MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:

“NESTED PCR O PCR ANIDADA”

SEMINARIO DE

BIOLOGÍA MOLECULAR

INTEGRANTES: BELTRÁN UBE CARLOS

GUERRERO MACIAS SELENA PEÑAFIEL JESÚS

GRUPO #7DOCENTE: Blgo. Saúl Escobar

NESTED PCR O PCR ANIDADA

La PCR anidada es una modificación de la PCR, diseñada para aumentar lasensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos decebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores sedesarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadoressituados internamente o anidados con respecto al primer grupo.

ESPECIFICIDAD

La especificidad de la PCR ANIDADA depende, fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se

incorporan a la reacción (además de depender de la secuencia de los cebadores).

COMPONENTES DE LA PCR ANIDADA

Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtenermuchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar estefragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario.

Para alcanzar este resultado, se necesita:

El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir,el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde.

Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: unaDNA polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para elfuncionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de lapolimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de clorurode magnesio (MgCl2).

Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente soncapaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA.

Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadenacomplementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos alextremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde.

PASOS PARA REALIZAR PCR ANIDADA

Inicio

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (o 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

Desnaturalización

La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA, separándose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno. Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por 15 segundos; sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C

Alineamiento

La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. Para ello se baja la temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a las cadenas. La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers dependen de la composición, tamaño y concentración de los primers amplificadores. Una temperatura de alineamiento óptima es 5ºC por debajo del Tm de los primers.

ExtensiónLa tercera reacción se efectúa a 72º C, temperatura a la cual, la polimerasa lleva a cabo su acción, insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a 72ºC.

CICLOSLas nuevas cadenas de ADN creados en laetapa de extensión y las plantillas de ADNoriginales se desnaturalizan porcalentamiento de la reacción, y otra ronda ociclo de PCR comienza. El ciclismo esesencialmente tomando desnaturalización,hibridación y extensión y haciendo una y otravez.La polimerasa de ADN de la termófilo T.aquaticus se utiliza para construir nuevascadenas de ADN en la PCR debido a que laetapa de desnaturalización utiliza paraseparar las hebras de ADN no afecta a lapolimerasa. Por lo tanto, las etapas se puedenrepetir muchas veces, cada vez con másplantilla de ADN disponible para lahibridación del cebador y extensión por lapolimerasa. La cantidad de ADN aumentaexponencialmente, generando cantidadesutilizables de ADN de alta calidad en untiempo relativamente corto.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BioPharmaceutical Technology Center. (2013). BioPharmaceutical Technology Center. Obtenido de

BioPharmaceutical Technology Center: http://www.btci.org/k12/bft/pcr/pcr_geneticscreening.html

Prats, P. G. (2005). Limitaciones de la PCR. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid :

Editorial Médica Panamericana.

Prats, P. G. (2005). Marcado de los amplicones. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid:

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Prats, P. G. (2005). Ventajas de la Nested PCR. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid :

Editorial Médica Panamericana.