Impacto clínico de la incorporación de nuevas técnicas en el diagnóstico

microbiológicoJesús Martínez López R4Servicio Microbiología

Índice• Definición y Objetivos Microbiología Clínica• Perspectiva histórica• Nuevas técnicas:

– Técnicas rápidas de diagnóstico– Sistemas de detección multiplex– Next-generation Sequencing (NGS)– Proteómica: MALDI-TOF

• Desafíos y oportunidades• Conclusiones

Definición

• Microbiología clínica:– RAE: microbiología.

• (De microbio y -logía).– 1. f. Estudio de los microbios.

“Estudio de los microorganismos (bacterias, hongos, parásitos y virus) que afectan al ser humano”

Microbiología clínicaBiología

Bioquímica

Epidemiología Patología

Fisiología

Farmacología

BacteriologíaBacteriología VirologíaVirología MicobacteriologíaMicobacteriología

MicologíaMicología ParasitologíaParasitología SerologíaSerología

Susceptibilidad antimicrobianaSusceptibilidad antimicrobiana

Microbiología molecular

Microbiología molecular

Objetivos• Diagnóstico etiológico

– Muestras / Orientación diagnóstica– Patógenos emergentes

• Tratamiento– Análisis de sensibilidad antimicrobiana (CMI)– Orientación tratamiento (empírico y dirigido)– Guías clínicas de tratamiento

• Prevención– “Centinelas” de enfermedades infecciosas (EDOS, SVE,

SAEI, SIMIC, Medicina Preventiva)– Vigilancia de resistencias antimicrobianas (EARSS,

Medicina Preventiva) Nat Rev Microbiol 2013; 11: 574-585

Historia Lab. Microbiología

1610Microscopio

óptico

1676“Animáculos”

1876Cultivo

1887 T. Gram

1928Penicilina

1968 Bactec Radiometric

70sELISA,

Secuenciación,API

1939 Microscopio electrónico

1986PCR

90sAutomatización

MicroarraysIC POC

MALDI-TOF

2000sMedios

cromogénicosTécnicas rápidas

dPCR

PiroseqIon torrent

IlluminaSOLiD

Logros

• ↓ Tiempo de respuesta

• ↑ Detección de microorganismos

Logros

Recepción de muestras

Cultivo24-48h

Identificación y antibiograma

18h

Confirmación resultados

18h

Bacteriología general: 2-4 díasBacterias anaerobias y fastidiosas: 5-15

díasVirus: días –semanas

Hongos: días - semanasMicobacterias: meses

Técnicas rápidas

(minutos)

MicroarrayPCR multiplex

(horas)

MicroarrayPCR multiplex (horas)

MALDI-TOF(minutos)NGS (horas-dias)

Técnicas rápidas de diagnóstico

Técnicas de diagnóstico rápidoTécnicas de diagnóstico microbiológico, con relevancia en el manejo de

pacientes, cuyos resultados pueden ser obtenidos en un tiempo inferior a los métodos convencionales

Técnicas inmunodiagnósticas• Detección Antígeno (Ag S. pneumoniae, S. pyogenes, etc)• Detección de Anticuerpos (VIH-1, Ac heterófilos, etc)

Resultados (min – hora)

Técnicas moleculares detección de determinantes génicos

Resultados (horas)

Técnicas de diagnóstico rápido

• Antígenos de Plasmodium

Técnicas de diagnóstico rápido

• Antígenos de Plasmodium

– “46. Lograr el acceso universal a las pruebas de diagnóstico de todos los casos presuntos de malaria. Para confirmar el diagnóstico presuntivo de malaria en todos los casos se deben practicar pruebas de detección del parásito, como el examen microscópico de buena calidad o una prueba de diagnóstico

rápido (…) . Lograr el acceso universal a las pruebas de diagnóstico reducirá el uso excesivo del tratamiento combinado basado en la artemisinina, que es la pauta de primera línea para tratar la

enfermedad sin complicaciones, y también la presión selectiva de los medicamentos sobre los parásitos.”

Técnicas de diagnóstico rápido

• Antígenos de Plasmodium– Resultado rápido (5-20 min)– Muestra: tubo EDTA– Ag: HRP-2 P. falciparum

Aldolasa Pan-Plasmodium

Am J Trop Med Hyg. 2007;77(6 Suppl):119-27.

Técnicas de diagnóstico rápido

• Antígenos de Plasmodium– S: 90-92% , mayor para P. falciparum y

dependiente de nivel de parasitemia Un resultado negativo no excluye malaria

– No es posible monitorizar tratamiento– No permite estimar el grado de parasitemia

MICROSCOPíA

Técnicas de diagnóstico rápido

• PCR Clostridium difficile– Diarrea asociada al uso de antibióticos en entorno

hospitalario– Factores de virulencia:

• Toxina A y B (tcdA, tcdB)• Toxina binaria (algunas cepas)

– Detección de cepas toxigénicas

Técnicas de diagnóstico rápido• PCR Clostridium difficile

– Objetivos:• EpidemiológicoLimitar la transmisión intrahospitalaria• Disminuir morbimortalidad asociada a la infección por

Clostridium difficile (CDI)

– Algoritmos diagnósticos 2 pasos (Clin. Microbiol. 2009; 51: 1152-1157)

Método clásico: cultivo citotoxigénico (3-4 días)

Nuevos métodos: EIA/ICT (minutos) + PCR (horas)

Técnicas de diagnóstico rápido

• PCR Clostridium difficile– Facilidad de uso muestra directa– Rapidez en los resultados– Economiza recursos: disminución de tratamiento

innecesario, aislamiento paciente, duración estancia hospitalaria Infect Dis Ther. 2014 Sep 3. [Epub ahead of print]

J Clin Microbiol. 2015 Jan;53(1):332-5.

Técnicas de diagnóstico rápido• Ventajas

– Facilidad de uso e interpretación– Inicio inmediato de antibioterapia específica– consumo innecesario de antibióticos– presión selectiva

• Desventajas– Pérdida de datos de sensibilidad Cultivo y antibiograma– Contexto clínico Portadores asintomáticos– Infecciones mixtas Detección de 1 patógeno

Sistemas de detección multiplex

Qué son

• Técnicas diseñadas para diagnóstico microbiológico rápido de cuadros clínicos con etiología diversa

• Aplicación: Cuadros clínicos graves (sepsis, meningitis, neumonía)

Orientación del tratamiento Microorganismos de crecimiento exigente / lento

(Bordetella spp, Mycoplasma spp) Evitar demora en resultados

Sensibilidad baja (Cryptosporidium spp) Evitar FN Virus Rapidez en resultados – Evitar tratamiento

antibiótico innecesario

Paneles según clínica

• Panel de patógenos respiratorios• Panel de patógenos entéricos• Panel de sepsis• Panel de meningitis/encefalitis• Panel de ITS

Microarrays● Hibridación especifica entre ácidos nucléicos● Tipos

– Sólidos → Detección del objetivo sobre superficie– Líquidos → Detección de objetivo mediante citometría de

flujo

Microarrays

● Potencial: 100 a >106 patógenos y mecanismos de resistencia detectados/ array

● Rapidez en resultados: 1,5-2h (PCR previa)

Panel PCR multiplex a tiempo real

• Detección de múltiples microorganismos en una misma muestra basada en amplificación DNA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real (rt-PCR)

• Panel de patógenos según sintomatología clínica Alta sensibilidad y especificidad Sistemas con extracción “offline” y automatizada

Panel PCR multiplex a tiempo real

Extracción “offline” Septifast: muestras de sangre en paciente

séptico N=20

Panel PCR multiplex a tiempo real

Septifast• Sensibilidad subóptima vs hemocultivo (42-79%)*• Confirmación por cultivo en el 67% muestras

positivas* • Necesidad de estudios prospectivos que evalúen el

impacto en resultados clínicos

Sustituido por las nuevas técnicas multiplex automatizadas

• Clin. Microbiol. Infect 2009; 15:544-551 Intensive Care Med 2010; 36: 241-247 Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2009; 28:569-573

Panel PCR multiplex a tiempo real

Muestra directa FilmArray

Automatización rtPCR en múltiples micropocillos con reactivos para nPCR única / pocillo y lectura individualizada / pocillo

Panel PCR multiplex a tiempo real

FilmArray N=24+3• Panel respiratorios, sepsis y gastroenteritis

Gram + Gram - Levaduras Resistencia antibiótica

Enterococcus A. baumannii C. albicans mecA- resistencia meticilinaL.

monocytogenes H. influenzae C. glabratavan A/B - resistencia

vancomicina

Staphylococcus N. meningitidis C. krusei KPC- resistencia carbapenemas

S. aureus P. aeruginosaC.

parapsilosis

StreptococcusEnterobacteriacea

e C. tropicalis

S. agalactiaeE. cloacae complex

S. pyogenes E. coli

S.pneumoniae K. oxytoca

K. pneumoniae

Proteus

S. marcescens

Panel PCR multiplex a tiempo real

FilmArray• Elevada Sensibilidad y Especificidad (>91%;

>97%)*• Cultivos polimicrobianos (S: 70%)• 1 muestra / ensayo • Enterococcus spp E. faecalis >>>S E.

faecium• Microorganismos no presentes en el panel??

*J. Clin. Microbiol 2013; 51:4130-4136 Expert Rev.Mol.Diagn. 2013; 13:779-788 J. Clin. Microbiol 2013; 51:1528-1533 Diagn. Microbiol. Infect. Dis 2014; 79:183-186

Conclusiones

• Ventajas• Rapidez en la obtención de resultados (1-5h)• Detección múltiple microorganismos en una

misma muestra (+ mecanismos de resistencia)• Potencial : reducción de costes del manejo del

paciente, tiempo de terapia subóptima, reducción de estancia hospitalaria, y costes globales para pacientes infectados con SARM, Enterococcus o Candida spp*

• Clin.Infec.Dis 2010; 51:1074-1080 J.Clin.Microbiol 2006; 44:3381-3383 Antimicrob. Agents Chemother.2008; 52:3558-3563

Conclusiones

• Desventajas• Detección limitada al panel• Resultados negativos?? Hemocultivo/Cultivo• DNAemia = Bacteremia/Fungemia = Peor

pronóstico??• Genotipo ≠ Fenotipo Cultivo + sensibilidad • Antibiograma?? CMI?? • Sistemas caros (automatizados>>manual)

Selección población diana

Next-Generation Sequencing (NGS)

NGS• Secuenciación paralela de miles o millones de

secuencias a la vez rendimiento coste (€/Mb secuenciado)

• Investigación FUTURO??

NGS

PROCESAMIENTO PREVIA SEQ

AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN ACOPLADAS

NGS• Aplicaciones:

o Secuenciación de productos obtenidos por PCR

o Estudios de epidemiología (brotes, patógenos emergentes, infección nosocomial)

o Secuenciación de genomas completos

o Secuenciación de transcriptomas

o Metagenómica

o “Ultradeep Sequencing” Virus

NGS• Detección de resistencias

o Detección de SNPs asociados a R antibiótica en múltiples loci- M. tuberculosis: RIF + INH + FQ – rpoB, katG, gyrAS: 96,7%, 64%, 70%; E: 97,3-100% (J.Clin.Microbiol. 2009; 47:3985-3990)

- VIH: ITIAN, ITINN, IP, (IIN)

NGS• Epidemiología

o Brote E. coli (EHEC O104:H4) en Alemania (2011)

Caracterización de las cepas mediante análisis filogenético en genomas completos.

PLoS One. 2011;6(7):e22751

NGS• Ultradeep sequencing

o Detección de poblaciones minoritarias resistentes (VIH)

- Secuenciación Sanger: límite de detección de variantes resistentes en el 15-20% población

- NGS: <1% población

Test de resistencias previo inicio de tratamientoAumento de carga viral atribuible a fallo terapéutico

Clin Infect Dis. 2008 Jul 15;47(2):266-85

NGSo Metagenómica: identificación de todos los

genomas de microorganismos que comparten un nicho ecológico concreto

Esputo y aspirado bronquial vs

BAL y biopsia bronquial en EPOC

o Coinfección

J Clin Microbiol. 2012 Nov;50(11):3562-8

NGS• Conclusiones – Uso en investigación

o Identificación de patógenos específicoso Identificación de patógenos en brotes/emergenteso Identificación de patógenos infección nosocomialo Identificación de subpoblaciones minoritariaso Identificación de mecanismos de resistencias conocidoso Limitaciones propias a las técnicas de BM (conocimiento

previo)o Preparación pre-seq "offline” formación técnicao Limitación nº muestras simultaneas o Detección de genes ≠ Expresión de genes y fenotipo o Sistemas muy caros

Proteómica: MALDI-TOF

MALDI-TOF• Conjunto de proteínas que definen una especie

microbiana

• Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight

Separación de proteínas según relación masa carga (m/z)

MALDI-TOF

Recepción de muestras

Cultivo24-48h

ANTIBIOGRAMA10-18h

Confirmación resultados

18h

IDENTIFICACIÓN SOBRE CULTIVO POSITIVO

(minutos)

Identificación y antibiograma (18h)

MALDI-TOF• Espectro de masas único para cada especie microbiana

o BBDD: 30,000 espectros para 750 especies (648 B/MB + 109 H) o "Aprendizaje" desarrollo continuo de la BBDD

• Equipos ID tradicionales:- Dependiente del crecimiento y metabolismo bacterianoBacterias

aerobias metabolismo no exigente

• MALDI-TOF:- Bacterias aerobias- Bacterias anaerobias- Micobacterias- Hongos levaduriformes- Hongos filamentosos

MALDI-TOF• Identificacion a partir de colonia

• Disminución radical en el tiempo de respuesta IDSistemas automatizados enz (18h) minutos /colonia

Concordancia 90-95% (16S) Ahorro ID

PLoS One 2011;6:e16424J.Clin.Microbiol.2011;49:887-892J.Clin.Microbiol.2012;50:3301-3308

Mínimo: 1,5 x 105 ufc muestra

Colonias aisladas

MALDI-TOF• Identificación bacteriana en muestra directa

• Muestras de hemocultivos positivos Hemocultivo monomicrobiano Tiempo de respuesta: 2h Permite el inicio de terapia antimicrobiana E. local Impacto manejo paciente: tiempo para terapia

antimicrobiana óptima y mortalidad 30 días

• Muestras de orina Orina >105 UFC/mL de una especie microbiana Tiempo de respuesta: 1h Guía terapia empírica Epidemiología local

Clin.Infect.Dis 2013;57:1237-45Arch.Pathol.Lab.Med 2013;137:1247-54

MALDI-TOF• Identificación de resistencias antimicrobianas

Detección antibiótico degradado en el espectro

• Resistencia mediada por mecanismos enzimáticos

• Tiempo de respuesta: 1-3 h

• Laborioso

• No aplicable a otros mecanismos de resistencia

J.Clin.Microbiol 2012; 50:2241-43J.Clin.Microbiol.2012;50:927-37

MALDI-TOF• Identificación de resistencias antimicrobianas

Detección de cambios en el espectro de masas gracias a un marcador de crecimiento bacteriano (aa marcado) en presencia del antibiótico

• Marcador: aminoácido marcado con isótopos estables (13C6

15N2-L-Lys)

• Tiempo de respuesta: 2,5 h

• Detección de resistencia «fenotípico», basado en el crecimiento, válido para cualquier mecanismo de resistencia

• Muy laboriosoJ.Clin.Microbiol 2013; 51:3741-48

MALDI-TOF• Ventajas / Desventajas

- Reducción en el tiempo de respuesta para identificación de bacterias, micobacterias y hongos (muestras positivas, TRAS CULTIVO)

- Tratamiento dirigido según epidemiología local- Identificación económica - Facilidad de procesamiento

- No es posible identificar microorganismos en la mayor parte de muestras directas

- No es posible identificar múltiples microorganismos en muestras complejas

- E. coli ≠ Shigella spp , S. mitis ≠ S.pneumoniae Revisión software y picos específicos

- No Antibiograma Epidemiología local

Conclusiones

DESAFÍOS Y OPORTUNIDADES● Incremento infecciones asociadas a cuidados sanitarios y de las

resistencias a antimicrobianos

– Optimización de los recursos, diagnóstico rápido y eficaz de los mecanismos de resistencia antimicrobiana, PROA, CMI - tratamientos basados en PK/PD

● Consumismo creciente

– Diagnóstico microbiológico con técnicas rentables y selección de pacientes

● Seguridad alimentaria

– Identificación y vigilancia de brotes alimentarios (E.coli O104:H4)● Cambio climático

– Identificación y vigilancia de enfermedades emergentes y reemergentes

DESAFÍOS Y OPORTUNIDADES● Centralización

- Nuevos medios de transporte y sistemas de comunicación adecuada para la información rápida y útil de los resultados obtenidos a los clínicos

● Incremento de información generada

– Correlación de la información genética obtenida con los resultados clínicos asociados

● Validación de nuevos ensayos para uso clínico

– Organismos internacionales que definan estándares de validación de las nuevas técnicas

● Disponibilidad nuevas técnicas (espacial/temporal)

– Disponibilidad del beneficio de estas técnicas (sistemas multiplex) independientemente del tamaño del hospital

CONCLUSIONES● Disminución en el tiempo de respuesta

– Identificación

– Mecanismos de resistencia

● Aumento del espectro de microorganismos detectados con mayor sensibilidad y especificidad

● Objetivo: ganar tiempo para el manejo adecuado del paciente →Cuanto antes mejor.

– Reducción estancia hospitalaria

– Reducción uso de antibióticos Reducción presión selectiva

– Reducción en los costes globales

CONCLUSIONES

FIN