INTERACCIÓN INTERACCIÓN

PROTEÍNA-LIGANDOPROTEÍNA-LIGANDO

Prof. Italo Chiffelle G. Prof. Italo Chiffelle G.

Bioquímico, Dr.Bioquímico, Dr.

En la mayoría de las proteínas globulares (P), el eventoinicial de su acción es fijarse a otra sustancia, denominada ligando (L). La interacción de P y L ocurreen un lugar específico de la proteína, llamado sitio defijación (n)

Asociación: P + nL PLn k directa

k inversa

K fijación = [PLn]/([P] [L]n) = k directak inversa

K es la constante de fijación o constante de asociación en equilibrio

donde n= 1, 2, 3, …..

Parámetros de interés Biológico:

1.- El número de sitios de fijación (valor de n)2.- La fuerza de fijación (valos de K)3.- Especificidad de P por los L4.- Si n ≥ 2, tipo interacción entre sitios (valor de c)

CUANTIFICACIÓN DE LA UNIÓN L Y P.

Función de saturación (v):

v = [L] fijado/ [P] total

Los límites de v son v=0 (no hay L fijado) yv=n (L máximo fijado, proteína 100% saturada)

v = n K [L]ic / (1+K [L]i

c )

Relación entre v y concentración de L inicial:

Patrones de fijación cooperativa y no cooperativa

CURVA SIGMOIDAL

Concentración Ligando inicial ([L]i)

Fu

nci

ón

de

satu

raci

ón

(v)

CURVA HIPEBÓLICA

v

[L]i

La gráfica directa de v contra [L]i da 2 tipos de curva con diferente tipo de fijación:

Una Curva Hiperbólica, significados posibles:

1.- Una proteína con n=1

2.- Una P con n ≥ 2 y no-cooperativo, los eventos defijación son independientes entre sí

3.- Una P con n ≥ 2 y negativamente cooperativo, lafijación de L interfiere en otro evento de fijación enun sitio distinto

Una Curva Sigmoidal significa solamente que entreP y L existe una fijación positivamente cooperativa

Análisis matemático para determinar las distintas constantes (n, K, c) y tipo de cooperación.

De la ecuación: v = n K [L]ic / (1+K [L]i

c )* En PRIMER lugar se omite c y se ordena para obtener una ecuación lineal:

v/ [L]i = n K - K v

GRÁFICO DE SCATCHARD

Función de saturación, v

v/ [

L] i Pendiente= - K

n

nK

Función de saturación, v

v/ [

L] i

1 23

n

Tipo de fijación, según gráfico de Scatchard:1. No-cooperativo: Lineal y n ≥ 1 2. Cooperación Negativa: No-lineal y n ≥ 2 (la curva pasa por un mínimo, convexa)3. Cooperación Positiva: No-lineal y n ≥ 2 (la curva pasa por un máximo, cóncava)

* En SEGUNDO lugar sin omitir c y se reordena para obtener una ecuación lineal:

log [v/ (n – v)] = c log [L]i + log K Ecuación de Hill

Log [L] inicial

Lo

g [

v(n

-v)]

Pendiente= c

log K

Tipo de fijación, según gráfico de Hill:1. No-cooperativo: c= 1 2. Cooperación Negativa: c<13. Cooperación Positiva: c>1

Fijación de O2 (g) a la Hemoglobina:

Presión parcial de O2 (gas) (Torr)

Sat

ura

ció

n c

on

O2

(g

) (

%)

10 30 100Sangre pulmonarMúsculo activo Músculo en reposo

Mioglobina (M, no-cooperativa, n=1, c=1)

Hemoglobina (2 β2, cooperativa positiva, n=4, c=+2,8)

2 β22 β2-O2 2 β2-2O2 2 β2-3O2 2 β2-4O2

O2 O2 O2 O2

facilitada x400 facilitada

En un experimento la concentración de enzima es constante, 11μM, y la concentración de inhibidor [I] vario (uM). Los siguientes resultados fueron obtenidos

Determinar la constante de asociación de la Enzima-Inhibidor y el número de sitios de unión en la enzima (n)

[I] total 5,2 10,4 15,6 20,8 31,2 41,6 62,4

[I] libre 2,3 4,8 7,95 11,3 18,9 27,4 45,8

[I] total 5,2 10,4 15,6 20,8 31,2 41,6 62,4

[I] libre 2,3 4,8 7,95 11,3 18,9 27,4 45,8

[I] unido 2,9 5,6 7,65 9,5 12,3 14,2 16,6

v= [I] unido/ [P] 0,264 0,5091 0,6955 0,8636 1,1182 1,2909 1,5091

1/v 3,793 1,9643 1,4379 1,1579 0,8943 0,7746 0,6627

v/ [I] libre 0,115 0,1061 0,0875 0,0764 0,0592 0,0471 0,0329

1/ [I] libre 0,435 0,2083 0,1258 0,0885 0,0529 0,0365 0,0218

Gráfico Hiperbólico

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 20 40 60 80

Concentración (uM)

v=

[In

hib

] u

nid

o/[

Pro

t] t

ota

l

[Inhib] libre [Inhib] total

Gráfico de Scatchard

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0 0,5 1 1,5 2

v=[Inhib]unido/[Prot] total

v /

[In

hib

] li

bre