OBTENCION DE OBTENCION DE

ANTICUERPOS ANTICUERPOS

MONOCLONALESMONOCLONALES

Esmeralda MurciaEsmeralda Murcia

TOPICOSTOPICOS

1. Antecedentes1. Antecedentes

2. Aspectos técnicos2. Aspectos técnicos

3. Aplicaciones3. Aplicaciones

TEORIA DE LA SELECCION TEORIA DE LA SELECCION CLONALCLONAL

El Ag activa un clon específico preexistente de El Ag activa un clon específico preexistente de linfocitos B induciendo proliferación linfocitos B induciendo proliferación

Cada linfocito B sintetiza unicamente una clase Cada linfocito B sintetiza unicamente una clase de inmunoglobulina específicica para el antígenode inmunoglobulina específicica para el antígeno

Burnet, F.M. Australian Journal of Science 20:67-69, 1957.Burnet, F.M. Australian Journal of Science 20:67-69, 1957.

SE BUSCASE BUSCA

Fuente contínua de Ac

Especificidad pre-definida

ANTECEDENTESANTECEDENTES

1962 Fusión por el virus Sendai1962 Fusión por el virus Sendai OkadaOkada

1962 Inducción de plasmacitomas1962 Inducción de plasmacitomas Potter y BoycePotter y Boyce

1964 Medios selectivos HAT1964 Medios selectivos HAT LittlefieldLittlefield

1970 Cultivo continuo de plasmacitomas1970 Cultivo continuo de plasmacitomas Horibata y HarrisHoribata y Harris

1973 Fusión de células de mieloma1973 Fusión de células de mieloma Cotton y MilsteinCotton y Milstein

INMORTALIZACION DE INMORTALIZACION DE CELULAS BCELULAS B

Cultivo continuo de células fusionadas Cultivo continuo de células fusionadas secretoras de anticuerpos con secretoras de anticuerpos con especificidad predefinida especificidad predefinida

Köhler, G. Milstein,C. Nature 256 :1 495-7. 1975

TOPICOSTOPICOS

1. Antecedentes1. Antecedentes

2. Aspectos técnicos2. Aspectos técnicos

3. Aplicaciones3. Aplicaciones

ASPECTOS TECNICOSASPECTOS TECNICOS

InmunizaciónInmunización FusiónFusión

TamizajeTamizaje

ClonaciónClonación

CaracterizaciónCaracterización

PurificaciónPurificación

INMUNIZACIONINMUNIZACION

Inmunización primariaInmunización primaria Inmunización secundariaInmunización secundaria Inmunización in vitroInmunización in vitro

Ag

FUSIONFUSION

Biológica: Biológica: Virus SendaiVirus Sendai

Química:Química: PolietilenglicolPolietilenglicol

Física:Física: ElectrofusiónElectrofusión

CELULASCELULAS

LINFOCITO BLINFOCITO B

BALB/cBALB/c Crecimiento limitadoCrecimiento limitado AnticuerposAnticuerpos HGPRTHGPRT++

ESPECIFICIDADESPECIFICIDAD

P3 X63 Ag8.653P3 X63 Ag8.653

Tumoral plasmáticaTumoral plasmática Crecen in vitro Crecen in vitro c-mycc-myc HGPRTHGPRT--

INMORTALIDADINMORTALIDAD

SINTESIS DE NOVO

5- aminoimidazol 4-carboxinucleótido UMP

DHFR DHFR

Acidos Acidos

GMP IMP AMP TMP

Nucleicos Nucleicos

HGPRT HGPRT APRT TK

G H A T

VIA DE SALVAMENTO

A A

TAMIZAJETAMIZAJE

ELISAELISA

RIARIA

InmunofluorescenciaInmunofluorescencia

InmunoblotInmunoblot

CLONAJECLONAJE

Agar semi sólidoAgar semi sólido

Dilución límiteDilución límite

Sorter (Citómetro Sorter (Citómetro de flujo) de flujo)

EXPANSIONEXPANSION

IN VITROIN VITRO

Cultivo celularCultivo celular

Larga escalaLarga escala

Mayor costoMayor costo

AdaptaciónAdaptación

10-6010-60g/ml g/ml

IN VIVOIN VIVO

AscitisAscitis

ManipulaciónManipulación

Menor costoMenor costo

PurificaciónPurificación

1-10 mg/ml1-10 mg/ml

CARACTERIZACIONCARACTERIZACION

OuchterlonyOuchterlony

ELISA isotypingELISA isotyping

PURIFICACIONPURIFICACION

APLICACIONESAPLICACIONES

MOLECULAS ASOCIADAS A SUPERFICIEMOLECULAS ASOCIADAS A SUPERFICIE

Diagnostico de infecciones.Diagnostico de infecciones. Diagnóstico e inmunolocalización de tumores.Diagnóstico e inmunolocalización de tumores. Determinación de tipos celulares.Determinación de tipos celulares.

APLICACIONESAPLICACIONES

MOLECULAS SOLUBLESMOLECULAS SOLUBLES

Determinación y/o cuantificación de proteínas, Determinación y/o cuantificación de proteínas, hormonas, enzimas medicamentos y drogas hormonas, enzimas medicamentos y drogas entre otros.entre otros.

CONJUGACIONCONJUGACION

AcMo anti - AcMo anti - tubulina tubulina

AcMo anti-FNTAcMo anti-FNT