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Spanish version regarding of drug susceptibility tests of M. tuberculosis.
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“UN DÍA PARA ESTAR AL DÍA EN TUBERCULOSIS”
H O S P I TA L R E B AG L I AT I
ES SA LU D
1
Métodos para determinar la resistencia a los fármacos
anti-tuberculosis
Méd. Alberto Mendoza Ticona
Instituto Nacional de Salud
Unión Nacional Contra la Tuberculosis
Instituto de Biotecnología y Salud
2
Pruebas de diagnóstico
Medicina basada en evidencias
Como evaluar una prueba diagnóstica:
- Para seleccionar una prueba a usar:
Sensibilidad
Especificidad
- Para evaluar la credibilidad de los resultados de la prueba:
Valor predictivo positivo
Valor predictivo negativo
Coeficiente de probabilidades positivo
Coeficiente de probabilidades negativo
Nomograma de Fagan
4
Nomograma de Fagan
5
Pruebas de susceptibilidad anti -TB6
Pruebas Fenotípicas Pruebas genotípicas
Ensayos de nitrato reductasa (Griess)* MTBDRplus y MTBDRsl
MODS* Xpert MTB/RIF
Ensayos de fagos* INNO-LiPA Rif. TB
Ensayos de agar en capa delgada Secuenciamiento de genes de resistencia
Proporciones en medio LJ*
Proporciones en agar 7H10, 7H11*
Reacción de reducción con colorantesbiológicos
Sistema MGIT
Sistema BACTEC 460 y 960
* Pueden ser evaluados de manera directa o indirecta.
7
Métodos de Referencia
Pruebas de susceptibilidad convencionales8
Pruebas fenotípicas
Ausencia de crecimiento de MTB en presencia de drogas.
Tres métodos importantes en medios sólidos:
Método de proporciones
Método de tasa de resistencia
Método de la concentración absoluta
Método de proporciones9
Más ampliamente usado como referencia
Medios sólidos: LJ, Ogawa, agar 7H10, 7H11
Proporción de resistencia > 1% (INH, RIF y PAS)
Proporción de resistencia > 10% (demás drogas)
Concentraciones críticas de los principalesantibióticos para el método de proporciones
10
Antibiótico LJ 7H10 7H11
INH 0,2 0,2 - 1,0 0,2 - 1,0
RIF 40,0 1,0 1,0
EMB 2,0 5,0 7,5
S 4,0 2,0 2,0 – 10,0
PAS 0,5 2,0 8,0
KM 20,0 5,0 6,0
ETH 20,0 5,0 10,0
Ofloxacina 2,0 2,0 2,0
Capremocyna 20,0 10,0 10,0
Cycloserina 40,0 30,0 30,0
Ciprofloxacina - 2,0 2,0
Adaptado de: Kent y Kubica 1985; NCCLS 2000
Método de la razón de resistencia11
Razón entre el MIC de una cepa problema sobre el MIC de una cepa de referencia (H37Rv)
Regla
Si MIC problema/MIC ref ≤ 2, sensible
Si MIC problema/MIC ref ≥ 8, resistente
MIC: La menor concentración de droga con la que se obtiene un número de colonias menor de 20.
Método de la concentración absoluta12
Usa un inóculo estandar
Interpretación más fácil
Usa concentración crítica de cada droga
Compara con medio libre de drogas
Interpretación:
Incubación entre 4 a 6 semanas
Sensible: Número de colonias < 20 con un control 3+ o 4+ en el crecimiento control.
BACTEC 46013
Becton – DickinsonMiddelbrook 7H9Acido palmítico – C14 (12B vial)El consumo del ac. graso produce CO2
SIREPZConsiderado Gold Standar para dorgas de primera líneaSobre todo PZMás rápido que medio sólidoDesventajas:Descontinuación, costo y desechos radiactivos
MGIT14
The Mycobacterial Growth Indicator Tube(BD)
Versión manual y automatizada
Contiene caldo Middlebrook 7H9 modificado unido a una sustancia fluorescente sensible al consumo de oxígeno.
Requiere luz UV para revelar la fluorescencia
Interpretación: la presencia de fluorescencia en el tubo con droga dentro de los dos días de reacción positiva del tubo control.
Indirecto y Directo
BACTEC 960/32015
Basado en el mismo principio, usa tubos MGIT
Tiene una lectura automatizada
Aprobado como Gold Estándar
Buena concordancia con PS en medio sólido y BACTEC 460
Métodos rápidos para TB-MDR
16
Bwanga F, et al. Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: A meta-analysis. BMC Infectious Diseases 2009, 9:67Disponible en: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/9/67
Ensayo de Reducción de Nitratos (NRA)17
Directo e Indirecto
Reactivo de Griess
Capacidad del MTB de reducir
nitrato a nitrito.
Reactivo de Griess
Lectura: Indirecto 7 y 14 días
Directo 14, 21 y 28 días
Recientemente recomendado por
la OMS.
Incorporada al MINSA desde 2005
MODS (1)18
Desarrollado en Perú, (Caviedes , 2000)
Simultáneamente detecta TB y susceptibilidad a H, R y MDR
Utiliza caldo 7H9, enriquecimiento OADCmezcla de antibióticos PANTA
Principio: identificación mediante microscopio invertido de la formación de microcolonias características de MTB (cordones)
Tiempo entre 7 a 21 días (para declarar negativo)
19
Decontaminación de la muestra
NaOH-NALC
Vortex y dejelo 15 minutes
Llene tubo hasta 15ml
PBSCentrifuga 15 min 3000g
7H9
PANTA
OADC
Cultivo y prueba de susceptibilidad
directarifampicina
isoniacida
sin droga
1
900μl/pozo
MODS
sin droga
3 42 5Control negativo
MODS (2)20
Avalado por OMS desde 2009 paradetectar TB y TB-MDR directa e indirectamente.
Menor rendimiento con INH.
Descentralizado en 4 regiones de Perú.
Nuevas propuestas de versiones demicroscopía electrónica y telediagnóstico y teledocencia (Zimic 2010)
Prototipo de un nuevo kit comercial (Hardy Diagnostic)
21
Métodos basados en Fagos22
Basado en la capacidad de MTB de permitir el crecimiento de micobacteriofagos (D-29)
Versiones “in house” y comerciales (FastPlaque TB)
Resultados buenos para R, no para H, pero baja especificidad
Evaluaciones en forma directa e indirecta.
No es respaldado por OMS.
Cultivo en agar de capa delgada (TLA)23
Capa delgada de agar 7h11
O método de la microcolonia
Visualización de las características culturales de lasmicrocolonias con microscopio estándar (Welch 1993)
Es muy bueno para detectar TB, pero requiere mayor evidencia para detectar TB-MDR.
Color test24
Desarrollado en Perú (Herrera B) En proceso de validación (Evans C) Detecta TB y resistencia a H, R y Quinolona (Cx) La colonia cambia de color Ahorra el proceso de decontaminación Envase con solución desinfectante Inoculación directa en los 4 campos
25
26
27
Métodos colorimétricos(CRI)28
Son métodos indirectos.Usan indicadores de reducción o sales de tetrazoliumpara detectar el crecimeinto de micobacterias a diversas concentraciones de drogas (MIC)
La resistencia se detecta al producirse cambio en el color del indicador añadido al medio.
Alamar blue cambia a rosadoSal de tetrazolium, amarillo cambia púrpura (MTT)REMA (Resazurin microtiter assay)
Utilizado en drogas de 1 y 2 línea.
Recomendado por OMS, julio 2010
Line Probe Assays29
Extrae ADN de muestra o cultivo.
Amplifica secuencia especifica (PCR)
Hibridación reversa con DNA específico inmovilizado en líneas paralelas en una tira de papel.
La hibridación es inferida porque se colorea la banda respectiva
INNO-LiPA (Complejo MTB y rPOB para RIF)
Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, INH y RIF)
Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, Fq, Km, Ak, Etb)
Regiones genómicas asociadas con resistencia a drogas de 1era y 2da línea
Antibiótico Gen Producto Frecuencia de mutación (%)
Estreptomicina rpsLrrs
Prot. Ribosomal S12RNAr 16S
60< 10
Rifampicina rpoβ Subunidad β RNApol > 95
Isoniacida
katGoxyR-ahpC
inhAkasAndh
Catalasa-peroxidasaAlkilhidroxireductasaEnoyl ACP reductasa
β ketoacil ACP sintetasaNADH deshidrogenasa
60-70 20
< 10< 10NA
Etambutol embCAB Arabinosiltransferasas 70
Pyrazinamida pncA Amidasa 70-100
Etionamida inhAethA
Enoyl ACP reductasaFlavoprot. monooxigenasa
< 10NA
Kanamicina rrs RNAr 16S 65
Fluoroquinolonas gyrAgyrB
Subunidad α DNA girasaSubunidad β DNA girasa
> 90NA
Capreomicina tlyArrs
RNAr metiltransferasaRNAr 16S
NANA
Acido para-aminosalicilico thyA Timidilato sintetasa NA
Genotype MDRTBplus & MTBDRsl
Primers marcadoscon biotina
GT Blot 48
GenoScan
Software BLOTRIX
Flujo de Trabajo
Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniacida usando el Genotype MTBDRplus
Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a Fluoroquinolonas, Aminoglicósidos/Péptidos cíclicos y Etambutol usando
el Genotype MTBDRsl
GeneXpert MTB/RIF35
Test molecular automatizado que detecta MTB y resistencia a RIF
Usa un heminested Real Time PCR para amplificar la secuencia del gen rpoB
Utiliza la plataforma MTB/RIF (GeneXpert, Cepheid) Integra los procesos sonre la muestra y elPCR dentro de
un cartucho de plastico: Lisis de la bacteria (sonicación) Extracción de AND Amplificación y Detección del amplicón
El resultado se obtiene dentro de las 2 horas.
36
Boehme et al. N Engl J Med 2010;363:1005-15.
Pruebas rápidas en Perú37
Prueba País n Sensi-bilidad
Especifi-cidad
Valor predicti
vo +
Valor predictiv
o -
Concordancia
H R H R H R H R H R
GRIESS1(Asencios)
Perú 192 99,1 93,5
100 100 100 100 98,7 92 99,5
96,4
MODS(Moore)
Perú 338 88,9
100 99,6 100 98,2 100 96,4 100 nr nr
MTBDR plus (Asencios)
Peru 208 97 99.1 98.7 95 nr nr nr nr 97.6 97.1
GeneXpert(Boheme)
Peruy otros
741 na 97.6 na 98,1 na nr na nr na nr
H: Isoniacida R: Rifampicina
Comparación de pruebas rápidas38
Características GRIESS MODS MTBDR plus
GeneXpert
Esputo BK + + + + +
Esputo BK - - + -? +
Muestras extrapulmonares - +* - -
Cultivo de micobacterias(indirecta)
+ - + +
Pacientes antes de inicio de tratamiento
+ + + +
Pacientes en tratamiento o fracaso
- - + +/-
Tiempo de proceso (días) 14 – 21 5 – 21 1 – 2 <1
Identifica MTB - + + +
Costo por prueba, solo reactivos
S/.8 S/.12 S/.30 S/.140
Costo de equipamiento USD
48 000 53 000 100 000 25000* Datos solo para diagnostico en LCR, líquido pleural, heces, no para susceptibilidad.
Nuevas declaraciones de políticas de OMS39
Respaldado por OMS No respaldado por OMS
GeneXpert (2010) Fagos
MODS (2010) Cultivo en agar de capa fina
NRA (2010)
Pruebas colorimétricas (2010)
MTDRplus (2008)
Inno Lipa (2008)
WHO. Non-commercial culture and drug-susceptibility testing method forscreening of patients at rosk of MDR-TB. Policy Statement. (pre publication), Julio de 2010.
40
41
42
Interpretación de una prueba43
Caso 1.
Niño de 10 años con BK ++, tío que vive en su casa tiene TB-MDR confirmada
Caso 2
Mujer de 30 años, vive en zona residencial de Arequipa, tieneBK de esputo +, sin factores de riesgo para TB-MDR, primer episodio de TB
Probabilidad pre-test de que tengan TB-MDR:
Caso 1: 50%
Caso 2: 5%
En Arequipa existe MODS44
Identificacion
de TB-MDR
Método de
proporciones en LJ
MODS Resistente Sensible Total
Resistente 40 1 41
Sensible 4 462 466
Total 44 463 507
Sensibilidad (%) 90.91 81.28 100.00Especificidad (%) 99.78 99.25 100.00
Índice de validez (%) 99.01 98.06 99.97Valor predictivo + (%) 97.56 91.62 100.00Valor predictivo - (%) 99.14 98.20 100.00
Razón de verosimilitud + 420.91 59.28 2988.39Razón de verosimilitud - 0.09 0.04 0.23
45
Nomograma de Fagan
Caso 1 Caso2
Rojo Azul
Pre: 50% Pre: 5%
Post +: 100% Post +: 83%
Post - : 5% Post -: 0,3%
46
Simultáneo con el cultivo Menos demora
Menor capacidad del laboratorio
No se manipulan cultivos
No se necesita aislamientoprimario, entonces bajo costo
menor carga de trabajo
Método Griess
medio solido (LJ)
MODS
medio liquido (7H9)
Programa de diagnóstico rápido de TB-MDR del INS
http://uwclh.conference2web.com/content/all
47
41 Conferencia Mundial de la IUATLD
Berlín 2010
LIBRE ACCESO A CONFERENCIAS
48
Méd. Alberto MendozaInstituto Nacional de Salud
Instituto de Biotecnología y Salud
Contacto:
[email protected]@gmail.com
Web site: www.tbperu.org
Teléfonos:9807-59549 / 617 6200 - 2143