blanco.

SS PF Lep0

1

2

3

4

a a a

ST

AT

-3-P

Y /

ST

AT

-3(U

.A)

Figura 37. Se muestran los resultados de un western-blot representativo de STAT3. Los datos

constituyen la media ± SEM 4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test Tukey. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

3.3.1- La leptina a través del SNA regula la funcionalidad del TAB y la sensibilidad a la

insulina. Resultados del test de tolerancia a glucosa.

Este ensayo se realizó con el objetivo de estudiar los efectos de la infusión

central de leptina sobre la sensibilidad global a la insulina, antes de continuar

profundizando en la influencia de la leptina sobre la capacidad lipogénica y lipolítica

del TAB.

SS PF Lep

STAT-3

p-tyr-STAT-3

Page 119: Tesis fernández briones

Resultados

91

Los resultados demuestran que la administración central de leptina aumentó de

forma significativa la sensibilidad global a la insulina. Como se observa en la Figura 38,

tras la infusión intraperitoneal de un bolo de glucosa, los animales tratados con leptina

requirieron menos insulina para bajar los niveles sanguíneos de glucosa. El ratio AUC

insulina: AUC glucosa se utilizó como un indicador de la sensibilidad global a la insulina,

en este sentido, los valores significativamente más bajos que se observan en los

animales tratados con leptina, indican un incremento notable de la sensibilidad a la

insulina.

SS PF Leptina

AUC Insulina / AUC glucosa 0.026±0.008a 0.021±0.007a 0.006±0.003 b

Figura 38. Resultados del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal. Los resultados

constituyen la media ± SEM de 3-4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test Tukey. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

3.3.2- Resultados de los ensayos de captura de glucosa en respuesta a insulina por el

TAB.

Los resultados que aquí representamos (Figura 39A), demuestran que la

administración central de leptina disminuye la sensibilidad a insulina del tejido adiposo

blanco en relación con la captura de glucosa. Como se observa en la figura, el

tratamiento con leptina central reduce la respuesta a la insulina del tejido adiposo

perirrenal, resultados similares a los descritos por Bonzón-Kulichenko, Tesis Doctoral,

2007 para el tejido adiposo epididimal. De modo que durante el tratamiento con

Page 120: Tesis fernández briones

Resultados

92

leptina, la insulina no promueve la captura de glucosa en ambos tipos de tejido

adiposo blanco, disminuyendo el contenido de grasa visceral (TAE + TAP) de los

animales tratados con leptina (Figura 39B).

Podemos apreciar también que los efectos de la leptina se producen a través

del sistema nervioso autónomo. Para demostrarlo realizamos la denervación del

sistema nervioso autónomo del tejido adiposo perirrenal. Como se observa en la figura

36A, la denervación bloquea los efectos inhibidores de la leptina sobre la captura de

glucosa por el tejido adiposo, en respuesta a la insulina.

PF PF+ins Lep Lep+ins Lep-d Lep-d+ins0

10

20

30 b

b

a a a

Cap

tura

de

[3H

]-2D

OG

por

el

TA

P (p

mol

2D

OG

/mg

tejid

o)

SS PF Lep0.0

2.5

5.0

7.5

c

ab

TA

E +

TA

P (

gram

os d

egr

asa

visc

eral

)

Figura 39. Efectos de la leptina sobre la capacidad lipogénica del tejido adiposo. A: Test de

captura de glucosa comparado con el grupo PF, ya que el grupo tratado con SS no se muestra

en esta figura. Los resultados constituyen la media ± SEM de 3-4 ratas por tratamiento. Anova

seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos

(p<0.05). B: Contenido de grasa visceral (TAE+TAP) en los animales sometidos a tratamientos

ICV leptina o ICV salino. Los resultados constituyen la media ± SEM de 6 – 10 ratas por

tratamiento. Anova seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas

entre tratamientos (p<0.05).

A

B

Page 121: Tesis fernández briones

Resultados

93

Tal y como se describió en el apartado de materiales y métodos, solo se

denervó un paquete adiposo, por esa razón, para confirmar la efectividad de la

denervación se pesaron ambos paquetes adiposos y se midió el contenido total de

norepinefrina en cada uno (inervado y denervado). Como se puede ver en la figura 40,

la denervación fue efectiva, ya que el lado denervado tiene más peso, tal y como se ha

descrito en la literatura (Kreier F y col., 2006). Por otra parte, los niveles de

norepinefrina en el paquete denervado, son significativamente menores que en el

paquete inervado por el sistema nervioso autónomo, lo que permite sugerir que, la

inervación del tejido adiposo blanco, a través del SNA y probablemente la vía

simpática, es necesaria para transmitir la señal de leptina hacia este tejido.

Intacto Denervado Intacto Denervado0.0

2.5

5.0

7.5

**

PF Lep

Pes

o de

TA

P (

g)

TAP inervado TAP denervado0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

a

ng N

E /

g d

e te

jido

Figura 40. Cambios en el peso de TAP y de los niveles de norepinefrina con la denervación. Los

resultados constituyen la media ± SEM de 3-4 ratas por tratamiento. Test T de student. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

3.3.3- Regulación de la expresión génica en el TAB por el SNA.

La tabla 10 muestra el resultado de la denervación sobre la expresión de genes

del tejido adiposo blanco. Los datos indican que la denervación disminuyó los niveles

de mRNA del factor regulador de la transcripción PGC-1α y de la hormona lipolítica

HSL, que son indicadores de tono simpático y que intervienen en la estimulación de la

vía lipolítica en este tejido. En ese sentido es importante destacar que la expresión de

estos genes está significativamente disminuida en el tejido adiposo de ratas de 24

meses de edad en ayunas de 16 horas (datos no mostrados) y de 36 horas, lo que

Page 122: Tesis fernández briones

Resultados

94

puede relacionarse con la disminución de la capacidad lipolítica de este tejido con el

envejecimiento.

Tabla 10. Estudio de expresión de genes relacionados con el tono simpático del tejido

adiposo.

GENES Inervado Denervado

HSL 1.0 ± 0.6 0.28 ± 0.05 a

PGC-1α 1.0 ± 0.09 0.8 ± 0.1 a

Los resultados constituyen la media ± SEM de 4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

3.3.4- Modificación de la capacidad lipogénica del tejido adiposo blanco por la

leptina a través del SNA.

La disminución de la capacidad lipogénica se estudió analizando la expresión de

genes implicados en la síntesis de TAG a partir de glicerol y ácidos grasos en estados de

bajos niveles de insulina y altos niveles de insulina. Para ello determinamos los niveles

de mRNA de la enzima GPDH (glicerol fosfato deshidrogenasa) y la PEPCK. (Tabla 11).

Como se puede observar la expresión de PEPCK, enzima que genera el glicerol-

3P en condiciones de ayuno (bajos niveles de insulina) para la esterificación de los

ácidos grasos se reduce significativamente con el tratamiento con leptina, mientras

que la expresión de GDPH, enzima que genera glicerol-3P en condiciones de

alimentación (altos niveles de insulina) para la síntesis de TAG, se reduce

significativamente cuando se suma el tratamiento de leptina e insulina (Tabla 11).

Tabla 11. Estudio de expresión de genes relacionados con la síntesis de glicerol-3p y de TAG en

el tejido adiposo.

SS - INS SS + INS PF - INS PF + INS LEP - INS LEP + INS

GPDH 1.0±0.2 a 0.7±0.2

a 1.9±0.07

b 1.2±0.06

a 1.8±0.2

b 0.2±0.08

c

PEPCK 1.0±0.2 a 0.5±0.01

c 1.4±0.1

b 1.0±0.2

a 1.0±0.08

a 0.15±0.2

d

Los resultados constituyen la media ± SEM de 4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

Page 123: Tesis fernández briones

Para estudiar los cambios en la funcionalidad del tejido adiposo blanco

regulada por la leptina a través del SNA, se analizaron los niveles de proteínas de las

enzimas LPL, ATGL y HSL.

La figura 41 muestra los niveles proteicos de la enzima lipasa lipoproteica (LPL).

Esta enzima se requiere para hidrolizar los TAG

de la AG en el tejido adiposo blanco que serán almacenados en forma de TAG. Como

se observa en la figura 41, el tratamiento con leptina disminuye el contenido de LPL en

el tejido adiposo con respecto al grupo PF.

Exp

resi

ón p

rote

ica

deLP

L (1

00m

g de

ext

ract

oto

tal)

Figura 41. Niveles proteicos de LPL en extracto total tras e

resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Tukey.

LPL

Β-Actina

Resultados

95

Para estudiar los cambios en la funcionalidad del tejido adiposo blanco

regulada por la leptina a través del SNA, se analizaron los niveles de proteínas de las

muestra los niveles proteicos de la enzima lipasa lipoproteica (LPL).

Esta enzima se requiere para hidrolizar los TAG-QM y los TAG-VLDL y para la liberación

de la AG en el tejido adiposo blanco que serán almacenados en forma de TAG. Como

, el tratamiento con leptina disminuye el contenido de LPL en

el tejido adiposo con respecto al grupo PF.

SS – INS / PF – INS / LEP – INS

SS- PF- L-0.0

0.5

1.0

1.5

a a

b

Niveles proteicos de LPL en extracto total tras el tratamiento ICV con leptina.

resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Actina

Para estudiar los cambios en la funcionalidad del tejido adiposo blanco

regulada por la leptina a través del SNA, se analizaron los niveles de proteínas de las

muestra los niveles proteicos de la enzima lipasa lipoproteica (LPL).

VLDL y para la liberación

de la AG en el tejido adiposo blanco que serán almacenados en forma de TAG. Como

, el tratamiento con leptina disminuye el contenido de LPL en

l tratamiento ICV con leptina. Los

resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Page 124: Tesis fernández briones

3.3.5- Incremento del tono simpático y de la capacidad lipolítica del

blanco por la leptina.

Datos de la literatura y de la primera parte del estudio de los efectos de la

leptina ICV, indican que la leptina incrementa la lipolisis del tejido adiposo blanco

(Gallardo y col, 2007). En este trabajo determinamos,

de proteína de algunas enzimas implicadas en el proceso de lipólisis. Como po

observar en las figuras 42

significativamente por la acción de la leptina.

SS- PF-0

1

2

3

a

Niv

eles

de

mR

NA

de

ATG

L en

TA

E

Figura 42. Niveles de expresión génica y proteica de ATGL tras el tratamiento ICV con leptina.

Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos

a –Ins y al control PF-Ins respectivamente.

Resultados

96

Incremento del tono simpático y de la capacidad lipolítica del

Datos de la literatura y de la primera parte del estudio de los efectos de la

leptina ICV, indican que la leptina incrementa la lipolisis del tejido adiposo blanco

En este trabajo determinamos, además, los niveles de mRNA y

de proteína de algunas enzimas implicadas en el proceso de lipólisis. Como po

observar en las figuras 42 los niveles de mRNA y proteína de la ATGL, aumentan

significativamente por la acción de la leptina.

SS – INS / PF – INS / LEP

Lep-

a,b

ATGL

SS- PF-0.0

0.5

1.0

1.5

aa

Niveles de expresión génica y proteica de ATGL tras el tratamiento ICV con leptina.

Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos

Ins respectivamente.

ATGL

Β-Actina

Incremento del tono simpático y de la capacidad lipolítica del tejido adiposo

Datos de la literatura y de la primera parte del estudio de los efectos de la

leptina ICV, indican que la leptina incrementa la lipolisis del tejido adiposo blanco

además, los niveles de mRNA y

de proteína de algunas enzimas implicadas en el proceso de lipólisis. Como podemos

los niveles de mRNA y proteína de la ATGL, aumentan

INS / LEP – INS

L-

b

Niveles de expresión génica y proteica de ATGL tras el tratamiento ICV con leptina.

Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test

Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05) respecto

Page 125: Tesis fernández briones

Resultados

97

Además en la figura 43 se observa que la disminución de la ingesta tanto en el

grupo PF como leptina produjo un incremento significativo en la masa de la enzima

HSL. Sin embargo el tratamiento con leptina incrementó significativamente los niveles

de la forma fosforilada en serina 565 de HSL, indicando que a largo plazo el aumento

de la señalización de la leptina sobre el tejido adiposo, a través del SNA, produce

inactivación de la enzima HSL, probablemente como mecanismo protector de las

reservas energéticas del organismo.

SS – INS / PF – INS / LEP – INS

SS- PF- L-0.0

0.5

1.0

1.5

Rel

ació

n P

-565

HS

L/H

SL

(100

mg

Ext

.tota

l)

a

b

a

Figura 43. Niveles proteicos de HSL en extracto total de tejido adiposo tras el tratamiento ICV

con leptina. Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova

seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos

(p<0.05) respecto a –Ins y al control PF-Ins respectivamente.

Page 126: Tesis fernández briones
Page 127: Tesis fernández briones

DISCUSIÓN

Page 128: Tesis fernández briones
Page 129: Tesis fernández briones

Discusión

99

4- DISCUSIÓN.

Como es bien sabido, el envejecimiento es un problema que nos atañe a todos,

el cual es ineludible, y provoca un deterioro progresivo del organismo, desde aumentar

la tasa de mortalidad de una especie una vez alcanzada la edad adulta, pasando por

modificar la composición bioquímica de ciertos tejidos llegando incluso a perder su

funcionalidad, y disminuyendo la capacidad de adaptación a un entorno, provocando

por tanto una mayor vulnerabilidad a las enfermedades. Por ello, hemos optado por

estudiar el comportamiento y la evolución del tejido adiposo con el envejecimiento,

puesto que tiene funciones determinantes en el mantenimiento de la homeostasis de

energía en los organismos vivos.

Por otro lado, también se decidió incluir en los experimentos el factor

producido por una restricción calórica, y los efectos que ella podría conllevar sobre el

organismo, ya que desde hace más de 70 años se sabe que la restricción calórica

retarda el envejecimiento y por lo tanto, incrementa el tiempo de vida del individuo.

Otra consecuencia de la restricción calórica es un aumento en la calidad de vida, ya

que un organismo que se somete a una dieta baja en calorías obtiene una disminución

de las enfermedades propias del envejecimiento.

Como en esta tesis se discuten las alteraciones del metabolismo y sabiendo que

los niveles tanto hormonales como de los diferentes metabolitos varían en función de

si el individuo se encuentra en un estado de ayuno, o en un estado post-prandial,

también se decidió incluir el ciclo de ayuno-realimentación en este trabajo.

La relación entre la diabetes mellitus y la adiposidad se discute en la literatura

científica desde hace más de 40 años. La diabetes mellitus y la obesidad pueden

asociarse con la resistencia a las acciones de la insulina en humanos y en roedores. En

la actualidad la resistencia a la insulina se observa en individuos con diabetes tipo 2 y

además en individuos con diabetes tipo 1 y obesidad. Se conoce que realmente, la

resistencia a la insulina resulta evidente cuando la adiposidad se acompaña de

hiperinsulinemia (Porte Jr D y col., 1970).

Page 130: Tesis fernández briones

Discusión

100

Al analizar las características generales de los animales sometidos a objeto de

estudio en este trabajo se corroboran los resultados publicados por nuestro grupo de

trabajo en diferentes ocasiones: el envejecimiento en la rata Wistar no conduce a

alteraciones de la glucemia y la insulinemia en ayunas, de este modo cuando se calcula

el índice HOMA (un indicador de resistencia a la insulina) no se observan

modificaciones que sean significativas desde el punto de vista estadístico en las ratas

de 24 meses de edad. Sin embargo, estos animales incrementan la adiposidad con la

edad y aunque son tolerantes a la glucosa, exhiben alteraciones de la sensibilidad

global a la insulina, cuando se someten a un test de tolerancia oral a glucosa y a un

clamp euglicémico-hiperinsulinémico, resistencia a la insulina que se manifiesta a

partir de los 8 meses de edad y que se desarrolla inicialmente en el tejido adiposo.

(Villar. M y col., 2006.; Escrivá F y col., 2007; Serrano R y col., 2009).

Sin embargo, para ampliar el conocimiento de la funcionalidad del tejido

adiposo y de los mecanismos que generan un estado de resistencia a la insulina con el

envejecimiento, se consideró interesante realizar un test oral de tolerancia a grasas y

por otra parte estudiar los efectos de un ayuno de 36 horas y el paso al estado de

alimentación.

Se conoce que en los minutos iniciales del estado postprandial (después de la

alimentación) se elevan en sangre los TAG en forma de TAG-QM. La vía de distribución

de estas lipoproteínas (primero conducto torácico y después circulación sanguínea)

permite descargar gran parte de los AG de los TAG de la dieta en los tejidos

extrahepáticos, entre ellos el tejido adiposo blanco. Durante el período postprandial, el

hígado sintetiza lípidos a partir de glucosa y exporta VLDL. Los TAG-LP (QM y VLDL) son

capturados y procesados por el tejido adiposo y los músculos esqueléticos. En el tejido

adiposo se esterifican al glicerol-P para formar TAG. La actividad de la enzima LPL

asociada a los capilares de estos tejidos (adiposo y muscular) así como la actividad de

los receptores de lipoproteínas LRP-1 (LDL receptor protein related-1) y LDL,

vinculados con el tejido adiposo y el hígado juegan en ello un papel fundamental.

La LPL es una enzima multifuncional producida por muchos tejidos como el

tejido adiposo, el corazón, los músculos esqueléticos, los macrófagos, que juega un

Page 131: Tesis fernández briones

Discusión

101

papel clave en la distribución de los AG y MAG derivados de las lipoproteínas

enriquecidas en TAG, los QM y las VLDL hacia los tejidos periféricos donde se

almacenan como lípidos neutros en el tejido adiposo y los macrófagos (TAG y ésteres

de colesterol) y se oxidan o almacenan como TAG en los músculos y el corazón. (Wang

H y col., 2009).

La forma LRP-1 del receptor de LDL se expresa en muchos tejidos, incluyendo el

hígado que es el sitio fundamental de aclaramiento de los remanentes de

quilomicrones. Se ha descrito que ratones deficientes del receptor LRP-1 en tejido

adiposo tienen deficiencias en la captura de TG-LP en estado postprandial, fenotipo

obeso, disminución del gasto energético y de la lipolisis del tejido adiposo. Por otra

parte ratones deficientes del receptor de lipoproteínas LRP-1 en cerebro demuestran

que LRP-1 regula la señal de leptina y la homeostasis de energía en el sistema nervioso

central. (Hofmann SM y col., 2007; Masson O y col., 2009; Liu Q y col.,2011).

En el trabajo que aquí se presenta se muestran resultados que indican que en

las ratas de 8 y 24m al consumir un bolo de grasas se elevan significativamente los TAG

y NEFA circulantes. Estos resultados apuntan a que con el envejecimiento disminuye la

capacidad del tejido adiposo blanco de almacenar la grasa exógena ya sea la

suministrada durante el test de tolerancia a grasa como la contenida en el pienso

normal de laboratorio que consumen ad limitum ya que en ambos casos, 30 minutos

después de la ingestión, el suero de las ratas de 24 meses de edad exhibe niveles

extraordinariamente elevados de TAG plasmáticos. En el caso de la ingestión de

grasas, los niveles de TAG y NEFA continúan aumentando hasta los 180 minutos

durante la carga oral de grasas, a partir de 180 minutos comienzan a disminuir y no

llegan a alcanzar los niveles basales a los 240 minutos de la carga oral, que podemos

considerar el final de un estado postabsortivo, teniendo en cuenta que la insulina ya ha

alcanzado los niveles basales. Situación similar se observa para los NEFA.

Los resultados de este trabajo indican que los niveles de mRNA de LPL están

incrementados con la edad, aunque no se observa el mismo comportamiento con los

niveles de proteína. El incremento de expresión de LPL es un indicador de disminución

de tono simpático basal del tejido adiposo, ya que la LPL disminuye su expresión en

Page 132: Tesis fernández briones

Discusión

102

respuesta a la estimulación simpática. Igualmente son indicadores de bajo tono

simpático la disminución de expresión de HSL y PGC-1α en este tejido (J Gómez-

Ambrosi y col, 2001; Hatakeyama y col., 2004). Además de la participación de la LPL,

para la captura de los ácidos grasos y de los TAG y ésteres de colesterol de las

lipoproteínas plasmáticas es importante la participación de los receptores LRP-1 (LDL

receptor protein related-1), en este trabajo se observó una disminución en la

expresión de LRP-1 con el envejecimiento. Estos resultados en conjunto, reflejan una

disfunción del tejido adiposo visceral, en relación con el aclaramiento de las

lipoproteínas plasmáticas en el estado de ayuno.

Sin embargo, en todos los animales estudiados (3-, 8- y 24-meses) observamos

que 30 minutos después de iniciar la realimentación después de un ayuno prolongado,

disminuyen significativamente los niveles de mRNA y de proteína de la LPL en el tejido

adiposo. En este sentido, podríamos sugerir que la regulación transcripcional de esta

enzima se inicia en el estado postprandial, primero tiene lugar la desregulación,

mediada probablemente por beta-adrenérgicos que estimularían la actividad de la

enzima en los músculos para después incrementar los niveles de mRNA en tejido

adiposo 3 horas más tarde en el estado postabsortivo. La insulina sería la hormona

responsable de regular la correcta actividad de la LPL en los capilares del tejido

adiposo blanco. Podría pensarse que en las ratas viejas, hay resistencia a la insulina en

las células del tejido endotelial que sumado a la resistencia a la insulina del tejido

adiposo y de algunos músculos mantiene significativamente elevados los niveles de

TAG-QM respecto a animales de 3 meses de edad. Cuando se trata de la infusión del

bolo de grasa empeora aún más el perfil lipídico del suero de los animales de 24-meses

de edad.

En el caso de LRP-1 se produce un incremento drástico de su expresión en ratas

de 24 meses en el tránsito ayuno-alimentación, demostrando que en estado

postprandial se incrementa en el tejido adiposo de ratas viejas la capacidad de

internalizar lipoproteínas plasmáticas.

Page 133: Tesis fernández briones

Discusión

103

Los estados de resistencia a la insulina se han asociado generalmente a niveles

incrementados de NEFA así como de insulina en sangre. Por una parte la

hiperinsulinemia se considera el resultado de la resistencia a la insulina de los tejidos

periféricos, y niveles altos de NEFA circulantes se asocian al aumento de la lipólisis del

tejido adiposo. (Langin D, 2006; Shulman GI y col., 2000; Wajchenberg BL, 2000). Sin

embargo, un resumen detallado de estudios desarrollados en humanos obesos entre

1990-2008 revela que la concentración de NEFA en plasma varía mucho entre

individuos e individualmente en diferentes situaciones (ayuno, realimentación, género,

dieta, etc) y no se correlaciona con la masa de tejido adiposo ni el índice de masa

corporal. (Karpe F y col., 2011). En el caso de la rata Wistar, se conoce que incrementa

su masa adiposa con el envejecimiento y presenta situaciones de hiperinsulinemia en

estado postprandial. Estos momentos de hiperinsulinemia podrían disminuir la

liberación de AGL por el tejido adiposo ya que los estudios de lipolisis en explantes

demuestran que predominan los efectos antilipolíticos de la insulina sobre los efectos

lipolíticos del isoproterenol en el tejido adiposo de ratas de 24 meses de edad.

La hiperglucemia en ayunas también es señal de resistencia a la insulina. En

este trabajo se presentan datos que apuntan a que en el estado postabsortivo la

glucemia se eleva de forma significativa en las ratas viejas, señal de incremento de

glucagón, descenso de insulina y falta de regulación de la producción hepática de

glucosa. Como en el estado postabsortivo más del 80% de la glucosa plasmática

proviene del hígado, está claro que la carga de lípidos produce resistencia hepática a la

insulina. Por lo tanto, los animales viejos son más susceptibles de desarrollar

enfermedades metabólicas derivadas de la resistencia a la insulina que los jóvenes. Sin

embargo, es posible que la leptina esté favoreciendo la homeostasis de glucosa y

lípidos de modo que muchos animales envejecen en estado prediabético.

En este sentido los resultados del test de tolerancia a grasas demuestran que

en las ratas de 24 meses de edad, los niveles de insulina aumentan de forma

significativa tras la infusión del bolo de grasa, comenzando el incremento a los 30

minutos de infundir el bolo y duplicando, a los 60 minutos, los valores observados en

animales de 3 y 8 meses de edad. En las ratas de 8 meses de edad, a pesar de

presentar niveles superiores de TAG y NEFA con respecto a las de 3 meses de edad,

Page 134: Tesis fernández briones

Discusión

104

pasadas 4 horas exhiben valores similares de glucemia, insulinemia, TAG y NEFA que

las ratas de 3 meses de edad. Sin embargo, las ratas de 24 meses de edad pasadas las 4

horas presentan hiperglucemia y niveles superiores a los basales de TAG y NEFA. Al

calcular el área bajo la curva tanto para los NEFA como para los TAG se observan

valores incrementados desde los 8 meses de edad. De modo que podemos afirmar que

la rata Wistar desarrolla intolerancia a los lípidos hiperlipemia, resistencia a la

capacidad de la insulina de mantener la homeostasis de los lípidos y como resultado de

ello hiperinsulinemia antes que se manifieste la incapacidad de la insulina de mantener

la homeostasis de la glucosa.

Además podemos afirmar que la resistencia a la insulina asociada al

envejecimiento en la rata Wistar, resulta evidente, después de ingerir un bolo de

grasa, ya que se produce hiperinsulinemia seguida de hiperglucemia. Este

razonamiento refuerza la importancia de la correcta funcionalidad del tejido adiposo

para la adecuada acción de la insulina de todo el organismo durante toda la vida. El

exceso de tejido adiposo puede tener consecuencias adversas fundamentalmente si se

alteran las actividades endocrinas e inmunológicas de este tejido. (Bays HE y col.,

2008). Realmente, la resistencia a la insulina resulta evidente cuando la adiposidad se

acompaña de hiperinsulinemia (Porte Jr D y col., 1970).

También se ha planteado en la literatura que la inanición, como tratamiento de

la obesidad, exacerba la resistencia a la insulina de los individuos obesos. (Bray GA,

1969). La introducción de un ayuno prolongado en el diseño de este trabajo nos ha

permitido demostrar que en la rata Wistar de 24 meses de edad, al igual que sucede

en humanos obesos, el ayuno prolongado (36 horas) aumenta la resistencia global a la

insulina. En este sentido, observamos que el ayuno prolongado incrementa

aproximadamente 5 veces los niveles de insulina en sangre de los animales de 24-

meses de edad, con respecto a los animales de 3-meses de edad.

Según (Arner y col, 1981), la inanición incrementa la sensibilidad a la insulina de

determinados paquetes de tejido adiposo, por ejemplo, el tejido adiposo femoral pero

no del abdominal. Por otra parte la obesidad disminuye la respuesta a la insulina del

tejido adiposo abdominal pero no afecta al femoral.

Page 135: Tesis fernández briones

Discusión

105

En humanos y en roedores, la hiperinsulinemia y la hiperglucemia en ayunas

son considerados estados prediabéticos (Bloomgarden ZT, 2008). La diabetes se

desarrolla cuando la secreción de insulina no es suficiente para compensar la

resistencia a la hormona. Los individuos que no son capaces de secretar suficiente

insulina para compensar la resistencia a insulina inducida por AGL (probablemente por

razones genéticas) terminan desarrollando T2DM. (Terauchi Y y col., 2007). La

diabetes tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina y disfunción de las células

beta del páncreas. (Kahn SE, 2003).

El término prediabetes se emplea cuando, en presencia de resistencia a la

insulina, se produce más insulina para evitar la diabetes. Pero esta situación está

relacionada con hiperglucemia en ayunas y/o intolerancia a la glucosa. La rata Wistar

no desarrolla intolerancia a la glucosa pero son resistentes a insulina (Escrivá, 2007),

en este caso, el defecto reside en la deficiente captura de glucosa en respuesta a la

insulina, por los tejidos insensibles a la acción de la hormona (tejido adiposo y en

segundo lugar algunos músculos). La resistencia periférica a la insulina es lo que

caracteriza también a individuos con intolerancia a la glucosa, mientras que la

resistencia hepática a la insulina, caracteriza a individuos con hiperglucemia en ayunas.

Podemos sugerir que el envejecimiento conduce a un estado de resistencia a la

insulina que en situaciones especiales, en las que se modifica la demanda energética, a

la alza o a la baja, puede producir hiperinsulinemia en ayunas (36h ayuno) e

hiperglucemia después de una sobrecarga de lípidos (4h después de SOG), que

correspondería a un estado postabsortivo. Como en el estado postabsortivo más del

80% de la glucosa plasmática proviene del hígado, está claro que la carga de lípidos

produce resistencia hepática a la insulina. Por lo tanto, los animales viejos son más

susceptibles de desarrollar enfermedades metabólicas derivadas de la resistencia a la

insulina que los jóvenes. Sin embargo, es posible que la leptina esté favoreciendo la

homeostasis de glucosa y lípidos de modo que muchos animales envejecen en estado

prediabético.

Page 136: Tesis fernández briones

Discusión

106

Sin embargo, en todos los animales estudiados (3-, 8- y 24-meses) observamos

que 30 minutos después de iniciar la realimentación después de un ayuno prolongado,

disminuyen significativamente los niveles de mRNA y de proteína de la LPL en el tejido

adiposo.

En este sentido, podríamos sugerir que la regulación transcripcional de esta

enzima se inicia en el estado postprandial, primero tiene lugar la desregulación,

mediada probablemente por beta-adrenérgicos que estimularían la actividad de la

enzima en los músculos para después incrementar los niveles de mRNA en tejido

adiposo 3 horas más tarde en el estado postabsortivo. La insulina sería la hormona

responsable de regular la correcta actividad de la LPL en los capilares del tejido

adiposo blanco. Podría pensarse que en las ratas viejas, hay resistencia a la insulina en

las células del tejido endotelial que sumado a la resistencia a la insulina del tejido

adiposo y de algunos músculos mantiene significativamente elevados los niveles de

TAG-QM respecto a animales de 3 meses de edad. Cuando se trata de la infusión del

bolo de grasa empeora aún más el perfil lipídico del suero de los animales de 24-meses

de edad.

El siguiente factor a tener en cuenta es el receptor nuclear PPARg. Se conoce

que PPARγ estimula la expresión del gen de LPL en el tejido adiposo y la captura de AG

por el tejido (Schoonjans y col., 1996; Semple y col., 2006). Con el envejecimiento no

se observan cambios en los niveles proteicos de PPARγ, sin embargo, estos niveles se

incrementan a las 3 horas de iniciada la realimentación o sea en el estado

postabsortivo. De este modo, podría colaborar en la acumulación de la grasa en el TAB

mecanismo que podría activarse de forma retardada, favoreciendo inicialmente la

entrada de la grasa a los músculos, el hígado y el corazón y que prepara tardíamente al

tejido adiposo para guardar el exceso de grasa que posiblemente provenga de una

comida posterior. Estos resultados preliminares van en la misma dirección descrita por

el grupo de Labbé SM y col. en el año 2011.

La captura de AG y su esterificación al glicerol para formar TAG en el TAB es un

proceso que requiere en paralelo de la captura de glucosa y su transformación en

glicerol-3P. Resultados previos del grupo han demostrado que con el envejecimiento

Page 137: Tesis fernández briones

Discusión

107

en la rata Wistar, disminuye la captura de glucosa en respuesta a la insulina, aunque

está incrementada la captura basal. Esto podría explicar que durante los primeros 30

minutos no se produzca la adecuada hidrólisis de los TAG-QM y no se estimule la

entrada de NEFA a los adipositos y su esterificación con glicerol-3P, por la menor

capacidad de las células de responder a la insulina y de capturar y transformar la

glucosa. Transcurridas 3 horas, ya en estado postabsortivo, el proceso que debe

predominar es el de síntesis de novo de glicerol y de ácidos grasos para formar TAG y

PL. Este proceso de reesterificación parece estar favorecido en el tejido adiposo de

ratas viejas (Escrivá y col, 2007) y podríamos añadir que el lactato puede ser el

precursor de glicerol (gliceroneogénesis) en estas condiciones. En este sentido es

importante destacar que durante el experimento de lipolisis en el medio de incubación

de los explantes el lactato se incrementa a los 30 minutos (probablemente como

resultado de la oxidación incompleta de la glucosa) pero disminuye a las 3 horas.

Retomando el tema de la captura de glucosa y con el objetivo de profundizar en

la capacidad del TAB de las ratas viejas de responder a la insulina incrementando la

lipogénesis, analizamos los niveles de mRNA de factores de transcripción y enzimas de

la vía lipogénica. Los resultados que aquí se presentan nos permiten afirmar que con el

envejecimiento disminuye la capacidad lipogénica del TAB, inicialmente porque

disminuye la captura de glucosa en respuesta a la insulina y en segundo lugar porque

disminuye de forma significativa la expresión de ChREBP y de sus genes diana, ACC y

FAS.

La funcionalidad del tejido adiposo es fundamental para la homeostasis de la

glucosa, los lípidos (Scherer T. y col, 2011). La disminución de la síntesis de novo de AG

en el TAB disminuye la síntesis y liberación del palmitoleato, una especie de ácido

graso con efectos sensibilizantes a la insulina (Scherer T. y col, 2011). En efecto, en el

plasma de las ratas viejas se observan una tendencia a tener niveles inferiores de este

ácido graso (4.34 ± 0.1 en ratas de 3m vs 3.0 ± 0.5 en ratas de 24m DATOS NO

MOSTRADOS). La disminución de la síntesis de novo de AG se asocia a resistencia a la

insulina. No obstante, a los 30 minutos de la realimentación no se observan cambios

en la expresión de ChREBP, factor que está regulado fundamentalmente por glucosa.

Page 138: Tesis fernández briones

Discusión

108

Gran parte de los estudios realizados en esta tesis iban dirigidos a analizar los

cambios en la capacidad lipolítica del tejido adipsoso con el envejecimiento. La lipólisis

es el proceso de hidrólisis de los TAG almacenados en los diferentes depósitos grasos

del organismo para liberar NEFA y glicerol. Aunque se conocen muchos aspectos de la

bioquímica de la lipólisis, los mecanismos que estimulan este proceso y los que utiliza

la insulina para inhibirlo no se están totalmente esclarecidos. Algunos trabajos

sugieren que la función de la insulina en humanos es la de controlar la lipólisis basal

(Jocken JW y col., 2007). Así como que la lipólisis basal está elevada mientras que la

inducida por catecolaminas está suprimida en humanos y roedores obesos. La lipólisis

en humanos y roedores está regulada por las enzimas: ATGL, HSL y MGL.

No obstante, en condiciones normales, se observa en el tejido adiposo de ratas

viejas disminución del tono simpático (menor expresión de HSL y PGC-1α). Debemos

comenzar el análisis de la lipólisis en el envejecimiento destacando que la expresión de

HSL y de PGC-1α está significativamente disminuída en el TAB de las ratas viejas. Bajos

niveles de expresión de HSL y PGC-1α demuestran bajo tono de los nervios simpáticos

que inervan el tejido adiposo (Gómez-Ambrosi y col, 2001; Hatakeyama y col., 2004).

La LPL del TAB se desregula por estimulación simpática a través de receptores

b-adrenérgicos. Además, la expresión de la enzima limitante del proceso lipolítico, la

ATGL, también está disminuída en un 50% en el TAB de la rata vieja. Para corroborar

que es la disminución del tono simpático lo que disminuye la capacidad lipolítica del

TAB analizamos el estado de activación del factor regulador de la transcripción CREB,

que se activa por la enzima PKA, la quinasa que se estimula por incremento del tono

simpático. Los resultados que aquí se muestran indican que a los 24m los niveles de

CREB son significativamente inferiores a los de animales jóvenes. Sin embargo están

incrementados los niveles de la AQP7, un canal de glicerol que puede favorecer la

salida y entrada de este metabolito a la célula, tejido en el que la expresión de glicerol

quinasa es baja.

Sin embargo, los niveles de perilipina no se modifican con el envejecimiento.

Por esa razón estudiamos mediante fraccionamiento celular el movimiento de

proteínas y enzimas lipolíticas entre diferentes fracciones subcelulares, incluyendo la

Page 139: Tesis fernández briones

Discusión

109

gota lipídica. En nuestras manos, en las ratas viejas está disminuída la lipolisis basal así

como la lipolisis mediada por el SNA.

Es interesante destacar que los niveles proteicos de ATGL y de HSL aumentan

de forma significativa a las 3h del inicio de la realimentación, es decir previo al estado

de ayuno, para garantizar la lipólisis basal de los TAG almacenados en el tejido

adiposo. En ayuno prolongado, la inhibición de la lipólisis por la insulina no aumenta

cuando se añaden agentes lipolíticos e insulina. Según los resultados de los estudios

realizados en los explantes a los 8m predomina el efecto del ISO sobre la hidrólisis de

los TAG en ayunas y durante la realimentación. A los 24m en ayuno prolongado

predomina el efecto antilipolítico de la insulina. Después de 30 minutos de

realimentación se bloquean los efectos de ISO, probablemente porque predomina el

efecto antilipolítico de la insulina.

Los lípidos se almacenan en un tipo especial de organelo llamado gota lipídica,

sin embargo los estudios en gota lipídica son escasos, de hecho se piensa que se forma

a partir del retículo endoplásmico por un mecanismo que aún no está descrito. No

obstante nos planteamos como hipótesis de trabajo la siguiente: Con la edad se

producen cambios en la composición y metabolismo de la gota lipídica en el tejido

adiposo blanco. Estos cambios van a estar relacionados con desórdenes del

metabolismo energético como la obesidad y la esteatosis hepática.

En este trabajo analizamos los niveles de determinadas proteínas que de alguna

manera están relacionadas con los procesos que tienen lugar en la superficie de la gota

lipídica, la formación de la gota lipídica y la hidrólisis de los lípidos almacenados en la

gota lipídica. El estudio lo hemos realizado en animales de diferentes edades en estado

de ayuno y alimentación.

Los resultados de nuestro trabajo nos permiten corroborar que en la medida en

que los animales envejecen se mantiene la homeostasis de la glucosa pero se pierde la

capacidad de controlar la liberación de TAG-VLDL por el hígado. Sin embargo los

niveles circulantes basales de NEFA y glicerol no se modifican con el envejecimiento, lo

cual podría ser interpretado como una correcta señalización de la insulina

Page 140: Tesis fernández briones

Discusión

110

A la vista de los resultados que aquí se presentan podríamos afirmar que a

partir de los 8 meses de edad los animales requieren más insulina para capturar

glucosa y ácidos grasos libres y provenientes de los TAG-QM y TAG-VLDL, además de

glucosa como se ha descrito con anterioridad (Escrivá y col, 2007). Como los niveles

circulantes de glucosa y NEFA no se alteran, la insulina consigue mantener niveles

normales de dos metabolitos conocidos por producir glucotoxicidad así como

lipotoxicidad y lipoapoptosis.

Se ha acuñado el término lipotoxicidad para describir el efecto dañino que

provoca la elevación crónica de los AGL sobre la secreción de insulina en las células b

del páncreas y otros tejidos. Se plantea que el exceso de lípidos promueve la

formación de especies lipídicas químicamente reactivas que alteran la funcionalidad

metabólica de las células, conduce a la muerte celular y por consiguiente al deterioro

de los órganos y tejidos (Unger RH y col., 2001; Kusminski CM y col., 2009; Unger RH y

col., 2010; Vidal-Puig A y col., 2010). De modo que la homeostasis de glucosa y NEFA

en la rata Wistar, se mantiene a costa de transformarles respectivamente en TAG, una

clase de lípidos menos activa y perjudicial. En este sentido, la elevación de los niveles

circulantes de TAG a la edad de 8 meses es ya un indicador de acumulación de lípidos

en tejidos no adiposos (corazón, hígado, músculos esqueléticos, páncreas) por falta de

funcionalidad de determinados paquetes de tejido adiposo blanco.

Esta compensación fisiológica puede no funcionar en situaciones

comprometidas, cuando la demanda de energía es diferente al estado basal. Por

ejemplo después de la SOG la hiperinsulinemia no evita la aparición de hiperglucemia

en estado postabsortivo en la rata vieja. Por otra parte, después de 36 horas de ayuno,

una situación que incrementa la hidrólisis de los TAG del tejido adiposo, se observa

hiperinsulinemia en las ratas de 24m. En paralelo se observan valores de glucemia

ligeramente superiores a los que presentan animales de 3 y 8 meses de edad. Los

niveles de TAG se mantienen elevados pero no aumentan los de NEFA, que son

inferiores a los observados a los 3m.

Page 141: Tesis fernández briones

Discusión

111

Estos resultados implican que: 1- En la rata vieja el tejido adiposo responde

peor al estrés del ayuno, liberando menos NEFA o que el bloqueo de la lipólisis por la

insulina, en la rata Wistar, se consigue con menos cantidad de insulina. 2- En la rata

vieja está afectado el eje hipotálamo-tejido adiposo. 3- El bloqueo de la liberación de

glucosa en la rata Wistar requiere mayor cantidad de insulina que el bloqueo de la

lipólisis del tejido adiposo.

Los resultados del experimento indican que los niveles de glucosa y TAG

tienden a aumentar en las ratas viejas respecto a los valores observados en ratas de

3m ayunadas. Sin embargo, los niveles de NEFA son superiores a los 8m respecto a 3m

y 24m. Se ha sugerido que la sensibilidad a la insulina y la lipólisis basal en humanos,

están estrechamente vinculadas tanto cuando la lipólisis es normal como cuando está

acelerada como ocurre con la obesidad y la diabetes (Arner and col, 1981) y que en

este mecanismo deben intervenir acciones que tienen lugar a nivel del receptor de

insulina y acciones que tienen lugar tras el receptor de insulina.

Por otra parte, estos autores observan que la inhibición de la lipólisis basal por

la insulina no aumenta cuando se incrementa la lipólisis basal mediada por

noradrenalina (NA), por el hecho de que cuando se incuba el tejido adiposo con NA u

otro agente lipolítico, la hidrólisis de los TAG no es completa y se acumulan DAG y

MAG, mientras que en la lipólisis basal, la hidrólisis de los TAG es completa a AGL y

glicerol. Además cuando se aíslan adipocitos, el tratamiento con colagenasa altera la

lipólisis basal y los efectos de las catecolaminas y de la insulina. Cuando se incuban los

explantes con dosis altas de insulina, la lipólisis basal disminuye pero la estimulada por

NA aumenta. Por esa razón se realizó un estudio de la lipólisis exvivo, empleando

explantes de tejido adiposo visceral que fueron incubados un período de tiempo de 3h

con el agente lipolítico isoproterenol. Además de haberlo realizado en adipocitos.

Los resultados muestran que los efectos antilipolíticos de la insulina disminuyen

a los 8m, pero no están alterados a los 24m. Cuando se incuban los explantes de tejido

adiposo de ratas con ISO la lipólisis, medida a través de la liberación de glicerol,

aumenta y cuando se incuban con ISO más dosis altas de insulina, la lipólisis basal

disminuye pero la estimulada por ISO aumenta a los 8 meses de edad. Resultados

Page 142: Tesis fernández briones

Discusión

112

similares se han encontrado en estudios realizados en humanos (Arner and col, 1981),

y en ratas (Desai KS y col., 1973). Se ha sugerido que la sensibilidad a la insulina y la

lipólisis basal en humanos, están estrechamente vinculadas tanto cuando la lipólisis es

normal como cuando está acelerada como ocurre con la inanición, la obesidad y la

diabetes (Arner and col, 1981), sin embargo estos autores sugieren que los efectos

antilipolíticos de la insulina no son los que median la resistencia a la insulina en la

obesidad.

Con el envejecimiento la rata Wistar desarrolla resistencia global a la insulina y

disminución de la captura de glucosa en respuesta a la insulina en primer lugar en el

tejido adiposo blanco. En situación de ayuno prolongado, que se ha asociado

normalmente a incremento de la lipólisis, nuestros datos indican que, en las ratas

viejas aumentan los niveles circulantes de insulina y no se incrementa la lipólisis. En

este sentido las acciones antilipolíticas de la insulina no parecen estar alteradas en las

ratas viejas de 24m, ya que en situación de hiperinsulinemia (ayuno 36h), los niveles

de glicerol en los medios de incubación de los explantes son inferiores a los

observados en ratas de 3m y de 8m. En esas condiciones además, los niveles proteicos

de las hormonas HSL y ATGL disminuyen con el envejecimiento.

Nuestros resultados corroboran la hipótesis planteada por Arner y col, 1981

pero aplicado al envejecimiento, sugerimos que los efectos antilipolíticos de la

hiperinsulinemia bloquean la lipólisis y no aceleran la resistencia a la insulina durante

el envejecimiento. Ya que la señalización temprana de insulina es similar en las ratas

de 8- y 24-meses ( ), los resultados indican la participación de algún factor

autocrino/paracrino del TAB visceral en la potenciación del efecto anti-lipolítico de la

insulina con el envejecimiento, lo que podría contribuir al incremento en la adiposidad

observada en estos animales con la edad.

La lipolisis basal y la expresión de los genes lipolíticos como HSL y ATGL se

incrementan de forma significativa en las ratas sometidas a restricción calórica y se

inducen en la transición ayuno-realimentación en las ratas alimentadas ad-libitum

mientras que se inhibe en las ratas con restricción nutricional, lo que sugiere una

Page 143: Tesis fernández briones

Discusión

113

adaptación metabólica diferencial en la regulación de las reservas energéticas del

tejido adiposo visceral.

Cuando los animales son realimentados y por consiguiente se incrementan los

niveles de insulina en sangre a los 30 minutos de la realimentación, el glicerol continúa

elevado en sangre. A las 3 horas, los niveles de insulina de las ratas de 24m son

significativamente superiores a los observados en las ratas de 8m. En efecto la

inanición exacerba el estado prediabético en las ratas viejas. Las ratas viejas son

prediabéticas. El término prediabetes se emplea cuando, en presencia de resistencia a

la insulina, se produce más insulina para evitar la diabetes. Pero esta situación está

relacionada con hiperglucemia en ayunas y/o intolerancia a la glucosa. La rata Wistar

no desarrolla intolerancia a la glucosa pero son resistentes a insulina (Escrivá, 2007),

en este caso, el defecto reside en la deficiente captura de glucosa en respuesta a la

insulina, por los tejidos insensibles a la acción de la hormona (tejido adiposo y en

segundo lugar algunos músculos). La resistencia periférica a la insulina es lo que

caracteriza también a individuos con intolerancia a la glucosa, mientras que la

resistencia hepática a la insulina, caracteriza a individuos con hiperglucemia en ayunas

(Abdul-Ghani, 2006).

La disfunción del TAB juega un importante papel en la patogénesis de la

obesidad y de la diabetes tipo 2 y hemos indicado hasta el momento que la

disfuncionalidad del tejido adiposo con el envejecimiento podría estar mediada por

una menor inervación del sistema nervioso autónomo. Para demostrar la importancia

de la inervación autonómica y de la correcta señalización central de la leptina, una

adipoquina que regula la actividad del SNA, se finalizó la tesis estudiando los efectos

de la leptina y la denervación sobre la regulación del metabolismo del tejido adiposo

blanco en ratas de 3 meses de edad.

En este trabajo demostramos que la administración ICV de leptina en ratas

wistar de 3 meses de edad regula la lipólisis y la lipogénesis del TAB. Concretamente

aumenta la lipólisis y disminuye la lipogénesis, con lo cual se reduce la masa del TAB.

En este sentido se sugiere que mejora la funcionalidad del tejido adiposo blanco y su

capacidad de regular la homeostasis de la glucosa y los lípidos. Una de las funciones

Page 144: Tesis fernández briones

Discusión

114

principales de este tejido es la de liberar AGL a la circulación en condiciones en las que

se incrementa la demanda de energía como es el estado de ayuno. En este sentido, los

resultados que aquí se presentan demuestran que la leptina actuando a través de

circuitos neuronales interviene en la adaptación al estado de ayuno, incrementando la

liberación de AGL del TAB.

La lipólisis del TAB y la consiguiente liberación de AGL a la circulación es un

proceso en el que participan fundamentalmente 3 enzimas: la ATGL, la HSL, y la MGL.

Siendo las 2 primeras las que impulsan verdaderamente la lipólisis de los TAG. En este

sentido la infusión de leptina estimula la expresión de los genes que codifican para

ATGL y los niveles proteicos de ATGL y HSL y del transportador de glicerol AQ7 (datos

no mostrados). Sin embargo 7 días de tratamiento con leptina incrementa la forma

menos activa de la HSL, indicando un posible mecanismo de protección contra el

exceso de lipolisis.

Los estudios de denervación del tejido adiposo resultan útiles para estudiar la

importancia de la regulación metabólica de este tejido por el SNA. La denervación

puede ser quirúrgica o química. La denervación quirúrgica (la que implica el corte de

un nervio) permite denervar un solo paquete adiposo de modo que el otro paquete

constituye el control inervado, tiene como inconveniente que no es selectiva porque

se ven afectados tanto los nervios autonómicos como sensores (que van juntos), de

modo que la denervación quirúrgica reduce la inervación simpática y sensorial. Por el

contrario, la denervación química (con agentes químicos como guanethidine o 6-

hidroxi-dopamina), es una denervación global por eso no la empleamos en este

estudio. Numerosas evidencias (Barntness y col, 2007) indican que la inervación

simpática del TAB es la principal vía que regula la movilización de los lípidos y que

tanto la vasculatura como los adipositos están inervados. Mientras que otros autores

(Keier F y col, 2006) sugieren que al TAB también lo inerva el parasimpático.

Sin embargo, es importante destacar que los diferentes paquetes adiposos se

comunican a través del SNC, de modo que el SNC integra la información proveniente

de cada paquete adiposo a través de las fibras sensoriales (aferentes) y las simpáticas

eferentes para elaborar una respuesta única que llega a los paquetes adiposos por la

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Discusión

115

vía del simpático. Por esta razón en determinadas condiciones en las que se denerva

un paquete adiposo, se produce el agrandamiento compensatorio de los paquetes

adiposos intactos. (Harris RB, 2012).

La leptina regula la ingesta de alimentos, el metabolismo y el estado

neuroendocrino, a través de circuitos hipotalámicos. Se conoce que la leptina

disminuye el apetito y el peso corporal en parte mediante la activación del sistema

nervioso simpático, aumentando la termogénesis y la liberación de la energía

(Elmquist JK, 2001). El núcleo PVN del hipotálamo está constituído por diferentes

secciones que regulan las actividades neuroendocrinas, el comportamiento y las

actividades autonómicas involucradas en el control homeostático del balance

energético. Estas secciones reciben señales de las neuronas del núcleo arcuato en

forma de los neuropéptidos AgRP (orexigénico) y POMC (anorexigénico). La leptina

dirige las señales específicas que debe recibir el PVN del ARC contribuyendo a la

regulación del balance energético. (Bouyer K y col., 2013).

El empleo del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal nos permitió estudiar,

de manera global, la capacidad de la leptina de regular la homeostasis de glucosa y por

lo tanto de incrementar la sensibilidad a la insulina. Se conoce que las neuronas POMC

del hipotálamo sensan los niveles de glucosa del organismo (Parton LE y col., 2007). Sin

embargo no se ha establecido aún en qué sitios y qué mecanismos permiten sensar los

niveles de lípidos o ácidos grasos y de qué forma su funcionamiento contribuye al

desarrollo de obesidad (Caspi L y col., 2007).

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CONCLUSIONES

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Conclusiones

117

5- CONCLUSIONES.

La acumulación del exceso de energía en el tejido adiposo de la rata Wistar se

activa de forma retardada, favoreciendo inicialmente la entrada de la grasa a los

músculos, el hígado y el corazón y preparando tardíamente al tejido adiposo para

guardar el exceso de grasa que posiblemente provenga de una comida posterior.

Después de un ayuno de 16 horas los niveles circulantes de NEFA y glicerol,

glucosa e insulina no se modifican con el envejecimiento, esto podría ser interpretado

como una correcta señalización de la insulina, en esas condiciones. Sin embargo se

observa hipertrigliceridemia.

La infusión aguda de lípidos agudiza la hipertrigliceridemia, aumenta los niveles

de NEFA y glicerol en sangre desde los 8 meses, aumenta la insulinemia en 8 y 24

meses y produce hiperglucemia en estado postabsortivo a los 24 meses.

En la rata Wistar como en humanos el aumento de la trigliceridemia en estado

postprandial jugar un importante papel en el desarrollo de enfermedades metabólicas

como la esteatosis hepática y sus complicaciones, la aterosclerosis y enfermedades

cardiovasculares como de la diabetes tipo 2.

La ingestión de grasas de forma aguda empeora la resistencia a la insulina con

el envejecimiento, produciendo hiperglucemia e hiperinsulinemia en ayunas de modo

que aumenta la susceptibilidad de las ratas viejas de desarrollar enfermedades

metabólicas derivadas de la resistencia a la insulina.

El ayuno prolongado produce hiperglucemia e hiperinsulinemia en los animales

de 24-meses de edad, con respecto a los animales de 3-meses de edad, aumentando la

resistencia a la insulina.

Las situaciones de estrés energético ayuno prolongado e ingestión de grasa de

forma aguda, empeoran el estado de resistencia a la insulina en la rata vieja.

A la vista de los resultados que aquí se presentan podríamos afirmar que a

partir de los 8 meses de edad los animales requieren más insulina para capturar

glucosa y ácidos grasos libres y provenientes de los TAG-QM y TAG-VLDL.

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Conclusiones

118

En la rata Wistar, la insulina consigue mantener niveles normales de dos

metabolitos conocidos por producir glucotoxicidad así como lipotoxicidad y

lipoapoptosis con el envejecimiento (glucosa y NEFA).

Con el envejecimiento se observa resistencia a la insulina del tejido endotelial

que sumado a la resistencia a la insulina del tejido adiposo y de algunos músculos

mantiene significativamente elevados los niveles de TAG-QM respecto a animales de 3

meses de edad.

Con el envejecimiento se observa una disfunción del tejido adiposo visceral, en

relación con el aclaramiento de las lipoproteínas plasmáticas por parte de este tejido

en estado de ayunas.

Con el envejecimiento disminuye la capacidad lipogénica del TAB, porque

disminuye la captura de glucosa en respuesta a la insulina y en segundo lugar porque

disminuye de forma significativa la expresión de ChREBP y de sus genes blanco, ACC y

FAS.

De modo que la homeostasis de glucosa y NEFA en la rata Wistar, se mantiene a

costa de transformarles respectivamente en TAG, la elevación de los niveles

circulantes de TAG a la edad de 8 meses es ya un indicador de acumulación de lípidos

en tejidos no adiposos por falta de funcionalidad de determinados paquetes de tejido

adiposo blanco. Esta compensación fisiológica puede no funcionar en situaciones

comprometidas, cuando la demanda de energía es diferente al estado basal.

En la rata vieja el tejido adiposo responde peor al estrés del ayuno, liberando

menos NEFA o que el bloqueo de la lipólisis por la insulina, en la rata Wistar, se

consigue con menos cantidad de insulina.

El bloqueo de la liberación de glucosa en la rata Wistar requiere mayor cantidad

de insulina que el bloqueo de la lipólisis del tejido adiposo.

Con el envejecimiento disminuye el tono simpático del tejido adiposo visceral,

disminuye la capacidad lipolítica y de reesterificación en estado de ayunas.

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Conclusiones

119

La capacidad lipolítica basal del tejido adiposo blanco visceral está disminuida

con el envejecimiento, siendo de especial relevancia la disminución del contenido de

las enzimas lipolíticas ATGL y HSL, de la proteína perilipina.

La disminución de la masa magra del viejo estimularía la lipolisis y conduciría a

pérdida progresiva de peso corporal. En este sentido la menor capacidad lipolítica del

tejido adiposo protegería de la eliminación de estas reservas y compensaría la falta de

tejido magro en el envejecimiento.

En estado postprandial se incrementa la capacidad de captura de lípidos de las

lipoproteínas circulantes y la esterificación a glicerol-3P proveniente de la oxidación de

la glucosa a lactato.

La inervación del tejido adiposo blanco es importante para la correcta

funcionalidad de este tejido. La denervación disminuye la capacidad lipolítica del

paquete adiposo denervado.

La leptina a través de circuitos neuronales estimula la lipolisis y disminuye la

lipogénesis, bajando el contenido de grasa acumulada en el organismo y aumentando

la sensibilidad global a la insulina.

El tratamiento crónico con leptina intracerebroventricular aumenta el

contenido de ATGL y HSL en el tejido adiposo pero atenúa el estado de activación de la

enzima lipolítica HSL siendo éste un posible mecanismo de protección contra el exceso

de lipolisis.

La hiperleptinemia sostenida en el tiempo podría estar implicada en la

disminución de la capacidad lipolítica del tejido adiposo observada con el

envejecimiento.

La leptina, al favorecer la homeostasis de glucosa y lípidos en el organismo,

interviene en el hecho de que la rata Wistar envejezca en estado prediabético.

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