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Análisis molecular del virus Análisis molecular del virus del papiloma humano parte IIdel papiloma humano parte II
Rodolfo Velazco Rodolfo Velazco
Laboratorio de biología molecularLaboratorio de biología molecular
Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas Departamento de Patología Departamento de Patología Unidad de genética y biología molecularUnidad de genética y biología molecular
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Estudio del Virus del papiloma humanoEstudio del Virus del papiloma humano
Rigoni-Stern, 1842.Rigoni-Stern, 1842.
Ciuffo, 1907.Ciuffo, 1907.
Shope, 1933.Shope, 1933.
Rous, 1934.Rous, 1934.
Favre, 1975.Favre, 1975.
Zur Hausen, 1986.Zur Hausen, 1986.
Villiers, 1987.Villiers, 1987.
Bosch, 1995.Bosch, 1995.
J exp med.1933, vol 58: 607J exp med.1933, vol 58: 607
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Aislamiento del virus en cultivos celularesAislamiento del virus en cultivos celulares
El virus no crece en cultivos El virus no crece en cultivos celulares porque es celulares porque es dependiente de la dependiente de la maduración de maduración de keratinocitos.keratinocitos.
Se ha logrado que el virus Se ha logrado que el virus se replique en levaduras se replique en levaduras modificando su genoma.modificando su genoma.
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Caracterización virus del papiloma humanoCaracterización virus del papiloma humano
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Algunas propiedades del ADNAlgunas propiedades del ADN
El ADN es un polinucleótido.El ADN es un polinucleótido.
Un nucleótido contiene:Un nucleótido contiene:
- Moléculas de desoxirribosa Moléculas de desoxirribosa unidas por enlaces fosfodiester. unidas por enlaces fosfodiester.
- Bases nitrogenadas (adenina, Bases nitrogenadas (adenina, timina, guanina y citosina).timina, guanina y citosina).
Las bases nitrogenadas de ambas Las bases nitrogenadas de ambas cadenas se aparean cadenas se aparean complementariamente y se unen por complementariamente y se unen por enlaces puente de hidrógenoenlaces puente de hidrógeno
Los enlaces puente de hidrógeno se Los enlaces puente de hidrógeno se desnaturalizan a altas temperaturas desnaturalizan a altas temperaturas (90-100ºC)(90-100ºC)
El ADN es una doble héliceEl ADN es una doble hélice
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Algunas propiedades del ADNAlgunas propiedades del ADN
Temperatura de disociación o meltingTemperatura de disociación o melting
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Los genes son ADN
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El dogma central de la biología molecularEl dogma central de la biología molecular
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Detección del virus del papiloma humano por hibridaciónDetección del virus del papiloma humano por hibridación
1.1. Aislamiento de ADNAislamiento de ADN
2.2. Digestión con enzimas de Digestión con enzimas de restricciónrestricción
3.3. ElectroforesisElectroforesis
4.4. Transferencia Transferencia
5.5. Hibridación con la sondaHibridación con la sonda
6.6. DetecciónDetección
Southern blottingSouthern blotting
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Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)
La célula antes de dividirse duplica La célula antes de dividirse duplica su ADN.su ADN.
En el proceso de replicación En el proceso de replicación intervienen:intervienen:
- El ADN que va a ser duplicado El ADN que va a ser duplicado
- NucleótidosNucleótidos
- ADN polimerasaADN polimerasa
- CebadoresCebadores
La PCR es una técnica que imita la La PCR es una técnica que imita la habilidad natural de las células para habilidad natural de las células para sintetizar enzimáticamente su ADN.sintetizar enzimáticamente su ADN.
Replicación del ADNReplicación del ADN
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PCR
ADN (muestra)ADN (muestra)
OligonucleótidosOligonucleótidos
DeoxinucleótidosDeoxinucleótidos
- dATPdATP
- dCTPdCTP
- dGTPdGTP
- dTTPdTTP
Enzima AND polimerasaEnzima AND polimerasa
Buffer (MgClBuffer (MgCl22))
Programa (ciclos)Programa (ciclos)
30, 40 …30, 40 …
Ciclos (pasos)Ciclos (pasos)
- DesnaturalizaciónDesnaturalización
90-95ºC90-95ºC
- HibridaciónHibridación
37-60ºC37-60ºC
- SíntesisSíntesis
72ºC72ºC
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Amplificación enzimática de ADNAmplificación enzimática de ADN
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Detección de los productos de PCRDetección de los productos de PCR
AgarosaAgarosa
PoliacrilamidaPoliacrilamida
Marcador de peso molecularMarcador de peso molecular
- 50 pb50 pb
- 100 pb100 pb
- 123 pb123 pb
Buffer TAE o TBEBuffer TAE o TBE
Bromuro de etidioBromuro de etidio
ElectroforesisElectroforesis
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Detección de ADN del virus del papiloma humanoDetección de ADN del virus del papiloma humano
Muestra (escobillado, lavado, Muestra (escobillado, lavado, biopsia)biopsia)
Aislamiento de ADN.Aislamiento de ADN.
Amplificación (PCR)Amplificación (PCR)
- MY09/MY11 (L1)MY09/MY11 (L1)
- GP5+/6+ (E7)GP5+/6+ (E7)
- PGMY (L1)PGMY (L1)
PCR + hibridación (genotipos)PCR + hibridación (genotipos)
PCR + RFLP (genotipos)PCR + RFLP (genotipos)
Procedimiento:Procedimiento: MY09/MY11MY09/MY11
MY09/MY11MY09/MY11
++
Enzima de Enzima de restricciónrestricción
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Line blotLine blot
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PCR en tiempo real: Amplificación y detección a la vezPCR en tiempo real: Amplificación y detección a la vez
Moléculas fluorecentesMoléculas fluorecentes
FormatosFormatos
- SYBR GreenSYBR Green
- Sondas TaqManSondas TaqMan
- Sondas FRETSondas FRET
Caracterización de los genotiposCaracterización de los genotipos
Cuantificación relativaCuantificación relativa
Cuantificación absoluta Cuantificación absoluta
PrincipioPrincipio
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SYBR Green
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Sonda TaqManSonda TaqMan
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Sonda FRETSonda FRET
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Caracterización de los genotipos: Caracterización de los genotipos: TmTm
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Caracterización de los genotipos: Caracterización de los genotipos: TmTm
PVH-16PVH-16 PVH-18PVH-18
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Sondas TaqMan para VPH-16 y VPH-18
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3 5
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Sonda QSonda Q
Sonda RSonda RPrimer Directo
Primer Reverso
ACGTCACACAACCCTAAGGATTACGCTGATGCT
L1 gene (amplicón) 450 pbL1 gene (amplicón) 450 pb
5´- TTCTACAGTAAGAGACCACTGGC – 3´
35
35 35
53
0 missPVH16:GCAGTTAGGCAGAAGTTTGATCGTAATCTGPVH18:C C G 3 miss
PVH6 T A 2 missPVH11: T A C 3 miss
5´- CAAGCCTAAAACAGGGAGTATCTC-3´
Este gráfico es cortesía de Roche Applied BiosciencesEste gráfico es cortesía de Roche Applied Biosciences
Diseño de una sonda FRET para determinar el genotipo
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Podemos detectar todos los VPH a la vez?Podemos detectar todos los VPH a la vez?
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Microarreglos (Microarrays)Microarreglos (Microarrays)
Chips de ADNChips de ADN
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MicroarreglosMicroarreglos
Aislamiento del ADNAislamiento del ADN
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MicroarreglosMicroarreglos
HibridaciónHibridación
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MicroarreglosMicroarreglos
DetecciónDetección
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MicroarreglosMicroarreglos
Formación de ClustersFormación de Clusters
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MicroarreglosMicroarreglos
ClustersClusters
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ClustersClusters
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Microarreglos
ClustersClusters
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MicroarreglosMicroarreglos
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Microarreglos para el virus del papiloma humanoMicroarreglos para el virus del papiloma humano
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OmicasOmicas
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Laboratorio de genética y biología molecularLaboratorio de genética y biología molecular
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¡GRACIAS!¡GRACIAS!
