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Evaluación de la eficacia deMetarhizium anisopliae y Beauveria bassiana

en el control de picudos asociadoscon la vid, utilizando

activadores de patogenicidad

1. 2. Jefe de laboratorio Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co / Jefe de producción Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co

3. Gerente General Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co

1 2 3Eliana Andrea Rincón , Carlos Andrés Montoya , Carlos Aníbal Montoya

Palabras clave: Picudos, Compsus spp. Vid, Plagas, Entomopatógenos, Beauveria, Metarhizium, Activadores de Patogenicidad, Biocontrol.

Resumen

En evaluaciones realizadas en cultivos de la vid, se ha determinado la presencia del picudo de los cítricos C o m p s u s s p p . ( C o l e o p t e r a : Curculionidae) en poblaciones que sobrepasan el umbral de daño económico, causando un marcado retraso en el crecimiento, la disminu-ción del tamaño y calidad del fruto, y como consecuencia una pérdida de producción de las plantas infestadas. Con el objetivo de buscar alternativas biológicas eficientes para el control de Compsus spp. en cultivos de la vid, con alternativas de aumento de la patogenicidad y virulencia de hongos entomopatógenos, se evaluó la eficacia de una cepa de Metarhizium anisopliae y de Beauveria bassiana

nes de este estudio se demuestra la eficacia de las cepas de M. anisopliae y B. bassiana en el control de picudos de la vid y el aumento de la virulencia al suplementar el medio de cultivo con activadores de patogenicidad, siendo una alternativa biológica eficaz, económica y sin impactos

Abstract

Phytosanitary evaluations per-formed in vine crops of Top Fruit Co. in Yumbo Va l l e , de te rm ined the presence of Compsus sp. (Coleoptera: Curculionidae) in populations exceed the economic threshold, causing a marked growth retardation, decreased fruit size and quality, and therefore a loss of efficiency of of infested plants. With the goal of finding effective biological control against Compsus spp. In vine crops, so as alternatives that increase the pathogenicity and virulence of entomopathogenic fungi, the efficacy of Metarhizium anisopliae

sobre picudos capturados en la empresa Top Fruit de la vereda San Marcos en el municipio de Yumbo Valle. Se inocularon cepas de los hongos cultivados en PDA, PDA enriquecido con bioproteina (BP) y PDA enriquecido con sustrato proteico (SP). Se encontraron diferencias estadísticas significativas en el porcentaje de mortalidad de adultos de Compsus spp., de acuerdo con la prueba de Tukey al nivel del 5%, entre el tratamiento control y los demás tratamientos. Las diferencias en cuanto al porcentaje de parasitismo o porcentaje de insectos con el hongo esporulado estuvieron a favor de los tratamientos M. anisopliae + PDA + BP y M. anisopliae + PDA con porcentajes por encima del 70%, seguido de los tratamientos B. bassiana + PDA + BP, M. anisopliae + PDA + SP y B. bassia-na + PDA con porcentajes entre 58,4 y 64,0%. En el tratamiento control, el porcentaje de insectos parasitados por hongos fue cero. Bajo las condicio-

was eva luated and Beauver ia bassiana on Compsus spp. Adult insects were inoculated with fungi grow in culture medium PDA, PDA enriched bioprotein (BP) and PDA enriched with protein substrate (SP). Results were, satistically different in mortality rate, according to the Tukey test at the level of 5%, between check treatment and treatments per se. The differences in the percentage of parasitism of insects by fungus sporulated favored treatment M. anisopliae + PDA + BP and M. anisopliae + PDA with percentages above 70%, followed by B. bassiana treatments + PDA + BP, PDA + M. anisopliae and B. bassiana SP + PDA with percentages between 58,0 and 64,0%. In the control treatment, the percentage of insects parasitized by fungi was zero. Under the conditions of this study the efficacy of the fungus M. anisopl iae and B. bassiana in controll ing vine weevil and the increased virulence by supplementing the culture medium with pathogenicity activators was demonstrated to be an effect ive biological al ternative, economical and low environmental impacts.

Introducción

Evaluaciones realizadas en cultivos de Vid, han permitido determinar la presencia del Picudo de los Cítricos C o m p u s s p p . ( C o l e o p t e r a : Curculionidae) en poblaciones que sobrepasan el Umbral de Daño Económico, causando un marcado retraso en el crecimiento, la disminu-ción del tamaño y calidad del fruto, y en el peor de los casos muerte de las plantas, ya que al atacar el sistema de raíces, las barrenan siendo la puerta de entrada de hongos patógenos, los cuales son habitantes naturales del suelo.

Las larvas eclosionadas de los más de 3500 huevos ovipositados por una hembra durante su ciclo, caen al suelo en donde se alimentan afectando todo el sistema radical, siendo el estado más dañino del ciclo biológico de la plaga (Montoya, 2001; Roa et al, 2005). Adicional al daño directo, las

Clarkson y Charnley (1996), afirman que la producción de enzimas que degradan la cutícula de insectos plaga al momento de la inoculación, es estimulada al adicionar al medio de cultivo activadores de patogenicidad.

Raymomd et al (2004), al estudiar la actividad biocontroladora de dos aislamientos de Metarhizium anisoliae sobre la garrapata Boophilus microlus, concluye que el uso de activadores de patogenicidad durante la fase de cultivo es un proceso que asegura un mejor efecto biocontrolador de los hongos sobre la garrapata.

Teniendo en cuenta lo anterior y con el fin de buscar alternativas biológicas eficientes para el control de Compsus spp. en cultivos de Vid, y de alternati-vas que incrementen la patogenicidad y la virulencia de las cepas de Sanoplant, se evaluó la eficacia de M e t a r h i z i u m a n i s o p l i a e y d e Beauveria bassiana sobre el control de picudos (Compsus spp), utilizando activadores de patogenicidad; para lo cual, fueron inoculados adultos de Compsus spp. colectados en plantas de Vid, con cepas de los hongos entomopatógenos crecidos en los medios de cultivo PDA, PDA enrique-cido con bioproteina (BP) y PDA enriquecido con sustrato proteico (SP).

Objetivo

Evaluar la eficacia de cepas M e t a r h i z i u m a n i s o p l i a e y d e Beauveria bassiana sobre el control de picudos de la Vid Compsus spp, utilizando activadores de patogenici-dad.

Objetivos Específicos

Evaluar la patogenicidad y virulencia de cepas de Metarhizium anisopliae y de Beauveria bassiana de Sanoplant, sobre picudos asociados a cultivos de Vid.

Determinar la eficacia de activado-res de patogenicidad sobre cepas de M e t a r h i z i u m a n i s o p l i a e y d e

lesiones en la raíz favorecen la entrada de microorganismos patóge-nos como son Ceratocystis spp., Rosellinia spp., Phytophthora spp. y Pythium spp. ( Montoya, 2000, Perez, 2000; Peñaloza y Díaz, 2004; Roa et al., 2005). Los adultos emergen a la superficie en donde se alimentan de brotes y frutos tiernos, reduciendo la capacidad fotosintéticamente activa de la planta y depreciando la calidad del fruto (Cano et al., 2002; Roa et al., 2005). El mayor daño causado por los adultos de Compsus spp. es que al alimentarse de las hojas, se favorece la entrada favorece la entrada de microorganismos patógenos, siendo Colletotrichum spp. uno de los de mayor importancia económica, debido a que causa grandes defoliaciones, caída de flores y daños en frutos (Montoya, 2000- Montoya 2001).

Reportes de literatura registran la eficiencia de los hongos entomo-patógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en el control de adultos e inmaduros de Compsus spp. (Peñaloza y Díaz, 2004; Bustillo, 2008, Montoya, 2001 y Orozco, 2011).

De igual manera se reporta que la virulencia de hongos entomopatóge-nos se incrementa con el enriqueci-miento del medio de cultivo, debido a los nutrientes ofertados y a la induc-ción de enzimas requeridas para la patogenicidad.

Smith y Grula (1981) han evaluado el integumento de insectos como fuente de nutrición de hongos.

Gonzales et al (2001) y Elsufty (1983), encontraron que aislamientos de Beauveria bassiana incrementaron su patogenicidad significativamente cuando se subcultivaron en medio suplementado con integumento, manteniendo estas características después de varias transferencias en medios de cultivo sin los insectos. Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Villamizar et al (2001), al suplementar con alas y patas de langosta el medio para el crecimiento de Metarhizium anisopliae.

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Investigación

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Beauveria bassiana de Sanoplant. Seleccionar el tratamiento que favorezca la patogenicidad y/o virulencia de los hongos entomopató-genos evaluados.

Diseño Experimental

Se evaluaron seis tratamientos que c o r r e s p o n d e n a d o s h o n g o s Metarhizium anisopliae cepa SMa27 y Beauveria bassiana cepa SBb66; y tres sustratos: PDA, PDA + bioprotei-na (BP), y PDA + sustrato proteínico (SP); más un tratamiento control: ADE. Por cada tratamiento se tuvieron 5 repeticiones, con 5 insectos o unida-des de observación, bajo un diseño completamente aleatorio (DCA). Los tratamientos se enumeraron de la manera que a continuación se des-cribe:

Empresa Top Fruit de la vereda San Marcos en el municipio de Yumbo, se des in festaron mediante la inmersión en hipoclorito de sodio al 0,1% y

doble inmersión en agua destilada esterilizada (Figura 1).

Los insectos se inocularon mediante inmersión durante 3 minutos en una suspensión del hongo a una concen-

7tración de 1x10 conidias/ml, y se ubicaron en cajas de Petri desecha-bles, con un papel filtro en la base humedecido con 350 µl de ADE. Las cajas se sellaron con vinipel y se llevaron a incubación a ± 24,7ºC y ± 37% de humedad. Cada dos días se evaluaron el número de insectos vivos, muertos y con el hongo esporu-lado, datos que al relacionarse y multiplicarse por 100 arrojan el valor del porcentaje de mortalidad y del porcentaje de esporulación, variables que demuestran la patogenicidad y la virulencia del inóculo y la eficiencia de los activadores de patogenicidad.

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Tratamiento

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Descripción

M. anisopliae + PDA + BP

M. anisopliae + PDA

M. anisopliae + PDA + SP

B. bassiana + PDA + BP

B. bassiana + PDA

B. bassiana + PDA + SP

Control

Metodología

El PDA se preparó al 3,9%. La concen-tración de la BP se hizo de acuerdo a lo reportado por Clarkson et al (1996)

33,3x10-3 g/cm ; teniendo en cuenta que fueron 6 cajas, y que el área de la

2caja es de 78,54 cm , se adicionaron 1,55 g a los 90 ml de PDA. Del SP se adicionaron 1 ml a los 90 ml de PDA.

La siembra de los hongos se hizo mediante el paso de alícuotas con una aguja microbiológica a partir de las cepas puras crecidas en medio de cultivo PDA. Las cepas sembradas fueron Bb66 de Beauveria bassiana y Ma27 de Metarhizium anisopliae. Las cajas fueron selladas con vinipel e incubadas a ± 24,7ºC y ± 37% de humedad relativa.

Los insectos colectados en la

Tabla 1. Descripción de los tratamientos

Figura 1. Desinfestación de picudos.a. inmersión en hipoclorito de sodio al 0,1%;b. inmersión en agua destilada estéril

a

b

a

b

c

Resultados

La mortalidad inició a los 4 días después de la inoculación (ddi) en todos los tratamientos. En el trata-miento 7 (control) se encontró un

insecto muerto a los 3 ddi, pero la muerte al parecer fue causada por otro de los individuos de la unidad experimental (Figura 3); esto de igual manera se presen-tó al día 5 en otra caja de Petri.

El tratamiento 7 presentó diferencias estadísticas significativas en el porcenta-je mortalidad, de acuerdo a la prueba de Tukey al nivel del 5% (Tabla 2).

La esporulación del hongo inoculado inició a los dos días en los tratamientos 1, 3, 4 y 6, que corresponde a los medios de cultivo suplementados con los activa-dores de patogenicidad. En los tratamientos 2 y 5, la esporulación se observó a los 4 días después de la inoculación. La esporulación se presentó inicialmente en boca, ano e integumento, y avanzó de la manera en que se ilustra en la siguiente Figura (Figura 4).

d

e

f

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Investigación

Figura 2. Protocolo. a. y b. suspensión delcultivo puro del hongo en ADE; c. dilución enbase 10; d. conteo de conidias en cámara deNeubauer; e. inoculación f. insectos en la cajade Petri

Figura 3. Insecto muerto por posible predación Figura 4. Avance del parasitismo del hongo en los insectos inoculados

Tabla 2. Porcentaje de mortalidad (Tukey 5%, R2 0,94, DMS: 6,51379, Error: 58,3136, Gl: 164)

Tratamiento Descripción Media N

7 12,004 97,60 3 98,40

6 99,20

1 99,20

5 100,00

2

Control

B. bassiana + PDA + BP M. anisopliae + PDA + SP

B. bassiana + PDA + SP

M. anisopliae + PDA + BP

B. bassiana + PDA

M. anisopliae + PDA 100,00

25 A

25 B

25 B 25 B 25 B

25

B

25 B

Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)

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Figura 5. Insectos a los 4 días después de la inoculación. Nótese que el insecto del tratamiento 7 está vivo

Tratamiento 1 Tratamiento 2

Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

Tratamiento 6 Tratamiento 7

En las siguientes Figuras se ilustra la esporulación en individuos de cada tratamiento a los 4 y 7 díasdespués de la inoculación (Figura 5 y 6).

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4

Tratamiento Descripción Media N 7 Control 00,00 25 A

6 B. bassiana + PDA + SP 48,80 25 B

4 B. bassiana + PDA + BP 58,40 25 B C

3 M. anisopliae + PDA + SP 64,00 25 B C 5 B. bassiana + PDA 67,20 25

B

C

1 M. anisopliae + PDA + BP 71,20 25

C

2 M. anisopliae + PDA 72,00 25 C

Investigación

Tratamiento 5 Tratamiento 6 Tratamiento 7

Figura 6. Insectos a los 7 días después de la inoculación. Nótese que el insecto del tratamiento 7 está vivo

Las diferencias en cuanto al porcentaje de parasitismo o porcentaje de insectos con el hongo esporulado estuvieron a favor de los tratamientos 1 y 2 con porcentajes por encima del 70%, seguido de los tratamientos 4, 3 y 5 con porcentajes entre 58,40 y 64%. En el tratamiento 7 el porcentaje de insectos parasitados por hongos fue cero.

Tabla 3. Porcentaje de parasitismo (Tukey 5%, R2 0,75, DMS: 18,95499, Error: 493,7979, Gl: 164)

Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)

En la siguiente Figura se ilustra el parasitismo en los insectos inoculados

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Figura 7. Parasitismo de Beauveriplant y Metarhiplant sobre los picudos inoculados

En la siguiente Figura se ilustran insectos del tratamiento 7 (control).

Figura 8. . Insectos del tratamiento control vivos

Investigación

Conclusiones

Bajo las condiciones de este estudio se concluye que:

El protocolo utilizado permitió determinar diferencias entre 2los tratamientos con un Coeficiente de Determinación R = 75%

, lo que demuestra la concordancia entre los valores observa-dos y los estimados como parte de los resultados por parte del modelo.

Los ingredientes activos de Metarhiplant y de Beauveriplant crecidos en medio de cultivo PDA solo o enriquecido, son eficientes biocontroladores de los Picudos asociados al cultivo de Vid.

No se presentaron diferencias en el porcentaje de mortalidad al evaluar el hongo crecido en medio PDA sólo y enriquecido con la BP y el SP, pero en términos del periodo de incubación y de latencia, si se encontraron efectos positivos, ya que los tiempos de infección y de colonización en los tratamientos con los activadores de patogenicidad, iniciaron a las 24 horas ddi, y se observó esporulación del hongo inoculado por las aberturas naturales como es el caso de boca y ano a las 48 horas ddi, lo cual es excelente en términos de control.

Los mayores promedios en el porcentaje de insectos parasitados se presentaron con Metarhizium anisopliae crecido en PDA y en PDA enriquecido con BP, con un valor de 70%.

Los productos de Sanoplant son una alternativa viable, eficaz y económica para controlar los picudos asociados a Vid, sin afectar el medio ambiente, ya que se protegen los recursos naturales tales como, Agua, Aire y Suelo,

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