Tutor

Dr. Enrique Castellón

Presentador

Kenneth Walker

Universidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnología MédicaCurso de Microscopía Electrónica

SECRECIÓN DE ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO, ACTIVIDAD PROLIFERATIVA

Y RESPUESTA A ANDRÓGENOS DE CO-CULTIVOS DE CÉLULAS EPITELIALES-ESTROMALES

DERIVADAS DE CÁNCER PROSTÁTICO HUMANO

ENRIQUE CASTELLÓN, KARINA VENEGAS, LEONARDO SÁENZ, HÉCTOR CONTRERAS and CHRISTIAN HUIDOBRO

Physiology and Biophysics Program, Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine,University of Chile, and Urology Department, Clinic Hospital J.J., Aguirre, University of Chile,

Chile

International Journal of Andrology, 28, 39–46. 2005

INTRODUCCIÓN

Con un estimado de 258.000 muertes para el 2008, el CaP se convierte en la sexta causa principal de muerte por cáncer en los hombres a nivel global.

En Chile, se estima que actualmente más de 1.700 pacientes mueren anualmente debido a este cáncer

El diagnóstico precoz mejora el pronóstico del paciente. Sin embargo, esto resulta complicado principalmente por la ausencia de síntomas en las etapas iniciales de la patología.

El tratamiento para CaP es la prostectomía. Sin embargo, más del 30% de los pacientes vuelven a padecer cáncer después de la cirugía.

Intentando comprender la mecánica del desarrollo del CaP, investigadores plantean la existencia de una relación paracrina entre las células epiteliales y estromales en el contexto del CaP.

Sin embargo, trabajan con líneas derivadas de metástasis que podrían no ser fielmente representativas de los eventos reales en el desarrollo del tumor primario en la próstata.

OBJETIVO GENERAL

 Estudiar los efectos morfológicos y fisiológicos en células epiteliales provenientes de CaP humano cultivadas en presencia y ausencia de células estromales del mismo origen usando un modelo de estudio representativo del tumor original.

 Objetivos específicos  Determinar la secreción de PSA, la respuesta hormonal y

la actividad proliferativa en células epiteliales provenientes de CaP humano en presencia (co-cultivo) y ausencia de células estromales.

Describir las características morfológicas ultraestructurales de las células epiteliales provenientes de CaP humano cultivadas en presencia (co-cultivo) y ausencia de células estromales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Próstatas obtenidas de prostectomías radicales a

pacientes del hospital institucional

Muestras recibidas en medio de cultivo estéril con inhibidores de

RNasa

De las próstatas adquiridas, se tomaron 8

A cada una se les realizo una evaluación histopatológica por medio de la determinación de

un score de Gleason.

60 min.

Retirar tejido hiperplásico

Inclusión en parafina

Score 4-6

Trozos de tejido prostático de 1mm3

Medio de cultivo para eliminar a las células sanguíneas indeseadas.

Lavado con agua y agitación y luego una digestión en:

Colagenasa (2,5mg/mL) Hialuronidasa (1mg/mL) Desoxirribonucleasa (0,01 mg/mL)

45 min. a 37ºC

2-3 hrs. a 37ºC

Agregados de células epiteliales

Colagenasa por otras 8-12 hrs.

Se van recolectando las células estromales

dispersadas

Las células estromales agrupadas fueron lavadas y puestas en placas de cultivo

Las células epiteliales agrupadas fueron lavadas y puestas en placas de cultivo

Co-cultivos de células epiteliales y estromales

método de Janecki y Steinberger (1987)

Esquema del sistema bicameral. Las células epiteliales (C) fueron cultivadas en una cámara con fondo de PET translúcido (B). Las células estromales (D) fueron cultivadas en una placa de cultivo común (A).

AB

C

D

Transferrina humanaInsulina Factor de crec. epidermalVitamina A y EHidrocortisonaSelenito de sodioDihidrotestosterona

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Deshidratación en etanoles de concentración ascendente

Post-fijación con tetróxido de osmio al 1%.

Muestra de co-cultivo y cultivo células epiteliales

Glutaraldehído al 4% en buffer fosfato 100mM, pH 7,4.

60 minutos

a T° ambiente

Inclusión en Epón 812

Microfotografía obtenida por medio de microscopio electrónico de transmisión (MET) para el análisis de la morfología ultraestructural de las células epiteliales en un sistema de co-cultivo.

(A) Microfotografía de bajo aumento que muestra la relación que se establece entre las células epiteliales derivadas de CaP de citoplasma granular y homogéneo. Destacan las interdigitaciones entre las membranas de las células vecinas. (B, C) Microfotografías tomadas con alto aumento con la intención de revelar los detalles ultraestructurales de las prolongaciones de membrana de las células epiteliales. Las prolongaciones digitiformes contienen un citoplasma sin variantes con respecto al resto de la célula.

Aquellas células epiteliales que se co-cultivaron con células estromales, presentaron prolongaciones digitiformes que normalmente no se observan en cultivos sin células estromales.

Por lo que la aparición de estas estructuras depende de alguna manera de la presencia de las células estromales y esto en parte, permite evidenciar que ocurren interacciones paracrinas.

Las estructuras observadas podrían relacionarse con propiedades invasivas y metastásicas de las células tumorales epiteliales.

Esta observación puede impulsar futuros estudios que podrían ayudar a comprender mejor el origen de estos cambios en el citoesqueleto de la célula epitelial durante el desarrollo del CaP.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Secreción de PSA en cultivos de células epiteliales y estromales de CaP humano. Las células epiteliales y estromales fueron aisladas y cultivadas por separado. Ambos cultivos se mantuvieron en presencia de 10 nM de DHT. La secreción de PSA se evaluó cada 48 hrs. en ambos cultivos. (A) Corte histológico de tejido prostático representativo del grado de diferenciación del adenocarcinoma usado para estos experimentos (score de Gleason 4-6). (B,C) Gráficos de barras que entregan información relevante acerca de la secreción de PSA en el cultivo de células estromales (B) y en cultivos de células epiteliales (C).

Secreción de antígeno prostático específico en co-cultivos. Los co-cultivos se mantuvieron en presencia de 10 nM de DHT. Las mediciones de PSA se hicieron cada 48 hrs. (A) Imagen de corte histológico de tejido prostático que indica el grado de diferenciación del tumor que se utiliza para estos experimentos (Gleason 4-6). (B) Gráfico de barras que entrega información respecto a la secreción de PSA en el sistema de co-cultivo. Los niveles de PSA detectados en el medio de cultivo fueron significativamente mayores y sostenidos que en los cultivos exclusivamente de células epiteliales.

Respuesta a andrógenos por parte del cultivo de células prostáticas . La secreción de PSA fue evaluada en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de dihidrotestosterona (DHT) (1-100 nM). Los niveles de PSA se evaluaron en el medio de cultivo cada 48 h. (A) Imagen de un corte histológico de tejido prostático representativo del tumor utilizado en estos experimentos (Score Gleason 4-6). (B) La secreción de PSA en cultivos exclusivos de células epiteliales no muestra efectos relacionados al DHT. (C) la secreción de PSA en co-cultivos bicamerales aumenta significativamente por la presencia de cualquiera de las concentraciones de DHT probados.

Evaluación de la tasa de proliferación celular de los cultivos de células epiteliales vs. co-cultivos en sistema bicameral a través de espectrofotometría. Se aprecia un aumento significativo en los co-cultivos. Los valores representan la media ± la desviación estándar de seis experimentos diferentes. Inserto: curva de calibración que grafica el número de células epiteliales/cm3 en función de la densidad óptica expresada en nanómetros (nm).

INMUNOCITOQUÍMICA PARA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Anticuerpos primarios específicos preparados en conejo contra

Antígeno tumoral de CaP (PCTA-1) para identificar células epiteliales Vimentina para identificar células estromales

Bloqueo con PBS + Glicina 20mM y albúmina de suero bovino

Cultivos en portaobjetos

Paraformaldehído al 3% + Sucrosa al 2% en PBS

30 minutos

a T° ambiente

Anticuerpos secundarios contra conejoconjugados con FIT-C

Fotografías de Inmunocitoquímica aplicada a los cultivos celulares. Las células fueron tratadas con anticuerpos contra PCTA-1 y vimentina los que se detectaron con IgG conjugadas con FITC. (A, C) Fotografías tomadas a bajo aumento que muestra la mayoría de las células fuertemente marcadas. (B, D) Fotografías tomadas a alto aumento que muestran la distribución de la fluorescencia en la célula.

Referencias

1. Castellón E, Venegas K, Sáenz L, Contreras H, Huidobro C. Secretion of prostatic specific antigen, proliferative activity and androgen response in epithelial-stromal co-cultures from human prostate carcinoma. International journal of andrology. 2005.

2. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM. GLOBOCAN 2008 v2.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010.

3. Celià-terrassa T, Meca-cortés Ó, Mateo F, Paz AM De, Rubio N, Arnal-estapé A, et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. Journal of Clinical Investigation. 2012.