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Universidad de Carabobo Sede AraguaEscuela de Medicina “Witremundo Torrealba”
Departamento de Bioquímica
Abril, 2015
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
AGENDA
Explicar las principales aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante en la medicina.
Principales aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante en medicina:
1. Diagnóstico de algunas enfermedades de origen genético
2. Detección de carga viral en pacientes con VIH, Hepatitis viral y Dengue
3. Producción de medicamentos y vacunasTerapia génica: - En células germinales - En células somáticas - Utilización de oligonucleótidos antisentido
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GENÉTICAS
Detección de las alteraciones o variaciones de la constitución genética de un individuo que están directa o indirectamente relacionadas con estados patológicos.
Diagnóstico
Molecular
DIRECTO INDIRECTO
Pretende la caracterización, con la
mayor precisión posible, del genotipo de un
individuo
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIRECTO
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GENÉTICAS
El máximo nivel de precisión del diagnóstico directo se obtiene con la secuenciación de los nucleótidos correspondientes al locus mutado
Por lo general se realiza mediante el estudio de los cambios que se producen en:
La estructura primaria del ADN
(secuencia)
Las propiedades físico-químicas de la
molécula de ADN
Los cambios que se presentan en el producto génico
(ARNm o proteína)
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIRECTO
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GENÉTICAS
Herramientas y metodologías para la detección de mutaciones
1. Las enzimas de restricción
2. Las técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos
3. La hibridación de ácidos nucleicos
4. La amplificación enzimática del ADN (PCR)
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIRECTO
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GENÉTICAS
MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTA DE MUTACIONES
Veremos a continuación mediante algunos ejemplos como se aplican estas técnicas básicas en el diagnóstico genético:
DETECCIÓN DIRECTA DE UNA MUTACIÓN QUE ALTERA UNA
DIANA DE RESTRICCIÓN
Figura 1. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001
Detección de la mutación que causa anemia falciforme mediante digestión con el enzima Mst I I .
Figura 2. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001
Detección de la mutación de anemia falciforme mediante PCR y digestión con el enzima Mst II.
DETECCIÓN DIRECTA DE LA SECUENCIA MUTADA
Detección de mutaciones en el gen de la fibrosis quística mediante oligonucleótidos específicos de alelo.
Figura 3. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001
DETECCIÓN DE MUTACIONES POR DELECIÓN
Mutación en el gen de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)
Perdida en el tono muscular
El gen ocupa más de 2 megabases de ADN
A edades más avanzadas la
musculatura se debilitaTranscripción de 13
kb
Pérdida de nucleótidos en una secuencia de ADN
Figura 4. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001
PCR Multiplex, como método de detecciónDetección
simultánea de distintas
deleciones en el gen DMD
Se amplifican de forma
simultánea distintos exones
del gen
El resultado del PCR se analiza
en una electroforesis
DETECCIÓN DE MUTACIONES INESTABLES
Expansión de unidades de repetición de tres nucleótidos.
Genes humanos responsables de patologías neurológicas
La repetición puede localizarse tanto en los exones como en los intrones
Figura 5. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001
Detección de mutaciones dinámicas mediante PCR o
hibridación.
DETECCIÓN DE NUEVAS MUTACIONES
Detección de variantes polimórficas mediante PCR y polimorfismo de cadena sencilla (SSCP).
Detección de variaciones en el apareamiento
Detección de cambios de conformación
Detección de productos génicos alterados
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GENÉTICASDIAGNÓSTICO MOLECULAR
INDIRECTO
Es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutación a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo es preciso conocer la localización cromosómica del locus implicado.
Figura 7. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001
DETECCIÓN DE CARGA VIRAL
EN PACIENTES CON VIH, HEPATITIS VIRAL Y DENGUE
Carga viral es la cuantificación de la infección por virus.
El análisis comprobó que el VIH nunca está “latente” y que se multiplica constantemente.
Detectar virus varios días después de la infección.
Carga viral puede predecir cuánto tiempo una persona se mantendrá saludable.
Todas las técnicas difieren en sus formatos pero
principalmente se encargan de
detectar el virus dependiendo de la
cantidad.
RT-PCR
RT-PCR en tiempo real
AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA
DE ARN
AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL
POR HIBRIDACIÓN MOLECULAR
Existen diversos métodos para la cuantificación
correcta de los virus (VIH, Dengue y Hepatitis).
Para estos virus, se pueden realizar las siguientes pruebas:
Esta prueba se basa en cinco procesos fundamentales:
• a) Extracción de ARN.
• b) Transcripción del ARN diana para generar ADN complementario.
• c) Amplificación por PCR de éste ADNc con iniciadores específicos.
• d) Hibridación de los productos amplificados con sondas oligonucleotídicas, específicas para las dianas.
• e) Detección por colorimetría de los productos amplificados y unidos a las sondas.
1. RT-PCR:
Se obtiene un patrón de cuantificación que pasa por las
fases de: Preparación de muestras, transcripción inversa, amplificación,
hibridación y detección.
• Usada solo para la Serotipificación.
• Consiste en una transcripción reversa inicial, en la que el ADN viral se convierte en ADN copia por la Transcriptasa reversa.
• Luego se amplifica una región conservada del virus.
• Consta de 3 Pasos:
PCR con Transcripción Reversa:
Pre- PCR
Transcriptasa Reversa
Post-PCR
Extracción del ARN.
ARN a ADN.
Punto final que indica si la prueba es positiva o no.
• Se usa para diagnóstico y serotipificación.
• Permite serotipificar y cuantificar el virus (Carga viral).
• Combina el PCR convencional con el uso de marcadores fluorecentes.
• Comparte los primero pasos del PCR convencional, excepto el punto final.
• Se observan curvas de amplificación y se obtiene un resultado cuantitativo.
• Los marcadores fluorecentes pueden ser: SYBR Green o sondas tipo TaqMan.
2. RT- PCR en tiempo real:
Existen múltiples formatos de sondas específicas, siendo las más frecuentemente utilizadas las sondas Taqman, FRET y “molecular beacons”.
• PCR en Tiempo Real (Carga Viral).
• Cuantificación del RNA del virus de la Hepatitis C por amplificación de ácidos nucléicos.
• Detección de fluctuaciones de la carga viral.
• Linealidad de: 43 a 69.0 millones UI/ml.
• Límite de detección: 15 UI/ml.
• Hepatitis C Viral:
La respuesta al tratamiento antiviral se evalúa con una carga viral basal (pre-tratamiento) y al menos una carga viral al término de éste y a las 24 semanas post
tratamiento.
• PCR en Tiempo Real (Carga Viral).
• Cuantificación de los niveles de DNA del virus de la Hepatitis B, para evaluación de la eficacia de la terapia antiviral.
• Linealidad de: 54.5 a 110.0 millones UI/ml.
• Límite de detección: 12 UI/ml Plasma (Carga Viral).
• Hepatitis B Viral:
• Las secuencias de ácidos nucleicos diana se pueden amplificar exponencialmente en condiciones isotérmicas(41ºC).
• Transcriptasa inversa, RNasa H, y una polimerasa ARN dependiente de ADN.
• Mimetiza el ciclo de replicación retroviral del ARN a través de un ADNc intermedio.
3. Amplificación isotérmica de ARN o NASBA:
Acumulación de copias de ADNc y ARNss de las secuencias diana.
• Es una técnica relativamente reciente, basada en la amplificación de señal que implica una serie de hibridaciones de ácidos nucleicos en la superficie del pocillo de una microplaca.
• Se pueden detectar hasta un mínimo de 500 partículas virales.
• Se basa en la amplificación de señales detectadas (CUANTIFICACIÓN DIRECTA) y no en la amplificación de secuencias diana.
4. Amplificación de señal por hibridación molecular o bDNA :
¿ TERAPIA GENÉTICA ?
Cuando hay algún trastorno
de origen proteico, se
recurre a una serie de técnicas
que permitan revertirlo
ADN
ARN
Introducción de material genético
funcional en sustitución de
uno o mas genes defectuosos en la célula diana de un organismo
TERAPIA GENÉTICA
TERAPIA GENÉTICA
Células no germinales
No heredable
Células somáticasCélulas
germinales
Mejora de gametos, heredable
No usada en humanos
TERAPIA GENÉTICA
Células germinale
s
TERAPIA GENÉTICA
Oligonucleótidos
anti-sentido artificialmente
diseñados que
interfieren con el flujo
de informac
ión genética
.
Secuencias antigen
Secuencias antisentidoRibozimas
BIBLIOGRAFÍA
"El diagnóstico de las enfermedades hereditarias” Dr. Joan Fibla Palazón. Departament de Ciències Mèdicas Bàsiques. Facultat de Medicina. Universitat de Lleida.
“Terapia Génica” C. L. RONCHERA-OMS J. Mª. GONZÁLEZ
http://www.aidsinfonet.org/fact_sheets/view/125?lang=spa
http://www.cibic.com.ar/medicos/metodos-carga-viral-hepatitis-c-en-contexto-nuevos-tratamientos/
¡Gracias por suatención!
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