Anticuerpos Monoclonales

Daniel Goicochea

Universidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Ciencias BiológicasEscuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología

• Anticuerpos policlonales resultantes de un animal inmunizado pueden reconocer una variedad de epítopes sobre el antígeno

Anticuerpos monoclonales (Köhler y Milstein, 1975, 1976).

• Tecnología de hibridomas: fusionar un linfocito B (información codificante para el anticuerpo) con una célula de mieloma (célula plasmática cancerosa: capacidad de multiplicación y crecimiento ilimitado), para obtener un híbrido: síntesis y secreción de un anticuerpo y crecimiento perpetuo

Características de las células de mieloma

• Haber perdido la capacidad de secretar inmunoglobulina propia (Ig-neg)

• Carecer de alguna de dos enzimas requeridas para el crecimiento en un medio de cultivo selectivo denominado HAT– Hipoxantina-guanosina fosforibosil-transferasa

(HGPRT) -> HGPRT-neg – Timidina kinasa (TK) -> TK-neg

Medio Selectivo HAT

• Contiene hipoxantina, aminopterina y timidina• Aminopterina actúa como inhibidor de la vía

principal de síntesis de ácidos nucleicos• La ruta alterna utiliza la hipoxantina y la

timidina como precursores, y que requiere de las enzimas HGPRT y TK

Producción de hibridomas murinos

• ↑ inmunogenicidad - ↑ expansión clonal y ↑ probabilidad de hallar hibridomas con la especificidad deseada

• no importa si la inmunización despertó una respuesta contra posibles contaminantes de la preparación de antígeno

Producción de hibridomas murinos

• Inmunización de ratón singénico (cepa BALB/c) con antígeno de interés

• Se sacrifica al animal para obtener Linfocitos esplénicos

• Mezcla de Linfocitos con células de mieloma por Polietilénglicol (PEG) que promueve la fusión de membranas celulares.

Hibridomas

Cepa BALB/c

semanas

• Se obtiene una cantidad de hibridomas al azar• Se siembran las células distribuidas en placas

de 96 hoyos, en medio HAT• Sobreviven los hibridomas y proliferan (12-

16h)• Se prueba los sobrenadantes de los cultivos

mediante ELISA u otra técnica inmunológica

Producción de hibridomas murinos

• Se identifican cultivos con Ab de interés• Se separan células en nuevo cultivo

(clonación)• Obtención de cultivo monoclonal de

hibridoma, cuyas células se pueden conservar congeladas en nitrógeno líquido a -196°C

Producción de hibridomas murinos

Separación de células en nuevo cultivo

nitrógeno líquido a -196°C

Producción de AcM

• In vitro: cultivos masivos (concentraciones desde µg/ml hasta mg/ml de medio de cultivo)

• Material más fácilmente purificable, pero más costoso por requerimiento de equipos, medios y suplementos.

Producción de AcM

• In vivo: células del hibridoma inyectadas en cavidad peritoneal de ratones singénicos con respecto a la cepa que origino los LB y al mieloma

• Se produce un tumor ascítico del cuál se obtiene grandes volúmenes con alta concentración de AcM (mg/ml)

• Contiene proteínas contaminantes. Se requiere de purificación.

• Se sacrifican animales.

Producción de AcM

• Determinación de isotipos empleando antisueros que reconocen distintas subclases de cadenas pesadas

• Técnicas: IDD, ELISA• Evaluación de reacciones cruzadas,

especificidad molecular a nivel de epítopo, probando la capacidad de unión a péptido.

Características AcM

• Moléculas únicas e idénticas entre sí.• Especificidad y afinidad constante (reproducible)• La capacidad de reconocer solo a un epítopo

disminuye la posibilidad de reacciones cruzadas con otros Ag.

• Desventaja en precipitación: al solo reconocer un epítopo de un Ag, no forma complejos multimoleculares adecuados.

• Ventaja en aglutinación: reconoce un solo epítopo, pero que está disponible repetidamente en la superficie

Usos de Ab monoclonales

• Su especificidad los hace útiles para usar como Ab primarios en inmunoensayos.

• La especificidad también los hace eficiente para unión a antígeno en mezcla de moléculas (como en purificación por afinidad)

AcM Humanizados

• AcM murinos no son útiles en humanos, ya que el sistema inmune los detecta como extraños (HAMA: human anti-murine Ab)

• Obtención de AcM humanos: transformación de linfocitos B mediante infección in vitro virus Epstein-Barr, manipulación directa de ADN, producción de Ab quiméricos y humanizados.

• Epstein–Barr virus (EBV) es un virus de herpes que, in vitro, inmortaliza eficientemente casi todoas los LB.

• Las líneas celulares linfoblastoides (LCL’s) preservan las características iniciales de las células: producen y secretan Ig y expresan dichas moléculas, que pueden ser aisladas en líneas celulares que secreten Ab específicos

• Este método permite la producción de IgM, IgG, IgA, y IgE anticuerpos monoclonales

• Human monoclonal antibodies are promising reagents for passive immunization.

Humanización de Ab

• A schematic representation of the advancement from fully mouse antibodies, represented by red domains, to fully human antibodies, represented by blue domains.

Humanización de Ab

• Aplicación de ingeniería genética para reducir la inmunogenicidad de Ab de ratón.

• Se produjo Ab quiméricos conteniendo dominios constantes de Ab humanos y los dominios variables de ratón para mantener la especificidad.

Dominio variable de ratón

Dominio constante humano

Mouse Fab spliced to human Fc

Humanización de Ab

• Posteriormente se produjo Ab humanizados conteniendo solo los CDR de ratón (región determinante de complementaridad), que es la responsable de la unión a Ag

CDR de ratón

Dominio constante humano

Humanización a partir de quimeras de ratón