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Procesamiento de muestras para
estudio inmunohistoquimico cromogenico
Santiago SepúlvedaJorge Gatica
Objetivos Conservar la inmunoreactividad de
células y tejidos Conservar la localización antigénica. No provocar interferencia con los
procedimientos inmunohistoquimicos Preservar la morfología del tejido
Tipos de muestras para estudio IHQ
CÉLULAS DE CULTIVO CÉLULAS EN SUSPENSIÓN FROTIS CITOLÓGICOS FROTIS SANGUÍNEOS CORTES EN CRIÓSTATO CORTES EN PARAFINA CORTES ULTRAMICRÓTOMO
Procesamiento de muestras incluidas en parafina para IHQ cromogenica
ETAPAS A CONSIDERAR: FIJACIÓN IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN CORTE Y MONTAJE RECUPERACION DE
INMUNOREACTIVIDAD
Fijación Detener los procesos de autólisis.
Especialmente la acción de proteasas y nucleasas
Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.
Preparar al tejido para los procedimientos posteriores
Anti-microbiano
Fijación con formaldehido Fijador más utilizado Formalina neutra
10% pH 7,0 La fijación involucra una interacción con
proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.
Provoca enmascaramiento de antígenos, perjudicando la inmunotinción.
Requiere de recuperación antigénica.
Aclaramiento e impregnación en parafina
Agente aclarante en buen estado Temperatura de las parafinas de
impregnación entre 56 -62°C. Tiempo de impregnación entre 30 –45
minutos en cada parafina.
Corte y montaje. Grosor recomendado:4 –5 µm. Montaje en portaobjetos previamente
silanizados. Evitar cortes con melladuras,
irregularidades, gruesos o desgarrados.
Recuperación de inmunoreactividad
El formaldehido y otros reactivos forman enlaces cruzados intra e inter proteicos que enmascaran a los epitopos originando falsos negativos.
Los métodos de recuperación están designados para romper lo enlaces cruzados, desenmascarando los epitopos y aumentando la intensidad de las inmunotinciones.
Recuperación antigénica mediante calor (HIER)
El más utilizado Incubacion de placas en buffer (citrato
pH 6,0 o EDTA pH 8,0) Llevar a temperatura de 90°C aprox con
fuente de calor (sea vaporera, olla a presion o microondas) por un tiempo aprox de 25 min.
Bloqueo de peroxidasa endógena y de reactividad inespecífica
Necesarios para resultados óptimos en IHQ cromógenica. Evitan falsos positivos.
Bloqueo de peroxidasa endogena 3% H₂O₂
NECESARIA SI SE USA HRP COMO ENZIMA EN LA REACCION CROMOGENICA. Bloqueo de reactividad inespecifica
PBS/BSA al 2,5%.
Incubación con ac. primario Anticuerpo especifico para el antígeno a
estudiar. Debe ser compatible con el sistema de
detección a utilizar posteriormente. En ocasiones, puede tener conjugado el
sist. de detección.
Demostración de reacción ag-ac mediante uso de enzimas
La enzima está activa Va conjugada al componente del
penúltimo paso de la inmunotinción La actividad de la enzima se revela
mediante un sustrato y un cromógeno.
Incubación con anticuerpo secundario
Reconoce al anticuerpo primario Suele estar conjugado con biotina, con
el sistema de detección o utilizarse como puente.
Sistema de amplificación Amplifica la señal de la reacción ag.-ac.