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Prácticas
Microbiología
2º Trimestre
Realizado por: Elena García López
2º L.D.C
Índice
1. Siembra de anaerobios (12/1/15)
2. RPR- carbón (14/1/15)
3. TPHA (14/1/15)
4. Antibiograma: Difusión con disco y Epslon test (20/1/15)
5. Urocultivo (26/1/15)
6. Laminocultivo (26/1/15)
7. Coprocultivo (2/2/15)
8. Prueba de adenovirus/ Rotavirus (2/2/15)
9. Siembra de mohos y observación en freso de mohos (10/2/15)
10. Test de filamentación (11/2/15)
11. Toxoplasmosis ( 4/2/15)
12. Técnicas de aglutinación: ASO , FR, PCR y Waaler Rose ( 10/3/15)
13. Observación de hongo con azul de lactofenol (10/3/15)
14. Exudado Vaginal ( 10/3/15)
15. Exudado nasal (12/3/15)
Práctica 1 Siembra y observación de anaerobios
Materiales.
Escobillón estéril.
Jarra de anaerobiosis.
Generador de anaerobiosis.
Tiras indicadoras de anaerobiosis.
Placa de agar sangre.
Procedimiento
Con un escobillón estéril frotamos la boca haciendo más incapie en las mejillas y
encías. Con el escobillón ya impregnado realizamos una siembra en masa en Agar
sangre y metemos en una jarra de anaerobiosis con sus tiras indicadoras y su
generador la placa.
Dejamos incubar durante 24 horas a 37 grados. En nuestro caso dejamos incubar más
tiempo ya que la práctica se hizo un viernes.
El lunes día 12/1/2015 sacamos las placas de la jarra de anaerobiosis y con los
anaerobios ya crecidos hicimos una tinción de Gram
Resultado.
Pudimos observar varias morfologías de bacterias. En mi caso se observaron
Estafilococos, estreptococos, diplococos, bacilos gram – y cocos gram +.
Práctica 2
RPR- carbón
Fundamento.
RPR- carbón es una técnica no treponémica de aglutinación en porta para la detección
cualitativa y semicuantitativa de reaginas plasmáticas en suero humano. Las partículas
de carbón sensibilizadas con una mezcla de lípidos, son aglutinadas en presencia de
reaginas presentes en la muestra del paciente afectado por sífilis.
Material.
Pipetas automáticas.
Porta con pocillos para RPR-
carbón.
Agitador mecánico.
Palillo mezclador
Reactivos.
Solución salina.
RPR carbón
Control + (tapón rojo)
Muestra.
Suero fresco.
Procedimiento.
1. Atemperamos los reactivos y muestra a temperatura ambiente.
2. Depositamos 50 µl de reactivo control + en el primer pocillo. En el segundo
pocillo ponemos 50 µl de control + más 50 µl de solución salina.
3. Realizamos una dilución seriada y añadimos 20 µl de partículas de carbón.
4. Llevamos al agitador y leemos el resultado
Resultados
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente
después de retirar el porta del agitador. Agitamos el porta manualmente antes de
realizar la lectura.
Aglutinación hasta ¼
Práctica 3
TPHA
Fundamento
Es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección
cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos específicos anti- Treponema pallidium en
suero humano.
Materiales
Pipetas automáticas
Placa con microtitulación con fondo en U
Reactivos
R1: Células test (TC)
R2: Células control (CC)
R3: Diluyente (DIL)
Control +
Control –
Muestra
Suero fresco
Procedimiento
1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Preparamos una dilución 1/20 en diluyente (10µl de suero + 190 µl de
diluyente).
3. Pipeteamos en los pocillos:
Muestra 1/20 o controles (µl)
25 25
Células control (µl) 75 --
Células test (µl) -- 75
4. Agitar suavemente la placa hasta homogeneizar.
5. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente 45-60 minutos.
6. Examinar macroscópicamente los patrones de aglutinación de las células.
Resultados
Aglutinación en el pocillo CT3, por lo tanto, resultado positivo
No hay aglutinación en el pocillo CC3, por lo tanto, resultado negativo
Práctica 4
Método de difusión en Agar y Método Epsilon test
Método de difusión en Agar
Fundamento.
El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la que se
enfrentan la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una
solución antibiótica absorbida en discos de papel de filtro. Este método está
estandarizado y lo halos de inhibición han sido obtenidos relacionándolos con las CMI
que aparecen en una tabla.
Muestra.
Cultivo puro (En este caso, E-Coli)
Materiales.
Solución salina.
Hisopo estéril
Asa de siembra de plástico.
Discos antibióticos
Procedimiento.
Inoculamos 3 o 4 colonias de bacterias,sembradas del día anterior ,en 3 ml de solución
salina. Una vez inoculadas las bacterias, mojamos un hisopo estéril en dicha solución,
quitamos el exceso y en una placa de Mueller- Hinton sembramos pasando
uniformemente el hisopo por toda la placa hasta cubrirla entera.
Dejamos secar unos minutos y con unas pinzas estériles colocamos los discos de
antibiótico sobre la superficie del agar apretándolas suavemente.
Los antibióticos puestos en la placa fueron los siguientes:
Amoxicilina ( AMC)
Vancomicina (Va)
Tobramicina (NN)
Cefotaxina (CTX)
Nalidipsico (NA)
Resultados.
Amoxicilina: halo de inhibición 21mm de diámetro, E-coli sensible al
antibiótico.
Vancomicina: No hay halo de inhibición por tanto el microorganismo es
resistente al antibiótico.
Tobramicina: Halo de inhibición 19mm de diámetro, E-coli sensible al
antibiótico.
Cefotaxina: Halo de inhibición 37mm, E-coli sensible al antibiótico.
Nalidipsico: halo de inhibición de 28mm, E-coli sensible al antibiótico.
Método del Epsilon Test
Fundamento
Podemos determinar, mediante lectura directa, la concentración inhibitoria mínima.
Materiales
Hisopo
Mechero Bunsen
Tiras de E-test
Muestra
Utilizamos el microorganismo E-Coli
Procedimiento
1. Con el asa de siembra esteril tomamos 3 o 4 colonias de E-coli y las añadimos a
un tubo con solución salina fisiológica. Mezclamos hasta que la turbidez del
inóculo sea la adecuada.
2. Introducir un hisopo estéril en el inóculo empapándolo bien y sembramos en
sábana en la placa.
3. Colocar la tira de E-test en el centro de la placa.
4. Incubar a 37 ˚C durante 24 horas.
5. Observar el halo de inhibición.
Resultado
La concentración mínima inhibitoria es de 0,5 mg/ml.
Práctica 5
Urocultivo
Fundamento
Detectar y cuantificar los microorganismos causantes de infección en la orina.
Materiales
Medio Cled
Medio McConkey
Medio CPS cromogénico
Asa de siembra desechable
Asa calibrada de 1 µl para medio
Cled
Muestra
Orina manipulada con Enterococcus
Procedimiento
1. Tomamos 3 o 4 colonias de enterococcus y las introducimos en la orina.
2. Con el asa de siembra
a. En medio Cled realizamos una línea hasta la mitad de la placa y a partir
de ella hacemos estrías. Para finalizar hacemos dos firmas partiendo de
los sembrado.
b. En medio Mc Conkey se siembra por agotamiento de estrías para
obtener aislamiento de colonias
c. En CPS cromogénico se procede como en el medio McConkey para
aislamiento y recuento de colonias.
3. Incubamos a 37 ˚C durante 24 horas.
Resultados
Medio Cled: Fermentación de lactosa. Colonias de color amarillo.
Medio McConkey: no hay crecimiento de bacterias
Medio CPS cromogénico: Aparecen colonias color verde son beta-
galactosidasas
Práctica 6
Laminocultivo
Fundamento
Detectar y cuantificar los microorganismos causantes de infecciones urinarias
Materiales
Pipeta pasteur
Sistema de laminocultivo (Medio McConkey y medio Cled)
Muestra
Orina reciente manipulada con Enterococcus
Procedimiento
1. Con ayuda de una asa de siembra estéril tomamos una cantidad de Entercoccus
e inoculamos en la orina
2. Con ayuda de una pipeta impregnamos el sistema de laminocultivo.
3. Incubamos en la estufa, sin cerrar del todo el bote, a 37 ˚C durante 24 horas.
Resultado
En medio Mc Conkey no hay cambio de color por tanto no hay crecimiento de
bacterias
En medio Cled el medio cambia de color de azul a amarillo por tanto las bacterias son
fermentadoras de lactosa.
Práctica 7
Coprocultivo
Fundamento
El coprocultivo permite aislar e identificar microorganismos responsables de procesos
diarreicos.
Materiales
Asa de siembra
Mechero Bunsen
Escobillón estéril
Medios de cultivo
Caldo selenito
Agar SS
Agar McConkey
Agar Sangre
Agar Hektoen
Agar XLD
Muestra
Heces sólidas, por lo tanto realizar una suspensión densa, en 2,5 ml de solución salina
estéril, tomando una porción de heces del tamaño de un guisante y agitando hasta su
homogenización.
Procedimiento
1. Con ayuda de un hisopo estéril realizar una siembra en estrías, desde un borde
hasta la mitad de la placa. A continuación, con la ayuda de un asa de siembra
estéril, se siembra por agotamiento de estrías en el resto de la placa.
2. Introducir el hisopo en el caldo selenito, agitándolo ligeramente.
3. Incubar las placas y el caldo a 37 ˚C durante 24 horas.
4. Al día siguiente, se realiza una resiembra del caldo en agar SS.
Resultado
Agar SS: Colonias marrones, no fermentadoras de lactosa, sin centro negro
(Shigella)
Agar Hektoen: Colonias azul- verdosas, sin centro negro ( Shigella)
Agar XLD: Colonias rojas sin centro negro ( Shigella)
Agar McConkey: Colonias incoloras.
Agar sangre: Para observar si existe disbacteriosis.
Práctica 8
Rotavirus/ Adenovirus
Fundamento
El dispositivo Rota/ Adeno es una prueba rápida, que utiliza la tecnología de a
inmunocromatografía para la doble detección cualitativa de rotavirus y adenovirus en
un extracto único de heces.
Materiales
Recipiente necesario para la recogida de muestras
Cronómetro
Centrífuga
Muestra
Heces recientes diluidas en solución salina
Procedimiento
1. Sacar el dispositivo de la bolsa sellada y utilizar rápidamente.
2. Colocar el dispositivo en una superficie plana.
3. Romper el embudo del frasco que contiene la muestra diluida
4. Invertir el frasco y mantener en posición vertical. Poner dos gotas de la muestra
en el pocillo del dispositivo y comenzar a cronometrar.
5. Esperar la aparición de la línea control y eventualmente las líneas R y/o A
Resultado
Positivo ya que aparece una línea en la zona de control y una línea azul en R.
Muestra positiva para Rotavirus pero negativa para Adenovirus.
Práctica 9
Siembra de mohos y observación en freso de mohos
Fundamento
Observación de mohos
Materiales
Asa de siembra
Agua destilada
Medio Saboureaud
Azul de lactofenol
Portaobjetos y cubreobjetos
Muestra
Mohos de la mandarina
Procedimiento
1. Mojamos el asa de siembra en agua destilada y raspamos la piel de la
mandarina.
2. Sembramos en medio saboureaud pinchado con cuidado en el centro de la
placa e incubamos a 37 ˚C durante 24 horas
3. Para la observación, raspamos la piel de la mandarina y ponemos en un
portaobjetos una gota de azul de lactofenol junto con el raspado.
4. Cubrir la preparación con un portaobjetos y observar al microscopio.
Resultado
Observación de IFAS y esporas.
Práctica 10
Test de Filamentación
Fundamento
Observación de
Materiales
Placa con colonias de C. Albicans
Portaobjetos y cubreobjetos
Mechero Bunsen
Microscopio
Suero muestra
Asa de platino
Procedimiento
1. A un tubo de suero le añadimos con el asa de platino una colonia sospechosa
de C. Albicans
2. Incubamos durante 3 horas en aerobiosis a 37 ˚C
3. Depositar una gota de la suspensión en el portaobjetos
4. Cubrimos con un cubreobjetos y observamos al microscopio
Resultado
Observación de hifas y tubos germinales.
Práctica 11
Serodiagnóstico de la toxoplasmosis por
hemoaglutinación indirecta
Fundamento
Permite la determinación cuantitativa de anticuerpos séricos dirigidos contra
Toxoplasma Gondii por hemoaglutinación indirecta.
Materiales
Micropipetas
Tubos para hemólisis
Microplacas con fondo en U
Reactivos
R1: hematíes sensibilizados
R2: Hematíes no sensibilizados
R3: 2- mecaptoetanol
Control +
Control –
Suero control
Procedimiento
1. Preparamos la solución madre con 50 µl de suero y 1,95 ml de tampón fosfato.
2. Con la ayuda de una micropipeta ponemos 50 µl de tampón fosfato en los 8
pocillos.
3. Dispensar 50 µl de la dilución madre de suero en el 1º pocillo.
4. Mezclar con el tampón y transferir 50 µl del 1º pocillo al 2º, del 2º al 3º y así
sucesivamente hasta el 6º pocillo donde se descartan 50 µl.
5. Dispensar 50 µl de la dilución madre de suero en el 7º pocillo, mezclar con el
tampón y descartar 50 µl.
6. Agitamos cuidadosamente la suspensión de hematíes
a. Depositar una gota de hematíes sensibilizados en los 6 primeros
pocillos.
b. Depositar una gota de hematíes no sensibilizados en el pocillo 7 (suero
control).
c. Depositar una gota de hematíes sensibilizados en el pocillo 8 (reactivo
control).
7. Homogeneizar cuidadosamente el contenido de los pocillos
8. Leer la reacción 2 horas más tarde.
Resultados
Se observó hemoaglutinación en los dos primero pocillos (reacción positiva) en los que
se podía observar un anillo más o menos grande en el fondo de dichos pocillo,mientras
que en el resto de pocillos había un fino ribete periférico que indicaba que no había
aglutinación y por tanto el resultado es negativo.
Práctica 12
Técnicas de aglutinación
1. PCR latex
Fundamento
Técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de
PCR en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con Ac anti-PCR humana son
aglutinadas por moléculas de PCR presentes en la muestra del paciente
Reactivos
Látex
Control +
Control –
Muestra
Suero fresco
Procedimiento
Técnica cuantitativa
1. Depositamos 50 µl de la muestra y una gota de cada uno de los controles sobre
círculos distintos de un porta
2. Homogeneizar suavemente el reactivo de PCR- látex antes de usar y colocar 50
µl junto a cada una de las gotas anteriores.
3. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del círculo.
4. Situar el porta sobre un agitador y agitar durante 2 minutos
Hay aglutinación tanto en la muestra como en el control +, por tanto el resultado es
positivo
Técnica semicuantitativa
1. Realizar diluciones dobles de la muestra en solución salina 9g/L
2. Proceder para cada dilución como en la muestra cuantitativa.
Aglutina hasta la dilución ½
2. ASO Látex
Fundamento
Es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa
de anti-estreptolisina O (ASO) en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con
estreptolisina O (SLO) son aglutinadas por anticuerpos ASO presentes en la muestra
del paciente.
Reactivos
Látex
Control +
Control –
Muestra
Suero fresco
Procedimiento
Técnica cualitativa
1. Depositar 50 µl de la muestra a ensayar y una gota de control + y – sobre
círculos distintos de un porta.
2. Mezclar el reactivo de ASO- látex vigorosamente y depositar 50 µl junto a cada
gota de las anteriores.
3. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del círculo.
4. Situar el porta en un agitador y agitar durante 2 minutos
Podemos observar aglutinación tanto en la muestra como en el control +, por lo tanto
el resultado de la prueba es positivo.
Técnica semicuantitativa
1. Realizar diluciones dobles de la muestra en solución salina 9g/L.
2. Proceder para cada dilución como en la prueba cualitativa.
Observamos aglutinación hasta a dilución 1/1.
3. FR- Látex
Fundamento
Técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de
factores reumatoides (FR) en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con
gamma-globulina humana son aglutinadas por factores reumatoides presentes en la
muestra del paciente.
Reactivos
Látex
Control +
Control –
Muestra
Suero fresco
Procedimiento
Técnica cualitativa
1. Depositar 50 µL de la muestra a ensayar y una gota de cada uno de los
controles Positivo y Negativo, sobre círculos distintos de un porta.
2. Homogeneizar suavemente el reactivo de FR- látex antes de usar. Depositar 50
µL junto a cada una de las gotas anteriores.
3. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del círculo.
4. Situar el porta sobre un agitador y agitar durante 2 minutos.
No observamos aglutinación en ningún pocillo por lo que el resultado de la prueba es
negativo.
4. Waaler Rose
Fundamento
Técnica de hemaglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa
de FR en suero humano. Los hematíes estabilizados de oveja y sensibilizados con IgG
de conejo antihematíe de oveja, son aglutinados por FR presentes en la muestra del
paciente.
Reactivos
Látex
Control +
Control –
Muestra
Suero fresco
Procedimiento
Técnica cualitativa
1. Depositar 50 µL de la muestra a ensayar y una gota de cada uno de los
controles Positivo y Negativo, sobre círculos distintos de un porta.
2. Mezclar el reactivo de WR vigorosamente antes de usar. Depositar 50 µL junto
a cada una de las gotas anteriores.
3. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del círculo.
4. Situar el porta sobre una superficie lisa y plana durante 2 minuto
Se observa aglutinación en la muestra y en el control +, por lo que la prueba resulta
positiva.
Práctica 13
Observación de hongos con azul de lactofenol
Procedimiento
Tomamos una pequeña cantidad de hongos y las colocamos en un portaobjetos junto
con una gota de azul de lactofenol, cubrimos con un cubreobjetos y observamos al
microscopio.
Resultado
Observación de hifas, blastoesporas y micelios
Práctica 14
Siembra y frotis de exudado vaginal
Fundamento
La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal, cuyo conocimiento y
consideración debe tenerse en cuenta a la hora del estudio microbiológico de
infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones:
Saber cuándo se altera el equilibrio de esta flora colonizante.
Búsqueda de agentes exógenos, transmitidos normalmente por vía sexual.
Detección de portadoras de determinados microorganismos.
Materiales
Escobillón estéril
Agar Saboreaud con cloranfenicol
Medio XLD
Agar Sangre
Procedimiento
1. Con el escobillón realizamos una siembra desde el borde de la placa hasta el
medio de ella.
2. Incubar a 37 ˚C durante 24 horas
Resultados
Agar saboureaud con cloranfenicol: No se observan colonias
Medio XLD: No han crecido colonias
Agar sangre: Se observan colonias de distintos tamaños y distinta forma.
Para diferenciar que tipo de microorganismos han crecido, con las colonias
sospechosas, hacemos una tinción de Gram.
Resultado de la tinción de Gram:
Cocos Gram +
Bacilos Gram –
Además de la tinción de Gram realizamos un frotis de exudado vaginal con panóptico
rápido y se observaron:
Células de descamación y levaduras
Práctica 15
Exudado nasal
Fundamento
Observar los distintos microorganismos del exudado nasal
Materiales
Hisopo estéril
Medio Manitol
Mechero bunsen
Procedimiento
1. Con un hisopo estéril tomamos una muestra de exudado nasal y sembramos
por agotamiento en un medio manitol
2. Incubar durante 24 horas a 37 ˚C
3. Observar macroscópicamente.
Resultados
Pudimos observar como el medio cambió de color rojo a amarillo, por lo tanto, el
microorganismo que creció fue S. Aureus.
