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Nuevas tecnologías de detección
HPV
Aplicación clínica
Alfonso Alba Menéndez
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES DE GALICIA
HPV
Detectar la presencia
¿Qué método uso?
EDAD
AL DIAGNÓSTICO
CONTROL ASC-US
CONTROL POST-TTO
¿ VACUNA?
¿REQUIERO TIPAJE?
Tipar
¿Qué es persistencia?
CARGA VIRAL
INTEGRACIÓN
¡Valor predictivo negativo!
Ordi J, Alonso I, Torne A, Esteve R, Sierra E, Campo E, Puig-Tintore LM. Human papillomavirus load in Hybrid Capture II assay: does
increasing the cutoff improve the test?
Gynecol Oncol. 2005 Nov;99(2):313-9.
Vacunas
¿Se debe tipar?
ALTA SENSIBILIDAD
TIPO ESPECÍFICO
Persistencia
GRUPO DE RIESGO
TIPAJE ESPECÍFICO
VARIANTES
¿Es necesario?
Tiempo
Carga viral
Sensibilidad
45, 33, 56 16, 33 16
Dinámica de la infección VPH
VPH 45 VPH 33 VPH 56 VPH 16
Tiempo
Carga viral
Sensibilidad
45 16 Negativo
Dinámica de la infección VPH
VPH 45 VPH 33 VPH 56 VPH 16
¿ Cual es la base común de todas las técnicas de detección
molecular ?
Complementaridad del ADN
• 5'UTR 575..607 /gene=“E6” ORF 689..>762 /gene=“HPV16" /number=1 BASE COUNT 200 a 207 c 206 g 149 t ORIGIN 1 1 1gatctgcctt ccttcctgcc cccatgtttg tctttccttg tttgtcttta tatagatcaa 61
gcaggtttta aattcctagt aggagcttac atttactttt ccaaggggga
gggggaataa 121 atatctacac acacacacac acacacacca cactggagtt
cgagacgagg cctaagcaac 181 atgccgaaac cccgtctcta ctaaatacaa
aaaatagctg agcttggtgg cgcacgccta 241 tagtcctagc tactggggag
gctgaggtgg gaggatcgct tgagcccaag aagtcgaggc 301 tgcagtgagc
cgagatcgcg ccgctgcact ccagcctgag cgacagggcg aggctctgtc 361
tcaaaacaaa caaacaaaaa aaaaaaggaa aggaaatata acacagtgaa
atgaaaggat 421 tgagagaaat gaaaaatata cacgccacaa atgtgggagg gcgataacca ctcgtagaaa
Selección de la técnica
Todas las técnicas de detección se basan en la hibridación de secuencias complementarias de nucleótidos
Selección de la técnica
Captura de híbridos
La sensibilidad y especificidad de todas las técnicas moleculares depende de
parámetros de astringencia
Hibridación reversa
PCR
Secuenciación
Ventajas
• Captura de Híbridos: Manejo
• PCR: Sensibilidad
• Secuenciación: “Gold Standard”
• Hibridación inversa: Archivo; infección múltiple
Inconvenientes
•Captura de Híbridos: No diferencia tipos
•PCR: Personal experto
•Secuenciación: Costo
•Hibridación inversa: Costo /requiere
PCR previa
Los resultados citológicos dependen de la calidad de la toma y existen variaciones inter e intraobservador
Los resultados moleculares NO dependen de la calidad de la toma ni del realizador
FALSO
LOS RESULTADOS MOLECULARES DEPENDEN DE
MULTITUD DE FACTORES
Calidad de la toma, tipo de muestra y conservación
Extracción y purificación del ADN
SELECCIÓN DE LA TECNICA
Reactivos
Lectura e interpretación de resultados
Calidad de la toma, tipo de muestra y conservación
Garantizar criterios de calidad comparables internacionalmente en
la detección y tipaje del ADN del papillomavirus humano, (HPV)
Porcentaje de detección de VPH en muestras calibradas
72,87 (95%CI; 43–95)
Porcentaje de detección de VPH en muestras calibradas
72,87 (43–95)
Determinaciones estimadas de VPH en 2009
125.000
33900 mujeres deficientemente caracterizadas
cada año en España (Pob.49 millones)
CASO A CASO B CASO C
Infección superficial transitoria
Infección bloqueada por respuesta inmune
humoral
Infección intracelular con alto riesgo
¿ Cómo suplir las deficiencias de la determinación cualitativa del
ADN viral ?
Determinación de VPH
Depende de las características morfológicas y biológicas de la lesión
[ADN E6/E7] Potencial transformación
ALTA ?
MEDIA ?
BAJA ?
MEDIA ?
E6 / E7
El ARNm nos permitirá determinar la cantidad de proteína oncogénica presente
y, con ello, una estimación real de acerca de la respuesta celular
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES
DNA
RNA-RNAs
PROTEÍNA
DOGMA GENERAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES
DNA E6 DNA E6
Transcripción a mRNA
Traducción a proteína
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES
¿comportamiento de las lesiones?
[Prot E6/E7] Potencial transformación
ALTA ELEVADO
MEDIA MODERADO
BAJA BAJO
MEDIA MODERADO
Carga viral total ALTA BAJA
(respuesta)
Carga viral total ALTA BAJA
(respuesta)
Carga viral relativa ALTA BAJA ALTA BAJA
(persistencia)
Carga viral relativa ALTA BAJA ALTA BAJA
(persistencia)
Expresión de ARNm ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA
(proteína)
Expresión de ARNm ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA
(proteína)
Riesgo relativo MUY ALTO BAJO MEDIO BAJO ALTO MEDIO ALTO MUY BAJORiesgo relativo MUY ALTO BAJO MEDIO BAJO ALTO MEDIO ALTO MUY BAJO
ARN mARN m
Espectrometría de masas en tandem
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser desorption/ionization
(MALDI) Time of flight (TOF)
Selección de la técnica
HPV % Total % relativo Expresión
16 53% 64%
18 16% 21%
31 11% 09%
33 n.d n.d
45 n.d n.d
56 20% 0,6%
E6-E7 HPV16 44 UR
E6-E7 HPV18 12 UR
E6-E7 HPV31 09 UR
E6-E7 HPV45 n.d.
p16 37 UR
E2F n.d
Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) Time of flight (TOF)
4518
31
3316
p16
E2F
MS/MS permite el análisis simultáneo de
hasta 80 analitos por paciente y no es
dependiente de parámetros externos
Sensibilidad MS/MS 91.4% [95% (CI), 84.3%–95.6%]
Sensibilidad RDBH 89.7% [95% (CI), 82.3%–94.3%]
Especifidad y PPV similares
Modelo de informe para la determinación múltiple de factores por MS/MS
HPV & Cytology
at 6-12 months
Women aged 25-64 y HPV Test
Normal 5 Year Recall
Cytology
Negative
Proposed New Screening Algorithm
Positive
Normal or Borderline ≥≥≥≥ Mild
Colposcopy
Normal 5 Year Recall
HPV & Cytology at
6-12 months
Colposcopy
Cyto Neg HPV Neg Cyto ≥≥≥≥ Mild
HPV Pos & Cyto < Mild
HPV Neg & Cyto Borderline
Dr. J. Cuzick
Routine cervical screening with primary HPV testing and cytology triage
protocol in a randomised setting
Kotaniemi-Talonen, L. (Finish Cancer Registry)
BJC, 93, 862 – 867, 2005
NegativoCONTROL
PositivaCOLPOSCOPIA
NegativaCONTROL
CITOLOGÍA COLPOSCOPIA
Positivo
HPV
NegativaCONTROL
PositivaCOLPOSCOPIA
CITOLOGÍA
Guidelines ASCCP
Conclusiones
- Las técnicas moleculares están sujetas a importantes variaciones en sus resultados
- La utilidad de las pruebas moleculares requiere, necesariamente, de una evaluación en el entorno clínico
- No solo es importante saber qué tipo de VPH tiene una paciente sino saber cómo se está relacionando con el huésped
- La disponibilidad de nuevos parámetros moleculares, el estudio de la dinámica de la infección a lo largo del tiempo o la expresión de proteínas que interaccionan con el ciclo celular nos permitirá, en un futuro próximo, la caracterización del riesgo individual de cada paciente
- La tecnología de MS/MS se perfila como la herramienta diagnóstica más potente y más eficiente para el estudio de patologías de base molecular
Gracias por su atención
Muralla de Lugo, Siglo I D.C.Patrimonio de la Humanidad
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES
