Uso de las tinciones en microbiología

Tinción de Gram

Descubierta por Hans Christian Gram.

Usada con frecuencia para examen microscópico directo de muestras y subcultivos.

Técnica de tinción de Gram

1. Realizar frotis delgado del material a estudiar y dejar secar al

2. Fijar el material en el portaobjeto pasándolo 3 ó 4 veces a través de la llama de un mechero Bunsen.

3. Colocar el frotis sobre un soporte para tinción y cubrir la superficie con solución de cristal violeta por el lapso de 1 min.

4. Lavar con agua destilada o buffer.5. Cubrir el frotis con solución de yodo, durante 1 min.6. Lavar nuevamente con agua.7. Cubrir la placa con decolorante de alcohol acetona

hasta que no desprenda mas el color violeta, (10 seg.).8. Lavar con agua corriente.9. Cubrir la placa con safranina durante 1 min.10. Lavar con agua corriente y colocar la placa en una

posición que drene el exceso de agua y el frotis seque.11. Observar el frotis con 1 gota de aceite de inmersión con

objetivo x 100.

Interpretación

Fundamento de la Tinción de Gram

1. Las bacterias Gram positivas, fijan el colorante cristal violeta (colorante primario), que al unirse al lugol (mordiente), forman un complejo insoluble en agua, debido a que las bacterias GP, poseen en su pared celular, RNA en forma de ribonucleato de magnesio. Este complejo imposibilita que el colorante cristal sea barrido por el alcohol acetona, quedando teñida de color morado.

2. Las bacterias Gram negativas, no poseen este compuesto en su pared celular, por lo tanto no forman el complejo insoluble, se tiñen con el último colorante ( fucsina básica) que es de color rosado.

Gram PositivosCocos:

Cocos en racimos = estafilococos

Cocos en cadenas = estreptococos

Diplococos Grampositivos = Streptocococus pneumoniae.

Grandes bacilos Grampositivos como:Especies de Bacillus o Clostridium

Pequeños bacilos Grampositivos como:

Especies de listeria ó Corynebacterium

Gram Negativos

Bacilos:

Bastones Gramnegativos curvos: especies de vibrio (en heces diarreicas), Campylobacter.

Bacilos: Haemóphilus.

Diplococos en forma arriñonada: especies de Neisseria

Bacilos GramNeg.

Las micobacterias están recubiertas por un grueso material céreo que resiste la tinción, sin embargo una vez teñidas las células bacterianas resisten la decoloración con solventes orgánicos fuertes como alcohol ácido. Por ese motivo, estas bacterias se conocen como acidorresistentes, fenómeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1882.

Ej. microbacteria de la tuberculosis

Tinción para Microorganismos Acidoresistentes

Técnica de tinción de Ziehl- Neelsen

1. Realizar frotis delgado del material a estudiar, dejar secar al aire.

2. Fijar el material en el portaobjeto pasándolo 3 ó 4 veces a través de la llama de un mechero Bunsen.

3. Colocar el frotis sobre un soporte para tinción y cubrir la superficie con solución fucsina fenicada por 3 min. Mientras se calienta la placa de la siguiente manera:

4. Pasar la llama por debajo de la placa, hasta la emisión de vapores, dejar enfriar. Repetir esta operación tres veces.

5. Lavar la placa con abundante agua corriente para eliminar el exceso de colorante.

6. Decolorar con la solución de alcohol ácido hasta que el extendido no elimine mas colorante, 30 seg.

7. Lavar la placa con agua.

8. Cubrir la placa con azul de metileno por el lapso de 1 min.

9. Lavar con agua el exceso de colorante.

10.Dejar secar la preparación y examinar al microscopio aplicando una gota de aceite de inmersión X100.

Otras tinciones

Azul Crecil brillante Colorante de Leifon