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WESTERN BLOT
Saldaña Hernández Perla YamilethFacultad de medicina
Sección 301INMUNOLOGÍA
• Prueba de VIH• la encefalopatía espongiforme
bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
• la enfermedad de Lyme
El WESTERN BLOT, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada .
PROCEDIMIENTO
a) Preparación de la muestra. Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química.
b) Electroforesis en gel de Acrilamida. Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida.
c) Transferencia electroforética a una membrana. Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas.
d) Hibridación del Anticuerpo. La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
e) Detección de las Bandas. Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localización de la banda en la membrana.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
• Las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos.
• El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico.
Métodos físicos de la disrupción de muestras.
MÉTODO DESCRIPCIÓN TIPO DE MUESTRA
Licuadora La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Gran cantidad de tejido
Homogeneizador DounceTubo de vidrio con pistón
ajustado maja las células por acción de corte
Células tisulares, útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o
nucleares.
Homogeneizador de ultrasonidos
Ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las
membranas celularesCélulas, tejido, bacterias
Pulverización de Nitrógeno liquido
La muestra se pulveriza utilizando un mortero y una
almirez refrigeradosTejido animal o no vegetal
Perlas de vidrioLa ruptura celular se produce por agitación de las perlas de
vidrioLevaduras
Soluciones de tampón y detergentesTIPO/LOCALIZACIÓN
PROTEÍNA DE INTERÉSDETERGENTE O SOLUCIÓN
TAMPÓN COMENTARIOS
Nativa (no desnaturalizada)Detergente suave no iónico Evitar detergentes
desnaturalizantes (SDS, Deoxicolatos)
Citoplasmáticos (soluble) Tris-HCl Puede combinarse con
métodos mecánicos, tales como el homogeneizador
Dounce Citoplasmático (unida a
citoesqueleto) Tris – Triton Los detergentes Triton son suaves y no iónicos
Membrana mitocondrial o nuclear
NP-40, RIPA (multiples détergentes), Triton X-100
Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de
enriquecimiento
Lisado total de celulas NP-40, RIPA, Triton X-100
Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es importante evitar, durante la preparación de la muestra, cualquier actividad proteásica.
• Evitar excesivos ciclos de congelación/descongelación. • Trabajar rápido y mantener las muestras en frío
durante todo el proceso. • Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis.
ELECTROFORESIS EN ACRILAMIDA
• Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel.
2. Realización de Western Blot cuantitativos o semicuantitativos.
1. Una vez se tienen las muestras de proteína• se pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar
ciclos repetitivos de congelación/ descongelación.• se pueden utilizar inmediatamente, con un tampón de carga 2. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-
10 minutos3. cargar la muestra en un gel de electroforesis.
Inicio de electroforesis• Antes de la carga del gel, es importante diseñar el experimento
incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados.
1. Marcadores de peso molecular2. Controles positivos
TRANSFERENCIA DE MEMBRANA
• Después de la separación electroforética de las proteínas por su peso molecular, éstas deben transferirse desde el gel de electroforesis a la membrana.
• Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos. Es muy importante bloquear los sitios de unión de la membrana sin reaccionar con el antígeno, para reducir la unión inespecífica de las proteínas.
HIBRIDACIÓN DEL ANTICUERPO
• Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo primario lavados anticuerpo secundario conjugado con HRP (D. indirecta)
DETECCIÓN DE LAS BANDAS
Los métodos directos utilizan un anticuerpo
primario conjuga-do con un marcaje detectable, como
un enzima, biotina o molécula fluorescente.
Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos; un
anticuerpo primario y un anticuerpo secundario
contra la especie del primer anticuerpo.
• Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son:
1. Quimioluminiscencia2. Fluorescencia 3. Colorimetría.
QUIMIOLUMINISCENCIA
• Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción entre el encima y el substrato produce luz, que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X