Microscopia

Breve reseña histórica

Los orígenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la ciudad de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas con el mundo del espectáculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el telescopio. Hans Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes de anteojos, se mencionan como posibles inventores. Sin embargo, algunos atribuyen a Galileo Galilei su invención en la primera mitad del siglo XVII, gracias a que él difundió el microscopio y su uso. El microscopio compuesto original consistía en dos o más lentes colocadas en un tubo rígido .

Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van Leeuwenhoek, de Holanda; Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek fabricó un microscopio simple y Hooke utilizó un microscopio compuesto. Los instrumentos empleados por Leeuwenhoek eran superiores a aquellos utilizados por Hooke, en parte debido a que se desconocía el efecto de las aberraciones de las lentes y como corregirlas. El microscopio compuesto de Hooke sumaba los defectos de los dos juegos de lentes (objetivo y ocular), dificultando la observación, de manera que en la historia de la microscopía fue Leeuwenhoek quien realizó la mayor cantidad de descubrimientos con su microscopio simple.

Sin embargo, el microscopio compuesto sería el instrumento con más futuro. El instrumento de Hooke del año 1665 tenía las partes básicas, dos lentes (una que aumentaba la imagen de la otra), una estructura mecánica, mecanismos de enfoque y un frasco esférico para concentrar la luz. Mejoras considerables se han realizado desde entonces.

Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios apropiados y mejorados por modelos con bases en trípode y la conocida base en herradura; no obstante, el verdadero microscopio útil apareció con la invención de las lentes acromáticas, desarrolladas en Inglaterra por Chester Moore Hall en 1729. El desarrollo de los instrumentos de óptica es inseparable del de la industria del vidrio y la fabricación de las lentes (61). Sin embargo, aún era difícil fabricar lentes acromáticas poderosas y a finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la comercialización de objetivos acromáticos. Las lentes con mayores aperturas numéricas fueron realizadas alrededor de 1890. Un fabricante famoso de microscopios de calidad superior era la firma de Powell y de Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder, apocromáticos y de inmersión con una apertura numérica de 1,50.

Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realizó objetivos de inmersión diseñados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teoría óptica de las lentes del microscopio y desarrolló el diseño de las mismas basado en un procedimiento matemático riguroso (62). A finales del siglo XIX los microscopios de campo claro fueron modificados para obtener campo oscuro y polarización, detalles que permitieron incrementar el contraste.

A principios del siglo XX la fabricación de microscopios se concentró en Alemania y en los años sucesivos se desarrolló la fluorescencia, contraste de fase, interferencia, holografía, luz ultravioleta, rayos X, métodos con electrones y protones, microscopios computarizados para la observación, cuantificación y análisis tridimensional. Estos instrumentos abrieron muchas posibilidades en el campo de la microscopía.

Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas necesidades, haciendo microscopios más efectivos, de uso universal, capaces de utilizar el tipo de radiación (luz visible o no) que revele de la mejor manera posible la naturaleza del espécimen y convierta detalles invisibles de la imagen en un patrón visible que pueda ser analizado.

Figura.-Microscopio de Leeuwenhoek. La lente está instalada entre dos placas de bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un tornillo, de manera que se puede regular en forma precisa la distancia entre el objeto y la lente; el observador tiene que acercar el ojo al instrumento y mirar a través de la lente.

 

 

Figura Microscopio utilizado por Hooke

Microscopio

Microscopia

MicroscopiaLa microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la microscopía se evidencia los grandes aportes que la física ha hecho a la biología.

Microscopio óptico de campo claro: El microscopio óptico convencional es compuesto porque posee dos sistemas principales de lentes convergentes (ocular y objetivo), en cambio los microscopios simples o lupas, de menor aumento, presentan un solo sistema de lentes biconvexas o plano-convexas montadas en una armadura metálica. La mayoría de los modelos actuales son binoculares, aunque también los hay monoculares. El microscopio compuesto convencional se denomina "de campo claro" o "de campo brillante" porque todo el campo se ilumina con una lente condensador común, a diferencia de variedades que utilizan luz difractada, de fondo obscuro. Las muestras que utiliza el microscopio compuesto convencional deben ser traslúcidas y estar teñidas para entregar contraste.

Microscopio de contraste de fases: Se basa en la propiedad de los rayos luminosos de modificar su longitud de onda al atravesar un medio de refracción distinto. Este desfase de las ondas es imperceptible a la vista, pero el microscopio lo transforma en diferencias visibles de amplitud, y por lo tanto de intensidad. Tiene un condensador especial (condensador de Zernike) y placas de retardo o láminas de desfasado. si hay pequeñas diferencias en el índice de refracción en el objeto, los rayos luminosos se retardan o adelantan respecto al haz original. Las distintas densidades originan diferencias de fase entre las ondas luminosas emergentes, que se transforman en diferencias de intensidad luminosa. Permite observar detalles en células vivas, provenientes de cultivos o de animales vivos, y observar material fijado que no puede colorearse. Tiene la desventaja de producir halos y es difícil obtener una alta resolución. Las muestras deben ser muy delgadas y no deben abarcar todo el campo de observación. La fuente luminosa debe ser muy intensa.

Microscopio de campo obscuro: Se basa en que substancias con distinto índice de refracción desvían de distinta manera los rayos luminosos, lo cual proporciona contraste a material no teñido, permitiendo visualizar muestras vivas. Un condensador especial bloquea los rayos centrales y deja pasar los periféricos, que se reflejan en la cara interna del condensador, iluminando con rayos laterales que se reflejan o refractan sobre el objeto, el que aparece fuertemente iluminado sobre fondo obscuro. Para evitar que penetren en el objetivo los rayos que emergen del condensador, utiliza un diafragma en el objetivo o un objetivo de abertura

numérica inferior a 1,1. Es útil para observar límites y movimientos de pequeños objetos transparentes, tales como quilomicrones, bacterias o espermios, y partículas ultramicroscópicas, pero sin entregar detalles. Requiere una fuente luminosa puntiforme muy intensa, lo cual no siempre es fácil si el material es un ser vivo.

Microscopio de fluorescencia: Su fuente luminosa es una lámpara de rayos ultravioleta (UV), los que son invisibles al ojo humano pero se tornan visibles al chocar con un objeto fluorescente. Posee dispositivos que permiten transmitir radiación UV a muestras que la absorben y emiten radiación de longitud más larga. Un filtro impide que los rayos blancos producidos juntos con los UV enmascaren la fluorescencia, otro filtro bloquea la luz UV que podría dañar los ojos del observador y deja pasar la fluorescencia. Sirve para observar estructuras fluorescentes o teñidas con colorantes fluorescentes (fluorocromos). Entrega imágenes de gran contraste y especificidad. Se utiliza para moléculas orgánicas, microorganismos, reacciones antígeno-anticuerpo y diagnóstico de cáncer. Inyectando a un animal una substancia fluorescente permite estudiar procesos metabólicos, tales como formación de orina o secreción biliar. Con inyección directa a nivel celular facilita el estudio de uniones intercelulares y vías nerviosas. Con el método de epifluorescencia, el objeto, previamente marcado con fluorocromo, se ilumina desde arriba por reflexión, de manera que la luz excitadora no atraviesa el espesor del corte y la fluorescencia ocurre en la superficie, dando una mayor nitidez.

Microscopio electrónico de transmisión: De disposición general similar al óptico, utiliza electrones para formar la imagen. Como los electrones tienen longitud de onda entre mil y cien mil veces inferior a la luz visible, posee mayor poder de resolución que los microscopios ópticos. Debido a las aberraciones de las lentes electromagnéticas y al contraste de las muestras su límite de resolución en la práctica no es tan bueno como el teórico, llegando hasta 0,2 nm en redes cristalinas. Tiene un filamento de tungsteno incandescente, una bomba de vacío de alto rendimiento, bobinas electromagnéticas que rodean al haz de electrones a diferentes niveles y un sistema traductor de imágenes con pantalla fluorescente o placa fotográfica. El filamento de tungsteno calentado emite un haz de electrones en el vacío, logrado mediante la bomba. Los electrones se aceleran entre el filamento y un ánodo por diferencia de potencial de alta tensión de 40.000 a 100.000 voltios y se desplazan en línea recta, pero se desvían y concentran por efecto de los campos electromagnéticos formados por las bobinas. Los modelos modernos disponen de dos lentes condensadores y cuatro que forman la imagen, cuya distancia focal se modifica ajustando la corriente que pasa por los enrollamientos, lo cual permite variar el aumento desde pocos cientos de veces

hasta cerca del millón de diámetros. La preparación de los objetos requiere ultramicrótomos de alta velocidad y técnicas especiales de fijación (generalmente con glutaraldehido) y de inclusión (con resinas epóxicas). Las secciones, ultradelgadas (típicamente de 0,1 um de grosor) se tiñen mediante inmersión en soluciones de un metal pesado (uranio o plomo).

Microscopio electrónico de transmisión: utiliza un haz fijo de electrones y en la formación de la imagen ocupa los electrones primarios, transmitidos por el espécimen, por eso los cortes deben ser muy delgados, menores de un micrómetro, y no puede utilizarse en el estudio de células vivas.

Microscopio electrónico de barrido: La lente condensadora produce un haz fino de electrones, de sólo 0,0015 micrómetros, que barre sistemáticamente la superficie de una preparación previamente recubierta por metal pesado. el haz electrónico excita la emisión de un haz secundario de electrones de menor energía desde la preparación, el que es recogido por un detector de centelleo, que convierte los impactos de los electrones en destellos de luz. Cada destello se amplifica electrónicamente en un tubo fotomultiplicador que barre sincrónicamente con el haz, formándose con la señal resultante una imagen sobre una pantalla de rayos catódicos. Tiene alto poder de penetración, su resolución es de entre 1 y 20 nanómetros y su aumento entre 15 y 50.000 diámetros, según el material, voltaje y distancia de trabajo. Su gran profundidad de foco da a la imagen un impresionante aspecto tridimensional. No se necesitan cortes ultrafinos, utiliza fragmentos sólidos de tejido. Permite observar muestras frágiles por deshidratación controlada.

Partes Del Microscopio* Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo óptico; de esta forma se puede acudir al cuando interesa.

* Revolver: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un objetivo u otro.

* Tornillos Macro Y Micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

* Foco: Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Está situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización.

* Condensador Y Diafragma: El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y ajusta la Apertura Numérica).

* Oculares: Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así, porque están muy cercanos al ojo. Su función es la de captar y ampliar la imagen formada en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) que están unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los más utilizados son los de 10X (producen un aumento de 10 veces).

* Objetivos: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metálica, denominada revolver, que permite cambiarlos fácilmente. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los más frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este último se llama de inmersión ya que para su utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación. En la superficie de cada objetivo se indican sus características principales, aumento, apertura numérica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos (rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X).

Manejo y Uso Del Microscopio1- Colocar el objetivo de menor aumento

2- Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3- Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. Para realizar el enfoque:

4- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación

6- Empleo del objetivo de inmersión:

 -  Bajar totalmente la platina.

a.      Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

b.     Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.

c.      Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

d.     Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

e.      Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

f.      Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

Clasificación bacteriana

Fenotípica: Las bacterias pueden clasificarse según su capacidad de retención de la tinción de gram positivos y negativos. Por su forma peculiar ( cocos, bacilos, espirilos). Por su aspecto macroscópico ( propiedades hemolíticas en un medio de agar sangre, la pigmentación, el tamaño y la forma de colonias.

Genotípica: El método más preciso de la clasificación de las bacterias es el análisis del material genético. Mediante el empleo de sondas moleculares, se extrae el ADN del microorganismo a identificarse.

Analítica: Se las clasifica en género especie y subespecie. El patrón cromatográfico de los ácidos micólicos de la pared celular. Análisis de los lípidos presentes de la célula. Análisis de las proteínas de la célula y de las enzimas.