Anticuerpos antinucleares

INMUNOFLUORESCENCIAMONTES HIJAR EFRAIN

INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

Microscopía de fluorescencia

La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que sólo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.

Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.

Filtros:Excitador: Transparente a cortas bloqueando más largas. Barrera: Transparente a largas bloqueando cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.

Inmunofluorescencia

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este

conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de

microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es

positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el

microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o

una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia

Clínica (Diagnósticos)

Investigación (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia)

Utilidades

Conjugación: Tendremos Ac marcado con fluoróforo y fluoróforo libre. ¿Cómo separamos?

Mediante tamiz molecular o diálisis

Imunofluorescência• Baseia-se na capacidade das moléculas

de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno.

• Reagentes Utilizados:– Anticorpos Marcados (Fluocromos –

Isotiocianato de Fluoresceína* )– Glicerina Alcalina– Corantes (Azul de Evans)

Imunofluoresência direta• A reação Ag-Ac é detectada pela emissão

de fluorescência• Pesquisa de antígeno• • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado

a substância fluorescente (conjugado)*• microscópio de fluorescência

IFI – Imunofluorescência INDIRETAA- pesquisa de antígeno

• • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *• • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *• • microscópio de fluorescência• • * lavagensB- pesquisa de anticorpos• • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *• • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *• • microscópio• • determinação do título e classe do Ac

ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

1. INTRODUCCION

LOS RESULTADOS DE ALGUNOS EXAMENES UTILIZADOS EN EL ESTUDIO DE LAS ENFEMEDADES REUMATOLOGICAS:

PUEDEN CONFIRMAR O NEGAR LA IMPRESION DIAGNOSTICA.

PUEDEN SER DE UTILIDAD EN EL SEGUIMIENTO DE LOS PACIENTES.

PUEDEN DETERMINAR EL PRONOSTICO DE LA ENFERMEDAD.

1. INTRODUCCION

EXAMENES IMPORTANTES EN REUMATOLOGIA:

REACTANTES DE FASE AGUDA AUTOANTICUERPOS COMPLEMENTO LIQUIDO SINOVIAL ANTIESTREPTOLISINAS ACIDO URICO.

1. INTRODUCCION

• LAS ENFERMEDADES REUMATOLOGICAS AUTOINMUNES SE CARACTERIZAN POR PRODUCCION ABUNDANTE DE Ab´s

• LOS PRINCIPALES SON:– LOS FACTORES REUMATOIDES (FR)– EL ANTIPEPTIDO CITRULIANO CICLICO (anti-CCP)– LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)– LOS ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA DEL NEUTROFILO(ANCA)– LOS ANTICUERPOS ANTIFOSFOLIPIDOS.

AUTOANTICUERPOS

2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )


• CELULAS LE: HARGRAVES, RICHMON Y MORTON (1948)

• ESTE HALLASGO DE AYUDA VALIOSA EN EL Dx DE LES, SIRVIO DE ESTIMULO EN LA INVESTIGACION DE LOS AUTO Ab`s CONTRA ANTIGENOS NUCLEARES Y CITOPLASMATICOS.

• POR CARENCIA DE SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO, Y POR LAS DIFICULTADES TECNICAS, ESTE PROCEDIMIENTO FUE REEMPLAZADO POR LA DETERMINACION DE LOS Ab´s ANTINUCLEARES.

• SI BIEN, A LA FAMILIA DE LOS AUTO Ab´s SE LA CONOCE COMO LA DE LOS Ab´s ANTINUCLEARES, SE SABE QUE ALGUNOS ANTIGENOS LOCALIZADOS POR FUERA DEL NUCLEO TAMBIÉN SON IMPORTANTES EN LA AUTOINMUNIDAD…

• … REALMENTE SON Ab´s DIRIGIDOS CONTRA Ag´s INTRA CEL´s.

• PARA DETECTARLOS: IFI UNA GRAN VARIEDAD DE SUSTRATOS:

• INICIALMENTE TEJIDOS DE RATON (RIÑON, HIGADO).

• ACTUALMENTE LAS CELULAS Hep-2.


• SON CELULAS DE LINEAS EPITELIALES HUMANAS DEIVADAS DE UN CARCINOMA LARINGEO.

• CONTINEN EL NUCLEO Y LOS NUCLEOLOS DE GRAN TAMAÑO LO QUE PERMITE IDENTIFICAR UN AMPLIO RANGO DE ANTIGENOS NUCLEARES Y CITOPLASMATICOS.

• CON EL EMPLEO DE LAS CEL´s Hep-2-2000, SE PUEDE DETECTAR FACILMENTE EL anti-Ro, ADEMAS DE OTROS Ag´s CLASICOS.


CELULAS Hep-2

• LA LECTURA SE INICIA CON DILUCIONES DE 1:40.

• UN TITULO > 1:640 + MANIFESTACIONES CLINICAS, SUGIERE ENFERMEDAD AUTOINMUNE, PRINCIPALMENTE LES, Y SE DEBE COMPLETAR EL ESTUDIO CON LA IDENTIFICACION DE LOS Ab´s ESPECIFICOS.

• NO OBSTANTE, SU SOLA PRESENCIA NO ES Dx DE ENFERMEDAD. SIGNIFICA QUE EXISTE UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA QUE AMERITA EL SEGUIMIENTO ADECUADO DEL PACIENTE.

• UN TITULO < 1:80 + POCOS SINTOMAS ES POCO SUGESTIVO.


• LOS ANA SON MUY UTILES PARA:– EL Dx

– SEGUIMIENTO Y PRONOSTICO (ALGUNOS)

• SE ENCUENTRAN PRINCIPALMENTE EN:– LES

– ESCLEROSIS SISTEMICA

– ENFERM MIXTA DEL TEJ CONECTICO

– SIND DE SJÖGREN.


• UN PACIENTE CON ANA (-) Y SOSPECHA CLINICA DE ENFER AUTOINMUNE, REQUIERE LA DETERMINACION DE AUTO Ab´s ESPECIFICOS, ESPECIALMENTE anti- Ro.

• SIN EMBARGO, UN RESULTADO DE ANA PERSISTENTEMENTE (-) ES UN ARGUMENTO EN CONTRA DE LES.


Too SON (+) LOS ANA

EN EL LUPUS INDUCIDO POR DROGAS. (HIDRALAZINA, PROCAINAMIDA, INH Y CLORPROMAZINA)

EN ALGUNOS PACIENTES CON ENFERMEDADES CRONICAS. EN LA ENFERMEDAD HEPATICA CRONICA.

OTRAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES REUMATOLOGICAS.

EDAD AVANZADA.


APROX EL 3% DE LOS INDIVIDUOS SANOS PUEDEN TENER ANA (+) 1:320, Y HASTA EL 32% CON ANA(+) 1:40.

LOS Ab´s CONTRA Ag´s CITOPLASMATICOS OCURREN EN ENFERMEDADES MUSCULARES CITOPLASMATICAS Y EN ALGUNAS ENTIDADES HEPATICAS.


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SENSIBILIDAD DE LOS ANA EN LAS ENFERMEDADES REUMATICAS Y NO REUMATICAS

3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

LOS PATRONES QUE SE OBSERVAN A LA INMUNOFLUORESCE SON LA CLAVE DE LA ESPECIFICIDAD DEL Ab´, PERO NO DETERMINAN CON CERTEZA SU TIPO.

LOS ANA PRODUCEN GRAN VARIEDAD DE PATRONES.

LOS PATRONES PUEDEN VARIAR EN EL MISMO INDIVIDUO Y SEGÚN LAS CIRCUNSTANCIAS.

CON FREC SE ENCUENTRAN PATRONES MIXTOS EN UN PACIENTE DADO.


POR IFI (CELULAS Hep-2), SE IDENTIFICAN 6 PATRONES:

1. PATRON HOMOGENEO O DIFUSO

2. PATRON PERIFERICO O EN ANILLO

3. PATRON MOTEADO FINO

4. PATRON NUCLEOLAR

5. PATRON CENTROMERICO

6. PATRON CITOPLAMATICO.


TODO EL NUCLEO SE COLOREA

SE DEBE A Ab´s QUE REACCIONAN: CON EL COMPLEJO ADN-HISTONA (RIBONUCLEOPROTEINA O NUCLEOSOMA) ANTI-dsADN ANTI-ssADN



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UN TITULO ALTO (>1:640) ES SUGESTIVO DE LES O LUPUS INDUCIDO POR DROGAS.

CON LAS CELULAS HEp-2 SE DEBEN COLOREAR LAS FIGURAS EN MITOSIS.



EL NUCLEO SE COLOREA PRINCIPALMENTE EN LA PERIFERIE.

SE PRODUCEN Ab´s CONTRA EL DNA NATIVO



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EN TITULOS ALTOS, ES CASI EXCLUSIVO DE LES.

ESTE PATRON SE ASOCIA CON Ab´s CONTRA EL ds ADN O EL ss ADN.

DESAFORTUNADAMENTE, Ab´s CONTRA LA MEMBRANA NUCLEAR PRODUCEN UN PATRON SIMILAR NO ESPECIFICO DE LUPUS

PERO LA AUSENCIA DE LAS CELULAS EN MITOSIS AYUDA A ESTABLECER LA DIFERENCIA.



LA COLORACION DEL NUCLEO ES RETICULAR O MOTEADA.

LO OCACIONAN ANTICUERPOS QUE REACCIONAN CON UNA GRAN VARIEDAD DE Ag´s NUCLEARES EXTRACTABLES (ENA)



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ESTOS Ab´s REACCIONAN PRINCIPALMENTE CON PROTEINAS NUCLEARES NO HISTONA (PROTEINAS ACIDAS). LAS MAS FREC:

Sm U1 RNP LA SS-B Ro (SS-A) Scl-70 ARN POLIMERASAS.



ESTE PATRON SE ENCUENTRA EN LES ENFERMEDAD MIXTA DEL TEJIDO CONECTIVO ESCLEROSIS SITEMICA ARTRITIS REUMATOIDE SINDROME DE SJÖGREN

MENOS FREC EN OTRAS ENTIDADES.



UNICAMENTE SE COLOREAN LOS NUCLEOLOS.

POSIBLEMENTE LO OCACIONAN Ab´S QUE REACCIONAN CON EL ARN NUCLEOLAR.

EN TITULOS ALTOS ESTE PATRON ES MAS COMUN EN ESCLEROSIS SISTEMICA.


4. PATRON NUCLEOLAR

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SE DEBE A Ab´s CONTRA LOS CENTROMEROS.

ES SIMILAR AL PATRON MOTEADO PERO CON CARACTERISTICAS ESPECIALES:

LOS PUNTOS DE FLUORESCENCIA NUCLEAR SON UNIFORMES MAS GRANDES Y FACILES DE CONTAR (GENERALMENTE 40 A 60 POR

NUCLEO)

LAS CELULAS EN MITOSIS TIENEN EL MISMO PATRON DE FLUORESCENCIA EN LOS CROMOSOMAS.



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ESTE PATRON SE ENCUENTRA PRINCIPAMENTE EN EL SIND DE CREST

CON MENOR FREC EN LA ENFER DE RAYNOUD, ESCLERODERMIA, CIRROSIS BILIAR PRIMARIA, LES Y AR.



LO OCACIONAN ANTICUERPOS CONTRA COMPONENTES DEL CITOPLASMA (RIBOSOMAS, MITOCONDRIAS, AMINOACIL tARN SINTETASAS Y PROTEINAS DEL COTOESQUELETO).

SE ENCUENTRAN PRINCIPALMENTE EN ENFERMEDADES INFLAMATORIAS DEL MUSCULO, ENFERMEDADES HEPATICAS Y LES (anti-P ribiosomasl)


6. PATRON CITOPLASMATICO

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4 . ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES

LOS ANA SON LA CARACTERISTICA INMUNE DEL LES.

SE ENCUENTRAN EN CASI TODOS LOS PACIENTES.

LA MAYORIA DE LOS ANTIGENOS, BLANCO DE LOS Ab´s, SON DE ORIGEN NUCLEAR.

LOS Ag´s SE PUEDEN CATEGORIZA EN: ASOCIADOS A CROMATINA O RIBONUCLEOPROTEINAS.

4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES

EN LES PODEMOS ENCONTRAR LOS SIGUIENTES Ab´s:

Anti-DNA Anti- Sm y anti-RNP Anti-Ro/SS-A y anti-LA/SS-B Antihistona Antirribosoma (anti-P ribosomal) Anticromatina Anti-Ku Ant-PCNA


ES UN ANTICUERPO DIRIGIDO CONTRA EPITOPES DEL ADN

EXISTEN DOS TIPOS:1. EL DE CADENA DOBLE O NATIVA: MUY ESPECIFICO DE LES.

OCACIONALMENTE POSITIVO EN TITULO BAJO EN LA AR SEVERA O EN EL SIN DE SJÖGREN

2. EL CADENA SENSILLA O DESNATURALIZADO: SE ENCUENTRA EN LES Y EN OTRAS ENTIDADES. TIENE POCA UTILIDAD Dx.


1. ANTI-ADN

SE ENCUENTRA EN EL 60 – 70% DE PACIENTES CON LES ACTIVO

PRINCIPALMENTE CUANDO EXISTE COMPROMISO RENAL, USUALMENTE ASOCIADO CON HIPOCOMPLEMENTARINEMIA, LO CUAL SE DEBE A SU PODER NEFRITOGENICO (ALTA AFINIDAD,

CARGA CATIONICA, IgG Y CAPACIDAD DE FIJAR EL COMPLEMENTO)

FLUCTUA CON LA ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD Y POR LO GENERAL DESAPARECE CON LA TERAPIA.


1. ANTI-ADN

OCASIONALMENTE SE ENCUENTRA EN PACIENTES EN REMISION O INACTIVOS.

ESTE Ab SE SOSPECHA CUANDO ELPATRON DE LA IFI, CON CEL´s Hep-2, ES HOMOGENEO O PERIFERICO.


1. ANTI-ADN

CONSTITUYEN UNA FAMILIA DE AUTOANTICUERPOS QUE REACCIONAN CON PROTEINAS NUCLEARES NO HISTONAS.

EL ANTIGENO SMITH (Sm) ABARCA UNA SERIE DE PROTEINAS (B, B´, D, E, F, y G) QUE FORMAN COMPLEJOS CON LOS FRAGMENTOS ARN (U1, U2, U4-6, U5); RECIBEN EL NOMBRE DE snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) Y SON NECESARIOS PARA FRAGMENTACION DEL PRECURSOR DEL mARN.


2. ANTI-Sm Y ANTI-RNP

EL Ab CONTRA EL ANTIGENO Sm ES ESPECIFICO DE LES. PERO SOLO SE ENCUENTRA EN 10 – 30% DE CASOS.

TIENE GRAN SIGNIFICADO Dx PRINCIPALMENTE CUANDO EL anti-ADN ES (-).

ASOCIADO CON EL anti-RNP PARECE SER PROTECTOR DE NEFROPATIA.

NO SE RELACIONA CON LA ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD NI CON LAS MANIFESTACIONES ESPECIFICAS.



El ANTICUERPO anti-RNP SOLO SE UNE A UNA PROTEINAQUE CONTIENE ARN U1.

EN TITULO ALTO ES SUGESTIVO DE ENFERMEDAD MIXTA DEL TEJIDO CONECTIVO Y CON FREC SE ASOCIA CON FENOMENO DE RAYNAUD.

TAMBIEN SE ENCUENTRA EN EL LES (30 – 60% DE LOS CASOS) PERO NO SE CORRELACIONA CON LA ACTIVIDAD Y, EN TITULO MAS BAJO, CON ESCLEROSIS SISTEMICA, EL SIND DE SJÖGREN Y LA AR


2. ANTI-RNP

ESTOS DOS Ab´S SE SOSPECHAN CUANDO EN LA IFI EL PATRON ES MOTEADO PERO USUALMENTE SE REQUIEREN EXAMENES CONFIRMATORIOS POR ELISA



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Anticuerpos antinucleares